CN101226201B - 活化部分凝血活酶时间(aptt)测定试剂 - Google Patents

活化部分凝血活酶时间(aptt)测定试剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种医学临床检验方面止血与血栓方面的检测试剂，特别是一种可用于测定血浆中活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂，其特征是：该试剂由下述的原料配置而成：试剂固体激活剂0.05～0.5g/l；磷酯20～200mg/l；二价金属离子盐0.1～10m mol/l；稳定剂0.1-0.5g/l；聚乙二醇PEG0.1～10g/l；缓冲剂0.05～4.0g/l；复兴剂2.0～5.0g/l；其余是水。它是一种满足APTT测定的高稳定性标准试剂，其操作简单，价格合适以及活化时间短、且灵敏度高。

Description

活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂
技术领域
本发明涉及一种医学临床检验方面止血与血栓方面的检测试剂，特别是一种可用于测定血浆中活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂。
背景技术
在临床检验方面，临床实验室对于止血与血栓方面的检测广泛用于出血、血栓性疾病及血栓前状的诊断，疗效观察，抗凝药剂量监测和预后分析。随着科学技术的发展和基础医学研究的进步，人们对止血与血栓的发生和发展认识越来越深刻，其检测手段越来越先进，其中一个显著的特点是凝血仪的迅速发展和在血栓与止血检测方面的广泛应用。
一个血浆试样的活化部分凝血活酶时间(APTT)可用于判断内源性凝血活性机制是否处于正常状态，如血友病A，使APTT延长，显示为缺乏凝血因子VIII。APTT检测常常还可以附带检测肝病治疗。因此，对其准确，快速测检意义重大。
测定APTT的试剂含一种活性剂(activator)，引发内在血块延续递增，直至形成活性因子IX，活化因子X需要磷脂，这也应包适在一个APTT试剂中，使血浆试样与试剂接触，经过短时间活化之后，再添加钙并测出形成血纤蛋白凝块时间，对APTT测定系统的要求是APTT试剂操作简单、稳定并且价格合理，实验获得APTT参数要可靠。现行的测定APTT试剂作为内源性凝血诱发剂大多是表面活性材料。作为液体活性材料有鞣花酸和它的衍生物，此类活性材料对肝素的灵敏度低。作为固体活化材料如高岑土，硅藻土等，其缺点是内源血块活化时间长，需要较长的潜伏期。况且这些固体活性材料均为天然矿物材料，其品质的一致性、均匀性都有可能影响测定结果，加之要求它们以悬浮物态存在，如出现沉淀能导致结块时间延长，并且会使血凝仪测定终止点发生差错。
发明内容
本发明目的是提供一种活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂，它是一种满足APTT测定的高稳定性标准试剂，其操作简单，价格合适以及活化时间短、且灵敏度高。
本发明的目的是这样实现的，研制一种活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂，其特征是：该试剂由下述的原料配制而成：试剂固体激活剂0.05～0.5g/L；磷脂20～200mg/L；二价金属离子盐0.1～10m mol/L；稳定剂0.1-0.5g/L；聚乙二醇PEG 0.1～10g/L；缓冲剂0.05～4.0g/L；复兴剂2.0～5.0g/L；其余是水。
所述的磷脂是指源于兔脑的脑磷脂或者牛脑的脑磷脂，特别是来源于脑髓中灰质部分。
所述的试剂固体激活剂是纳米二氧化硅，为亲水性二氧化硅，其比表面积大于140m2/g以上，其颗粒直径在15-6nm之间，最佳的比表面积是200-210m2/g，颗粒直径为10-12nm。
所述的二价金属离子盐是二价金属离子的硫酸盐或氯盐。
所述的硫酸盐是CuSO4、NiSO4、ZnSO4、MnSO4、MgSO4，氯盐是CuCl2、ZnCl2、MgCl2。
所述的稳定剂是牛血清血白蛋白。
所述的缓冲剂是指N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸-甘氨酸缓冲剂，三羟甲基氨基甲烷-盐酸。
所述的聚乙二醇是指的聚合度在2000～8000之间的聚乙二醇，最佳聚合度在4000～6000之间。
所述的复兴剂是甘露醇、海藻糖。    
所述的试剂的制备方法如下：
称取0.05～2.0g N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸和0.1～4.0g甘氨酸于400mL无菌蒸馏水中，搅拌溶解，用稀氢氧化钠或稀盐酸调整pH至7.30，定容至700mL，加纳米二氧化硅0.05～0.5g，在磁力搅拌器上搅拌混合均匀，加20～200mg兔脑磷脂提取液，搅拌30min，充分混合均匀，再加入0.1～10mmol MnCl220mL，1％牛血清血白蛋白0.1-0.5g，聚乙二醇0.1～10g，搅拌，放置4h以上即为液态测试APTT试剂，再加入2.0～5.0g甘露醇，其余用水补足，使其体积为1L，即为测定活化部分凝血活酶时间APTT的试剂；冻干保存。
本发明的特点是：本发明是用于测定活化部分凝血活酶时间(APTT)的试剂以及这种试剂的制备方法和测定血浆试样中活化部分凝血活酶时间(APTT)的测定方法。本发明的测定APTT试剂由各组分构成，固态激活剂纳米二氧化硅，进一步激活X因子的磷脂及二价金属离子，如CuSO4、NiSO4、ZnSO4、MnSO4、MgSO4，以及保持测试体系处于适当pH的缓冲液如N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸-甘氨酸缓冲剂，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲剂，为提高激活剂分散性和均匀性的聚乙二醇，以及为便于长期保存的稳定剂牛血清血白蛋白和复兴剂甘露醇、海藻糖。
试剂中纳米二氧化硅溶液为0.05～0.5g/L，要求其为亲水性。试剂中20～200mg/L的磷脂，这是实验可重复性高所需要的，该磷脂为混合物。为了进一步缩短凝血时间实现快速测定，有必要加入水溶性好的二价金属离子，为阻止氧化提高试剂在冻干及保存过程中的稳定性，可加入一定量的牛血清白蛋白。
如果缺少这些组分或组成不在权利要求的浓度范围之内，则会由于凝血过快或过慢，无法准确测定准确时间。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅限于以下实施例。
实施例1：称取1.15g N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸和2.25g甘氨酸于400mL无菌蒸馏水中，搅拌溶解，用pH计测定pH在7.30，否则用稀氢氧化钠或稀盐酸调整至7.30，加水至700mL，加纳米二氧化硅0.12g，在磁力搅拌器上搅拌混合均匀，加100mg兔脑磷脂，搅拌30min，充分混合均匀，再加入0.1m mol.L-1MgCl220mL，1％牛血清血蛋白0.1g，聚乙二醇3.0g，搅拌，放置4h以上即为液态测试APTT试剂，为了便于保存，运输，可加入5g复兴剂甘露醇，冻干保存。
实施例2：称取2.0g三羟甲基氨基甲烷和10％的盐酸1.0mL于400mL无菌蒸馏水中，搅拌溶解，用pH计测定pH在7.30，否则用稀氢氧化钠或稀盐酸调整至7.30，加水至700mL，加纳米二氧化硅0.5g，在磁力搅拌器上搅拌混合均匀，加200mg牛脑磷脂，搅拌30min，充分混合均匀，再加入0.5mmol.L-1MgSO420mL，1％牛血清血蛋白0.5g，聚乙二醇3.0g，搅拌，放置4h以上即为液态测试APTT试剂，为了便于保存，运输，可加入4.0g复兴剂海藻糖，冻干保存。
实施例3：
称取0.05g N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸和0.1g甘氨酸于400mL无菌蒸馏水中，搅拌溶解，用pH计测定pH在7.30，否则用稀氢氧化钠或稀盐酸调整至7.30，加水至700mL，加入不同特性的纳米二氧化硅0.05g，在磁力搅拌器上搅拌混合均匀，加20mg兔脑磷脂，搅拌30min，充分混合均匀，再加入0.5mmol.L-1MnSO420mL，1％牛血清血蛋白0.3g，聚乙二醇0.1g，搅拌，放置4h以上即为液态测试APTT试剂。
不同特性的纳米二氧化硅对APTT的影响如下：
1.二+氧化硅亲水性对APTT时间的影响
纳米二氧化硅的加工与制造过程中，对二氧化硅进行了不同的改性，有疏水性和亲水性之分。本发明中所涉及的纳米二氧化硅必须是亲水性的，一方面是为了在水溶液中具有较好的悬浮性和均匀性，另一方面是为了保证APTT测值的准确性。
2.二氧化硅粒径和表面积对APTT的影响
纳米二氧化硅的表面积及粒径大小直接关系到固体激活剂的活性大小，测定APTT的试剂中作为诱发剂所含有纳米二氧化硅在N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸-甘氨酸缓冲剂(pH7.30)中用不同混合比，不同的用量，不同粒径和不同表面积，并且每升中加有脑磷脂提取液100ml，取正常混合血浆及经生理盐水按50％稀释的血浆(视为异常)0.1mL，与0.1mL试剂混合，在37℃下预热3分钟，后加入0.1mL0.025mol.L-1CaCl2溶液，在PK-II型血凝仪(中山市培康医疗电子器械厂)测量达到凝固点的时间，由表1表明。
表1纳米二氧化硅比表面积对APTT测定的作用
  SiO2比表面积(m2/g)     50     90     140     200     210     220
  粒子直径(nm)APTT(NP)APTT(AP)     3552102     223765     153353     123250     103251     73352
表1表示SiO2比表面积及颗粒直径对APTT测值有影响，随比表面积的增加、颗粒直径的减小明显缩短了血浆的凝结时间，当比表面积大于140m2/g、颗粒直径小于15nm时，试剂中纳米SiO2不但改善了敏感性，而且测值趋于稳定。纳米二氧化硅的最佳的颗粒直径为10-12nm，最佳比表面积为200-210m2/g。
3.纳米二氧化硅用量的影响
选用比表面积为140m2/g的二氧化硅，加入不同用量，对APTT测值也有一定影响，结果如表2。
表2纳米二氧化硅用量的影响
  纳米SiO2用量(mg/L)   0.005   0.01   0.02   0.05   0.1   0.2   0.5
  APTT(NP)APTT(AP)   4766   4260   3856   3457   3356   3257   3355
实施例4：
称取1.15g N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸和2.25g甘氨酸于400mL无菌蒸馏水中，搅拌溶解，用pH计测定pH在7.30，否则用稀氢氧化钠或稀盐酸调整至7.30，加水至700mL，加入比表面积为140m2/g，粒经为15nm的亲水性纳米二氧化硅0.12g，在磁力搅拌器上搅拌混合均匀，加100mg兔脑磷脂，搅拌30min，充分混合均匀，再加入0.05mmol.L-1CuSO4、或NiSO4、或ZnSO420mL，1％牛血清血蛋白0.5g，聚乙二醇10g，搅拌，放置4h以上即为液态测试APTT试剂，纳米二氧化硅对VIII因子的敏感性的影响如下：
选定一个对VIII因子的敏感性曲线，参照试样，用缺VIII因子标准血浆实验，用生理盐水按几何比进行稀释。0.1mL这种稀释血浆与0.1mL配制试剂混合，在37℃下预热3分钟，同时加0.1mL0.025mol.L-1CaCl2溶液，测定凝固时间，测定结果如表3。
表3对VIII因子的敏感性
  VIII因子(相对％)   凝结时间
  100502512.56.25   577295103112
实施例5：
称取1.15g N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸和2.25g甘氨酸于400mL无菌蒸馏水中，搅拌溶解，用pH计测定pH在7.30，否则用稀氢氧化钠或稀盐酸调整至7.30，加水至700mL，加入比表面积140m2/g，粒经15nm的亲水性纳米二氧化硅0.12g，在磁力搅拌器上搅拌混合均匀，加100mL兔脑磷脂，或脑髓中灰质部分，其灵敏度最高，搅拌30min，充分混合均匀，再分别加入0.05mmol.L-1CuCl2、或ZnCl2、或NiSO4、或MnSO4、或MgSO420mL，1％牛血清血蛋白0.5g，聚乙二醇3.0g，搅拌，放置4h以上即为液态测试APTT试剂，不同离子对APTT敏感性的影响结果如表4。
表4不同金属离子对APTT测值的影响
  金属离子   Cu2+   Zn2+   Mg2+   Ni2+   Mn2+
  APTT(NP)APTT(AP)   3543   3348   3340   3451   3253

Claims (3)

1.活化部分凝血活酶时间APTT测定试剂，其特征是：该试剂由下述的原料配置而成：试剂固体激活剂0.05～0.5g/L；磷脂20～200mg/L；二价金属离子盐0.1～10mmol/L；稳定剂0.1-0.5g/L；聚乙二醇PEG 0.1～10g/L；缓冲剂0.05～4.0g/L；复兴剂2.0～5.0g/L；其余是水；所述的磷脂是指源于兔脑的脑磷脂或者牛脑的脑磷脂；所述的试剂固体激活剂是纳米二氧化硅，并为亲水性二氧化硅，其比表面积大于140m2/g以上，其颗粒直径在15-6nm之间；所述的二价金属离子盐是指二价金属离子的硫酸盐或氯盐；所述的硫酸盐是CuSO4、NiSO4、ZnSO4、MnSO4、MgSO4，氯盐是CuCl2、Zn Cl2、Mg Cl2；所述的稳定剂是牛血清血白蛋白；所述的缓冲剂是指N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸-甘氨酸缓冲剂，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲剂；所述的复兴剂是甘露醇、海藻糖。
2.根据权利要求1所述的活化部分凝血活酶时间APTT测定试剂，其特征是：所述的聚乙二醇是指的聚合度在2000～8000之间的聚乙二醇。
3.根据权利要求1所述的活化部分凝血活酶时间APTT测定试剂，其特征是：所述的试剂的制备方法如下：
称取0.05～2.0g N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸和0.1～4.0g甘氨酸于400mL无菌蒸馏水中，搅拌溶解，用稀NaOH或稀盐酸调整pH至7.30，定容至700mL，加纳米二氧化硅0.05～0.5g，在磁力搅拌器上搅拌混合均匀，加20～200mg兔脑磷脂，搅拌30min，充分混合均匀，再加入0.1～10mmol MnCl220mL，1％牛血清血白蛋白0.1-0.5g，聚乙二醇0.1～10g，搅拌，放置4h以上即为液态测试APTT试剂，再加入2.0～5.0g甘露醇，其余用水补足，使其体积为1L，即为测定活化部分凝血活酶时间APTT的试剂；冻干保存。
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