KR20070006621A

KR20070006621A - 아실-코에이:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제 저해 활성을가지는 조성물

Info

Publication number: KR20070006621A
Application number: KR1020060064138A
Authority: KR
Inventors: 김영국; 노문철; 이현선; 이승웅; 권오억; 정미연; 최정호; 동미숙
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2005-07-08
Filing date: 2006-07-08
Publication date: 2007-01-11
Also published as: US20080268076A1; JP5091859B2; WO2007007997A1; EP1904055A4; KR101350954B1; JP2009502744A; EP1904055A1; CN101242828B; CN101242828A

Abstract

본 발명은 호초(Piper nigrum L.) 추출물 또는 그로부터 분리된 래트로프렉트아마이드 에이(ractamideRetrof A), 피퍼사이드(pipercide), 피페롤레인 비(piperolein B), 피퍼차바미드 디(piperchabamide D) 및 펠리토린(pellitorine)으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 아실 코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 저해 활성을 가지는 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 고지혈증, 동맥경화 등의 혈관 질환에 대한 예방 및 치료 효과를 가진다.

아실-코에이:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제(acyl-CoA:cholesterolacyltransferase, ACAT), 고콜레스테롤혈증, 아마이드(amide), 피퍼사이드(Pipercide), 호초(Piper nigrum L.)

Description

아실-코에이:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제 저해 활성을 가지는 조성물{Composition for inhibiting Acyl-CoA:cholesterol acyltransferase}

도 1은 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 수소핵자기공명 스펙트럼 (CDCl₃, 500.13 MHz), 탄소 핵자기 공명스펙트럼 (CDCl₃, 125.75 MHz), 질량분석 스펙트럼(FAB-Mass)을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 화학식 2로 표시되는 화합물의 수소핵자기공명 tm펙트럼 (CDCl₃, 500.13 MHz), 탄소 핵자기 공명스펙트럼 (CDCl₃, 125.75 MHz), 질량분석 스펙트럼(FAB-Mass)을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 화학식 3으로 표시되는 화합물의 수소핵자기공명 스펙트럼 (CDCl₃, 500.13 MHz), 탄소 핵자기 공명스펙트럼 (CDCl₃, 125.75 MHz), 질량분석 스펙트럼(FAB-Mass)을 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명에 따른 화학식 4으로 표시되는 화합물의 수소핵자기공명 스펙트럼 (CDCl₃, 500.13 MHz), 탄소 핵자기 공명스펙트럼 (CDCl₃, 125.75 MHz), 질량분석 스펙트럼(FAB-Mass)을 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명에 따른 화학식 5으로 표시되는 화합물의 수소핵자기공명 스 펙트럼 (CDCl₃, 500.13 MHz), 탄소 핵자기 공명스펙트럼 (CDCl₃, 125.75 MHz), 질량분석 스펙트럼(FAB-Mass)을 나타낸 것이다.

도 6은 화학식 1 내지 5의 화합물의 ACAT 효소저해활성을 나타낸 것이다.

도 7은 화학식 1 내지 5의 화합물의 HepG-2 세포에서 효소저해 활성을 나타낸 것이다.

본 발명은 아실 코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 저해 활성을 가지는 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 호초(Piper nigrum L.) 추출물 및 그로부터 분리된 특정 화합물 또는 그 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 아실 코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 저해 활성을 가지는 조성물에 관한 것이다.

심혈관 질환은 주로 고지혈증에 의하여 발병되며 이 질환의 사망률은 전체 사망률 중에서 상위를 차지하고 있으며, 그에 따른 의약품의 개발이 요구되고 있다.

Heider의 연구에 의하면 생체가 필요로 하는 콜레스테롤은 음식물의 섭취에 의한 외인성 콜레스테롤과 생체내 간장에서 합성에 의한 내인성 콜레스테롤이 있다고 알려져 있다 [Heider J.G. 1986. Agent which inhibit cholesterol esterification in the intestine and their potential value in the treatment of hypercholesterolaemia, J.R. Prous Science Publishers, 423-438]. 그러나, 중성지방과 콜레스테롤의 체내유입이 지나쳐 고지혈증이 되면 혈중에 콜레스테롤이나 트리글리세라이드가 과다하게 높은 증상이 되며 동맥경화증을 일으키는 주 요인으로도 알려져 있다. 이런 증상들은 지단백질 (lipoprotein)의 형성, 운반, 분해 과정 중에 이상이 생겨 지단백질의 대사가 비정상적으로 이루어지기 때문이다. 역학적 조사에 의하면 허혈성 심장질환의 대부분은 관상동맥의 아테로마성 동맥경화증이 주된 원인이고, 혈청 콜레스테롤의 상승이 병의 발생과 진전에 중요한 인자라고 알려져 있다. Goldstein 등과 Komai의 보고에 의하면 혈청 콜레스테롤을 저하시키기 위해서 소장에서 콜레스테롤의 흡수 저해, 간에서 콜레스테롤의 생합성 저해, 담즙산의 배설을 촉진시키는 방법들이 제시되고 있다 [Goldstein J.L. and S.M. Brown 1990. Regulation of the mevalonate pathway : Nature 33 425-430, Komai T. and Y. Tsujita 1994. Hepatocyte selectivity of HMG-CoA reductase inhibitors: DN & P, 7: 279-288]. 현재, 혈청 콜레스테롤 농도를 낮추기 위하여 사용되고 있는 의약품으로는 간장에서 생합성되는 콜레스테롤의 합성을 저해하는 의약품으로 일본의 산쿄, 미국의 Merck사의 제품으로 콤팩틴 (compactin)의 생물학적 변형 유도체인 프라바스타틴 (pravastatin)과 심바스타틴 (simvastatin)이 가장 높은 점유율과 신장률을 보이고 있다. 이들 의약품의 작용 기작은 간장에서 콜레 스테롤의 생합성 과정 중 합성중간단계에 관여하는 3-히드록시-3-메틸 글루타릴 Co-A 환원효소를 저해하는 것이다. 그러나, Grunler의 연구에 의하면 작용 기작 상 HMG Co-A 환원효소 저해제를 장기간 사용하면 메바로네이트 (mevalonate) 이후의 콜레스테롤 합성 중간단계의 부경로에서 생성되어야 할 인체가 필요한 유비퀴논 (ubiquinone), 돌리콜(dolichol), 헴 에이 (haem A), 파네실화된 단백질 (farnesylated protein) 및 콜레스테롤에서 생성되는 스테로이드 호르몬, 비타민 D, 담즙산, 지단백질의 생산에 영향을 주는 것으로 보고하였다 [Grunler J., J. Ericsson and G. Dalloner 1994. Branch-point reactions in the biosynthesis of cholesterol, dolichol, ubiquinone and prenylated proteins: Biochim . Biophys , Acta 1212, 259-277]. Willis의 연구에 의하면 HMG Co-A 환원효소 저해제를 지속적으로 사용 시 심장기능과 면역기능에 중요한 역할을 하는 코엔자임 큐의 합성을 감소시키는 것으로 나타나, 동맥경화증 환자나 심장질환 환자에게는 악영향을 줄 수 있는 것으로 보고되었다 [Willis R.A., K., Folkers. J.L. Tucker, C.Q. Ye, , L.J. Xia, and H Tamagawa. 1990. Lovastatin decreases coenzyme Q levels in rats: Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 87, 8928-8930].

현재 고지혈증 치료제로는 간장에서 합성되는 콜레스테롤의 생합성을 저해하는 저해제와, 간장에서 분비되어 음식물을 소화시키고 대장에서 재흡수되는 담즙산에 결합하는 음이온 교환체가 콜레스테롤 재흡수 저해제로 임상적으로 사용되고 있으나, 보다 사용에 제한사항이 없고 작용기작이 확실하며 부작용이 적은 새로운 고지혈증 치료제의 개발이 요구되고 있다. Sliskovic의 보고에 의하면 그 중에서 고 지혈증 예방과 치료에 ACAT 활성 저해제가 효과가 있는 것으로 보고되었고 [Sliskovic D. R. and A. D. White 1991. Therapeutic potential of ACAT inhibitors as lipid lowering and antiatherosclerotic agents: Trends in Pharmacol . Sci. 12:194-199], 특히 동맥경화 발생 기작에 직접적으로 관련되어 있는 새로운 작용기작을 갖는 고지혈증 치료제 개발의 일환으로 ACAT 저해제의 개발이 추천되고 있다. ACAT는 콜레스테롤의 아실화에 관여하여 소장에서 콜레스테롤의 흡수, 간장에서 VLDL (very low density lipoprotein)의 합성, 지방세포와 혈관내벽에 저장형 콜레스테롤의 축적에 관여하는 효소로 알려져 있다.

외국의 경우 연구소, 대학, 제약업체에서 고지혈증 치료제를 개발하기 위하여 수종의 탐색 체계가 개발, 운용되고 있으며 그 중에 몇몇은 개발에 성공하여 큰 성과를 올리고 있는 것도 있으나, 보다 안전하고 확실한 작용기작을 갖는 차세대 고지혈증 예방 치료제를 개발하기 위하여 ACAT 저해제가 탐색되고 있다. 지금까지 연구되어진 ACAT 저해제들은 화학합성품이 주로 연구대상이었으며 Warner Lambert, Pfizer, Yamanouchi 등에서 우레아, 아미드, 페놀계의 합성화합물이 주종을 이루고 있다 [Matsuda K. 1994. ACAT inhibitors as antiatherosclerosis agent:compounds and mechanisms .14, John Wiley & Son, Inc., 271-305]. 새로운 구조를 갖는 ACAT 저해 선도물질을 개발하기 위하여 미생물 자원을 대상으로 탐색연구가 진행되고 있고 일본 키타사토 (Kitasato) 연구소의 퍼팩틴 (purpactin) [Tomoda H., H. Nishida, R. Masuma, J. Cao, S. Okuda and S. Omura 1991. Purpactins, new inhibitor of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase produced by Penicillium purpurogenum I. Production, isolation and physico-chemical and biological properties: J. Antibiotics 44:136-143]의 구조가 밝혀진 것을 시작으로 일본 산쿄사의 에피-콜리퀴논 에이 (epi-cohliquinone A) [일본 공개특허공보 특개평 4-334383, 1992], 동경 농공대의 아카테린 (acatelin) [Naganuma S., K Sakai, K. Hasumi and A. Endo 1992. Acaterin, a novel inhibitor of aycl-CoA: cholesterol acyltransferase produced by Pseudomonas sp. A92: J. Antibiotics 45:1216-1221], 헬민토스포롤 (helmintosporol) [Park J.K., K. Hasumi and A Endo 1993. Inhibitors of acyl-CoA:cholesterol acyltransferase by Helminthosporol and its related compounds: J. Antibiotics 46:1303-1305], 라테리틴 (lateritin) [Hasumi K., C. Shinohara, T. Iwanaga and A. Endo 1993. Lateritin, A new inhibitors of acyl-CoA:cholesterol acyltransferase produced by Gibberella lateritium IFO 7188: J. Antibiotics 46:1782-1787], 짚세틴 (gypsetin) [Shinohara C., K. Hasumi , Y. Takei and A. Endo 1994. Gypsetin, a new inhibitor of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase produced by Nanniizzia gypsea var. incurvata IFO 9228., I. Fermentation, isolation physico-chemical properties and biological activity: J. Antibiotics 47:163-167], 일본 키타사토 연구소의 엔니아틴 (enniatins) [Nishida H., X.H Huang, R. Masuma, Y.K. Kim and S. Omura 1992. New cyclodepsipeptides, enniatins D. E. and F produced by Fusarium sp. FO-1305: J. Antibiotics 45:1207-1214], 글리소프레닌 (glisoprenins) [Tomoda, H. X.H, Huang, H. Nishida, R Masuma, Y.K. Kim and S. Omura 1992. Glisoprenins, new inhibitors of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase produced by Gliocladium sp., I. Production. Isolation and physico-chemical and biological properties: J. Antibiotics, 45:1202-1206], 피리피로펜 (pyripyropenes) [Omura S., H. Tomoda, Y.K. Kim and H. Nishida 1993. Pyripyropenes, highly potent inhibitors of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase produced by Aspergillus fumigatus: J. Antibiotics 46:1168-1169; Kim Y.K, H Tomoda, H. Nishida, T. Sunazuka, R. Obata, S. Omura 1994. Pyripyropenes, novel inhibitors of acyl-CoA:cholesterol acyltransferase produced by Aspergillus fumigatus ., II. Structure elucidation of pyripyropenes A, B, C and D: J. Antibiotics 47:154-162], 테르펜돌 (terpendols) [Huang X.H, H. Tomoda, H. Nishida, R, Masuma and S. Omura 1995. Novel ACAT inhibitors produced by Albophoma yamanashiensis: J. Antibiotics 48:1-4], 일본 교와하꼬 (Kyowa Hakko)사의 AS-183 [Kuroda K., M. Yoshida, Y. Uosaki, K. Ando, I. Kawamoto, E. Oishi, H. Onuma, K. Yamada and Y. Matsuda 1993. AS-183, a novel inhibitor of aycl-CoA: cholesterol acyltransferase produced by Scedosporium sp. SPC-15549: J. Antibiotics 46:1196-1202], AS-186 [Kuroda K., Y. Morishita, Y. Saito, Y. Ikuina, K. Ando, I. Kawamoto and Y. Matsuda 1994. AS-186, New inhibitor of aycl-CoA: cholesterol acyltransferase from Penicillium asperosporium KY1635: J. Antibiotics 47:16-22], 한국생명공학연구원의 GERI-BP-001 [ Jeong T. S., S. U. Kim, K. H Son , B. M Kwon, Y. K. Kim ,M. U. Choi and S. H. Bok 1995. GERI- BP001 compounds, New inhibitors of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase produced by Aspergillus fumigatus F37: J. Antibiotics 48:751-756], GERI-BP-002 [Kim Y. K, H. W. Lee, K. H Son, B. M Kwon, T. S Jeong, D. H Lee, J H Shin, Y W. Seo , S. U. Kim, S. H. Bok 1996. GERI-BP002-A, Novel inhibitors of acyl-CoA:cholesterol acyltransferase produced by Aspergillus fumigatus F93: J. Antibiotics 49:31-36], 화이자의 아바시미베 (avasimibe) 등이 ACAT 저해를 통한 새로운 고지혈증 치료제로 관심을 모으고 있다 [Heinonen TM., 2002. Acyl coenzyme A:cholesterol acyltransferase inhibition: potential atherosclerosis therapy or springboard for other discoveries ? : Expert Opin Investig Drugs. 11:1519-1527].

상기에서 살펴본 기존의 아실 코에이 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제(ACAT) 저해제 외에도, 보다 우수한 ACAT 저해 활성을 가지는 물질을 천연물로부터 획득하고자 하는 연구의 일환으로, 본 발명자들은 ACAT를 저해하는 활성물질을 탐색하는 과정에서 호초의 추출물 및 그로부터 분리한 래트로프렉트아마이드 에이(ractamideRetrof A), 피퍼사이드(pipercide), 피페롤레인 비(piperolein B), 피퍼차바미드 디(piperchabamide D) 및 펠리토린(pellitorine) 등의 아마이드(amide) 계열 화합물이 ACAT에 대한 우수한 저해 활성이 가지는 것을 확인하고, 상기 추출물과 화합물이 고콜레스테롤혈증에 기인하는 고지혈증, 동맥경화 등의 혈관 질환에 대한 예방 및 치료 효과를 가짐을 밝히고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 호초 추출물 또는 그로부터 분리된 래트로프렉트아마이드 에이(ractamideRetrof A), 피퍼사이드(pipercide), 피페롤레인 비(piperolein B), 피퍼차바미드 디(piperchabamide D), 및 펠리토린(pellitorine)으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 아실 코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 저해 활성을 가지는 조성물을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또다른 목적은 아실 코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 저해 활성을 가지는 호초 추출물을 분리하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 호초 추출물로부터 아실 코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 저해 활성을 가지는 아마이드계 화합물을 분리하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 아실 코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 저해 활성을 가지는 호초 추출물 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 래트로프렉트아마이드 에이(ractamideRetrof A), 피퍼사이드(pipercide), 피페롤레인 비(piperolein B), 피퍼차바미드 디(piperchabamide D) 및 펠리토린(pellitorine)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되 는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 아실 코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 저해 활성을 가지는 조성물에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 래트로프래트아마이드 에이(ractamideRetrof A), 피퍼사이드(pipercide), 피페롤레인 비(piperolein B), 피퍼차바미드 디(piperchabamide D) 및 펠리토린(pellitorine)은 상기 호초 추출물로부터 분리된 것이나, 이들 화합물은 바람직하게 화학적 합성법에 의해 합성될 수도 있다.

본 발명자는 호초의 추출물이 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제(ACAT) 저해 활성을 가짐을 발견하였으며, 따라서 그러한 추출물 중 특히 ACAT 저해 활성을 나타내는 유효 성분을 밝히고자 하였다. 이를 위하여, 본 발명자는 호초를 알코올 등의 유기 용매로 추출하여 조추출물을 얻은 후, 이를 물 및 다양한 유기 용매로 다시 분획하여 각 분획물의 ACAT 저해 활성을 측정하였다. 물 및 다양한 유기 용매로 추출한 각각의 분획물 모두가 ACAT 활성을 나타내었으나, 그로부터 ACAT 활성이 가장 높게 나타난 클로로포름 추출물을 선택하여 이로부터 여러 단계의 크로마토그래피를 수행함으로써 활성을 나타내는 화합물들을 분리하였다. 분리된 화합물의 구조 및 화학적 특성을 분석하기 위하여, 전자충격 질량분석, 수소 핵자기 공명스펙트럼, 탄소 핵자기 공명스펙트럼 등의 분석을 수행하였다.

그 결과, ACAT 활성을 가지는 유효성분이 하기 화학식 1의 래트로프렉트아마이드 에이(ractamideRetrof A), 화학식 2의 피퍼사이드(pipercide), 화학식 3의 피페롤레인 비(piperolein B), 화학식 4의 피퍼차바미드 디(piperchabamide D), 및 화학식 5의 펠리토린(pellitorine)임을 알 수 있었다. 본 발명 이전에는 이들 화합물의 ACAT 저해 활성에 대하여 밝혀진 바 없다.

아실-코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(Acyl-CoA:cholesterol acyltransferase : ACAT)는 콜레스테롤 및 패티 아실-코엔자임 A(ftty acyl-coenzyme A)로부터 콜레스테릴 에스테르(cholesteryl ester)의 형성을 촉매하는 효소이다.

본 발명에서 용어, “아실-코에이:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제(Acyl-CoA:cholesterol acyltransferase: ACAT) 저해”란 콜레스테릴 에스테르(cholesteryl ester)의 형성시키는 상기 효소 촉매 반응이 차단 또는 반응 효율이 감소되는 것을 의미한다. ACAT에 의해 촉매되는 반응은 장에서의 콜레스테롤 흡수, 지단백질을 함유하는 아포리포단백질 B(apoB)의 합성과 분비, 콜레스테롤의 세포내 저장에 필수적이며, ACAT 억제는 음식물에서의 콜레스테롤 흡수를 차단하고 간의 VLDL 흡수를 감소시켜 혈액내 콜레스테롤 수준을 감소시킨다.

ACAT와 콜레스테롤 조절과의 직접적인 관련성이 밝혀지면서, ACAT는 콜레스테롤 조절이 제대로 되지 않아서 유발되는 질환의 치료 타겟으로 연구되어져 왔다. ACAT의 선택적 저해에 의해 혈액내 콜레스테롤 수준이 감소된다는 사실에 기반하 여, 혈관내 높은 지방 수준에 의해 유도되는 뇌 혈관질환, 심장 혈관질환, 말초 혈관질환 등을 포함하는 혈관질환을 효과적으로 치료할 수 있다. 예들 들어, 과콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia)(Raal FJ et al., Atherosclerosis. 2003 Dec;171(2):273-279), 고지혈증(hyperlipidemia)(kusunoki J., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2000 Jan;20(1):171-178), 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis)(Heinonen TM., Curr Atheroscler Rep. 2002 Jan;4(1):65-70), 동맥경화증(arteriosclerosis)(Heinonen TM., Expert Opin Investig Drugs. 2002 Nov;11(11):1519-1527), 관상 동맥경화증(coronary arteriosclerosis)(Meynier A., Br J Nutr. 2002 May;87(5):447-458), 대동맥류(aortic aneurysm)(Hiatt WR et al., Vasc Med. 2004 Nov;9(4):271-277) 등의 질환을 예방 및 치료할 수 있다. 또한, ACTC를 억제하면 알츠하이머 질환에서 플라크(plaque)를 형성하는 아밀로이드-베타의 생성이 억제되므로 ATCT 억제제를 이용하여 알츠하이머를 치료할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Hutter-Paier B et al., Neuron. 2004 Oct 14; 44(2): 227-238; Puglielli L et al., J Mol Neurosci, 2004; 24(1):93-96). ACAT의 선택적 저해제를 이용하여, 상기 질환뿐만 아니라 이에 의해 유발되는 증상(symptom) 또는 합병증(complication)을 예방 및 치료할 수 있다.

본 발명에서 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 호초 추출물 또는 그로부터 분리된 상기 화합물 또는 그의 약제학적 염을 포함하는 조성물의 투여로 상기 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 용어, "치료"란 본 발명에 따른 추출물 또는 상기한 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호 전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 ACAT 저해 활성을 가지는 상기 화합물들은 천연물질, 바람직하게 호초로부터 분리할 수 있다. 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관, 예를 들어 뿌리, 줄기, 잎, 꽃, 열매 뿐만 아니라 식물 조직 배양물으로부터 분리가능하다. 또한, 당 분야의 공지된 방법으로 화학적 합성에 의해 제조될 수도 있다.

본 발명에서, 용어 “약제학적으로 허용가능한 염”이란 약리학적 또는 생리학적으로 허용되는 무기산, 유기산 및 염기로부터 유도된 염을 의미한다. 적합산 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 포함할 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 알칼리 금속, 예들 들어, 나트륨, 알칼리토금속, 예들 들어, 마그네슘, 암모늄 등을 포함할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 호초 추출물과 그로부터 상기 특정 화합물들을 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 호초 추출물은 호초를 물, 유기용매 또는 이의 혼합 용매를 이용하여 추출함으로써 얻을 수 있고, 바람직하게는 일정 시간 건조시켜 분쇄한 호초를 당 분야에서 공지된 바와 같은 냉침 추출, 가열 추출, 초음파 추출, 냉각 추출 등 다양한 추출법에 따라 추출할 수 있다. 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있 다. 이로부터 추출된 호초의 추출물로부터 활성이 높은 분획을 얻고, 이를 크로마토그래피 등의 방법에 따라 더 분리함으로써 본 발명에 따른 ACAT 활성을 갖는 상기 화합물들을 분리할 수 있다.

따라서, 바람직하게, 상기 화합물은, 호초를 물, 유기용매 또는 이의 혼합 용매를 이용하여 추출하는 단계; 및 상기 추출물을 비극성 유기 용매로 분획하는 단계; 상기 비극성 용매 가용층을 크로마토그래피하는 단계를 포함하는 방법에 의해 분리할 수 있다.

호초의 추출에 사용될 수 있는 유기용매에는, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매가 있으며, 바람직하게는 알코올, 보다 바람직하게는 메탄올, 에탄올 등의 저급 알코올 사용하여 추출할 수 있다.

일차 추출된 호초 추출물로부터 활성이 높은 분획물을 얻기 위하여, 물 및 유기용매를 사용하여 분획물을 얻었다. 상기 유기용매로는 비극성 유기 용매가 바람직하며, 특히 바람직한 것으로, 헥산, 에테르, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이드 또는 이들의 혼합 용매 등을 이용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 노말 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 물을 사용하여 각각의 분획물을 얻었으며, 이 중 클로로포름 분획물이 가장 높은 활성(89%)을 나타내었으며 물 분획물이 가장 낮은 활성(15%)을 나타내었다.

이와 같이 얻어 비극성 용매 분획물, 즉 비극성 용매 가용층에 대해 크로마토그래피를 1회 이상 순차적으로 수행함으로써 활성 성분을 분리할 수 있으며, 크로마토그래의 컬럼의 종류와 전개 용매는 다양하게 조절될 수 있다.

하나의 구체적 실시예에서, 본 발명자는 호초 추출물로부터 상기 화학식 1 내지 화학식 5에 해당하는 화합물을 분리하였다. 분말화된 호초의 건조 질량 3배에 해당하는 메탄올을 가하여 실온에서 7일간 추출한 뒤 여과 후 감압 농축하여 조추출물을 얻었다. 상기 조추출물을 노말 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 또는 물을 이용하여 각각의 분획하였다. 이를 감압 농축하고 4번에 걸쳐 크로마토그래피를 수행하였다. 실리카겔의 컬럼 크로마토그래피(n-헥산:에틸아세테이트 = (50/1 ~ 0/100)로 구성된 단계농도 구배 용매 사용), 역상 컬럼 크로마토그래피(reversed-phase column chromatography, ODS gel, 메탄올을 용매로 사용), 저압액체크로마토그래피(low pressure liquid chromatography; LPLC, LKB, 메탄올을 용매로 사용)를 수행하고, 마지막으로 고속액체 크로마토그래피 (high performance liquid chromatography; HPLC, YMC Jsphere ODS H-80 (250 ×20 ㎜))를 수행함으로써 총 5종의 순수화합물(㎎)을 분리하였다.

상기 방법으로 분리된 화합물을 전자충격 질량분석, 수소 핵자기 공명스펙트럼, 탄소 핵자기 공명스펙트럼 등으로 분석한 결과, 상기 화합물은 모두 아마이드 계열 화합물로, 화학식 1의 구조식을 가지는 래트로프렉트아마이드 에이(ractamideRetrof A), 화학식 2의 구조식을 가지는 피퍼사이드(pipercide), 화학식 3의 구조식을 가지는 피페롤레인 비(piperolein B), 화학식 4의 구조식을 가지 는 피퍼차바미드 디(piperchabamide D), 또는 화학식 5의 구조식을 가지는 펠리토린(pellitorine)인 것으로 밝혀졌다. 화학식 1내지 5에 해당하는 화학물은 모두 ACAT 저해활성을 가지며 각각의 IC₅₀ 값은 24.5, 3.7, 87.5, 11.5 40.4 μM 이다. 특히, 화학식 2의 피퍼사이드는 obovatol 보다 12 배 정도의 높은 활성을 보인다.

상기한 바와 같이, 화학식 1 내지 화합식 5의 화합물은 우수한 ACAT 저해 활성을 가지며, 이들 화합물을 모두 포함하는 호초 추출물 역시 동일한 활성을 가질 것으로 충분히 예측할 수 있다. 따라서, 이들 화합물 또는 호초 추출물은 상기에서 살펴본 이유로 뇌, 심장, 말초 혈관질환을 포함하는 혈관질환에 대한 우수한 예방 및 치료 활성을 갖는다. 또한, 알츠하이머에 대한 우수한 예방 및 치료 활성을 가짐을 할 수 있다. 상기 화합물은 인공적으로 합성된 화합물이 아니라 천연 추출물로부터 획득한 성분을 유효 성분으로 함유하므로 안전하고 독성, 부작용이 거의 없으므로 장기간의 복용이 가능하다는 장점을 가진다. 또한, 상기 조성물은 인간뿐만 아니라 뇌, 심장, 말초 혈관질환이 발생될 수 있는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물에게 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 또 하나의 양태로서, 호초 추출물 또는 그로부터 분리된 화학식 1 내지 5 의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 하나 이상 포함하는 상기 질병의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 혈관질환 예방 및 치료용 약학조성물은 조성물 총 중량에 대하여 하나 이상 선택되는 전체 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다. 또한, 상기 조 성물은 약효를 증가시키지는 않으나 약재 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가성분을 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 비타민B₁, B₂, B₆, C, E, 니아신, 카르니친, 베타인, 엽산 판토텐산, 비오틴, 아연, 철, 칼슘, 크롬, 마그네슘, 이들의 혼합물 등의 무기, 유기 첨가물들을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 단독 사용하거나 기존 사용되어진 치료 활성을 가지는 물질을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하여 경구 또는 비경구용의 인체 또는 수의용 제제로 제형화될 수 있다.

본 발명의 조성물을 제제화 할 경우에는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제한다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 추출물 또는 화합물을 포함하는 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토스(Lactose) 및 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘, 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물 및 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜 및 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

이러한 조성물은 단위-용량(1회분) 또는 다중-용량(수 회분) 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰풀 및 바이알에 제시될 수 있고, 사용 직전에 멸균성 액상 담체, 예를 들면, 주사용 수의 부가 만을 요구하는 동결-건조 조건 하에 저장할 수 있다. 즉석의 주사 용제 및 현탁제는 멸균성 산제, 과립제 및 정제로부터 제조할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 호초 추출물 또는 화학식 1 내지 화학식 5의 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물을 환자에게 투여하여 혈관질환을 예방 및 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "환자"는 세포 내에서 ACAT 활성을 억제하는 본 발명의 조성물을 투여에 의하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간과 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물을 의미한다. 호초 추출물 또는 상기 화학식 1 내지 화학식 5의 화합물에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 조성물을 환자에게 투여함으로써, 상기에서 언급한, 과콜레스테롤혈증, 고지혈증, 아테롬성 동맥경화증, 동맥경화증, 관상 동맥경화증 및 대동맥류를 포함하는 혈관질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다. 본 발명의 조성물을 기존의 상기 질환 치료제와 병 행하여 투여할 수 있다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다.

본 발명에서 용어, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성병, 연령, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 조성물은 경구투여 또는 정맥투여가 바람직하고, 일반적으로 그 유효용량은 경구투여인 경우에는 보통 성인을 기준으로 1회에 1 내지 10 ㎎/kg이 바람직하며, 정맥투여인 경우에는 1 내지 5 ㎎/kg이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에서는, 호초의 추출물 또는 그로부터 분리된 분획물 을 포함하는 건강식품 조성물을 제공한다. 상기한 바와 같은 ACAT 활성을 가지는 호초의 추출물과 그로부터 분리된 분획물은 약제학적 조성물 뿐만 아니라 일상 생활에서 간편하게 복용하여 혈관 질환 또는 알츠하이머 질환 등을 예방할 수 있는 효과를 갖는다.

바람직한 건강 식품의 형태는 당 분야에서 잘 알려진 바에 따라 제조될 수 있으며, 정제, 과립, 분말, 음료 등 다양한 형태로 제조되고 섭취될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것 일뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 효소저해 활성물질의 분리정제

발명에 사용한 호초는 대전 생약시장에서 구입하여 물로 깨끗이 세척한 후 그늘에서 건조한 후, 칼날 달린 분쇄기로 분말화 시켰다. 분말화된 호초 5 kg에 3배의 메탄올(건조된 호초 중량에 대해)을 가하여 7일간 실온에서 방치 추출한 후 여과하였다. 상기 여과액을 감압 농축하여 조추출물을 얻었다. 상기 조추출물에서 활성물질을 분리,정제하기 위하여, 노말 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 물을 이용하여 각각의 분획물로 분리하여 하기 ACAT 저해 활성을 측정하였다. 각 분획물의 일부를 건조하여 1mg/ml로 시료를 조제하여 ACAT 저해 활성을 측정한 결과, 노말 헥산 25%, 클로로포름 89%, 에틸아세테이트 55% , 물 15%로 클로르포름층에서 가장 우수한 ACAT 저해 활성이 나타내었다. 상기 1에서 얻은 클로로포름층을 감압 농축하고(157.7g), n-헥산:에틸아세테이트 = (50/1 ~ 0/100)로 구성된 단계농도 구배(step gradient) 용매 시스템을 이용하여 실리카겔의 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 활성분획을 분리하였다. 상기 분리된 활성분획의 ACAT 저해활성을 측정하여 그 중에서 가장 저해활성이 높은 분획들을 모아, 용출 용매로 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 메탄올을 사용하여 역상 컬럼 크로마토그래피(reversed-phase column chromatography, ODS gel)로 활성분획을 분리하였다. 상기 분리된 활성분획의 ACAT 저해활성을 측정하여 그 중에서 가장 저해활성이 높은 4번째 및 5번째 분획을 75% 및 80% 메탄올을 사용하여 각각 6 ㎖/분, 8 ㎖/분으로 흘려주면서 저압액체크로마토그래피(low pressure liquid chromatography, LKB)로 분리하였다. 이 중 ACAT 저해활성이 높은 4번째의 3번과 5번째의 2,4번 분획들은 75% 및 80% 메탄올을 사용하여 각각 4 ㎖/분, 6 ㎖/분 및 4 ㎖/분으로 흘려주면서, 고속액체 크로마토그래피 (high performance liquid chromatography; HPLC, YMC Jsphere ODS H-80 (250 ×20 ㎜))를 실시하여 각각 1종 및 4종 의 순수화합물(㎎)을 얻었다. 활성물질의 검출은 UV 254㎚ 및 210㎚ 에서 행하였으며, ACAT 저해활성 물질은 4번째의 3번 분획에서는 35분, 5번째의 2번 분획에서는 31분 그리고 4번 분획에서는 각각 43, 45, 53분에 용출되었다.

실시예 2: 활성물질의 구조결정

호초로부터 분리한 화합물 1-5 의 이화학적 특성은 다음과 같다.

화합물 1

(1)물질의 성상: 백색 분말상,

(2)물질의 분자식과 분자량: C₂₀H₂₅NO₃, 327

(3)전자충격 질량분석(70eV): m/z(rel. int) = 360 [M+Na]+

(4)수소 핵자기 공명스펙트럼[300MHz, 클로로포름-d₃, δ(ppm)]: 7.19 (1H, dd, J=15, 15.3 Hz, H-3), 6.87 (1H, br s, H-2'), 6.73 (1H, m, H-5' and 6'), 6.30 (1H, d, J=15.3 Hz, H-9), 6.17 (1H, dd, J=9.9, 15.3 Hz, H-4), 6.10 (1H, m, H-5), 5.98 (1H, m, H-8), 5.93 (2H, s, H-7'), 5.77 (1H, d, J=14.7 Hz, H-2), 5.59 (NH, br s), 3.16 (2H, t, J=6.6 Hz, H-1"), 2.30 (4H, m, H-6 and 7), 1.79 (1H, m, H-2"), 0.93 and 0.91 (3H, s, H-3" and 4")

(5)탄소 핵자기 공명스펙트럼 [75MHz, 클로로포름-d₃, δ(ppm)]: 20.10 (q, C-3" and 4"), 28.59 (d, C-2"), 32.15 (t, C-7), 32.81 (t, C-6), 46.90 (t, C-2"), 100.92 (t, C-7'), 105.39 (d, C-2'), 108.20 (d, C-5'), 120.36 (d, C-6'), 122.23 (d, C-2), 127.66 (d, C-8), 128.77 (d, C-4), 130.15 (d, C-9), 132.04 (s, C-1'), 140.94 (d, C-3), 141.69 (d, C-5), 146.71 (s, C-3'), 147.91 (s, C-4'), 166.27 (s, C-1)

화합물 2

(1)물질의 성상: 백색 분말상,

(2)물질의 분자식과 분자량: C₂₂H₂₉NO₃, 355

(3)전자충격 질량분석(70eV): m/z(rel. int) = 354 [M-H]+

(4)수소 핵자기 공명스펙트럼[300MHz, 클로로포름-d₃, δ(ppm)]: 7.19 (1H, dd, J=14.4, 14.7 Hz, H-3), 6.88 (1H, br s, H-2'), 6.74 (1H, m, H-5'), 6.73 (1H, br s, H-6'), 6.28 (1H, d, J=15.6 Hz, H-11), 6.13 (1H, dd, J=15.3, 15.3 Hz, H-4), 6.05 (1H, d, J=15 Hz, H-5), 6.02 (1H, d, J=15.9 Hz, H-10), 5.92 (2H, s, H-7'), 5.75 (1H, d, J=15.3 Hz, H-2), 5.56 (NH, br s), 3.16 (2H, t, J=6.6 Hz, H-1"), 2.17 (4H, m, H-6 and 9), 1.79 (1H, m, H-2"), 1.46 (4H, m, H-7 and 8),0.93 and 0.91 (3H, s, H-3" and 4")

(5)탄소 핵자기 공명스펙트럼[75MHz, 클로로포름-d₃, δ(ppm)]: 20.09 (q, C-3" and 4"), 28.27 (t, C-7), 28.60 (d, C-2"),28.90 (t, C-8), 32.64 (t, C-9), 32.75 (t, C-6), 46.89 (t, C-1"), 100.88 (t, C-7'), 105.35 (d, C-2'), 108.18 (d, C-5'), 120.20 (d, C-6'), 121.89 (d, C-2), 128.38 (d, C-4), 128.92 (d, C-10), 129.52 (d, C-11), 132.32 (s, C-1'), 141.12 (d, C-3), 142.69 (d, C-5), 146.55 (s, C-4'), 147.90 (s, C-3'), 166.31 (s, C-1)

화합물 3

(1)물질의 성상: 무색의 오일상

(2)물질의 분자식과 분자량: C₂₁H₂₉NO₃, 343

(3)전자충격 질량분석(70eV): m/z(rel. int) = 366 [M+Na]+

(4)수소 핵자기 공명스펙트럼[300MHz, 클로로포름-d₃, δ(ppm)]: 6.88 (1H, br s, H-2'), 6.74 (1H, m, H-5'), 6.73 (1H, br s, H-6'), 6.27 (1H, d, J=15.3 Hz, H-9), 6.03 (1H, dt, J=15.9, 6.9 Hz, H-8), 5.92 (2H, s, H-7'), 5.75 (1H, d, J=15.3 Hz, H-2), 3.54 (2H, t, J=5.4 Hz, H-1"), 3.38 (2H, t, J=5.5 Hz, H-5"), 2.30 (2H, t, J=7.5 Hz, H-2), 2.16 (2H, q, J=6.6 Hz, H-7), 1.61 (4H, m, H-2" and 4"), 1.54 (4H, m, H-4 and 3"), 1.45 (2H, m, H-6), 1.35 (4H, m, H-3 and 5)

(5)탄소 핵자기 공명스펙트럼[75MHz, 클로로포름-d₃, δ(ppm)]: 24.57 (t, C-3"), 25.37 (t, C-4"), 25.56 (t, C-4), 26.55 (t, C-2), 28.95 (t, C-5), 29.24 (t, C-6), 29.34 (t, C-3), 32.80 (t, C-7), 33.39 (t, C-2), 42.54 (t, C-1"), 46.67 (t, C-5"), 100.85 (t, C-7'), 105.34 (d, C-2'), 108.15 (d, C-5'), 120.14 (d, C-6'), 129.27 (d, C-8), 129.30 (d, C-9), 132.42 (s, C-1'), 146.48 (s, C-3'), 147.87 (s, C-4'), 171.37 (s, C-1)

화합물 4

(1)물질의 성상: 백색 분말상,

(2)물질의 분자식과 분자량: C₂₂H₃₁NO₃, 357

(3)전자충격 질량분석(70eV): m/z(rel. int) = 380 [M+Na]+

(4)수소 핵자기 공명스펙트럼[300MHz, 클로로포름-d₃, δ(ppm)]: 6.89 (1H, br s, H-2'), 6.83 (1H, dt, J=15.3, 7.5 Hz, H-3), 6.75 (1H, m, H-5'), 6.74 (1H, br s, H-6'), 6.28 (1H, d, J=15.9 Hz, H-11), 6.03 (1H, dt, J=15.3, 7.5 Hz, H-10), 5.93 (2H, s, H-7'), 5.75 (1H, d, J=15.3 Hz, H-2), 5.43 (NH, br s), 3.14 (2H, t, J=6 Hz, H-1"), 2.17 (4H, m, H-4 and H-9), 1.80 (1H, m, H-2"), 1.44 (4H, m, H-5 and H-8), 1.33 (4H, m, H-6 and H-7), 0.93 and 0.91 (3H, s, H-3" and H-4")

(5)탄소 핵자기 공명스펙트럼[75MHz, 클로로포름-d₃, δ(ppm)]: 20.11 (q, C-3" and 4"), 28.19 (t, C-5), 28.59 (d, C-2"), 28.93 (t, C-6), 29.02 (t, C-7), 29.30 (t, C-8), 31.97 (t, C-4), 32.84 (t, C-9), 46.81 (t, C-1"), 100.89 (t, C-7'), 105.37 (d, C-2'), 108.20 (d, C-5'), 120.18 (d, C-6'), 123.60 (d, C-2), 129.32 (d, C-10 and C-11), 132.45 (s, C-1'), 144.69 (d, C-3), 146.53(s, C-4'), 147.91(s, C-3'), 166.06(s, C-1)

화합물 5

(1)물질의 성상: 노란색 분말상,

(2)물질의 분자식과 분자량: C₁₄H₂₅NO, 223

(3)전자충격 질량분석(70eV): m/z(rel. int) = 222 [M-H]+

(4)수소 핵자기 공명스펙트럼[300MHz, 클로로포름-d₃, δ(ppm)]: 7.17 (1H, dd, J=14.7, 14.7 Hz, H-3), 6.08 (1H, m, H-4 and H-5), 5.76 (1H, d, J=14.7 Hz, H-2), 5.67 (NH, br s), 3.15 (2H, t, J=6.6 Hz, H-1"), 2.13 (2H, m, H-6), 1.88 (1H, m, H-2"), 1.40 (2H, m, H-7), 1.29 (4H, m, H-8 and H-9), 0.92 and 0.90 (3H, s, H-3" and H-4"), 0.87 (3H, s, H-10)

(5)탄소 핵자기 공명스펙트럼[75MHz, 클로로포름-d₃, δ(ppm)]: 13.96 (q, C-10), 20.09 (q, C-3' and C-4'), 22.43 (t, C-9), 28.44 (t, C-7), 28.59 (d, C-2'), 31.32 (t, C-8), 32.87 (t, C-6), 46.89 (t, C-1'), 121.76 (t, C-2), 128.18 (t, C-4), 141.19 (d, C-3), 143.10 (d, C-5), 166.40 (s, C-1)

완전히 분리, 정제된 화합물 1은 무색의 결정성 분말로, 분자량을 측정한 결과 [M+Na]⁺가 m/z 350 이었으며, 고분해 FAB-MS 에서 분자식이 C₂₀H₂₅NO₃로 추정되었다. 화합물의 자외선 흡광도를 측정한 결과 최대 흡수치가 260㎚에서 나타났으며, 295~305㎚에서 shoulder 흡수가 나타났으므로 화합물의 구조중에 컨주게이트된 디엔아미드(dienamide)가 존재할 것으로 추정하였다. 화합물의 구조를 결정하기 위한 NMR 시험중에, ¹H-NMR 스펙트럼에서는 한개의 메틸렌디옥시 프로톤(methylenedioxy proton, 5.93, s)이 관찰되었으며, δ5.7~7.3 사이에 9개의 올레핀 프로톤(olefinic proton)이 관찰되었다. 한편, δ5.59에서 -NH-의 프로톤(br s)이 관찰되었으며, δ2.30에서 두 개의 메틸렌 프로톤(methylene proton)이 관찰되었다. 또한, δ3.15에서 -NH-와 결합하는 메틸렌 프로톤, δ1.79의 메틴 프로톤(methine proton) 그리고 δ0.93 과 δ0.91에서는 메틸 프로톤이 관찰되었으며, 이 프로톤들 로부터 아이소 부틸기(isobuthyl group)의 존재를 추정할 수 있었다(도 1, 도 2 및 도 3). 상기 측정 결과는 아미드(amide) 결합을 구조 중 에 포함하는 래트로프렉트아마이드 에이(ractamideRetrof A)의 구조와 아주 유사하므로, 발표된 문헌(Park, I.K., Lee, S.G., Shin, S.C., Park, J.D. and Ahn, Y.J. 2002. Larvividal activity of isobuthylamides identified in Piper nigrum fruits against three mosquito species: J Agric Food Chem 50, 1866-1870)의 데이타와 비교 분석한 결과, 화학식 1의 화합물은 래트로프렉트아마이드 에이로 판명하였다.

완전히 분리, 정제된 화합물 2 는 무색의 결정성 분말로, 분자량을 측정한 결과 [M-H]⁺가 m/z 354 이었으며, 고분해 FAB-MS 에서 분자식이 C₂₂H₂₉NO₃로 추정되었다. 화합물의 자외선 흡광도를 측정한 결과는 화합물 1과 유사하여 컨주게이트된 디엔아미드(dienamide)가 존재할 것으로 추정하였으며, ¹H-NMR 스펙트럼에서는 δ1.46에서 두 개의 메틸렌 프로톤(methylene proton) 관찰을 제외하고는 화합물 1의 NMR 스펙트럼과 유사하였다. 상기 측정 결과는 아미드(amide) 결합을 구조 중 에 포함하는 피퍼사이드(Pipercide)의 구조와 아주 유사하므로, 발표된 문헌(Park, I.K., Lee, S.G., Shin, S.C., Park, J.D. and Ahn, Y.J. 2002. Larvividal activity of isobuthylamides identified in Piper nigrum fruits against three mosquito species: J Agric Food Chem 50, 1866-1870)의 데이타와 비교 분석한 결과, 화학식 2의 화합물은 피퍼사이드로 판명하였다.

완전히 분리, 정제된 화합물 3은 무색의 오일상으로, 분자량을 측정한 결과 [M+Na]+가 m/z 366 이었으며, 고분해 FAB-MS 에서 분자식이 C₂₁H₂₉NO₃로 추정되었다. 화합물의 자외선 흡광도를 측정한 결과 최대 흡수치가 260㎚에서 나타났으며, 화합물의 구조중에 디엔아미드(dienamide)가 존재할 것으로 추정하였다. 화합물의 구조를 결정하기 위한 NMR 시험중에, ¹H-NMR 스펙트럼에서는 한개의 메틸렌디옥시 프로톤(δ5.92, s)이 관찰되었으며, δ6.0~7.0 사이에 5개의 올레핀 프로톤이 관찰되었다. 한편, δ3.54, δ3.38 에서 -N-과 결합하는 메틸렌 프로톤이 관찰되었으며, δ2.30, δ2.15에서 두 개의 메틸렌 프로톤과 δ1.31~1.67 사이에 14개의 메틸렌 프로톤이 관찰되었다. (도 2, 도 3 및 도 4). 상기 측정 결과로부터 구조 중 에 피페리딘 (piperidine)을 포함하는 피페롤레인 비(piperolein B)의 구조와 아주 유사하므로, 발표된 문헌(Kiuchi, F., Nakamura, N., Tusda, Y., Kondo, K. and Yoshimura, H. 1988. Studies on crude drugs effective on visceral larva migrans. IV. isolation and identification of larvicidal priciples in pepper: Chem Pharm Bull 36(7), 2452-2465)의 데이타와 비교 분석한 결과, 화학식 3의 화합물은 피페롤레인 비로 판명하였다.

완전히 분리, 정제된 화합물 4는 무색의 결정성 분말로, 분자량을 측정한 결과 [M+Na]+가 m/z 380 이었으며, 고분해 FAB-MS 에서 분자식이 C₂₂H₃₁NO₃로 추정되었다. 화합물의 자외선 흡광도를 측정한 결과 최대 흡수치가 260㎚에서 나타났으며, 295~305㎚에서 shoulder 흡수가 나타났으므로 화합물의 구조중에 컨주게이트된 디엔아미드(dienamide)가 존재할 것으로 추정하였다. 화합물의 구조를 결정하기 위한 NMR 시험중에, ¹H-NMR 스펙트럼에서는 한개의 메틸렌디옥시 프로톤(methylenedioxy proton, 5.93, s)이 관찰되었으며, δ5.7~7.3 사이에 7개의 올레핀 프로톤(olefinic proton)이 관찰되었다. 또한, δ1.30~1.50 사이에 4개의 메틸렌 프로톤(methylene proton)이 관찰되었으며, 화합물1의 NMR 스펙트럼과 유사하였다(도 2, 도 3 및 도 4). 상기 측정 결과는 아이소 부틸기(isobuthyl group)를 가지며, 아미드(amide) 결합을 구조 중 에 포함하는 피퍼차바미드 디(piperchabamide D)의 구조와 아주 유사하므로, 발표된 문헌(Morikawa, T., Matsuda, H., Yamaguchi, I., Pongpiriyadacha, Y. and Yishikawa, M. 2004. New amides and gastroprotective constituents from the fruit of Piper chaba: Planta Med 70, 152-159)의 데이타와 비교 분석한 결과, 화학식 4의 화합물은 피퍼차바미드 디로 판명하였다.

완전히 분리, 정제된 화합물 5는 짙은 노란색의 결정성 분말로, 분자량을 측정한 결과 [M-H]+가 m/z 222 이었으며, 고분해 FAB-MS 에서 분자식이 C₁₄H₂₅NO로 추정되었다. 화합물의 자외선 흡광도를 측정한 결과 최대 흡수치가 260㎚에서 나타났으며, 295~305㎚에서 shoulder 흡수가 나타났으므로 화합물의 구조중에 컨주게이트된 디엔아미드(dienamide)가 존재할 것으로 추정하였다. 화합물의 구조를 결정하기 위한 NMR 시험중에, ¹H-NMR 스펙트럼에서는 δ5.7~7.3 사이에 4개의 올레핀 프로톤(olefinic proton)이 관찰되었으며, δ5.67에서 -NH-의 프로톤(br s)이 관찰되었다. 한편, δ3.15 과 δ2.13에서 각각 한 개씩의 메틸렌 프로톤, δ1.20~1.45 사이에 3개의 메틸렌 프로톤 그리고 δ1.88의 메틴 프로톤(methine proton)이 관찰되 었다. 또한, δ0.87, δ0.90 그리고 δ0.92에서는 3개의 메틸 프로톤이 관찰되었다. 상기 측정 결과로부터 화합물 5는 아이소 부틸기는 가지고 있으나 메틸렌다이옥시벤질기는 가지지 않는 펠리토린 (pellitorine)으로 추정하였으며, 발표된 문헌(Park, I.K., Lee, S.G., Shin, S.C., Park, J.D. and Ahn, Y.J. 2002. Larvividal activity of isobuthylamides identified in Piper nigrum fruits against three mosquito species: J Agric Food Chem 50, 1866-1870)의 데이타와 비교 분석한 결과, 화학식 5의 화합물은 펠리토린으로 판명하였다.

실시예 3: ACAT 효소원의 제조

제조원으로는 흰쥐 (Male Sprague - Dawley rats 250 -300 g)의 간을 분리하여 microsome buffer A (0.25 M sucrose, 1 mM EDTA, 0.01 M Tris-HCl, pH 7.4)로 세척하고 가위로 적당히 세절하고 테플론-글라스 호모게나이저(teflon-glass homogenizer)로 균질화 하였다. 균질액을 14,000 x g에서 15분 동안 원심 분리하여 상등액을 모아 이 상등액을 다시 100,000 x g에서 1시간 동안 원심 분리하였다. ACAT이 포함된 microsome 분리를 위해 원심분리한 침전물을 microsome buffer B (0.25 M sucrose, 0.01 M Tris-HCl, pH 7.4)를 가하여 100,000 x g에서 1시간동안 다시 원심 분리하였다. 시험시 효소원의 단백질 농도의 균일화를 위하여 원심분리된 침전물에 microsome buffer B를 적당히 가하여 용해시키고 단백질 표준물질로 BSA(bovine serum albumin) 을 사용하여 Lowry 방법에 의해 단백질 농도를 결정한 후, 효소원은 microsome buffer B로 희석하여 단백질 농도를 10 ㎎/㎖로 조정하여 1 ㎖ 바이알에 분주하여 -70 ℃에서 보관하면서 시험에 사용하였다.

실시예 4: ACAT 효소활성측정

ACAT 효소활성측정은 [1-¹⁴C]올레오일-코에이를 기질로 하여 김 등의 방법을 일부 수정하여 사용하였다 [Kim Y. K, H. W. Lee, K. H Son, B. M Kwon, T. S Jeong, D. H Lee, J H Shin, Y W. Seo , S. U. Kim, S. H. Bok 1996. GERI-BP002-A, Novel inhibitors of acyl-CoA:cholesterol acyltransferase produced by Aspergillus fumigatus F93: J. Antibiotics 49:31-36]. 반응 용액으로는 10.0 ㎕ 시료액, 4.0 ㎕ 쥐의 간 조직의 마이크로솜 효소 (liver microsomal enzyme), 20.0 ㎕ 반응 완충액 (assay buffer) [0.5 M KH₂PO₄, 10 mM DTT, pH 7.4], 농도가 40 ㎎/㎖의 소 혈청 알부민 (essentially fatty acid free) 15.0 ㎕, 20 ㎎/㎖ 농도의 콜레스테롤 2.0 ㎕, 증류수 41.0 ㎕ 를 가하여 37 ℃에서 20분간 예비 반응시키고, 이 효소반응액에 [1-¹⁴C]올레오일-코에이 (0.05 μCi, 최종농도 10 μM) 8.0 ㎕를 첨가하여 효소 본반응을 위하여 37 ℃에서 25 분간 반응시킨 후 이소프로판올-헵탄 (4 : 1 ; v / v) 1 ㎖을 가하여 효소반응을 정지시키고, 헵탄 0.6 ㎖과 5배로 희석한 어세이 버퍼 0.4 ㎖을 첨가한 후 유기용매의 분리가 용이하도록 원심분리를 행하였다. 효소 활성의 측정은 원심 분리하여 얻은 상층액 100 ㎕에 리포루마 신틸레이션 칵테일 (scintillation cocktail) 3 ㎖를 가한 후 잘 섞어 리퀴드 신틸레이션 카운터 (liquid scintillation counter)를 이용하여 방사능 (radioactivity)을 측정하였다.

ACAT 저해도는 방사능으로 표지한 기질과 효소에 검색시료를 넣어 반응된 생성물의 양을 방사능 측정장치를 사용하여 측정하였고, 다음 수학식 1로 활성 저해도를 계산하였다.

% 활성저해도=100×[1-CPM(T)-CPM(C2)/CPM(C1)-CPM(B)]

CPM (T) : 시료와 효소를 넣었을 때의 CPM

CPM (C1) : 시료는 넣지 않고, 효소는 넣었을 때의 CPM

CPM (C2) : 시료는 넣고, 효소는 넣지 않았을 때의 CPM

CPM (B) : 효소와 시료를 넣지 않았을 때의 CPM

이때 공시험은 0℃에서 반응시켰다. 양성 대조군으로는 obovatol을 사용하였으며, ACAT 저해활성을 측정한 결과 IC₅₀값은 44 μM이고, 화학식 1, 2, 3, 4, 5로 표시되는 아마이드계 화합물의 IC₅₀값은 24.5, 3.7, 87.5, 11.5, 40.4 μM 로 나타났고 화합물은 효소에 농도 의존적인 저해활성을 보여 주었다(도 6, 도7).

ACAT 저해활성 물질은 소장에서 콜레스테롤의 체내 흡수를 저해하여 혈중 콜레스테롤 농도를 저하시키는데 유효하며, 간장에서 VLDL의 합성을 저해하여 혈중의 LDL 콜레스테롤 저하, 혈관내의 동맥경화 병변에서 동맥경화의 진전에 관여하는 콜 레스테롤 아실화를 저해하여, 고콜레스테롤혈증에 기인하는 고지혈증, 동맥경화 등 각종 심혈관 질환의 예방 및 치료용 의약품으로 유용하게 사용될 수 있다.

실시예 5: 정제의 제조

피퍼사이드- 1 g

락토스 - 7 g

결정성 셀룰로오스 - 1.5 g

마그네슘 스테아레이트 - 0.5 g

총 량 - 10 g

상기에서 나열된 성분들을 잘 혼합한 후 직타법 (direct tableting method)에 의해 정제를 제조하였다. 각 정제의 총량은 100 ㎎이고, 그 중 유효성분의 함량은 10 ㎎이다.

실시예 6: 분말제의 제조

피퍼사이드 - 1 g

옥수수 전분 - 5 g

카르복시 셀룰로오스 - 4 g

총 량 - 10 g

상기에 나열된 성분들을 잘 혼합하여 분말을 제조하였다. 경질 캡슐에 분말 100 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이,래트로프렉트아마이드 에이(ractamideRetrof A), 피퍼사이드(pipercide), 피페롤레인 비(piperolein B), 피퍼차바미드 디(piperchabamide D) 및 펠리토린(pellitorine)으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 우수한 아실 코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(ACAT)를 효과적으로 저해하므로 고지혈증, 동맥경화 등의 혈관 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

또한, 상기 화합물들을 분리, 정제하기 전 이들 화합물을 모두 포함하는 호초의 추출물과 그로부터 분리된 분획물 또한 상기와 동일한 활성을 가짐은 당연하며, 이러한 추출물의 경우, ACAT 저해활성을 가지는 약제학적 조성물 뿐만 아니라 일상 생활에서 간편하게 복용할 수 있는 건강식품 형태로도 효과적으로 이용될 수 있다.

Claims

호초 추출물 또는 그의 비극성 유기용매 분획물을 포함하는 아실 코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 저해 활성을 가지는 조성물.
제 1 항에 있어서, 호초 추출물은 호초를 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출한 것인 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올 또는 이들의 혼합물인 조성물.
제 1 항에 있어서, 비극성 유기용매 분획물은 호초 추출물을 헥산, 에테르, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합 용매로 분획한 것인 조성물.
호초를 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 냉침 또는 가온 추출하여 추출물을 얻는 것을 포함하는 아실 코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 활성을 가지는 호초 추출물의 제조 방법.
제6항에 있어서, 얻어진 추출물에 헥산, 에테르, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합 용매를 이용하여 분획하는 것을 더 포함하는 호초 추출물의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 혈관 질환 또는 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 건강식품 조성물.
화학식 1 내지 화학식 5의 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 아실 코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 저해 활성을 가지는 조성물.

화학식 1

화학식 2

화학식 3

화학식 4

화학식 5
제 10 항에 있어서, 혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제 11 항에 있어서, 심장혈관 또는 말초혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제 12 항에 있어서, 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia), 고지혈증(hyperlipidemia), 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis), 동맥경화 증(arteriosclerosis), 관상 동맥경화증(coronary arteriosclerosis) 또는 대동맥류(aortic aneurysm)의 예방 또는 치료용 조성물.
제 10 항에 있어서, 알츠하이머의 예방 또는 치료용 조성물.
a) 호초를 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 추출물을 얻는 단계,

b) 얻어진 추출물로부터 물 또는 비극성 유기 용매를 이용하여 분획물을 얻는 단계, 및

c) 상기 분획물을 분리, 정제하는 것을 포함하는,

호초로부터 제 10 항에 기재된 화학식 1 내지 화학식 5의 화합물 중 하나 이상의 화합물을 분리하는 방법.
제 15 항에 있어서, 단계 a)의 유기용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 방법.
제 16 항에 있어서, 유기용매가 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올 또는 이들의 혼합물인 방법.
제 15 항에 있어서, 단계 b)의 비극성 유기용매는 헥산, 에테르, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합 용매인 방법.
제 15 항에 있어서, 상기 비극성 유기용매가 클로로포름 또는 에틸아세테이트인 방법.
제 15 항에 있어서, 단계 c)의 분리, 정제는 크로마토그래피 과정을 포함하는 것인 방법.