CN101242828B - 抑制酰基辅酶a：胆固醇酰基转移酶的组合物 - Google Patents

Abstract

此处公开的是具有抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶活性的组合物，其包括retrofractamide A、胡椒杀虫胺、piperrolein B、piperchabamideD、墙草碱或者其组合，或者其药学上可接受的盐。该组合物对于预防和治疗血管疾病，如高血脂症、动脉硬化等是有效的。

Description

抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶的组合物

技术领域

本发明涉及具有抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶能力的组合物。更具体而言，本发明涉及用于抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶的组合物，包括作为活性成分的黑胡椒(Piper nigrum L.)提取物，从提取物中分离的化合物，或者其药学上可接受的盐。

技术背景

血管疾病的发生主要是由于高血脂症。在所有引起死亡的疾病中，血管疾病名列前茅。因此，需要治疗和预防血管疾病的药品。

根据Heider’s的研究，已知机体需要外源性胆固醇和内源性胆固醇，外源性胆固醇可通过食物的摄取来供应，而内源性胆固醇在肝脏中合成。(Heider J.G.1986.Agents which inhibit cholesterolesterification in the intestine and their potential value in the treatment ofhypercholesterolaemia.，J.R.Prous Science pulishers，423-438)。然而，过多地摄食甘油三酯和胆固醇导致高血脂症的发生，高血脂症是以血液中甘油三酯和胆固醇的过高水平为特征的病症，并且己知是动脉硬化发生的主要原因。这些疾病或病症主要是由于在脂蛋白形成、转运、和/或降解过程中脂蛋白的异常代谢引起的。流行病学研究表明，大多数的缺血性心脏病主要是由于冠状动脉硬化引起的，并且血清胆固醇水平的升高是在其发病和发展中起重要作用的因子。Goldstein等和Komai的报道教导了降低血清胆固醇水平的方法，即通过抑制小肠中胆固醇的吸收和肝脏中胆固醇的生物合成并且促进胆汁酸的分泌而进行的。(Goldstein J.L.and S.M.Brown 1990.Regulation of themevalonate pathway：Nature 33425-430，Komai T.and Y.Tsujita 1994.Hepatocyte selectivity of HMG-CoA reductase inhibitors：DN&P，7：279-288)。作为目前可用的用于降低血清胆固醇水平的药品的例子是普伐他汀和辛伐他汀，分别由日本的Daiichi Sankyo和美国的Merk制造，普伐他汀和辛伐他汀都是从Compactin经过生物学修饰而来，抑制肝脏中胆固醇的生物合成，这两种药品占据了市场的最大份额并有最高的普及率。这些药品的医学机理基于它们对3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutary Co-Areductase)抑制作用，此还原酶参与了肝脏中胆固醇生物合成的中间步骤。Grunler’s的研究揭示：长期使用HMG辅酶A还原酶抑制剂对辅酶Q、多萜醇、血红素A、法尼基化的蛋白质(farnesylated protein)和胆固醇衍生物，如类固醇激素、维生素D、胆汁酸、脂蛋白等的产生具有负面作用，此类物质对机体是必不可少的，其必须在甲羟戊酸形成之后由胆固醇生物合成的旁路产生(Grunler J.，J.Ericsson and G.Dalloner 1994.Branch-point reactions in the biosynthesis of cholesterol，dolichol，ubiquinone and prenylated proteins：Biochim.Biophys，Acta1212，259-277)。根据Will’s的研究，长期使用HMG辅酶A还原酶抑制剂导  致辅酶Q的生物合成降低——辅酶Q在心脏功能和免疫功能中具有重要作用，从而该抑制剂对患有动脉硬化或心脏病的病人具有危险的后果(Willis R.A.，K.，Folkers.J.L.Tucker，C.Q.Ye，L.J.Xia，and H.Tamagawa.1990.Lovastatin decreases coenzyme Q levels in rats：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87,8928-8930)。

目前可用的用于高血脂症的医疗试剂或者是肝脏中胆固醇生物合成的抑制剂，或者是阴离子交换剂，这种试剂与胆汁酸相关，因而抑制大肠中胆固醇的重吸收。这两类医疗试剂都在临床上应用，但是需要一种新的治疗高血脂症的药品，此种药品能够无限制使用并且具有可靠的治疗机理，有很小或者没有副作用。Sliskovic报道ACAT抑制剂对于高血脂症的预防和治疗是有效的(Sliskovic D.R.and A.D.White 1991.Therapeutic potential of ACAT inhibitors as lipid lowering andantiatherosclerotic agents：Trends in Pharmacol.Sci.12：194-199)。尤其是，ACAT抑制剂的发展受到很大的关注，ACAT抑制剂被评价为一种高血脂症的治疗剂，其直接涉及针对动脉硬化发生的新的预防机理。ACAT是一种酶，已知与胆固醇的酰化作用有关，因而参与了小肠中胆固醇的吸收、肝脏中VLDL(极低密度脂蛋白)的合成和酯化胆固醇的累积。

许多大学研究所和商业的研究所，如药剂公司的那些研究所，  已经研究了高血脂症的治疗剂，它们中的一些已经成功开发出有效的治疗剂。然而，在多数情况下，研究侧重于ACAT抑制剂的开发，即作为安全的可靠的用于预防高血脂症的下一代药剂的开发。迄今为止，大多数研究的ACAT抑制剂是基于尿素、酰胺或酚类的合成化学品，如在Warner Lambert、辉瑞(Pfizer)、Yamanouchi等公司所开发的那些化学品(Matsuda K.1994.ACAT inhibitors as antiatherosclerosisagent：compounds and mechanisms.14，John Wiley & Son，Inc.，271-305)。为了开发具有新结构的ACAT抑制剂前体，应用微生物材料进行了广泛的研究。以日本Kitasato研究所(Kitasato Institute)对purpactin的结构鉴定的成功为起点(Tomoda H.，H.Nishida，R.Masuma，J.Cao.S.Okuda and S.Omura 1991.Purpactins，new inhibitor ofacyl-CoA：cholesterol acyltransferase produced by Peniciliumpurpurogenum I.production，isolation and phico-chemical and biologicalproperties：J.Antibiotics 44：136-143)，已经发现了各种新的微生物ACAT抑制剂，包括日本Daiichi Sankyo开发的Epi-cohliquinone A(日本专利，公开出版屋编号Hei 4-334383，1992)，东京农业技术大学(TokyoUniversity ofA griculture and Technology)开发的acaterin(Naganuma S.，K Sakai，K.Hasumi and A.Endo 1992.Acaterin，a novel inhibitor ofacyl-CoA：cholesterol acyltransferase produced by Pseudomonas sp.A92：J.Antibiotics 45：1216-1221)，长蠕孢醇(Park J.K.，K.Hasumi and A Endo1993.Inhibitors of acyl-CoA：cholesterol acyltransferase byHelminthoporol and its related compounds：J.Antibiotics 46：1303-1305)，土红镰孢菌素(Lateritin)(Hasumi K.，C.shinohara，T.Iwanaga and A.Endo 1993.Lateritin，A new inhibitors of acyl-CoA：cholesterolacyltrarsferase produced by Gibberella lateritium IFO 7188：J Antibiotics46：1782-1787)，gypsetin(Shinohara C.，K.Hasumi，Y.Takei and A.Endo1994.Gypsetin，a new inhibitor of acyl-CoA：cholesterol acyltransferaseproduced by Nannizzia gypsea var.incurvata IFO 9228.，I.Fermentation，isolation physico-chemical properties and biological activity：J.Antibiotics47：163-167)，日本Kitasato研究所开发的恩镰孢菌素(ennitins)(Nishida H.，X.H Huang，R.Musuma，Y.K.Kim and S.Omura 1992.Newcyclodepsipeptides，enniatins D.E.and Fproduced by Fusariumn sp.FO-1305：J.Antibiotics45：1207-1214)，glisoprenins(Tomoda，H.X.H，Huang，H.Nishida，R Masuma，Y.K.Kim and S.Omura 1992.Glisoprenins，new inhibitors of acyl-CoA：cholesterol acyltransferaseproduced by Gliocladium sp.，I.Production.Isolation and phsico-chemicaland biological properties：J.Antibiotics，45：1202-1206)，pyripyropenes(Omura S.，H.Tomoda，Y.K.Kim and H.Nishida 1993.Pyripyropenes，highly potent inhibitors of acyl-CoA：cholesterol acyltransferase producedby Aspergillus fumigatus：J.Antibiotics 46：1168-1169；Kim Y.K，H Tomoda，H.Nishida，T.Sunazuka，R.Obata，S.Omura 1994.Pyripyropenes，novelinhibitors of acyl-CoA：cholesterol acyltransferase produced by Aspergillusfumigatus.，II.Structure elucidation of pyripyropenes A，B，C and D：JAntiibotics47：1540162)，terpendols(Huang X.H，H.Tomada，H.Nishida，R.Masuma and S.0mura 1995.Novel ACAT inhibitors produced byAlbophomna yamanashiensis：J.Antibiotics48：1-4)，日本Kyowa Hakko开发的AS-183(Kuroda K.，M.Yoshida，Y.Uosaki，K.Ando，I.Kawamoto，E.Oishi，H.Onuma，K.Yamada and Y.Matsuda 1993.AS-183，a novelinhibitor of acyl-CoA：cholesterol acyltransferase produced byScedosporiumsp.SPC-15549：J.Antibiotics46：1196-1202)，AS-186(Kuroda K.，Y.Morishita，Y.Saito，Y.Ikuina，K.Ando，I.Kawamoto and Y.Matsuda 1994.AS-186，New inhibitor of acyl-CoA：cholesterolacyltransferase from Penicillium asperosporium KY1635：J.Antibiotics47：16-22)，韩国生物科学和生物技术研究所(Korea Research Institute ofBioscience and Biotechnology)开发的GERI-BP-001(Jeong T.S.，S.U.Kim，K.H Son，B.M Kwon，Y.K.Kim，M.U.Choi and S.H.Bok 1995.GERI-BP001 compounds，New inhibitors of acyl-CoA：cholesterolacyltrarsferase produced by Aspergillus fumigatus F37：J.Antibiotics48：751-756)，GERI-BP-002(Kim，Y.K，H.W.Lee，K.H Son，B.M Kwon，T.S Jeong，D.H Lee，J H Shin，Y W.Seo，S.U.Kim，S.H.Bok 1996.GERI-BP002-A，Novel inhibitors of acyl-CoA：cholesterol acyltransferaseproduced by Aspergillus fumigatus F93：J.Antibiotics 49：31-36)，以及辉瑞(Pfizer)开发的avasimibe，这些抑制剂都吸引了广泛的注意力(Heinonen TM.，2002.Acyl coenzyme A：cholesterol acyltransferaseinhibition：potential atherosclerosis therapy or springboard for otherdiscoveries？：Expert Opin Investig Drugs.11.1519-1527)。

导向本发明，本发明的发明人对天然存在的具有抑制ACAT活性的材料进行了深入细致的彻底地研究，结果发现从黑胡椒(Piper nigrum L.)中分离的酰胺基化合物，包括retrofractamide A、胡椒杀虫胺(pipercide)、piperrolein B、piperchabamide D和墙草碱(pellitorin)，具有抑制ACAT的有效活性并且对于预防和治疗高胆固醇血症血管疾病，例如高胆固醇血症、高血脂症、动脉硬化等是有效的。

发明内容

因此，本发明目的是提供具有抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶活性的药物组合物，包括从黑胡椒提取的提取物，选自retrofractamide A、胡椒杀虫胺、piperrolein B、piperchabamide D、墙草碱的化合物和其组合，或者其药学上可接受的盐。

本发明的另一个目的是提供从黑胡椒中制备具有抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶活性的提取物的方法。

本发明进一步的目的是提供从提取物中分离具有抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶活性的酰胺基化合物的方法。

附图简述

图1显示：化学式1所代表的化合物的波谱数据，包括H-NMR(CDCl₃，500.13MHz)，C-NMR(CDCl₃，125.75MHz)和FAB-Mass。

图2显示：化学式2所代表的化合物的波谱数据，包括H-NMR(CDCl₃，500.13MHz)，C-NMR(CDCl₃，125.75MHz)和FAB-Mass。

图3显示：化学式3所代表的化合物的波谱数据，包括H-NMR(CDCl₃，500.13MHz)，C-NMR(CDCl₃，125.75MHz)和FAB-Mass。

图4显示：化学式4所代表的化合物的波谱数据，包括H-NMR(CDCl₃，500.13MHz)，C-NMR(CDCl₃，125.75MHz)和FAB-Mass。

图5显示：化学式5所代表的化合物的波谱数据，包括H-NMR(CDCl₃，500.13MHz)，C-NMR(CDCl₃，125.75MHz)和FAB-Mass。

图6显示：化学式1至化学式5的化合物的％ACAT抑制。

图7显示：在HepG2细胞中，化学式1至化学式5的化合物对ACAT的抑制活性。

本发明最佳实施方式

按照实施方式，本发明涉及具有抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶活性的黑胡椒提取物和包含此提取物的组合物。

按照另外一个实施方式，本发明涉及具有抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶活性的组合物，包括选自retrofractamide A、胡椒杀虫胺、piperrolein B、piperchabamide D、墙草碱的化合物和其组合，或者其药学上可接受的盐。retrofractamide A、胡椒杀虫胺、piperroleinB、piperchabamide D和墙草碱是优选地天然存在的材料，是从黑胡椒中提取的。可选地，这些化合物可以是合成的材料。

所获得的关于黑胡椒提取物对酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶(ACAT)具有抑制活性的知识引导本发明的发明人去寻找提取物中的活性成分。为了实现这个目的，将黑胡椒溶解在有机溶剂，如醇类中得到粗提物，得到粗提物，在水和各种有机溶剂中分馏粗提物。发现所有馏分都显示出ACAT抑制活性，其中氯仿馏分中抑制活性最高。应用各种层析分离活性化合物。通过电子轰击质谱(electron impactmass spectrometry)、氢核磁共振波谱术(hydrogen nuclear magneticresonance spectrometry)和碳核磁共振波谱术(carbon nuclear magneticresonance spectrometry)对这些化合物的结构和化学特性进行分析。

分析结果揭示了这些活性化合物：化学式1的retrofractamideA、化学式2的胡椒杀虫胺、化学式3的piperrolein B、化学式4的piperchabamide D和化学式5的墙草碱。在本发明之前已经发表的文献中，任何地方都没有提及这些化合物的ACAT抑制活性。

[化学式1]

[化学式2]

[化学式3]

[化学式4]

[化学式5]

酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶(ACAT)是一种膜内在蛋白质，催化由胆固醇和脂肪酰基辅酶A形成胆固醇酯。

术语“酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶(ACAT)抑制”或者相应的短语，如此处所用的，意即导致胆固醇酯形成的酶反应被阻断或者变得低效。ACAT催化的反应对肠内胆固醇的吸收、载脂蛋白B(apoB)的合成和分泌以及细胞内胆固醇的贮存是必需的。因此，ACAT抑制导致肠内来自食物的胆固醇的吸收和肝脏内VLDL的吸收的中断，因而降低了血清中的胆固醇水平。

自从发现ACAT与胆固醇的血清水平有直接关系，ACAT作为胆固醇相关疾病的治疗靶标而被研究。基于这样的事实：选择性ACAT抑制导致胆固醇的血清水平降低，可以给予在脑、心脏和周边血管中发生的血管疾病以有效的治疗。例如，ACAT活性的抑制在预防和治疗高胆固醇血症(Raal FJ et al.，Atherosclerosis.2003 Dec；171(2)：273-279)、高脂血症(Kusunoki J.，Arterioscler Thromb Vasc Biol.2000 Jan；20(1)171-178)、动脉粥样硬化(Heinonen TM.，Curr AtherosclerRep.2002 Jan；4(1)：65-70)、动脉硬化(Heinonen TM.，Expert Opin InvestigDrugs.2002 Nov；11(11)：1519-1527)、冠状动脉硬化(Meynier A.，Br J Nutr.2002 May；87(5)：447-458)、和主动脉瘤(Hiatt WR et al.，Vasc Med.2004Nov；9(4)：271-277)中有用。此外，发现ACTC参与阿尔茨海默氏病(Alzheimer，s disease)相关淀粉样斑块的产生，因而可以用ACAT抑制剂治疗这种疾病(Hutter-Paier Betal.，Neuron.2004 Oct 14；44(2)：227-238；Puglielli Letal.，J Mol Neurosci，2004；24(1)：93-96)。因此，ACAT的选择性抑制剂可被用于上述疾病及其症状或并发症的预防和治疗。

此处所用的术语疾病的“预防”表示通过施用本发明的组合物，限制或者延缓疾病发生的所有行动。此处所用的术语疾病的“治疗”表示通过施用本发明的组合物，使疾病状况转向或变向更好的或者有利的状态的所有行动。

根据本发明，用在组合物的活性组分中的化合物可以从生物体中分离，并且优选地从黑胡椒中分离。天然的、杂交的或突变植物的各种组织，如根、茎、花、果实等以及植物的组织培养物可被用于制备化合物。它们也可以通过应用本领域人员已知的方法合成。

此处所用的术语“药学上可接受的盐”意指来自药理学上的或生理学上可接受的无机酸、有机酸和碱的盐。在本发明中适合的酸的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、醋酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、2-萘磺酸(naphtalene-2-sulfonicacid)、苯磺酸等。源自适合的碱的盐的例子是碱金属例如钠的盐，碱土金属的盐如镁盐和铵盐。

在另外一种实施方式中，本发明提供了从黑胡椒中获得提取物的方法和从提取物中分离特定化合物的方法。

应用水、有机溶剂或者其混合物可以得到黑胡椒的提取物。优选地，将黑胡椒干燥预定的时间并且粉碎之后，可用提取方法提取。有用的提取方法的例子包括，但不局限于：冷沉淀、热萃取、超声波提取、和冷萃取。只要是最低程度地破坏活性成分，可以使用任何提取方法。可以通过如下方法制备具有抑制ACAT活性的化合物：从提取物中获得高活性组分，并且从该活性组分中通过如色谱方法分离具有抑制ACAT活性的化合物。

因此，可以使用下述方法制备化合物，该方法包括：从黑胡椒中将所述化合物萃取到介质如水、有机溶剂或者其混合物中；用非极性有机溶剂分馏萃取物；通过色谱方法纯化非极性有机溶剂中的内含物。

在粉碎植物的萃取中有用的有机溶剂的例子包括：甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、乙烯、丙酮、己烷、醚、氯仿、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚枫(DMSO)、1，3-丁二醇、丙二醇和其混合物，优选醇类并且更优选低级醇如甲醇或乙醇。

为了从黑胡椒的初级提取物中获得高活性的组分，应用水和有机溶剂。在有机溶剂中，优选非极性有机溶剂。特别优选的是正己烷、醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯或其混合物。在本发明的一个例子中，在正己烷、氯仿、乙酸乙酯和水中获得各自的组分。在它们中，发现氯仿组分具有最高活性(89％)，水相组分活性最低(15％)。

非极性溶剂组分，也就是，溶解在非极性溶剂中的内容物，进行一次或多次的色谱以分离活性成分。各种色谱柱和展开剂可以被合适地使用。

在一个例子中，具有化学式1至5结构的化合物被分离。将三份重的甲醇倒入到粉末状的黑胡椒中并使其在室温下静置七天，随后通过过滤和在真空中干燥以浓缩它们。由此获得的粗提物用正己烷、氯仿、乙酸乙酯或者水分馏。在真空中浓缩各自的组分并且进行色谱分离4次。按顺序进行硅胶柱色谱(浓缩梯度正己烷：乙酸乙酯＝50/1～0/100)，反相柱色谱(ODS胶，使用甲醇)，低压液相色谱(LPLC；LKB，使用甲醇)和高效液相色谱(HPLC；YMCJ’sphere ODS H-80(250×20mm)，以获得总共5种纯的化合物。

通过电子轰击质谱、氢核磁共振波谱、碳核磁共振波谱等的分析揭示了纯化的化合物是酰胺类化合物，经鉴定为化学式1的ractamideRetrofA、化学式2的胡椒杀虫胺、化学式3的piperolein B、化学式4的piperchabamide D和化学式5的墙草碱。发现对应于化学式1至5的所有化合物具有抑制ACAT的活性，已确定的各自的IC₅₀是24.5、3.7、87.5、11.5、40.4μM。具体而言，化学式2的胡椒杀虫胺的抑制活性是obovatol的抑制活性的12倍。

根据上面所描述的基础上，具有抑制ACAT的有效活性的化学式1-5的化合物，对于脑血管、心血管和周边血管疾病的预防和治疗在治疗上是有用的。此外，化合物显示出对于阿尔茨海默氏病的有效的预防和治疗活性。本发明的组合物包括非合成的、天然存在的活性化合物，因而本发明的组合物是安全的并且可以长期施用而几乎没有毒性或者副作用。对于患有脑血管、心血管和周边血管疾病的哺乳动物如母牛、马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊、狗等以及人类，本发明的组合物也是有效的。

因此，按照另一种实施方式，本发明提供了对于血管疾病防治和治疗有效的药物组合物，包括取自黑胡椒的提取物、化学式1至5的化合物中的至少一种，或者至少一种其药学上可接受的盐。

按照本发明，用于防治和治疗血管疾病的药物组合物包括活性成分，该活性成分选自总量为基于组合物总重量的0.1至50wt％的化合物。该组合物进一步包括添加剂，其经常被用于改善风味、口味、外观和其他非药用性能。此外，该组合物可进一步包括有机或无机添加剂，添加剂选自微生素B₁、B₂、B₆、C和E、烟酸、肉碱(canritin)、甜菜碱(betain)、叶酸、泛酸、生物素、锌、铁、钙、铬、镁和其组合。本发明的组合物可以单独使用或者与预先存在的、治疗有效的材料联合使用。

该组合物包括药学上可接受的载体，可以配制成人和哺乳动物口服或者非口服的剂型。

根据本发明，稀释剂或者便利剂(expedients)，如填充剂、增稠剂、粘结剂、润湿剂、分解剂和表面活性剂通常被用于组合物的配制。口服剂型的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒和胶囊。用本发明的组合物与至少一种便利剂，如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶结合制备这些固体制剂。除了便利剂(expedients)，可以使用润滑剂如镁、硬脂酸、滑石粉等。口服的液体制剂包括悬浮液、内部溶液(internal solution)、乳液和糖浆。在这些液体制剂中，可以包括各种便利剂，如润湿剂、甜味剂和防腐剂以及简单的稀释剂如水和液体石蜡。非臼服剂型的制剂以无菌水溶液、非水溶液、悬浮液、乳液、冻干剂和栓剂为典型。对于非水溶液和悬浮液，可以使用植物油如丙二醇、聚乙二醇和橄榄油或注射用酯如油酸乙酯。

组合物可以以单位剂量(单个剂量)或多剂量的形式如在密封的安瓿和小瓶中提供，或者以冻干的形式贮存，其只需在施用前，向其加入无菌液体载体，如注射用水。原位注射液或悬浮液可被制备成为无菌粉末、颗粒或片剂。

按照本发明进一步的实施方式，所提供的是防治和治疗血管疾病的方法，包括给患者施用组合物，该组合物含有作为活性成分的至少一种选自化学式1至5的化合物或者至少一种其盐。

如此处所用的术语“患者”意指患有疾病的哺乳动物，当向其施用本发明的ACAT抑制组合物时，所述疾病能够减轻。为了有效地防治或治疗血管疾病，如高胆固醇血症、高血脂症、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠状动脉硬化和主动脉瘤，可以向需要的患者施用组合物，该组合物包括来自黑胡椒的提取物或者至少一种选自化学式1至5的化合物。因而该组合物可以与预先存在的治疗试剂联合施用。

此处所用的术语“施用(给药，administration)”意即应用合适的方法将预定的物质导入病人。只要预定的物质达到靶组织，可以采用任何施用途径，不论是口服或非口服。此外，本发明的组合物可以在装置的辅助下施用，所述装置使得活性成分容易地到达靶细胞。

本发明的组合物以药学有效量施用。

此处所用的术语“药学上的有效量”意即在治疗过程中，足以产生最优受益/危险比例的药物量。这个比例取决于医疗领域中各种已知的因素，包括患者的性别和年龄、疾病的种类和严重性、药物活性、敏感性、给药时间、给药途径、流量比、给药间隔时间、共同施用的药物和其它因素。本发明的组合物可以单独施用或者与其他治疗联合施用。本发明的组合物与其他治疗的共同施用可以同时进行或者按顺序进行。单剂量或多剂量施用是可能的。以足以获得最大治疗效果而无副作用的最低可能剂量使用组合物是非常重要的。优选地，对于口服，本发明的化合物的药学上的有效量范围是每剂量在1至10mg/kg之间，而对于静脉注射，本发明的化合物的药学上的有效量是每剂量的范围在1至5mg/kg之间。

仍然在进一步的实施方式中，本发明提供了健康食物，其包括从黑胡椒提取的提取物或者从提取物分离的组分。以及在本发明的组合物中，从黑胡椒中提取的提取物或从提取物中分离的组分可被用在能够方便摄取的健康食物中，因此可在正常时间预防血管疾病和阿尔茨海默氏病。

健康食品可以应用本领域技术人员知道的方法制备，并且可以以片剂、颗粒、粉剂、饮料等形式制备。

鉴于下面的实施例可以更好的理解本发明，该实施例被阐述以用于举例说明本发明，但不是解释为限制本发明。

实施例1：酶抑制剂的分离与纯化

黑胡椒(Piper nigrum L.)购自位于韩国Daejeon的一个市场，在经过水洗和阴凉处干燥后，用带有刀片的粉碎机粉碎成粉末。向5kg的黑胡椒粉末中加入3份重量的甲醇，并且使溶液在室温下静置7天，然后过滤。滤液在真空中干燥，产生粗制的浓缩提取物。将粗制的浓缩提取物溶解在正己烷、氯仿、乙酸乙酯和水中以分离和纯化活性材料。检测粗提物各个组分的ACAT抑制活性。为了检测，干燥每个组分的一部分从而得到密度为1mg/ml的测试样品。经检测，ACAT抑制活性在正己烷组分中是25％，在氯仿组分中是89％，在乙酸乙酯组分中是55％，在水组分中是15％。在真空中浓缩具有最高ACAT抑制活性的所有氯仿组分(157.7g)，并且加到硅胶柱色谱上，用由正己烷：乙酸乙酯＝50/1～0/100组成的一步梯度洗脱系统洗脱，产生活性组分。汇集含有最高ACAT抑制活性的一些组分，用50％、60％、70％、80％、90％、100％甲醇作为洗脱液，在ODS胶上通过反相柱色谱纯化。组分4和组分5的ACAT抑制活性比其它组分更高，用75％和80％甲醇分别以6ml/min和8ml/min的流速，通过低压液相色谱(LKB)进一步纯化。这样获得的组分中，发现组分4的第3号和组分5的第2号和第4号的ACAT抑制活性比其它组分编号的ACAT抑制活性高，进一步经过高效液相色谱(YMC J’sphere ODS H-80(250×20mm))纯化，用75％和80％甲醇以4ml/min和6ml/min的流速洗脱，从组分3的第3号中产生一种纯的活性化合物和从组分5的第2号和第4号中产生4种纯的活性化合物。在组分4的第3号洗脱开始后35min，组分5的第2号洗脱开始后31min，和组分5的第4号洗脱开始后43min、45min和53min，使用254nm和210nm的紫外线光进行ACAT抑制剂的检测。

实施例2：活性成分的结构测定

从黑胡椒提取的化合物1至5的理化特性如下：

化合物1

(1)形式：白色粉末

(2)实验式和分子量：C₂₀H₂₅NO₃，327

(3)电子轰击质谱(70eV)：m/z(rel.int)＝360[M+Na]+

(4)H-NMR波谱[300MHz，氯仿-d₃，δ(ppm)]：7.19(1H，dd，J＝15，15.3Hz，H-3)，6.87(1H，brs，h-2’)，6.73(1H，m，H-5’和6’)，6.30(1H，d，J＝15.3Hz，H-9)，6.17(1H，dd，J＝9.9，15.3Hz，H-4)，6.10(1H，m，H-5)，5.98(1H，m，H-8)，5.93(2H，s，H-7’)，5.77(1H，d，J＝14.7Hz，H-2)，5.59(NH，brs)，3.16(2H，t，J＝6.6Hz，H-1”)，2.30(4H，m，H-6和7)，1.79(1H，m，H-2”)，0.93和0.91(3H，s，H-3”和4”)

(5)C-NMR波谱[75MHz，氯仿-d₃，δ(ppm)]：21.10(q，C-3”和4”)，28.59(d，C-2”)，32.15(t，C-7)，32.81(t，C-6)，46，90(t，C-2”)，100.92(t，C-7’)，105.39(d，C-2’)，108.20(d，C-5’)，120.36(d，C-6’)，122.23(d，C-2)，127.66(d，C-8)，128.77(d，C-4)，130.15(d，C-9)，132.04(s，C-1’)，140.94(d，C-3)，141.69(d，C-5)，146.71(s，C-3’)，147.91(s，C-4’)，166.27(s，C-1)

化合物2

(1)形式：白色粉末

(2)实验式和分子量：C₂₂H₂₉NO₃，355

(3)电子轰击质谱(70eV)：m/z(rel.int)＝354[M-H]+

(4)H-NMR波谱[300MHz，氯仿-d₃，δ(ppm)]：7.19(1H，dd，J＝14.4，14.7Hz，H-3)，6.88(1H，brs，H-2’)，6.74(1H，m，H-5’)，6.73(1H，brs，H-5’)，6.28(1H，d，J＝15.6Hz，H-11)，6.13(1H，dd，J＝15.3，15.3Hz，H-4)，6.05(1H，d，J＝15Hz，H-5)，6.02(1H，d，J＝15.9Hz H-10)，5.92(2H，s，H-7’)，5.75(1H，d，J＝15.3Hz，h-2)，5.56(NH，brs)，3.16(2H，t，J＝6.6Hz，h＝1”)，2.17(4H，m，H-6和9)，1.79(1H，m，H-2”)，1.46(4H，m，H-7和8)，0.93和0.91(3H，s，H-3”和4”)

(5)C-NMR波谱[75MHz，氯仿-d₃，δ(ppm)]：20.09(q，C-3”和4”)，28.27(t，C-7)，28.60(d，C-2”)，28.90(t，C-8)，32.64(t，C-9)，32.75(t，C-6)，46.89(d，C-1”)，100.88(t，C-7’)，105.35(d，C-2’)，108.18(d，C-5’)，120.20(d，C-6’)，121.89(d，C-2)，128.38(d，C-4)，128.92(d，C-10)，129.52(d，C-11)，132.32(s，C-1’)，141.12(d，C-3)，142.69(d，C-5)，146.55(s，C-4’)，147.90(s，C-3’)，166.31(s，C-1)

化合物3

(1)形式：无色油

(2)实验式和分子量：C₂₁H₂₉NO₃，343

(3)电子轰击质谱(70eV)：m/z(rel.int)＝366[M+Na]+

(4)H-NMR波谱[300MHz，氯仿-d₃，δ(ppm)]：6.88(1H，brs，H-2’)，6.74(1H，m，H-5’)，6.73(1H，brs，H-6’)，6.27(1H，d，J＝15.3Hz，H-9)，6.03(1H，dt，J＝15.9，6.9Hz，H-8)，5.92(2H，s，H-7’)，5.75(1H，d，J＝15.3Hz，H-2)，3.54(2H，t，J＝5.4Hz，H＝1”)，3.38(2H，t，J＝5.5Hz，H＝5”)，2.30(2H，t，J＝7.5Hz，H＝2)，2.16(2H，q，J＝6.6Hz，H＝7)，1.61(4H，m，H-2”和4”)，1.54(4H，m，H-4和3”)，1.45(2H，m，H-6)，1.35(4H，m，H-3和5)

(5)C-NMR波谱[75MHz，氯仿-d₃，δ(ppm)]：24.57(t，C-3”)，25.37(t，C-4”)，25.56(t，C-4)，26.55(t，C-2)，28.95(t，C-5)，29.24(t，C-6)，29.34(t，C-3)，32.80(t，C-7)，33.39(t，C-2)，42.54(t，C-1”)，46.67(t，C-5”)，100.85(t，C-7’)，105.34(d，C-2’)，108.15(d，C-5’)，120.14(d，C-6’)，129.27(d，C-8)，129.30(d，C-9)，132.42(s，C-1’)，146.48(s，C-3’)，147.87(s.C-4’)，171.37(s，C-1)

化合物4

(2)形式：白色粉末

(2)实验式和分子量：C₂₂H₃₁NO₃，357

(3)电子轰击质谱(70eV)：m/z(rel.int)＝380[M+Na]+

(4)H-NMR波谱[300MHz，氯仿-d₃，δ(ppm)]：6.89(1H br s，H-2’)，6.83(1H，dt，J＝15.3，7.5Hz，H-3)，6.75(1H，m，H-5’)，6.74(1H，brs，H-6’)，6.28(1H，d，J＝15.9Hz，H-11)，6.03(1H，dt，J＝15.3，7.5Hz，H-10)，5.93(2H，s，H-7’)，5.75(1H，d，J＝15.3Hz，H-2)，5.43(NH br s)3.14(2H，t，J＝6Hz，H-1”)，2.17(4H，m，H-4和9)，1.80(1H，m，H-2”)，1.44(4H，m，H-5和8)，1.33(4H，m，H-6和H-7)，0.93和0.91(3H，s，H-3”和H-4”)

(5)C-NMR波谱[75MHz，氯仿-d₃，δ(ppm)]：20.11(q，C-3”和4”)，28.19(t，C-5)，28.59(d，C-2”)，28.93(t，C-6)，29.02(t，C-7)，29.30(t，C-8)，31.97(t，C-4)，32.84(t，C-9)，46.81(t，C-1”)，100.89(t，C-7’)，105.37(d，C-2’)，108.20(d，C-5’)，120.18(d，C-6’)，123.60(d，C-2)，129.32(d，C-10和C-11)，132.45(s，C-1’)，144.69(d，C-3)，146.53(s，C-4’)，147.91(s，C-3’)，166.06(s，C-1)

化合物5

(3)形式：黄色粉末

(2)实验式和分子量：C₁₄H₂₅NO，223

(3)电子轰击质谱(70eV)：m/z(rel.int)＝222[M-H]+

(4)H-NMR波谱[300MHz，氯仿-d₃，δ(ppm)]：7.17(1H，dd，J＝14.7，14.7Hz，H-3)，6.08(1H，m，H-4和H-5)，5.76(1H，d，J＝14.7Hz，H-2)，5.67(NH brs)，3.15(2H，t，J＝6.6Hz，H-1”)，2.13(2H，m，H-6)，1.88(1H，m，H-2”)，1.40(2H，m，H-7)，1.29(4H，m，H-8和H-9)，0.92和0.90(3H，s，H-3”和H-4”)，0.87(3H，s，H-10)

(5)C-NMR波谱[75MHz，氯仿-d₃，δ(ppm)]：13.96(q，C-10)，20.09(q，C-3”和C-4”)，22.43(t，C-9)，28.44(t，C-7)，28.59(d，C-2’)，31.32(t，C-8)，32.87(t，C-6)，，46.89(t，C-1’)，121.76(t，C-2)，128.18(t，C-4)，141，19(d，C-3)，143.10(d，C-5)，166.40(s，C-1)

化合物1被完全地分离和纯化为无色结晶状粉末，其[M+Na]⁺为m/z 350。通过高分辨率的FAB-MS测量，预测化合物1具有实验式C₂₀H₂₅NO₃。在紫外光谱中，在260nm检测到最大吸收并且吸收肩峰在295～305nm，这说明在化合物的结构中有共轭酰胺二烯(dienamide)的存在。进行NMR以确定化合物的结构。在¹H-NMR波谱波谱中，发现一个亚甲二氧基质子(methylendioxy proton，5.93，s)并且检测到：9个烯烃质子在δ5.7～7.3，-NH-的质子(brs)在δ5.59，两个亚甲基质子在δ2.30，连接到-NH-的1个亚甲基质子在δ3.15，1个次甲基质子在δ1.79，和甲基质子在δ0.93和δ0.91。从这些质子，能够推断出异丁基基团的存在(图1、2和3)。上面得到的数据与含有酰胺键的ractamideRetrof A的结构的数据非常相似。通过与公开发表的数据对比与分析(Park，I.K.，Lee，S.G.，Shin，S.C.，Park，J.D.and Ahn，Y.J.2002.Larvicidal activity of isobutylamides identified in Piper nigrumfruits against three mosquito species：J Agric Food Chem 50，1866-1870)，化合物1被确定为retrofractamide A。

化合物2被完全地分离和纯化为无色结晶状粉末，其[M+Na]⁺为m/z 354。通过高分辨的FAB-MS测量，预测化合物2具有实验式C₂₂H₂₉NO₃。与化合物1的情况类似，紫外波谱表明化合物结构中共轭酰胺二烯存在的可能性。除了在δ1.46发现两个亚甲基质子之外，化合物2的¹H-NMR波谱数据与化合物1的数据相似。两者合起来，上面获得的数据与具有酰胺键的胡椒杀虫胺的结构数据非常相似。通过与公开发表的数据对比与分析(Park，I.K.，Lee，S.G.，Shin，S.C.，Park，J.D.and Ahn，Y.J.2002.Larvicidal activity of isobutylamidesidentified in Piper nigrum fruits against three mosquito species：J AgricFood Chem 50，1866-1870)，化合物2被确定为胡椒杀虫胺。

化合物3被完全地分离和纯化为无色结晶状油，其[M+Na]⁺为m/z 366。通过高分辨FAB-MS测定，预测化合物3具有实验式C₂₁H₂₉NO₃。在紫外光谱中，在260nm检测到最大吸收，这说明在化合物的结构中有酰胺二烯的存在。进行NMR以确定化合物的结构。在¹H-NMR波谱中，发现一个亚甲二氧基质子(5.93，s)并且检测到：9个烯烃质子在δ6.0～7.0，结合-N-的亚甲基质子(br s)在δ3.54和δ3.38，两个亚甲基质子在δ2.30和δ2.15，14个亚甲基质子在δ1.31～1.67(图2、3和4)。上面获得的数据与具有哌啶的piperrolein B的结构数据非常相似。通过与公开发表的数据对比与分析(Kiuchi，F.，Nakamura，N.，Tusda，Y.，Kondo，K.and Yshimura，H.1988.Studies on crude drugseffective on visceral larva migrans.IV.isolation and identification oflarvicidal principles in pepper：Chem Pharm Bull 36(7)，2452-2465)，化合物3被确定为piperrolein B。

化合物4被完全地分离和纯化为无色结晶状粉末，其[M+Na]⁺为m/z 380。通过高分辨FAB-MS测定，预测化合物4具有实验式C₂₂H₃₁NO₃。在紫外光谱中，在260nm检测到最大吸收并且吸收肩峰在295～305nm，这说明在化合物的结构中有共轭酰胺二烯的存在。进行NMR以确定化合物的结构。在¹H-NMR波谱中，发现一个亚甲二氧基质子(5.93，s)并且分别在δ5.7～7.3和δ1.30～1.50检测到7个烯烃质子和4个亚甲基质子(图2、3和4)。上面获得的数据与具有异丁基和酰胺键的piperchabamide D的结构数据非常相似。通过与公开发表的数据对比与分析(Morikawa，T.，Matsuda，H.，Yamaguchi，I.，Pongpiriyadacha，Y.and Yishikawa，M.2004.New amides and gastroprotective constituents from the fruit of Piper chaba：Planta Med 70，152-159)，化合物4被确定为piperchabamide D。

化合物5被完全地分离和纯化为黄色结晶状粉末，其[M+Na]⁺为m/z 222。通过高分辨FAB-MS测量，预测化合物5具有实验式C₁₄H₂₅NO。在紫外光谱中，在260nm检测到最大吸收并且吸收肩峰在295～305nm，这说明在化合物的结构中有共轭酰胺二烯的存在。进行NMR以确定化合物的结构。在¹H-NMR波谱中，检测到：4个烯烃质子在δ5.7～7.3，-NH-的质子(brs)在δ5.67，1个亚甲基质子在δ3.15和δ2.13中的每一个，3个亚甲基质子在δ1.20～1.45，1个次甲基质子在δ1.88和3个甲基质子在δ0.87、δ0.90和δ0.92。基于上面获得的数据，预测化合物5是墙草碱，其具有异丁基基团但不含有亚甲基二羟基苄基基团。通过与公开发表的数据对比与分析(Park，I.K.，Lee，S.G.，Shin，S.C.，Park，J.D.and Ahn，Y.J.2002.Larvicidal activity ofisobutylamides identified in Piper nigrum fruits against three mosquitospecies：J Agric Food Chem 50，1866-1870)，化合物5被确定为墙草碱。

实施例3：ACAT来源的制备

从雄性Sprague-Dawley大鼠(250-300g)中移取肝脏，将肝脏用微粒体缓冲液(microsome buffer)A(0.25M蔗糖，1mM EDTA，0.01M Tris-HCl，pH7.4)洗涤，用剪刀细分，用Teflon-玻璃匀浆机匀浆化。将匀浆液在14,000×g离心15min，所产生的上清进一步在100,000×g离心1小时。将如此获得的沉淀溶解在微粒体缓冲液B(0.25M蔗糖，0.01M Tris-HCl，pH7.4)中，然后在100,000×g离心1小时，分离含有ACAT的微粒体。为了得到酶源的一致的蛋白质浓度，将沉淀在适量的微粒体缓冲液B中溶解，以BSA(牛血清白蛋白)作为标准，通过Lowry方法测定蛋白浓度。此后，将所获得的酶源用微粒体缓冲液B稀释为10mg/ml的蛋白质浓度，等份分装在1ml小瓶中，保存在-70℃直到使用。

实施4：ACAT活性的检测

用Kim’s方法加以修改(Kim Y.K，H.W.Lee，K.H Son，B.MKwon，T.S Jeong，D.H.Lee，J.H.Shin，Y.W.Seo，S.U.Kim，and S.H.Bok1996.GERI-BP002-A，Novel inhibitors of acyl-CoA：cholesterolacyltransferase produced by Aspergillus fumigatus F93：J.Antibiotics49：31-36)，以[1-¹⁴C]油酰基-辅酶A作为底物，检测ACAT活性。通过混合10.0μl样品、4.0μl大鼠肝脏微粒体酶、20.0μl检测缓冲液[0.5MKH₂PO₄，10mM DTT，pH7.4]，15.0μl的40mg/ml BSA(不含必需脂肪酸)，2.0μl的20mg/ml胆固醇，和41.0μl蒸馏水，制备反应溶液。反应液在37℃预反应20min。向此酶反应液加入8.0μl[1-¹⁴C]油酰基-辅酶A(0.05μCi，终浓度10μM)，酶反应在37C进行25min，用1ml异丙醇-庚烷(4：1v/v)终止反应。加入0.6ml庚烷和0.4ml稀释五倍的检测缓冲液之后，进行离心以分离有机溶剂。将100μl上清与3mlLipoluma闪烁混合物(cocktail)混合均匀，用液体闪烁计数器测定放射性。

抑制ACAT的活性定量为在待测样品存在时检测到的放射标记的底物和酶之间反应产物的放射性，根据下面的方程1计算活性抑制百分比。

[方程1]

％活性抑制＝100×[1-CPM(T)-CPM(C2)/CPM(C1)-CPM(B)]

CPM(T)：样品和酶共同存在时检测到的CPM

CPM(C1)：没有样品，仅有酶存在时检测到的CPM

CPM(C2)：没有酶，仅有样品存在时检测到的CPM

CPM(B)：样品和酶都不存在时检测到的CPM。

空白样品在0℃反应。作为阳性对照，当obovatol针对ACAT的IC₅₀值被测定为44μM时，化学式1至5的酰胺类化合物的IC₅₀值分别为24.5、3.7、87.5、11.5和40.4μM，这表明抑制活性是剂量依赖型的方式(图6和图7)。

ACAT抑制剂具有阻断小肠中胆固醇吸收的功能，因此，降低胆固醇的血清水平，阻碍肝脏中VLDL的合成，由此降低血清LDL胆固醇，并且抑制胆固醇的酰化反应——胆固醇的酰化对于在受侵袭的损伤处动脉硬化的发生是必不可少的，所以ACAT抑制剂能被用做预防和治疗高胆固醇水平相关的血管疾病如高血脂症、动脉硬化等的有效药物。

实施例5：片剂的制备

胡椒杀虫胺-1g

乳糖-7g

结晶纤维素-1.5g

硬脂酸镁-0.5g

共计-10g

将上述成分充分混合并且用直接压片的方法制备成片剂。每片重100mg，含有10mg活性成分。

实施例6：粉剂的制备

胡椒杀虫胺-1g

玉米淀粉-5g

羧基纤维素-4g

共计-10g

充分混合这些成分，产生的粉末然后被包裹进软胶囊中，每个胶囊的量是100mg。

工业适用性

如迄今为止所描述的，retrofractamide A、胡椒杀虫胺、piperroleinB、piperchabamide D、墙草碱和其药学上可接受的盐有效地抑制ACAT，因此能够单独或联合用于血管疾病如高血脂症、血管硬化等的预防和治疗。

此外，从黑胡椒中提取的提取物或者从提取物中分离的组分显示了如上所述的相同的抑制活性，因为尽管未被纯化，提取物或组分包含所有的活性成分。因此，提取物能有效地用在具有抑制ACAT活性的药剂组合物中以及用在对于预防血管疾病有用的健康食品中。

Claims (4)

1.由下列化学式1至5所代表的化合物中的至少一种化合物，或者其药学上可接受的盐中的至少一种在制备用于预防或治疗高血脂症、动脉硬化或阿尔茨海默氏病的药物中的用途

2.由下列化学式1至5所代表的化合物中的至少一种化合物，或者其盐的至少一种在制备用于预防高血脂症、动脉硬化或阿尔茨海默氏病的健康食品中的用途

3.权利要求1或2中所限定的用途，其中所述高血脂症是高胆固醇血症。

4.权利要求1或2中所限定的用途，其中所述动脉硬化是动脉粥样硬化或冠状动脉硬化。

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