CN101246098B - 一种蚕豆根尖细胞微核制片方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蚕豆根尖细胞微核制片方法，该方法包括蚕豆种子的浸种催芽、根尖的固定离析和染色压片等步骤。该方法通过采用一种固定离析液将固定和离析融合为一步完成，使原来需要25小时左右才能完成的试验，缩短为仅需30分钟左右就可完成，极大地节省了试验时间、减少了药品消耗；并通过使用操作简便、染色效果好的细胞核染液，达到了使细胞核着色明显、核质对比度大、细胞轮廓清晰的最佳微核制片效果，从而确保了用蚕豆根尖微核技术监测环境的可行性和准确性。

Description

一种蚕豆根尖细胞微核制片方法

技术领域

本发明涉及一种细胞微核制片方法，特别是涉及一种蚕豆根尖细胞微核制片方法。

背景技术

植物蚕豆(Vicia faba L)根尖细胞的染色体大，数量少，DNA含量多，对诱变剂反应敏感。蚕豆根尖细胞微核技术是1982年由Francesca和MaTe-Hsiu建立的，目前已在环境污染监测和致突变剂检测方面被中国、美国、联合国环境规划署(UNEPA)和世界卫生组织(WHO)等众多的国家、地区及国际组织认可。中国国家环境保护总局2002年颁布的《水和废水监测分析方法》中，将蚕豆根尖微核试验列为在环境监测与执法过程中使用的B类方法，并在蚕豆根尖微核试验中提供了具体的席夫试染色制片方法，该方法的步骤是：取约1厘米根尖→加卡诺氏固定液固定24小时→用蒸馏水浸洗两次，每次5分钟→吸净蒸馏水→加入5摩尔/升盐酸，放入28℃水浴锅中水解25分钟→用蒸馏水洗两次，每次5分钟→用席夫试液遮光染色12分钟→用SO₂洗涤液浸洗两次，每次5分钟→用蒸馏水浸洗5分钟→用解剖针截下1毫米长的根尖→滴上少许45％的乙酸溶液→用解剖针捣碎根尖→压片→观察。这种微核制片方法的步骤多，试验耗时长，药品花费量大，并且由于席夫试染液的配制、使用过程中都需要遮光，给试验增加了一定的难度；另外由于蚕豆根尖细胞用浓盐配进行离析的时间很难掌握，在试验过程中常造成根尖细胞时而离析不够，细胞不能压成单层；时而离析过度，又影响细胞的着色；以及用席夫试染蚕豆根尖细胞时间较长，其试剂中含有的盐酸往往使材料过于软化，也影响到细胞核的着色情况，从而直接造成蚕豆根尖细胞微核制片的质量不佳。

我们知道，细胞微核制片方法是确保细胞微核制片质量的关键，直接影响到蚕豆根尖微核技术监测环境污染的可行性和准确性。从当前使用的制片方法来看，确实存在上述不足，因此在一定程度上限制了我国蚕豆根尖细胞微核技术在环境污染监测和致突变剂检测方面的广泛运用。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足而提供一种试验步骤少、试验时间短、药品耗费少、细胞微核制片质量佳的蚕豆根尖细胞微核制片方法。

为达到上述目的，本发明采用的解决方案是：先将蚕豆种子进行催种催芽，然而切取约1cm长度的根尖，放入配制的固定离析液中处理4～6分钟，再将处理后的根尖取出，用蒸馏水清洗干净后进行染色压片，所述固定离析液由固定液和离析液按1∶1的比例(体积比)现用现配，其中固定液由无水乙醇和冰醋酸按125∶3的比例(体积比)配制，离析液选用浓盐酸，染液为Giemsa染液或改良苯酚品红染液，染色时间为4～7分钟。

上述方案中根尖在固定离析液中进行处理时的温度为27～29℃。

本发明与现有席夫试染色制片方法相比具有如下优点：(1)由于将固定、离析融合为一步完成，因此实验步骤大大简化，试验时间明显缩短，由原来的需要25小时左右才能完成的试验，缩短为仅需30分钟左右就可完成，药品耗费也明显减少。(2)由于采用的是Giemsa染液或改良苯酸品红染液，因此操作简便，无需遮光；并且细胞核着色稳定，细胞核、质着色对比度大，细胞轮廊清晰，能清楚地辨别出微核所属的细胞，因而可准确地计算出监测细胞中的微核数，使微核制片效果达到较佳，从而确保了用蚕豆根尖微核技术监测环境浸染的可行性和准确性。该方法可广泛应用到对各种水源、大气、土壤、农药以及食品、食品添加剂、药品、化妆品和放射性污染等的质量检测中。

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

具体实施方式

实施例1

(1)浸种催芽：选择无病虫害的蚕豆种子用25℃温水浸泡，待种子吸胀后，剥去胚根附近的种皮，放入铺有一层滤纸的培养皿中，加入少量蒸馏水，在30℃恒温培养箱中进行催芽培养，在培养期间要勤换水，待根长到1～2cm时，选出根生长良好、长度一致的种子进行试验；

(2)配制固定离析液：先按125∶3的体积比取无水乙醇和冰醋酸，并将其混合制成固定液，离析液选用浓盐酸，再按1∶1的体积比将固定液和离析液混合配制成固定离析液；

(3)固定离析：取长约1cm的根尖放入28℃固定离析液中处理5min，随即取出根尖用蒸馏水清洗2～3次，每次2～3min，直至将根尖上的固定离析液清洗干净；

(4)染色压片：将洗净后的根尖置于载玻片上，吸干水分，用解剖针取根尖1mm左右，并用解剖针仔细捣碎，然后在根尖细胞上滴加Giemsa染液染色6min后，盖上盖玻片进行压片并在显微镜下观察。根据试验观察，用Giemsa染液染色，微核制片效果最好。

实施例2

(1)浸种催芽：选择无病虫害的蚕豆种子用25℃温水浸泡，待种子吸胀后，剥去胚根附近的种皮，放入铺有一层滤纸的培养皿中，加入少量蒸馏水，在28℃恒温箱中进行催芽培养，在培养期间要勤换水，待根长到1～2cm时，选出根生长良好、长度一致的种子进行实验；

(2)配制固定离析液：先按125∶3的体积比取无水乙醇和冰醋酸，并将其混合制成固定液，离析液选用浓盐配，再按1∶1的体积比将固定液和离析液混合配制成固定离析液；

(3)取约1cm的根尖放入29℃的固定离析液中处理6min，随即取出根尖用蒸馏水清洗2～3次，每次2～3min，直至将根尖上的固定离析液清洗干净；

(4)染色压片：将洗净后的根尖置于载玻片上，吸干水分，用解剖针取根尖1mm左右，并用解剖针仔细捣碎，然后在根尖细胞上滴加改良苯酚品红染液染色7min后，盖上盖玻片进行压片并在显微镜下观察。根据试验观察，用改良苯酚品红染液染色，微核制片效果稍次于Giemsa染液。

Claims (2)

1.一种蚕豆根尖细胞微核制片方法，其特征在于：先将蚕豆种子进行催种催芽，然后切取1cm长度的根尖，放入配制的固定离析液中处理4～6分钟，再将处理后的根尖取出，用蒸馏水清洗干净后进行染色压片，所述固定离析液由固定液和离析液按1∶1的体积比配制，其中固定液由无水乙醇和冰醋酸按125∶3的体积比配制，离析液选用浓盐酸，染液为Giemsa染液或改良苯酚品红染液，染色时间为4～7分钟。

2.根据权利要求1所述的一种蚕豆根尖细胞微核制片方法，其特征在于：根尖在固定离析液中处理时的温度为27～29℃。