CN101198702B

CN101198702B - 产生l-苏氨酸的方法

Info

Publication number: CN101198702B
Application number: CN2006800215948A
Authority: CN
Inventors: 辻雄一郎; 加藤直人; 小山直人; 城永佑志
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2005-06-29
Filing date: 2006-06-29
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2026-06-29
Also published as: WO2007001097A1; KR101059380B1; EP1896599A1; RU2402610C2; DE602006008306D1; RU2008103198A; JP2007037533A; BRPI0613059B1; CN101198702A; KR20080024226A; ES2330257T3; EP1896599B1; PL1896599T3; BRPI0613059A2

Abstract

本发明描述用于产生L-苏氨酸的方法，其包括以下步骤：将具有产生L-苏氨酸的能力、属于埃希氏菌属的微生物培养在包含碳源、氮源和硫源的发酵培养基中，和收集L-苏氨酸，其中调节所述培养基中的硫浓度从而使其处于预定水平或更低。

Description

产生L-苏氨酸的方法

技术领域

本发明涉及用于发酵工业中的技术。更具体而言，本发明涉及通过使用埃希氏菌属(Escherichia)细菌的发酵有效产生L-苏氨酸的方法。L-苏氨酸是必需氨基酸之一，并且作为用于医学目的的营养混合物中的成分是有用的。还将其以多种方式使用作为动物饲料添加剂，和作为制药工业和化学工业中的反应剂。

背景技术

L-氨基酸例如L-苏氨酸和L-异亮氨酸是通过使用产生氨基酸的细菌的发酵以工业方法产生的，所述细菌例如具有产生这些L-氨基酸的能力的棒状杆菌型细菌(coryneform bacteria)或埃希氏菌属细菌。作为这些产生氨基酸的细菌，使用从自然界分离的细菌菌株或这些细菌菌株的人工突变体。使用细菌菌株的重组体以改进生产力(productivity)，所述重组体中通过基因重组等增强了L-氨基酸生物合成酶。

具体而言，产生L-苏氨酸的埃希氏菌属细菌的突变菌株是已知的，例如6-二甲基氨基嘌呤(6-dimethylaminopurine)抗性菌株(Japanese Patent Laid-open(Kokai)No.5-304969)和疏螺旋体素(borrelidin)抗性菌株(国际专利公开WO98/04715)。使用重组埃希氏菌属细菌产生L-苏氨酸的方法是已知的，具体而言在使用的菌株中通过使用质粒来扩增苏氨酸操纵子(US5，175，107)，或在使用的菌株中通过使用质粒来扩增磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和天冬氨酸酶基因(美国专利申请号2002/0110876)。

作为大肠杆菌中涉及L-苏氨酸生物合成的酶的编码基因，已知天冬氨酸激酶III基因(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(aspartate semialdehydedehydrogenase gene)(asd)、天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶基因(thrA)、高丝氨酸激酶基因(thrB)和苏氨酸合酶基因(thrC)等。thrA、thrB和thrC(thrABC)构成苏氨酸操纵子。苏氨酸操纵子形成弱化子结构(attenuator structure)，并且其在培养基中的表达受异亮氨酸和苏氨酸抑制。已知将此弱化区的前导序列或弱化子从苏氨酸操纵子去除时，发酵产率得到改进(美国专利号5,538,873，Biotechnology Letters，Vol.24，No.21，November 2002，和国际专利公开WO05/049808)。

迄今为止，已经开发的用于产生L-苏氨酸的方法包括使用：分批培养，其使用初始含有所有营养物的发酵罐；补料分批培养，其使用初始含有预定营养物并且用一种或多种额外营养物进行连续补料的发酵罐(美国专利号5,538,873和欧洲专利号593792)；和调节糖浓度的方法，从而使糖浓度保持在预定水平或更低(国际专利公开WO05/014840和国际专利公开WO05/014843)。此外，已开发的产生L-苏氨酸的其它方法是对培养基进行补料的方法，或向培养基添加营养物的方法，从而将磷酸和碳源作为生长限制因子(美国专利号5,763,230)。

硫是细菌细胞生长的必需因子，并且通常以硫酸铵的形式包含在用于L-苏氨酸发酵的培养基中。然而，就L-苏氨酸的发酵产生而言，在发酵培养基中调节硫浓度和降低硫浓度的作用是未知的。

发明内容

本发明的目的是提供通过使用具有产生L-苏氨酸的能力的埃希氏菌属细菌有效产生L-苏氨酸的方法。

本发明的发明人进行了勤勉地研究从而达到了前述目的。结果，本发明人发现培养基中的硫浓度能够影响发酵结果，并且能够通过调节发酵培养基中的硫浓度以使其保持在预定水平或更低来改进发酵期间L-苏氨酸的产率，并且由此完成本发明。

本发明的目的是提供产生L-苏氨酸的方法，其包括：在含有碳源、氮源和硫源的发酵培养基中培养具有产生L-苏氨酸的能力、属于埃希氏菌属的微生物；和从培养物中收集L-苏氨酸，其中调节所述培养基中的硫浓度以使其处于预定水平或更低。

本发明的又一目的是提供如上所述的方法，其中调节所述发酵培养基中的硫浓度从而使其为0.35g/L或更低。

本发明的又一目的是提供如上所述的方法，其中所述微生物是大肠杆菌。

本发明的又一目的是提供如上所述的方法，其中对所述微生物中的L-苏氨酸生物合成酶进行修饰，从而使该酶不受到L-苏氨酸的反馈抑制。

本发明的又一目的是提供如上所述的方法，其中所述L-苏氨酸生物合成酶选自下组：天冬氨酸激酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶和它们的组合。

本发明的又一目的是提供如上所述的方法，其中所述硫源选自下组：硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐、半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽和它们的组合。

本发明的又一目的是提供如上所述的方法，其中所述培养方法选自下组：分批培养方法、补料分批培养方法和连续培养方法。

本发明的又一目的是提供如上所述的方法，其中所述培养方法是补料分批培养方法或连续培养方法，其中将含有硫源的补料培养基添加至发酵罐中的培养物。

本发明的又一目的是提供如上所述的方法，其中所述补料培养基进一步含有碳源和具有生长促进作用的营养物，并且其中将所述补料培养基连续地或间歇地添加至发酵罐中的培养物，从而使培养物中的碳源浓度在微生物的对数生长结束之后保持在30g/L或更低。

本发明的又一目的是提供以发酵液为基础产生动物饲料添加剂的方法，其包括：

A)在包含碳源、氮源和硫源的发酵培养基中培养具有产生L-苏氨酸的能力、属于埃希氏菌属的微生物，

B)进行发酵，其中调节所述培养基中的硫浓度从而使其处于预定水平或更低，

C)将粗发酵液干燥至按重量计10％或更少的水含量。

附图简述

图1显示最初添加至培养基的硫的量和L-苏氨酸产率之间的关系。

优选实施方案详述

<1>本发明的方法

本发明的方法是产生L-苏氨酸的方法，通过在含有碳源、氮源和硫源的发酵培养基中培养具有产生L-苏氨酸的能力、属于埃希氏菌属的微生物，从而在培养基中将L-苏氨酸产生，其中调节所述培养基中的硫浓度从而使其保持在预定水平或更低。在本发明中，术语“硫浓度”的意思是依据硫原子浓度的硫源浓度。

用于本发明的培养基可以是任何培养基，只要其是含有碳源、氮源和硫源作为营养物的液体培养基，除了调节所述培养基使其硫浓度保持在预定水平或更低之外，对培养基不进行具体限定。硫源可以是任何含硫来源。硫酸的盐，例如硫酸盐、硫代硫酸盐和亚硫酸盐，以及含硫氨基酸例如半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽是理想的。在这些之中，硫酸铵是特别优选的。不对盐进行具体限定，并且可使用铵盐、钙盐、钠盐、磷盐、镁盐、锰盐和铁盐。此外，所述培养基可包含仅一类、或两类或更多类的这些物质。短语“预定水平或更低”所表示的浓度可以是任何浓度，在该浓度L-苏氨酸产率与在含有大量硫的培养基中或常规发酵培养基中的产率相比得到改进。具体而言，发酵培养基中的硫浓度优选为0.35g/L或更低，更优选0.25g/L或更低，特别优选0.10g/L或更低。本发明的特征之一是调节发酵培养基中的硫浓度。对于本发明的方法，可使用分批培养、补料分批培养和/或连续培养，并且可在初始培养基中将培养基中的硫浓度调节至预定水平或更低，或可通过控制补料培养基中的硫浓度或通过组合使用这些技术将培养基中的硫浓度限定在预定水平或更低。对于初始培养基和补料培养基可使用相同的硫源，或补料培养基中的硫源可不同于初始培养基中所使用的硫源。

在本发明中，补料分批培养指下述培养方法：其中在培养期间将培养基连续地或间歇地添加至容器中，并且在培养完成之前不从容器中取出(withdraw)培养基。连续培养指下述培养方法：在培养期间连续地或间歇地将培养基添加至容器中，并且从容器中提取培养基(通常而言，以等同于培养基补料的量)。术语“初始培养基”的意思是在补料分批培养或连续培养中，添加补料培养基之前用于分批培养的培养基；术语“补料培养基”的意思是在进行补料分批培养或连续培养时，将提供至发酵罐的培养基。补料培养基可包含微生物生长所必需的全部或部分成分。在本发明中，术语“发酵培养基”的意思是包含在发酵罐中的培养基，并且从此发酵培养基中收集L-苏氨酸。此外，在本发明中，术语“发酵罐(fermenter)”的意思是在其中进行L-苏氨酸发酵的容器，并且不限定其形状。可使用发酵罐(fermentation tank)或小型发酵罐(jar fermenter)。此外，只要能够产生和收集L-苏氨酸，不限定发酵罐的容积。

虽然优选在全部发酵过程中始终将硫浓度限定于预定水平或更低，但也可仅在部分过程中对其进行限定。例如，当本发明的方法包括细胞增殖阶段(生长期)和L-苏氨酸产生阶段(L-苏氨酸产生期)时，在L-苏氨酸产生期将硫浓度限定于预定水平或更低是足够的。在生长期(细胞增殖期间)，硫可以以多于预定的量存在于培养基中，或可将硫浓度限定于预定水平或更低。此外，在产生L-苏氨酸的阶段中，硫含量无需在此阶段的全部时间内始终在前述范围内，硫含量在该阶段的早期可以在前述水平或更高，并且可随着培养时间而降低。此外，在硫不足(run short)时，可将其间歇地添加。术语“生长期”用于本发明中的意思是自开始培养起3小时，优选6小时，特别优选10小时之内的时期，在这段时期中主要消耗碳源用于细菌细胞生长，即，细胞以对数增殖。术语“L-苏氨酸产生期”用于本发明中的意思是自开始培养起在最初3小时，优选6小时，特别优选10小时之后的时期，在这段时期主要消耗碳源用于L-苏氨酸产生。

发酵培养基包含微生物生长所需的最小量的硫是足够的；然而，硫的量可能暂时不足。短语“不足”的意思是与培养中较早的点相比，硫浓度降低，并且甚至可能成为“0” 。术语“暂时”的意思是，例如，硫可能在相当于全部发酵时间的大约20％、大约40％或至多大约60％的时间内不足。在硫不足的时期内，虽然浓度可以暂时为0，但是期望的是硫以1μg/L或更多、10μg/L或更多或100μg/L或更多的浓度存在于发酵培养基中。因此，即使硫浓度暂时成为0，对于任何时期的含硫培养基的培养均包含在以下表述之内：“在包含碳源、氮源和硫源的发酵培养基中培养属于埃希氏菌属的微生物”。培养基中的硫浓度能够通过离子层析方法和热瓶方法(hot flask method)测量。

此外，根据本发明，在能够使用补料分批培养时，可调节补料培养基中的硫浓度从而将其限定于预定水平或更低。例如，通过使用补料分批培养限定硫浓度时，优选将发酵培养基中的硫浓度控制在0.35g/L或更低，理想的是0.25g/L或更低，更理想的是0.10g/L或更低。

本发明中使用的碳源的实例包括糖，例如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和糖蜜(molasses)。葡萄糖和蔗糖是特别优选的。此外，有机酸例如乙酸和柠檬酸，和醇例如乙醇，也能够单独使用或与其它碳源组合使用。此外，碳源的原料可以是蔗糖蜜、甜菜糖蜜、高级糖蜜(high test molasses)和柑橘类糖蜜(citrus molasses)，和天然原料如纤维素、淀粉、玉米、谷物和木薯淀粉(tapioca)的水解物。此外，溶解在培养基中的二氧化碳也能够用作碳源。这些碳源能够用在初始培养基中和/或补料培养基中。培养基可包含这些碳源的一种或多种类型。此外，可将相同的碳源用于初始培养基和补料培养基，或补料培养基的碳源可不同于初始培养基的碳源。例如，可将葡萄糖用在初始培养基中，而将蔗糖用在补料培养基中。

在本发明中使用的氮源的实例包括氨、铵盐例如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、乙酸铵和尿素、硝酸盐等。用于调节pH的氨气和氨水也能够用作氮源。此外，也能够使用蛋白胨、酵母提取物、肉膏(meat extract)、麦芽提取物(malt extract)、玉米浆(corn steep liquor)、大豆水解物等。培养基可包含这些氮源的一种或多种类型。这些氮源也能够用在初始培养基中和/或补料培养基中。此外，可将相同的氮源用于初始培养基和补料培养基二者，并且补料培养基的氮源可不同于初始培养基的氮源。

此外，本发明的培养基除碳源、氮源和硫之外优选还包含磷酸源。作为磷酸源，能够使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和磷酸聚合物例如焦磷酸。

此外，本发明的培养基除碳源、氮源和硫之外可包含生长促进因子(具有生长促进作用的营养物)。能够使用的生长促进因子包括痕量金属、氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸以及蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白水解物。

痕量金属的实例包括铁、锰、镁、钙、钾、钠等。维生素的实例包括维生素B₁、维生素B₂、维生素B₆、烟酸、烟酰胺、维生素B₁₂等。可将这些生长促进因子包含在初始培养基中或补料培养基中。

此外，在使用其生长需要氨基酸等的营养缺陷突变体(auxotrophic mutant)时，优选将所需营养物添加至培养基。具体而言，因为在如下所述能够用于本发明的产生L-苏氨酸的细菌中，L-苏氨酸生物合成途径通常是增强的并且L-苏氨酸降解能力通常是减弱的，所以优选添加L-赖氨酸、L-高丝氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸或它们的组合。

初始培养基和补料培养基可具有相同或不同的组成。此外，初始培养基和补料培养基可具有相同或不同的硫浓度。此外，当在多个阶段添加补料培养基时，在各个阶段所添加的补料培养基的组成可以是相同或不同的。

培养优选在通气条件下进行，发酵温度优选在20至45℃，特别优选在33至42℃。优选将氧浓度调节到5至50％，更优选调节至大约10％。此外，进行通气时优选将pH调节到5至9。如果在培养期间pH降低，例如，可添加碳酸钙或碱例如氨气和氨水以中和培养物。在这些条件下进行培养时，优选进行大约10至120小时，可观量的L-苏氨酸积累于培养基中。只要能够将L-苏氨酸从培养基分离和收集，则对积累的L-苏氨酸的浓度不进行限定，并且L-苏氨酸的浓度为50g/L或更高，理想的是75g/L或更高，更理想的是100g/L或更高。

在本发明中，微生物的培养可以通过种子培养(seed culture)和/或主培养(main culture)来进行，以诱导高于一定水平的L-苏氨酸积累。种子培养可通过使用摇瓶等的摇动或通过分批培养来进行。主培养可作为补料分批培养或连续培养进行。或者，种子培养和主培养均可作为分批培养进行。

在这些培养方法中，当L-苏氨酸浓度达到预定水平时，可取出一些发酵液，并且可添加新鲜培养基以重复培养。作为新鲜培养基，包含碳源和具有生长促进作用的营养物(生长促进因子)的培养基是优选的，并且其优选包含预定浓度或更低的硫。表述“预定浓度或更低”的意思是调节待添加的培养基从而使发酵培养基中的硫浓度成为0.35g/L或更低，理想的是0.25g/L或更低，更理想的是0.10g/L或更低。作为碳源，葡萄糖、蔗糖和果糖是优选的。作为生长促进因子，氮源、磷酸、氨基酸等是优选的。作为氮源，能够使用氨、铵盐例如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、乙酸铵和尿素、硝酸盐等。此外，作为磷酸源，能够使用磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。至于氨基酸，在使用营养缺陷突变菌株时，优选补充以所需的氨基酸。

当根据本发明进行补料分批培养或连续培养时，可将补料培养基的添加间歇暂停，从而将糖或营养物的供给暂停。优选将补料培养基的添加暂停补料时间(feeding time)的至多30％，理想的是20％，特别理想的是10％。所述“补料时间”的意思是从初次添加补料培养基开始到最后一次添加补料培养基结束的时期。补料培养基添加的暂停可少于30％，并且最优选少于10％。当间歇添加补料培养基时，起初可在预定的时间添加补料培养基，并且可控制第二次和之后的添加以使其在计算机检测到pH或溶氧浓度增加时开始。这种检测发现通常发生在某个添加时期前的添加/暂停时期内发酵培养基中的碳源耗尽后，并且因此培养罐(culture tank)中的底物浓度应该自动并且始终如一地(consistently)保持在低水平(美国专利号5,912,113)。

用于补料分批培养的补料培养基优选是包含碳源和具有生长促进作用的营养物(生长促进因子)的培养基，并且可以包含硫以使发酵培养基中的硫浓度保持在预定浓度或更低。表述“预定浓度或更低”用于本文的意思是调节添加的培养基从而使发酵培养基中的硫浓度保持在0.35g/L或更低，理想的是0.25g/L或更低，更理想的是0.10g/L或更低的浓度。尽管补料培养基自身的硫浓度可以在前述浓度范围之内或之外，优选其在前述浓度范围之内。

作为碳源，葡萄糖、蔗糖和果糖是优选的。作为生长促进因子，氮源、磷酸、氨基酸等是优选的。作为氮源，能够使用氨、铵盐例如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、乙酸铵和尿素、硝酸盐等。此外，作为磷酸源，能够使用磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。至于氨基酸，在使用营养缺陷突变菌株时，优选补充以所需的氨基酸。此外，补料培养基可以是一种类型的培养基，或两种或多种类型的培养基的混合物。在使用两种或两种类型的补料培养基时，可将培养基混合并且通过使用一种补料罐(feed can)来添加，或通过使用两种或多种补料罐来添加。

此外，在进行补料分批培养时，优选进行添加以使糖的量不超过30g/L，优选20g/L，更优选10g/L的全部补料分批培养基或发酵培养基。具体而言，在微生物完成对数生长之后，优选将糖浓度控制在前述浓度范围之内。能够通过美国专利号5,912,113中所述方法控制碳源的补料速率(feeding rate)。此外，优选补料糖和磷酸以使其浓度可使糖和磷酸成为细菌细胞生长的限制因素。磷酸存在于补料培养基中，使得磷/碳(P/C)比率为2或更低，优选1.5或更低，更优选1或更低(美国专利号5,763,230)。

在将连续培养方法用于本发明时，可将培养基同时取出和添加；或可提取部分培养基，并且可随后添加培养基。此外，所述方法也可以是连续培养方法，其中将包含L-苏氨酸和细菌细胞的培养基取出，并且仅将细胞再循环至发酵罐(法国专利号2669935)。作为连续或间歇添加营养源的方法，使用与补料分批培养中所用的相同方法。

将培养基间歇取出时，在L-苏氨酸浓度达到预定浓度时收集部分L-苏氨酸，并且添加新鲜培养基以继续培养。此外，至于待添加的新鲜培养基的量，添加新鲜培养基之后，培养中总培养基的最终量等于提取之前培养基的量。术语“等于”用于本文的意思是提取前培养基的量的大约93至107％。

在将培养基连续取出时，优选在添加营养培养基的同时或之后开始取出。例如，开始时间是添加开始之后的最多5小时，优选3小时，更优选1小时。此外，培养基的取出量优选等于添加的培养基的量。

重复使用细菌细胞的连续培养方法是如下所述的方法：在氨基酸浓度达到预定水平时，将发酵培养基间歇或连续地取出，仅取出L-苏氨酸，并且将包含细菌细胞的过滤残余物再循环(re-circulating)到发酵罐中，这种方法能够通过参考例如法国专利号2669935来进行。

L-苏氨酸和其它氨基酸的分析能够通过如Spackman等(AnalyticalChemistry 30：1190-1206(1958))所述的阴离子交换层析然后是茚三酮衍生化(ninhydrin derivation)，或通过如Lindroth等(Analytical Chemistry 51：1167-1174)所述的反相HPLC来进行。

<2>基于本发明产生的发酵液产生动物饲料添加剂的方法

基于本发明产生的发酵液的动物饲料添加剂能够通过以下分离方法制备。

L-苏氨酸分离方法例如离心、过滤、倾析、絮凝或这些的组合能够用于去除或减少生物质。

使用已知方法例如旋转蒸发器、薄层蒸发器(thin layer evaporator)、反渗透(reverse osmosis)或纳米过滤(nanofiltration)，能够将通过本发明获得的培养液(broth)提浓(thicken)或浓缩。(FR8613346B、US4,997,754、EP410005B、JP1073646B)

随后使用冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾粒化(spray granulation)或任何其它方法处理浓缩的培养液，以提供优选自由流动的(free flowing)、细碎的(finelydivided)粉末用于动物饲料添加剂。通过使用合适的压制(compacting)或粒化方法能够将这种自由流动的、细碎的粉末转化成粗粒化(coarse-grained)、非常自由流动的、稳定并且基本上无粉尘(largely dust-free)的产品。总而言之，以此方法将多于90％的水去除，从而使饲料动物添加剂的水含量按重量计少于10％，优选少于5％。

饲料添加剂的蛋白含量按重量计可少于10％，优选少于5％，并且L-苏氨酸的浓度可多于50％，优选多于85％，更优选多于95％。(US5,431,933、JP1214636B、US4,956,471、US4,777,051、US4946654、US5,840358、US6,238,714、US2005/0025878)

不必要必需进行上述分离步骤，但是可以以技术上有利的方式将其组合。

<3>能够用于本发明的埃希氏菌属细菌

能够用于本发明的埃希氏菌属细菌是具有产生L-苏氨酸的能力的埃希氏菌属细菌，并且术语“产生L-苏氨酸的能力”用在本发明中的意思是将所述细菌在培养基中培养时，在培养基中产生游离L-苏氨酸的能力，即，将游离L-苏氨酸产生至细胞外，其程度使得能够从培养基收集L-苏氨酸。优选地，用于本发明的埃希氏菌属细菌是经过培育以使该菌株与野生型菌株或亲本菌属相比能够产生更高的L-苏氨酸量的菌株。具体而言，优选在使用未调节硫浓度的通常培养方法时，所述埃希氏菌属菌株产生30g/L或更高，更优选50g/L或更高，特别优选75g/L或更高的L-苏氨酸量。

用于获得适用于本发明的埃希氏菌属细菌的埃希氏菌属细菌的亲本菌株无具体限定，其具体实例包括在Neidhardt等(Neidhardt，F.C.et al.，Escherichiacoli and Salmonella Typhimurium，American Society for Microbiology，Washington D.C.，1029，表1)的工作中提到的那些菌株。在这些菌株之中，例如，大肠杆菌是优选使用的。大肠杆菌的具体实例包括均源自原型野生型菌株K12的大肠杆菌W3110(ATCC 27325)和大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)等。

为了获得这些菌株，能够从例如美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)(地址：P.O.Box 1549 Manassas，VA 20108，United States ofAmerica)获得它们。为各细菌菌株提供一个对应的注册号，并且使用该注册号能够预定各菌株。对应于细菌菌株的注册号列于美国典型培养物保藏中心的目录中。

<3-1>赋予L-苏氨酸产生能力

在下文中，将描述将L-苏氨酸产生能力赋予埃希氏菌属细菌的方法。

为了赋予L-苏氨酸产生能力，能够使用已被常规采用的培育埃希氏菌属细菌或棒状杆菌型细菌的方法，例如获得全都具有L-苏氨酸产生能力的营养缺陷突变体、类似物抗性菌株(analogue resistant strain)或代谢调控突变菌株(metabolism control mutant strain)，以及构建其中将L-苏氨酸生物合成酶的活性增强的重组菌株。例如，可对突变或重组菌株进行修饰，以使L-苏氨酸生物合成酶不受到反馈抑制；或可对重组菌株进行修饰，以增强L-苏氨酸生物合成酶基因的表达。在通过这些方法培育产生L-苏氨酸的细菌时，可单独地或组合地赋予例如营养缺陷型(auxotrophy)、类似物抗性和代谢调控突变等性质。在将L-苏氨酸生物合成酶的活性增强时，可将一种或多种这些酶的活性增强。此外，如上所述，赋予上述性质和增强酶活性可组合进行。

将产生L-苏氨酸的能力赋予埃希氏菌属细菌的方法实例，或通过增强L-苏氨酸生物合成酶的活性来增强产生L-苏氨酸的能力的方法实例，将在下进行说明。可通过如下方法增强酶活性：例如，将突变引入编码该酶的基因或扩增该基因以使酶的细胞内活性增加。这些能够通过使用基因重组技术实现。

编码L-苏氨酸生物合成酶的基因的实例包括天冬氨酸激酶III基因(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)、thr操纵子中包括的天冬氨酸激酶I基因(thrA，SEQ ID NO：1的核苷酸编号337至2799)、高丝氨酸激酶基因(thrB，SEQ ID NO：1的核苷酸编号2801至3733)和苏氨酸合酶基因(thrC，SEQ IDNO：1的核苷酸编号3734至5020)。括号中所示是这些基因的缩写名称。可将这些基因的两种或多种引入细菌。可将L-苏氨酸生物合成基因引入其中苏氨酸降解受到抑制的埃希氏菌属细菌。其中苏氨酸降解受到抑制的埃希氏菌属细菌的实例包括苏氨酸脱氢酶活性缺陷的TDH6菌株(EP1149911A)等。

L-苏氨酸生物合成酶的酶活性受到作为终产物的L-苏氨酸的抑制。因此，为了构建产生L-苏氨酸的细菌，有益的是对L-苏氨酸生物合成体系基因进行修饰从而使编码的酶不受到L-苏氨酸的反馈抑制。前述thrA、thrB和thrC基因构成苏氨酸操纵子，并且该苏氨酸操纵子具有弱化子结构。苏氨酸操纵子的表达受到存在于培养基中的异亮氨酸和苏氨酸的抑制，并且通过弱化作用抑制。前述修饰能够通过去除弱化区中的前导序列(SEQ ID NO：6)完成，或通过去除弱化子(SEQ ID NO：1)完成(国际专利公开WO02/26993；BiotechnologyLetters，Vol.24，No.21，November 2002；国际专利公开WO05/049808、WO98/04715、WO03/097839)。具体而言，期望的是修饰苏氨酸操纵子以从SEQ ID NO：1的序列中除去核苷酸188至310的序列。或者，修饰苏氨酸操纵子以从SEQ ID NO：1的序列中除去核苷酸148至310的序列也是期望的。

天然启动子存在于苏氨酸操纵子的上游区，并且可将其用非天然启动子取代(参考WO98/04715)。或者，可构建苏氨酸操纵子以使涉及苏氨酸生物合成的基因的表达受到λ噬菌体的阻抑物(repressor)和启动子的调节(参考欧洲专利号0593792)。此外，经修饰从而不受到L-苏氨酸反馈抑制的埃希氏菌属细菌也能够通过选择对α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)有抗性的菌株来获得(参考WO03/097839)。

此外，优选能够存在经修饰从而不受到L-苏氨酸反馈抑制的苏氨酸操纵子的多拷贝。或者，将所述操纵子连接至强启动子从而增加表达。能够通过使用质粒将其扩增和/或使用转座子、Mu噬菌体等将其转移至染色体上来增加L-苏氨酸操纵子的拷贝数(US5,175,107)。

此外，经修饰而不受到L-赖氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶III基因(lysC)是优选使用的。这种lysC基因能够通过美国专利号5,932,453中所述的方法获得。

除了L-苏氨酸生物合成酶之外，还优选增强以下基因的表达：涉及糖酵解途径、TCA循环或呼吸链的基因，调节基因表达的基因，和糖摄取基因。对L-苏氨酸产生具有作用的基因实例包括转氢酶(pntAB)基因(欧洲专利号733712)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(pepC)(国际专利公开WO95/06114、US2005-0136518)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)(欧洲专利号877090)和棒状杆菌型细菌或芽孢杆菌属(Bacillus)细菌的丙酮酸羧化酶基因(国际专利公开WO99/18228；欧洲专利公开号1092776)。

此外，还优选增强如下基因的表达：将L-苏氨酸抗性赋予宿主的基因，或将L-高丝氨酸抗性赋予宿主的基因，或将二者组合。赋予抗性的基因的实例包括rhtA基因(Res.Microbiol.，2003 Mar.，154(2)：123-35)、rhtB基因(欧洲专利公开号0994190)、rhtC基因(欧洲专利公开号1013765)、yfiK基因和yeaS基因(欧洲专利公开号1016710)。此外，用于将L-苏氨酸抗性赋予宿主的方法在欧洲专利公开号0994190和国际专利公开WO90/04636中描述。

由前述基因编码的酶的活性能够通过增强所述基因的表达来增加，例如，通过使用基因重组技术增加细胞中基因的拷贝数。例如，可将包含靶基因的DNA片段连接至在宿主微生物中发挥功能的载体，优选多拷贝型载体，并且可用这种载体DNA转化宿主微生物。

将大肠杆菌基因用作靶基因时，其能够通过如下方法获得：通过参考在GenBank登记的大肠杆菌MG1655或W3110中已知的基因序列来制备引物，并且使用大肠杆菌染色体DNA作为模板来进行聚合酶链式反应(PCR)(参考White，T.J.et al.，Trends Genet.5，185(1989))。其它微生物的靶基因也能够使用基于该微生物的已知基因信息或来自GenBank的序列信息制备的引物通过PCR从该微生物的染色体DNA或染色体DNA文库获得；或使用基于前述序列信息制备的寡核苷酸作为探针通过杂交获得。染色体DNA能够从供体微生物制备，例如，通过Saito和Miura(参考H.Saito and K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)；Text for Bioengineering Experiments，Edited bythe Society for Bioscience and Bioengineering，Japan，pp.97-98，Baifukan，1992)的方法等。

此外，因为编码靶酶的基因的核苷酸序列可能依赖于埃希氏菌属细菌的种类或细菌菌株而变化，用于本发明的靶基因不限于在GenBank登记的已知基因或基因序列，并且可以是突变的或人工修饰的基因。这种突变的或经修饰的基因可编码蛋白质，所述蛋白质具有的序列在一个或多个位点包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加等，只要编码的靶蛋白的功能，即，产生L-苏氨酸的能力能够通过扩增该基因而得到改进。术语“几个”所指的数目用于本文时依赖于蛋白质三维结构中氨基酸残基的位置和氨基酸残基的类型而变化。然而，具体而言其为1至20，优选1至10，更优选1至5。

前述取代优选是保守取代，其是不引起功能改变的中性突变。保守突变是其中的取代如下发生的突变：取代位点是芳族氨基酸时，取代在Phe、Trp和Tyr之中发生；取代位点是疏水氨基酸时，取代在Leu、Ile和Val之中发生；取代位点是极性氨基酸时，取代在Gln和Asn之间发生；取代位点是碱性氨基酸时，取代在Lys、Arg和His之中发生；取代位点是酸性氨基酸时，取代在Asp和Glu之间发生；并且取代位点是具有羟基的氨基酸时，取代在Ser和Thr之间发生。更具体而言，保守取代的实例包括用Ser或Thr取代Ala，用Gln、His或Lys取代Arg，用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，用Asn、Glu或Gln取代Asp，用Ser或Ala取代Cys，用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln，用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu，用Pro取代Gly，用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His，用Leu、Met、Val或Phe取代Ile，用Ile、Met、Val或Phe取代Leu，用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，用Ile、Leu、Val或Phe取代Met，用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe，用Thr或Ala取代Ser，用Ser或Ala取代Thr，用Phe或Tyr取代Trp，用His、Phe或Trp取代Tyr和用Met、Ile或Leu取代Val。

此外，也可使用同源基因，只要其与靶基因具有相同的功能。具体而言，同源基因应该编码与已知蛋白质的序列具有80％或更多，优选90％或更多，更优选95％或更多，特别优选97％或更多同源性的蛋白质。此外，由于基因的简并性依赖于引入该基因的宿主而变化，可使用具有密码子取代的基因，所述密码子能够在该宿主中容易地使用。类似地，只要能够将靶基因的产生L-苏氨酸的能力通过扩增该基因而改进，可将基因在N末端或C末端延伸或缩短。延伸或缩短的长度，例如，就氨基酸残基数而言，是50个或更少，优选20个或更少，更优选10个或更少，特别优选5个或更少。更具体而言，蛋白质可具有在N末端和/或C末端缩短了5-50个氨基酸残基的氨基酸序列。

与靶基因同源的基因能够通过修饰核苷酸序列获得，例如通过定位诱变，从而使编码的蛋白质在特定位点包含氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。此外，这种基因也能够通过已知的突变处理获得，如下所述。这些突变处理的实例包括：用羟胺等体外处理靶基因的核苷酸序列的方法，用UV照射或常规诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或甲磺酸乙酯(ethylmethanesulfonate)(EMS)处理具有所述基因的微生物如埃希氏菌属细菌的方法，和通过易错PCR引入突变的方法。此外，前述氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加、倒位(inversion)等包括天然存在的突变(突变体或变体)，例如基于具有所述靶基因的微生物的个体差异和/或物种差异的突变。这些基因是否编码当它们的表达水平增加时改进产生L-苏氨酸的能力的蛋白质，能够通过如下方法确认：例如将这些基因引入大肠杆菌的野生型菌株或具有产生L-苏氨酸的能力的菌株，并且检测产生L-苏氨酸的能力是否得到改进。

靶基因也可以是在严紧条件下，与靶核苷酸序列或其互补序列或从这些序列制备的探针杂交的DNA，并且其编码通过增强表达改进埃希氏菌属细菌产生L-苏氨酸的能力的蛋白质。本文所指的“严紧条件”包括，在该条件下，形成所谓的特异性杂合体，而不形成非特异性杂合体。难以通过使用任何数值来清晰地表述这种条件。然而，例如，严紧条件包括，在该条件下，具有高同源性的DNA，例如具有50％或更多、优选60％或更多、更优选70％或更多、更优选80％或更多、更优选90％或更多、进一步优选95％或更多、最优选97％或更多同源性的DNA彼此杂交，但具有低于上述同源性的DNA不相互杂交。或者，可将严紧条件示例性说明为：在用于杂交的条件下，在通常用于Southern杂交中洗涤的盐浓度，即，1 x SSC、0.1％SDS、60℃，优选0.1 x SSC、0.1％SDS、68℃，洗涤一次，优选2至3次。

随后，通过将PCR扩增的靶基因连接至能够在宿主微生物细胞中发挥功能的载体DNA来制备重组DNA。这种载体包括在宿主微生物细胞中可自主复制的载体。在大肠杆菌细胞中可自主复制的载体的实例包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184(pHSG和pACYC可从Takara Bio Inc.获得)、RSF1010、pBR322、pMW219(pMW可从Nippon Gene获得)等等。

通过已知的转化方法，能够将如上所述制备的重组DNA引入微生物。实例包括：已报导用于大肠杆菌K-12的用氯化钙处理受体细胞从而增加DNA透性的方法(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))，已报导用于枯草芽孢杆菌的从生长期细胞制备感受态细胞然后将DNA引入其中的方法(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Young，F.E.，Gene，1，153(1977))等。除了这些方法之外，可使用如下方法：将DNA受体细胞制成能够容易地摄取(take up)重组DNA的原生质体或原生质球，然后将重组DNA引入DNA受体细胞，该方法已知可用于枯草芽孢杆菌、放射菌类(actinomycetes)和酵母(Chang，S.and Cohen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111，1979；Bibb，M.J.，Ward，J.M.andHopwood，O.A.，Nature，274，398，1978；Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci.USA，75，1929(1978))。

基因拷贝数的增加也能够通过将基因的多拷贝引入微生物的染色体DNA中来完成。为了引入多拷贝，可使用于多拷贝存在于染色体DNA上的序列作为靶进行同源重组。作为以多拷贝存在于染色体DNA上的序列，可使用存在于可转座元件末端的反向重复序列和重复DNA。也可将靶基因通过同源重组引入染色体上不必要的基因中，或可将靶基因一前一后(in tandem)引入不必要的区域中。或者，如日本专利公开(laid open)号2-109985中所披露的，也可将靶基因并入转座子，并使其转移从而将基因的多拷贝引入染色体DNA(参考美国专利号5,595,889)。靶基因是否已转移至染色体，能够通过使用部分靶基因作为探针的Southem杂交来确认。

此外，除了增加基因拷贝数，靶基因的表达能够通过如下方法增强：将染色体DNA或质粒上的靶基因表达调控序列(例如启动子)用更强的调控序列(例如启动子)代替；扩增增加表达的调节基因(regulator)；或缺失/弱化减少表达的调节基因，如国际专利公开WO00/18935中所述。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、源自λ噬菌体的Pr启动子等被称为强启动子。此外，通过在启动子区引入核苷酸取代，能够将靶基因的启动子修饰得更强。启动子强度的评估，以及对已知的强启动子的描述，在Goldstein et al.(Prokaryoticpromoters in biotechnology，Biotechnol.Annu.Rev.，1995，1，105-128)中阐明。此外，已知取代核糖体结合位点(RBS)和起始密码子之间的间隔区(spacer)，具体而言，取代恰位于起始密码子上游的序列中的几个核苷酸，对mRNA翻译效率具有极大的影响，并且可对这些核苷酸进行修饰。通过使用启动子搜索矢量(promoter search vector)或基因分析软件程序例如GENETYX，能够测定表达调控区例如启动子。通过取代或修饰这些启动子来增强靶基因的表达。通过使用例如温度敏感质粒，能够取代表达调控序列。

通过这些方法增加活性的结果是，与野生型菌株或未修饰菌株相比，酶活性增加至少10％、25％、50％、100％、200％、400％、600％或1000％。此外，用于增加酶活性的技术能够相互组合实施，或与酶活性的减少组合实施。提供作为参考的埃希氏菌属细菌的实例包括，作为野生型菌株，源自原型野生型菌株K12的大肠杆菌W3110(ATCC 27325)、大肠杆菌MG1655(ATCC47076)等。

此外，在本发明的细菌中，催化由L-苏氨酸生物合成途径分支的反应和产生L-苏氨酸之外的化合物的反应的酶活性可以是减少的或缺陷的。这种酶的实例包括苏氨酸脱氢酶、苏氨酸脱氨酶和苏氨酸脱水酶。具有减少或缺乏这些酶活性的菌株在国际专利公开WO95/23864、WO96/17930、WO03/080843、WO04/087895等中描述。

此外，在本发明的细菌中，除了L-苏氨酸降解体系酶之外，以下酶的活性可以是减少的或缺乏的：糖酵解途径、TCA循环或呼吸链中涉及的反向影响L-苏氨酸产生的酶，调节基因表达的酶，或副产物生物合成系统的酶。编码这种酶的基因的实例包括编码RNA聚合酶σ(sigma)因子的基因(rpoS，国际专利公开WO01/05939和WO03/074719)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(pckA，国际专利公开WO02/29080)、磷酸葡糖异构酶基因(pgi，Molecular andGeneral Genetics，217(1)：126-31(1989))、丙酮酸氧化酶基因(poxB，国际专利公开WO02/29080)等。

为了减少或消除如上所述的酶的活性，通过常规突变处理，能够将减少或消除所述酶细胞内活性的突变引入染色体上前述酶的基因中。这通过如下方法来实现：例如，通过基因重组而缺失染色体上编码酶的基因，修饰表达调控序列例如启动子和Shine-Dalgarno(SD)序列等。此外，也能够通过如下方法来实现：在染色体上编码酶的区域中引入一个或多个氨基酸取代(错义突变)，引入终止密码子(无义突变)，引入添加或缺失一个或两个核苷酸的移码突变，或缺失基因的部分或全部区域(Journal of Biological Chemistry，272：8611-8617(1997))。此外，还能够通过如下方法减少或消除酶活性：构建编码突变酶的基因，其中将编码区缺失，并且通过同源重组等用这种基因取代染色体上的正常基因；或将转座子或IS因子引入到基因中。此外，其还能够通过用反义RNA抑制表达来实现(Proceedings of the National Academy ofSciences，USA，95 5511-5515(1998)；Journal of Biological Chemistry，266，20833-20839(1991))。

为了通过基因重组引入减少或消除如上所述酶活性的突变，例如，使用如下方法。可通过如下方法用突变型基因取代染色体上的靶基因：修饰靶基因的部分序列以制备突变基因，其由于突变而不产生正常发挥功能的酶，并且用包含这种基因的DNA转化埃希氏菌属细菌以引起突变基因和染色体上基因的重组。这种利用通过同源重组的基因取代的位点特异性突变是已知的，其实例包括使用线性DNA的方法、使用包含温度敏感性复制起点的质粒的方法(美国专利号6,303,383；日本专利公开号05-007491)等。此外，前述通过利用同源重组的基因取代的位点特异性突变也能够使用在宿主中不具有复制能力的质粒来进行。

通过这些方法减少活性或表达的结果是，与野生型菌株或未经修饰的菌株相比，酶活性减少了75％、50％、25％或10％，或将活性完全消除。此外，可将这些减少酶活性的方法的两种或多种组合实施，或可将它们与如上所述酶活性的增加组合使用。提供作为参考的埃希氏菌属细菌的实例包括大肠杆菌W3110(ATCC 27325)、大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)等，其源自原型野生型菌株K12。

用于本发明的产生L-苏氨酸的细菌可以是经修饰从而能够同化蔗糖作为碳源的菌株。例如，同化蔗糖的菌株能够通过P1转导从大肠杆菌H155菌株获得，使用其以蔗糖作为唯一碳源生长的能力作为指标。能够同化蔗糖作为碳源、产生L-苏氨酸的细菌能够通过参考国际专利公开WO90/04636构建。

此外，除了前述基因操作，用于构建产生L-苏氨酸的细菌的方法的实例包括如下方法：通过UV照射或用常规诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸处理埃希氏菌属菌株，以获得对L-氨基酸或L-氨基酸类似物具有抗性的菌株或L-氨基酸营养缺陷型菌株，并且选择具有改进的L-苏氨酸产生能力的菌株。所述菌株的实例包括疏螺旋体素抗性突变菌株(美国专利号5,939,307)、二氨基琥珀酸抗性突变菌株(国际专利公开WO00/09661)、α-甲基丝氨酸抗性突变菌株(国际专利公开WO00/09661)、氟代丙酮酸(fluoropyruvate)抗性突变菌株(国际专利公开WO00/09661)、乙酸抗性突变菌株(美国专利号5,919,670)、苏氨酸抗性突变菌株(国际专利公开WO90/04636)和AHV抗性突变菌株(Genetika，16：206(1978))。

<3-2>能够用于本发明的产生L-苏氨酸的细菌的实例

在下文中将描述能够用于本发明的赋予L-苏氨酸产生能力的埃希氏菌属细菌的实例。然而，只要该细菌具有产生L-苏氨酸的能力，能够用于本发明的细菌不限于这些实例。

作为能够用于本发明的产生L-苏氨酸的细菌的实例，包含大肠杆菌VKPM B-3996菌株(美国专利号5,175,107)。此VKPM B-3996菌株于1987年11月19日以登记号VKPM B-3996保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russia，117545 Moscow，1 Dorozhny proezd.1)。此VKPM B-3996菌株具有质粒pVIC40(国际专利公开WO90/04636)，所述质粒通过将苏氨酸生物合成基因(苏氨酸操纵子thrABC)插入pAYC32获得，是具有链霉素抗性标记的广宿主载体质粒(参考Chistorerdov，A.Y，Tsygankov，YD.，Plasmid，1986，16，161-167)。在pVIC40中，将L-苏氨酸对由苏氨酸操纵子中thrA编码的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I的反馈抑制消除。

作为能够用于本发明的产生L-苏氨酸的细菌实例，还包含大肠杆菌VKPM B-5318菌株(欧洲专利号0593792)。大肠杆菌VKPM B-5318菌株于1990年5月3日以登记号VKPM B-5318保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russia，117545 Moscow，1 Dorozhny proezd.1)。此VKPMB-5318菌株不需异亮氨酸，具有温度敏感性C1阻抑物、PR启动子和苏氨酸操纵子。即，将苏氨酸生物合成相关基因，其中将弱化子区域和天然转录调节区域缺失，位于λ噬菌体Cro蛋白N末端区的基因的下游。此外，这种菌株包含重组质粒DNA，已将其构建以使涉及苏氨酸生物合成的基因的表达受到λ噬菌体的启动子和阻抑物的调节。

大肠杆菌427T23(美国专利号5,631,157)也能够作为产生L-苏氨酸的细菌的优选实例。427T23菌株具有不受到L-苏氨酸反馈抑制的高丝氨酸脱氢酶。同样，这种菌株已将苏氨酸脱氨酶活性弱化，并且能够使用蔗糖作为碳源。427T23菌株已经以登录号ATCC 98082保藏在美国典型培养物保藏中心。

大肠杆菌kat-13(美国专利号5,175,107)也能够优选用作产生L-苏氨酸的细菌。kat-13菌株对疏螺旋体素具有抗性，具有不受到L-苏氨酸反馈抑制的高丝氨酸脱氢酶、弱化的苏氨酸脱氨酶活性，并且能够使用蔗糖作为碳源。

用编码苏氨酸生物合成酶的基因转化的大肠杆菌TDH6菌株(日本专利公开号2001-346578)也能够优选用作产生L-苏氨酸的细菌。TDH6菌株缺乏苏氨酸脱氢酶活性，并且通过将携带编码苏氨酸生物合成酶基因的pVIC40从B-3996菌株(US5,631,157)中去除而获得，已经以登录号VKPM B-3420保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russia，117545 Moscow，1Dorozhny proezd.1)。

此外，能够用于本发明的产生L-苏氨酸的细菌的其它实例包括以下细菌菌株：

大肠杆菌MG-442(CMIMB-1628，美国专利号4,278,765)

大肠杆菌VL334/pYN7(美国专利号4,278,765)

大肠杆菌H-4225(FERM BP-1236，美国专利号5,017,483)

大肠杆菌H-7256(FERM BP-2137)

大肠杆菌DSM9807(KCCM-10168)

实施例

将参考以下实施例进行更具体地说明本发明。然而，本发明不限于这些实施例。

实施例1：补料分批培养中对初始添加的硫进行调节的影响

首先，在补料分批培养中，检查在L-苏氨酸产生期间，将主培养初始培养基中的硫限定在预定浓度或更低的影响。

将VKPM B-5318菌株在含有20mg/L硫酸链霉素的LB琼脂培养基平板上(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L NaCl、15g/L琼脂)于37℃培养24小时，从一个平板将平板上1/10的细胞刮下并且接种到带挡板的烧瓶(baffle flask)中50mL含有20mg/L硫酸链霉素的LB培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L NaCl)中，在40℃和144rpm进行6小时种子培养。

种子培养完成之后，将等于主培养培养基体积16％的体积的种子培养培养基接种到装有300mL主培养培养基的1-L小型发酵罐中，并且在40℃和pH 7.0进行培养。主培养培养基组成如下所示。

主培养培养基组成：

蔗糖 27g/L

酵母提取物 1.8g/L

KH₂PO₄ 1.5g/L

NaCl 0.6g/L

MgSO₄·7H₂O 0.36g/L

FeSO₄·7H₂O 18mg/L

MnSO₄·4H₂O 18mg/L

硫酸链霉素 20mg/L

合适地添加硫酸铵，从而使初始添加的硫含量就硫含量来说是0.78至0.10g/L。

在培养期间，通过添加氨气将培养物调节至pH 7.0。在将培养基中的糖消耗之后，添加600g/L蔗糖水溶液以进行补料分批培养。

培养42小时之后，通过HPLC测定L-苏氨酸浓度。

结果，L-苏氨酸发酵产率随着硫的减少而增加，并且其增加显著，特别在硫浓度为0.29g/L或更低时增加显著，如表1所示。

表1

初始添加的(NH₄)₂SO₄(g/L)	初始添加的S(g/L)	产率(％)
			3.0	0.78	35.7
2.0	0.54	36.6
			1.0	0.29	38.6
0.8	0.25	39.9
			0.4	0.15	40.8
0.2	0.10	43.6

实施例2：补料分批培养中对补料培养基中的硫进行调节的影响

首先，按照与实施例1中相同的方式，将VKPM B-5318菌株在含有20mg/L硫酸链霉素的LB琼脂培养基平板上(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L NaCl、15g/L琼脂)于37℃培养24小时，从一个平板将平板上1/10的细胞刮下，并且接种在带挡板的烧瓶中50mL含有20mg/L硫酸链霉素的LB培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L NaCl)中，以在40℃和144rpm进行6小时种子培养。

种子培养完成之后，将等于主培养培养基体积16％的体积的种子培养培养基接种到装有300mL主培养培养基的1-L小型发酵罐中，并且在40℃和pH 7.0进行培养。主培养培养基具有如实施例1中所用的相同组分。

在培养期间通过添加氨气将培养物调节至pH 7.0。在将培养基中的糖消耗之后，添加包含蔗糖的补料培养基进行发酵，并且进行调节以使发酵培养基中的硫浓度处于预定水平或更低。结果示于表2。将补料培养基中的硫浓度控制在0至1.22g/L，并且控制培养以使发酵培养基在全部主培养时期始终含有0.144至0.548g/L的硫。

结果，确认通过将发酵培养基中的硫浓度调节至0.35g/L或更低，也使补料分批培养中的L-苏氨酸产率得到改进。

表2

补料溶液中的(NH₄)₂SO₄(g/L)	补料溶液中的S(g/L)	总S(g/L)	产率(％)
				0.0	0.00	0.144	41.8
1.0	0.24	0.225	39.1
				2.0	0.49	0.305	38.8
5.0	1.22	0.548	37.5

工业适用性

根据本发明，在使用具有产生L-苏氨酸的能力、属于埃希氏菌属的微生物通过发酵产生L-苏氨酸的方法中，能够使发酵产率和L-苏氨酸的产生得到改进。