BRPI0613059A2 - método para produzir l-treonina, e, método para produzir aditivo de alimentação de animal baseado em caldo de fementação - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA PRODUZIR L-TREONINA, E, MéTODO PARA PRODUZIR ADITIVO DE ALIMENTAçãO DE ANIMAL BASEADO EM CALDO DE FERMENTAçãO. A invenção refere-se a um método para produzir L-treonina, que compreendem as etapas de: cultivar um microorganismo que pertence ao gênero Escherichia que tem uma capacidade de produzir L-treonina, em um meio de fermentação contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, e uma fonte de enxofre; e coletar L-treonina da cultura, em que a concentração de enxofre no meio é regulada de forma que ela esteja em um nível predeterminado ou menor.

Description

"MÉTODO PARA PRODUZIR L-TREONINA, E, MÉTODO PARA PRODUZIR ADITIVO DE ALIMENTAÇÃO DE ANIM4JL BASEADO EM CALDO DE FERMEN TAÇÃO" CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a urna técnica para uso na indústria de fermentação. Mais especificamente, a presente invenção se refere a Uin método para produzir eficientemente L-treonina por fermentação utilizando uma bactéria Escherichia. L-treonina é um dos aminoácidos essenciais e é útil como um ingrediente em misturas nutricionais para propósitos médicos. Ele é também utilizado em várias formas como um aditivo de alimentação de animal, e como um reagente nas indústrias farmacêutica e química. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os L-aminoácidos, tais como L-treonina e L-isoleucina, são industrialmente produzidos por fermentação usando bactérias produtoras de aminoácidos, tais como bactérias corinefonnes ou bactérias de Escherichia que têm uma capacidade de produzir estes L-aminoácidos. Como estas bactérias produtoras de aminoácidos, as cepas bacterianas isoladas de mutantes naturais ou artificiais destas cepas de bactérias são usadas. Os recombinantes de cepas de bactérias em que enzimas de biossíntese de L- aminoácido são aumentados por recombinação de genes e assim por diante são usados de forma a melhorar a produtividade.

Especificamente, as cepas mutantes de bactérias de Eseherichia produzindo L-treonina, tais como cepa resistente a ó- dimetilaminopurina (Patente Jajrtonesa publicada (Kokai) No. 5-304969) e uma cepa resistente a borrelidina (Publicação de Patente Internacional WO98/04715). Os métodos de usar bactérias de Eseheriehia recombinantes para produzir L-treonina são conhecidos, especificamente usando uma cepa na qual o operon de treonina é amplificado pelo uso de um plasmídeo (US5,175,107), ou era que o gene de fosfoenolpimvato carboxilase e o gene de aspartase são amplificados pelo uso de um plasmídeo (Pedido de Patente U.S. 2002/0110876).

Como genes que codificam enzimas envolvidas na biossíntese de L-treonina em Escherichia coli, o gene de aspartocinasc 1ΪΙ (IysC), o gene de aspaitato semi-aldeído desidrogenase (asd), o gene de aspartoquinase I- homoserina desidrogenase (thrA), o gene de homoserina quinase (thrB) e o gene de íreonina sintase (thrC) e outros são conhecidos, O thrA, o thrB e o thrC (thrABC) constituem o operon de treonina. O operon de treonina foiTna uma estrutura atenuadora, e a sua expressão é inibida por isoleucina e treonina em um meio de cultura. É sabido que o rendimento da fermentação é melhorado quando a seqüência líder desta região de atenuação ou o atenuador é removido do operon de treonina (Patente U.S. 5,538,873, Bioteclinology Letters, Vol. 24, No. 21, November 2002, e Publicação Internacional de Patente WG05/049S0S).

Até hoje, os métodos para a produção de L-treonina que foram desenvolvidos incluem usando de um fermentador inicialmente contendo todos os nutrientes, uma cultura alimentada por batelada usando um fermentador inicialmente contendo nutrientes predeterminados e continuamente alimentada com um ou mais nutrientes adicionais (Patente U.S. 5,538,873 e Patente EP No. 593792), e um método de regulação da concentração de sacarídeos, de forma que ela seja mantida em um nível predeterminado ou menos (Publicação Internacional de Patente WQ05/014840 e Publicação internacional de Patenie W005/014843). Além disso, outro método para a produção de L-treonina que foi desenvolvido é um método de alimentação de um meio de cultura, ou adição de nutrientes a um meio, de forma que as fontes de ácido fosfórico e de carbono sirvam como fatores de limitação de crescimento (Patente U.S. 5,763,230).

Enxofre é um fator essencial para o crescimento de células bacterianas e é usualmente incluído no meio para a fermentação de L-treonina na forma de sulfato de amônio. Com relação à produção de L-treonina por fermentação, contudo, regulação da concentração de enxofre no meio de fermentação e o efeito de diminuição da concentração de enxofre são desconhecidos.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Um objeto da presente invenção é fornecer um método para produzir de forma eficiente L-treonina pelo uso de uma bactéria de Escherichia tendo uma capacidade de produzir L-treonina.

Os presentes inventores da presente invenção estudaram assiduamente de forma a alcançar o objeto acima. Como resultado, os inventores verificaram que a concentração de enxofre no meio pode afetar os resultados da fermentação, e que a produção de L-treonina durante a fermentação pode ser melhorada pela regulação da concentração de enxofre no meio de fermentação, de forma que ela seja mantida em um nível predeterminado ou menor, e, assim, seja realizada a presente invenção.

É um objeto da presente invenção se fornece]· um método para a produção de L-treonina compreendendo o cultivo de um microorganismo que pertence ao gênero Escheriehia que tem uma capacidade de produzir L- treonina, em um meio de fermentação contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio,, e uma fonte de enxofre, e coletar L-treonina da cultura, em que a concentração de enxofre no meio é regulada de forma que ela esteja em um nível predeterminado ou menor.

E um outro objeto da presente invenção fornecer o método descrito acima, em que a concentração de enxofre no meio de fermentação é regulada de forma que ela seja 0,35 g/l ou menor.

E um outro aspecto da presente invenção fornecer o método descrito acima, em que o microorganismo é Eseheriehia Coli.

E um outro objeto da presente invenção fornecer o método descrito acima, em que uma enzima de biossíntese de L-treonina no microorganismo é modificada de forma que a enzima não seja submetida à inibição de realimentação por L-treonina.

E um outro objeto da presente invenção fornecer o método descrito acima, em que a enzima de biossíntese ue L-treonina é selecionada do grupo que consiste de aspartoquinase, homoserina quinase, treonina sintase, e combinações destes.

E um outro objeto da presente invenção fornecer o método descrito acima, em que a fonte de enxofre é selecionada do grupo que consiste de sulfatos, tiosulfatos, sulfitos, cisteína, cistina, glutationa, e combinações destes.

E um outro objeto da presente invenção fornecer o método descrito acima, em que o método de cultura é selecionado do grupo que consiste de um meio de cultura em batelada, um método de cultura alimentado por batelada, e um método de cultura contínuo.

E também um outro objeto da presente invenção fornecer o método descrito acima, em que o método de cultura é um método de cultura alimentado por batelada ou um método de cultura contínuo, em que um meio de alimentação contendo uma fonte de enxofre é adicionado à cultura em um fermentador.

E urn outro objeto da presente invenção fornecer o método descrito acima, ern que o dito meio de alimentação também contém uma fonte de carbono e um nutriente tendo um efeito de promoção de crescimento, e em que o dito meio de alimentação é adicionado ao fermentado]- continuamente ou intemiitentemente, de forma que a concentração da fonte de carbono no meio de cultura seja mantida em 30 g/1 ou menor após o final do crescimento logaritmo do microorganismo.

É um outro objeto da presente invenção fornecer um método para a produção de um aditivo de alimentação para animal baseado em um caldo de fennentação compreendendo:

a) cultivar uni microorganismo que pertence ao gênero Escherichia que tem uma capacidade de produzir L-treonina, em um meio de fermentação contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, e uma fonte de enxofre,

b) conduzir a fennentação, em que a concentração de enxofre no meio é regulada de forma que ela esteja em um nível predeterminado ou menor,

O secar o caldo de fennentação bruto até um teor de água de 10% ou menos em peso.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO DO DESENHO

A Fig. 1 mostra a relação entre a quantidade de enxofre inicialmente adicionado ao meio e a produção de L-treonina. DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

O Método da Presente Invenção

O método cia presente invenção é um método para a produção de L-treonina pelo cultivo de um microorganismo que pertence ao gênero Escherichia que tem uma capacidade de produzir L-treonina, em um meio de fermentação contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, e uma fonte de enxofre, de forma que L-treonina seja produzida no meio, em que a concentração de enxofre no meio seja regulada de forma que ela seja mantida em um nível predeterminado ou menor. Na presente invenção, o teimo "concentração de enxofre" significa a concentração da fonte de enxofre em termos de concentração de átomo de enxofre,

O meio usado para a presente invenção pode ser qualquer meio contanto que ele seja um meio líquido que contenha uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, e uma fonte de enxofre como nutrientes, e o meio não é particularmente limitado, com a exceção de que é ajustado de forma que a concentração de enxofre seja mantida em um nível predeterminado ou menor. A fonte de enxofre pode ser qualquer fonte contendo enxofre, Os sais de ácido sulíurico, tais como sulfatos, tiosulfatos e sulfitos, bem como aminoácidos contendo enxofre, tais como cisteína, cistina e giutationa são desejáveis. Dentre estes, sulfato de amônio é particularmente preferido. Os sais não são particularmente limitados, e sais de amônio, sais de cálcio, sais de sódio, sais de potássio, sais de magnésio, sais de manganês, e sais de ferro podem ser usados. Além disso, o meio pode conter somente uni tipo, ou dois ou mais tipos, destas substâncias. A concentração indicada pela frase "nível predeterminado ou menor" pode ser qualquer concentração na qual a produção de L-treonina é melhorada quando comparada com aquela em um meio contendo uma grande quantidade de enxofre, ou um meio de fermentação convencional. Especificamente, a concentração de enxofre no meio de fermentação é preferivelmente 0,35 g/l ou menor, mais preferivelmente 0,25 g/l ou menor, mais preferivelmente 0,10 g/l ou menor. Uma das características da presente invenção é que a concentração de enxofre no meio de fermentação é regulada. Para o método da presente invenção, uma cultura de batelada, cultura alimentada por batelada, e/ou uma cultura contínua podem ser empregadas, e a concentração de enxofre no meio pode ser regulada como estando em um nível predeterminado ou menor no meio inicial, ou limitada para estar em um nível predeterminado ou menor pelo controle da concentração de enxofre no meio de alimentação ou pelo uso destas técnicas em combinação. A mesma fonte de enxofre pode ser usada para o meio inicial e para o meio de alimentação, ou a fonte de enxofre no meio de alimentação pode ser diferente daquela usada no meio iniciai.

Na presente invenção, uma cultura alimentada por batelada se refere a um método de cultura em que o meio é adicionado, continuamente ou intermitentemente, em um vaso durante a cultura, e não retirando o meio do vaso antes do término da cultura. A cultura contínua se refere a um método de adição contínua ou intermitente de um meio em um vaso durante a cultura, e extração do meio do vaso (normalmente, em uma quantidade equivalente ao meio alimentado). O termo "meio inicial" significa um meio usado para cultura de batelada antes do meio de alimentação ser adicionado na cultura alimentada por batelada ou cultura contínua, e o termo "meio livre" significa um meio a ser fornecido a um fermentador quando a cultura alimentada por batelada ou cultura contínua for realizada. O meio de alimentação pode conter todos ou uma parte dos componentes necessários para o crescimento de um microorganismo. Na presente invenção, o teimo "meio de fermentação" significa um meio contido em um fermentador, e L-treonina é coletada deste meio de fermentação. Além disso, na presente invenção, o termo "fermentador" significa um vaso em que a fermentação de L-treonina é realizada, e a sua forma não é limitada. Um ianque de fermentação 011 um fermentador em jarro pode ser usado. Além disso, o volume do fermentador não é limitado contanto que L-treonina possa ser produzida e coletada.

Embora a concentração de eiixofre seja preferivelmente limitada a um nível predeterminado ou menor através de todo processo de cultura, ela pode ser limitada durante uma parte do processo. Por exemplo, quando o método da presente invenção incluir um estágio no qual as células se proliferam (fase de crescimento) e um estágio no qual L-treonina é produzida (fase de produção de L-treonina), é suficiente que a concentração de enxofre seja limitada a um nível predeterminado ou menor na fase de produção de L-treonina. Na fase de crescimento (durante a proliferação celular), enxofre pode estar presente no meio em mais que a quantidade predeterminada, ou a concentração de enxofre pode ser limitada ao nível predeterminado ou menor. Além disso, durante o estágio no qual L-treonina é produzida, o teor de enxofre não precisa estar na faixa mencionada acima por todo o período deste estágio, e o teor de enxofre pode estar no nível mencionado acima ou maior durante um período inicial deste estágio, e pode ser reduzido com o tempo de cultura. Além disso, enxofre pode ser adicionado intermitentemente quando ele seja curto. O termo "fase de crescimento" usando na presente invenção significa um período dentro de 3 horas, preferivelmente 6 horas, particularmente preferivelmente 10 horas, do início da cultura, durante o qual período a fonte de carbono é principalmente consumida para o crescimento de células de bactérias, isto é, células que se proliferam logaritmamente. O teimo "fase de produção de L-treonina" usado na presente invenção significa um período após as 3 horas iniciais, preferivelmente 6 horas, particularmente preferivelmente 10 horas, desde o início da cultura, durante o qual a fonte de carbono é principalmente consumida para a produção de L-treonina.

E suficiente que o meio de fermentação contenha uma quantidade mínima de enxofre, que é requerida para o crescimento do microorganismo, contudo, a quantidade de enxofre pode temporariamente ficar pouca. A frase "ficar pouca" significa que a concentração de enxofre é reduzida quando comparada com pontos anteriores na cultura, e pode ainda se tornar "0". O termo "temporariamente" significa que, por exemplo, enxofre pode ficar curto por um período correspondente a cerca de 20%, cerca de 40%, ou cerca de 60°<o no máximo, de todo o período de fermentação. Durante o período quando enxofre fica curto, embora a concentração possa temporariamente ser Ov enxofre está desejavelmente presente no meio de fermentação em uma concentração de 1 ^ig/l ou mais, 10 μο/i ou mais, ou 100 Ltg/l ou mais. Assim, mesmo que a concentração de enxofre se tome, temporariamente, Oi uma cultura de um meio contendo enxofre por qualquer período é englobada dentro da expressão "cultura de um microorganismo que pertence ao gênero Escherichia em um meio de fermentação contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, e uma fonte de enxofre". A concentração cie enxofre no meio de cultura pode ser medida pelo método de cromatografia e o método de frasco quente. Além disso, de acordo com a presente invenção, a concentração de enxofre no meio de alimentação pode ser ajustada de forma que ela seja limitada a um nível predeteiminado ou menor quando a cultura alimentada por batelada puder ser empregada. Por exemplo, quando a concentração de enxofre for limitada pelo uso cie uma cultura alimentada por batelada, é preferível se controlar a concentração de enxofre no meio de fermentação para que seja 0,35 g/1, mais preferivelmente 0,25 g/l ou menor, mais preferiveimente 0,10 g/l ou menor.

Exemplos da fonte de carbono usada na presente invenção incluem sacarídeos, tais como glucose, glicerol, frutose, sacarose, maltose, manose, galactose, hidrolisado de amido, e melaço. Glucose e sacarose são particulannente preferidas. Em adição, os ácidos orgânicos, tais como ácido acético e ácido cítricô, e álcoois, tais como etanol, podem também ser usados sozinhos ou em combinação com outra fonte de carbono. Além disso, o material bruto da fonte de carbono pode sei- melaço de cana, melaço de beterraba, melaço de teste alto e melaço cítric-o, e hidrolisaclos de materiais brutos naturais, tais como celulose, amido, milho, cereal e tapioca. Além disso, clióxido de carbono dissolvido em um meio cie cultura pode também ser usado como uma fonte de carbono. Estas fontes de carbono podem ser usadas no meio inicial e/ou no meio cie alimentação. O meio pode conter um ou mais tipos destas fontes de carbono. Além clisso, a mesma fonte de carbono pode sei" usada para o meio inicial e para o meio de alimentação, ou a fonte de carbono do meio de alimentação pode ser diferente daquela do meio inicial. Por exemplo, glucose pode ser usada no meio inicial, enquanto que sacarose pode ser usada no meio de alimentação.

Exemplos da fonte de nitrogênio usada na presente invenção incluem amorna, sais de amònio, tais como sulfato de amônio, carbonato de amônio, cloreto de amonio, fosfato de amônio, acetato de amônic» e uréia, nitratos, e assim por diante. Gás de amônia e amônia aquosa, que são usados para ajustar o pH. podem também ser utilizados como a fonte de nitrogênio. Além disso, peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, licor de farelo de milho, hidrolisado de feijão-soja, e assim por diante, podem ser usados. O meio pode conter um ou mais tipos destas fontes de nitrogênio. Estas fontes de nitrogênio podem também ser usadas no meio inicial e/ou no meio de alimentação. Além disso, a mesma fonte de nitrogênio pode ser usada no meio inicial e no meio de alimentação, e a fonte de nitrogênio do meio de alimentação pode ser diferente daquela do meio inicial.

Além disso, o meio da presente invenção preferivelmente contém uma fonte de ácido fosfórico em adição a uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, e enxofre. Como a fonte de ácido fosfórico, diidrogenofosfato de potássio, hiidrogenofosfato de dipotássio, e polímeros de fosfato, tais como ácido piro fosfórico, podem ser utilizados.

Além disso, o meio cia presente invenção pode conter um fator de promoção de crescimento (um nutriente tendo um efeito de promoção de crescimento) em adição a uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, e enxofre. Os fatores de promoção de crescimento que podem ser usados incluem metais traço, aminoácidos, vitaminas, ácidos graxos, ácidos nucleicos, bem como peptona, ácido casamino, extrato de levedura, hidrolisado de proteína de feijão-soja.

Exemplos dos metais traço incluem ferro, manganês, magnésio, cálcio, potássio, sódio e assim por diante. Exemplos das vitaminas incluem vitamina Bi, vitamina B2, vitamina B0, ácido nicotínico, amida de ácido nicotínico, vitamina B12, e assim por diante. Estes fatores de promoção de crescimento podem estar contidos no meio inicial ou no meio de alimentação.

Além disso, quando um mutante que requer um aminoácido ou semelhante para o seu crescimento for usado, é preferível se adicionar o nutriente requerido ao meio. Em particular, como a via biossintética de L- treonina é freqüentemente melhorada e a habilidade de degradação de L- treonina é freqüentemente atenuada nas bactérias produtoras de L-treonina que podem ser usadas para a presente invenção como descrito abaixo, L- lisina, L-homoserina, L-isoleucina, L-metionina. ou uma combinação destes são preferivelmente adicionados.

U meio inicial e o meio de alimentação podem ter a mesma ou diferentes composições. Além disso, o meio inicial e o meio de alimentação podem ter a mesma ou diferentes concentrações de enxofre. Além disso, quando o meio de alimentação for adicionado em vários estágios, a composição do meio de alimentação adicionado em cada estágio pode ser igual ou diferente.

A cultura é preferivelmente realizada com aeração, preferivelmente em uma temperatura de fermentação de 20 a 45°C, particularmente preferivelmente em 33 a 42°C. A concentração de oxigênio é preferivelmente ajustada para de 5 a 50%, mais preferivelmente para cerca de 1U0 o. Além disso, aeração é preferivelmente realizada com o pH ajustado para de 5 a 9. Se o pH for diminuído durante aa cultura, por exemplo, carbonato de cálcio ou um alcalino, tal como gás amônia e amônia aquosa, pode ser adicionado para neutralizar a cultura. Quando a cultura for realizada sob tais condições, preferivelmente por de cerca de 10 a 120 horas, uma quantidade notada de L-treonina se acumula no meio de cultura. A concentração de L- treonina acumulada não é limitada contanto que L-treonina possa ser isolada e coletada do meio, e é 50 g/l ou maior, desejavelmente 75 g/l ou maior, mais desejavelmente, 100 g/l ou maior.

Na presente invenção, a cultura de microorganismo pode ser realizada por cultura de semente e/ou uma cultura principal de forma a induzir a acumulação de L-treonina maior que um certo nível. A cultura de semente pode ser realizada por misturação, usando um frasco ou semelhantes, ou uma cultura de batelacla. A cultura principal pode ser realizada como cultura com alimentação em batelada ou uma cultura contínua. Alternativamente, tanto a cultura cie semente como a cultura principal podem ser realizadas como uma cultura em batelada.

Nestes métodos de cultura, quando a concentração de L- treonina alcançar um nível predeterminado, uma parte do caldo de fermentação pode ser retirada, e meio fresco pode ser adicionado para repelir a cultura. Como o meio fresco, um meio contendo uma fonte de carbono e um nutriente tendo um efeito de promoção de crescimento (fator de promoção de crescimento) é preferido, e preferivelmente contém enxofre em uma concentração predeterminada ou menor. A expressão "concentração predeterminada ou menor" significa que o meio a ser adicionado é ajustado, de forma que a concentração de enxofre no meio de fermentação se torne 0,35 g/l ou menor, desejavelmente 0,25 g/l ou menor, mais desejavelmente 0,10 g/l ou menor. Como a fonte de carbono, gliicose, sacarose e frutose são preferidas. Como o fator de promoção de crescimento, fonte de nitrogênio, ácido fosfórico, aminoácidos e assim por diante são preferidos. Como a fonte de nitrogênio, amônia, sais de amônio, tais como sulfato de amônio, carbonato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, acetato de amônio e uréia, nitratos, dentre outros podem ser usados. Além disso, como a fonte de ácido fosfórico, diidrogenofosfato cie potássio e hiclrogenofosfato de dipotássio podem ser usados. Como para aminoácidos, quando uma cepa mutante auxotrópica for usada, é preferível se suplementar com o aminoácido requerido.

Quando a cultura alimentada em bateladas ou cultura contínua ior realizada de acordo com a presente invenção, a adição do meio de alimentação pode ser intermitentemente suspensa, de forma que o suprimento de sacarícleos ou nutrientes seja temporariamente suspenso. A adição do meio de alimentação é preferivelmente suspensa por, no máximo, 30%, desejavelmente 20%, particularmente desejavelmente 10%, do tempo de alimentação. O "tempo de alimentação" significa o período desde o início da primeira adição do meio de alimentação até o final da última adição do meio de alimentação. A suspensão da adição do meio de alimentação pode ser menor que 30'? o, e, mais preferivelmente, menor que 10%. Quando o meio de alimentação for intermitentemente adicionado, o meio de alimentação pode ser inicialmente adicionado durante um tempo predeterminado, e a segunda adição e as seguintes podem ser controladas, de forma que sejam iniciadas quando um aumento no pH ou no consumo de oxigênio dissolvido seja detectado por um computador. Tal detecção tipicamente ocorre 110 esgotamento da fonte de carbono 110 meio de fermentação durante um período de adição/suspensão antes de um certo período de adição, e assim a concentração de substrato no tanque de cultura deve ser automaticamente e consistentemente mantida em um nível baixo (Patente U.S. 5.912.113).

O meio de alimentação usado para a cultura alimentada em bateladas é preferivelmente um meio contendo uma fonte de carbono e um nutriente tendo um efeito de promoção de crescimento (fator de promoção de crescimento), e pode conter enxofre, de forma que a concentração de enxofre no meio de fermentação seja mantida em uma concentração predeterminada ou menor. A expressão "concentração predeterminada ou menor", como usado aqui, significa que o meio adicionado é ajustado de fonria que a concentração de enxofre no meio de fermentação seja mantida em uma concentração de 0,35 g/l ou menor, desejavelmente 0,25 g/l ou menor, mais desejavelmente 0,10 g/l ou menor. Embora a concentração de enxofre do meio de alimentação sozinho possa estar dentro ou fora da faixa de concentrações mencionada acima, ela está preferivelmente dentro da faixa de concentrações mencionada acima.

Como a fonte de carbono, glucose, sacarose e frutose são preferidos. Como o fator de promoção de crescimento, fontes de nitrogênio, ácido fosfórico, aminoácidos, dentre outros, são preferidos. Como a fonte de nitrogênio, amônia, sais de amônio, tais como sulfato de amônio, carbonato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, acetato de amônio e uréia, nitratos, e assim por diante, podem ser usados. Além disso, como a fonte de ácido fosfórico, diidrogenofosfalo de potássio e hiidrogenofosfato de dipotássio podem ser utilizados. Como para os aminoácidos, quando uma cepa mutante auxotrópica for usada, é preferível se suplementar com o aminoácido requerido. Além disso, o meio de alimentação pode ser de um tipo, ou uma mistura de dois ou mais tipos de meios. Quando dois ou mais tipos de Jiieios de alimentação forem usados, o meio pode ser misturado e adicionado pelo uso de uma lata de alimentação ou pelo uso de duas ou mais latas de alimentação.

Além disso, quando uma cultura alimentada em bateladas for realizada, a adição é preferivelmente realizada de forma que a quantidade de sacarídeos não exceda 30 g/l, preferivelmente 20 g/l, mais preferivelmente 10 g/l, do meio de cultura ou meio de fermentação alimentado em bateladas. Em particular, a concentração de sacarídeos é preferivelmente controlada para estar dentro da faixa de concentrações mencionada acima após o término do crescimento logaritmo do microorganismo. A taxa de alimentação da fonte de carbono pode ser controlada pelo método descrito na Patente U.S. 5.912.113. Além disso, o sacarídeo e o ácido fosfórico são preferivelmente alimentados de forma que as concentrações sejam tais que o sacarídeo e o ácido fosfórico sejam fatores limitantes para o crescimento de células bacterianas. O ácido fosfórico está presente no meio de alimentação de forma que a relação fósforo/carbono (P/C) seja 2 ou menor, preferivelmente 1,5 ou menor, mais preferivelmente 1 ou menor (Patente U.S. 5.763.230).

guando o método de cultura contínuo for usado para a presente invenção, o meio pode ser removido e adicionado simultaneamente, ou u ma parte do meio pode ser extraída, e então o meio pode ser adicionado. Além disso, o método pode também ser um método de cultura contínuo de remoção do meio de cultura contendo L-treonina e células bacterianas e reciclando somente as células para o fermentado]· (Patente francesa No. 2669935). Como o método de adição contínua ou intermitenle de uma fonte de nutrientes, o mesmo método usando na cultura alimentada em bateladas é usado.

Quando o meio de cultura for intermitentemente removido, uma parte de L-treonina é coletada quando a concentração de L-treonina alcançar um nível £>redeterminado, e meio fresco é adicionado para continuar a cultura. Além disso, como para a quantidade do meio fresco a ser adicionado, a quantidade final do meio total na cultura após a adição do meio fresco é igual à quantidade do meio de cultura antes da extração. O termo "igual", como usado aqui, significa cerca de 93 a 107% da quantidade do meio de cultura antes da extração.

Quando o meio de cultura for continuamente removido, a remoção é preferivelmente iniciada ao mesmo tempo que, ou após, a adição do meio de nutrientes. Por exemplo, o tempo de início é, no máximo, 5 horas, preferivelmente 3 horas, mais preferivelmente 1 hora, após o início da adição. Além disso, a quantidade removida do meio de cultura é preferivelmente igual à quantidade do meio adicionado. O método de cultura contínuo de reutilização de células bacterianas é um método de remoção contínua ou intermitente do meio de fermentação quando a concentração de aminoácido alcançar um nível predeterminado, remoção somente de L-treonina, e filtração com recirculação de resíduos contendo células bacterianas no fermentador, e pode ser realizado como referência a, por exemplo, Patente francesa No. 2669935.

A análise de L-treonina e de outros aminoácidos pode ser realizada por cromatografia de troca aniónica seguida pela derivação de ninidiina, como descrito em Analytical Chemistry 30:1190-1206 (195S) ou por HPLC em fase reversa como descrito em Lindroth et al. (Analytical Chemistty 51:1167-1174).

Método para a produção de aditivo de alimentação animal baseado em caldo de fermentação produzido pela presente invenção

Um aditivo de alimentação de animal baseado em caldo de fermentação produzido pela presente invenção pode ser preparado pelo seguinte método de separação.

Os métodos de separação de L-treonina, tais como centrifugação, filtração, decantação, floculação ou uma combinação destes podem ser usados para remover ou reduzir biomassa.

U caldo obtido por esta invenção pode ser espessado ou concentrado usando métodos conhecidos, tais como um evaporador rotativo, evaporador de camada fina, osmose reversa, ou nanofiltração (FR8Ó13346B, US4,997,754, EP410005B, JP1073646B).

U caldo concentrado é então processado usando os métodos de secagem por congelamento, secagem por aspersão, granulação por aspersão ou qualquer outro processo para dar um pó finamente dividido preferivelmente de I7Iuxo livre para aditivo de alimentação de animal. Este pó finamente dividido de fluxo livre pode ser convertido em um produto livre de poeira e estável, de grãos grandes, com fluxo bem livre, pelo uso de processos de compactação ou granulação adequados. Mais que 90% de água são removidos desta forma, de forma que a concentração de água do aditivo de animal de alimentação seja menor que 10%, preferivelmente menor que 5% em peso.

O teor de proteínas do aditivo de alimentação pode ser menor que 10%, preferivelmente menor que 5% em peso, e a concentração de L- treonina pode ser maior que 50%., preferivelmente maior que 85%, mais preferivelmente maior que 95%.. (US5,431,933, JP1214636B, US4,956,471, US4,777,051, US4946Ó54, US5,840358, USÓ,238,714, US2005/0025S7S).

A etapa de separação descrita acima não necessariamente tem que ser realizada, mas pode sei- combinada em uma maneira tecnicamente expediente.

Bactérias Escherichia que podem ser usadas para a presente invenção

As bactérias Escherichia que podem ser usadas paira a presente invenção são bactérias Eseheriehia tendo unia capacidade de produzir L- treonina, e o termo "capacidade de produzir L-treonina" usado na presente invenção significa uma capacidade, quando as bactérias são cultivadas em um meio, de produzi]· L-treonina livre no meio, isto é, fora das células, em uma extensão tal que L-treonina possa ser coletada do meio. Preferivelmente, a bactéria de Escheriehia usada para a presente invenção é uma cepa que é crescida de forma que a cepa possa produzir uma maior quantidade de L- treonina quando comparada com cepas do tipo selvagem ou cepas parentais. Especificamente, é preferível que a bactéria de Eseheriehia produza uma quantidade de L-treonina de 30 g/l ou maior, mais preferivelmente 50 g/l ou maior, particularmente preferivelmente 75 g/l ou maior, usando um meio de cultura típico no qual a concentração de enxofre não é ajustada.

As cepas originárias de bactérias Eseheriehia usadas para obter as bactérias de Eseheriehia adequadamente usadas para a presente invenção não são particularmente limitadas, e exemplos específicos destes incluem aqueles mencionados no trabalho de Neidhardt et al. (Neidhardt, F.C. ei al., Eseheriehia eoli and Salmomlla Typhimiirinm, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1029, Tabela 1). Dentre estas, por exemplo, E. eoli é preferivelmente usada. Exemplos específicos da Eseheriehia eoli incluem Eseheriehia eoli W3Í10 (ATCC 27325) e Eseheriehia eoli MGl655 (ATCC 47076), ambas são derivadas de urna cepa Kl 2 tipo selvagem, dentre outras.

Para obtenção destas cepas, elas podem ser obtidas de, por exemplo, American Type Culture Collection (endereço: P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, Estados Unidos). Para cada cepa bacteriana é dado um número de registro correspondente, e cada cepa pode sei* ordenada pelo uso deste número de registro. Os números de registro correspondentes às cepas bacterianas são listados no catálogo da American Type Culture Collection. Conferimento de capacidade de produção de L-treonina

A seguir, o método para conferir uma capacidade de produção de L-treonina a uma bactéria de Escherichia vai ser descrito.

Para conferir uma capacidade de produção de L-treonina, os métodos podem ser usados, os quais tendiam sido convencionalmente adotados para procriação de bactérias Eseheriehia ou de bactérias corineiformes, tais como aquisição de um mutante auxotrópico, cepa resistente análoga, ou cepa mutante de controle de metabolismo, todas têm uma capacidade de produção de L-treonina, bem como construção de uma cepa recombinante na qual uma atividade cie uma enzima de biossíntese de L- treonina é aumentada. Por exemplo, uma cepa recombinante ou mutante pode ser modificada de forma que uma enzima de biossíntese de L-treonina não seja submetida à inibição de realimentação, ou uma cepa recombinante pode ser modificada para aumentar a expressão de um gene de enzima de biossíntese de L-treonina. Na procriação de bactérias de produção de L- treonina por estes métodos, propriedades, tais como auxotrofia, resistência análoga, e unia mutação de controle metabólico, podem ser conferidas sozinhas ou em combinação. Quando a atividade de uma enzima de biossíntese de L-treonina for aumentada, uma ou mais destas atividades de enzimas podem ser aumentadas. Além disso, o conferirnento das propriedades mencionadas acima e o aumento da atividade enzimática, como mencionado acima, podem sei· implementadas em combinação.

Um exemplo de um método para conferir capacidade de produção de L-treonina para uma bactéria de Eseherichia, ou aumentar a capacidade de produção de L-treonina pelo aumento da atividade de uma enzima de biossíntese de L-treonina, será explicado abaixo. Uma atividade enzimátiea pode ser aumentada por, por exemplo, indução de uma mutação em uma codificação de gene para a enzima ou amplificação do gene de forma que atividade intracelular da enzima aumente. Estas podem ser alcançadas utilizando técnicas de recombinação de gene.

Exemplos dos genes que codificam enzimas de biossíntese de L-treonina incluem o gene aspartoquinase III (IysC), gene de aspartato de semi-aldeído desidrogenase (asd), gene aspartoquinase I incluída no operon thr UhrA, números de nucleotídeo 337 a 2799 de SEQ ID NO: 1), gene bomoserina quinase (thrB, números de nucleotídeo 2S01 a 3733 de SEQ ID NO: 1), e gene treonina sintase (íhrC, números de nucleotídeo 3734 a 5020 de SEQ ID NO: 1). Mostrados ai ire parêntesis estão os nomes abreviados destes genes. Dois ou mais destes genes podem ser introduzidos em uma bactéria. Os genes biossintéticos de L-treonina podem ser introduzidos em uma bactéria de Escherichia na qual a degradação de treonina é suprimida. Exemplos da bactéria de Escherichia na qual a degradação de treonina é suprimida incluem a cepa de TDH6, que é deficiente na atividade de treonina desidrogenase (EP114991 IA), dentre outras.

As atividades enzimáticas de enzimas de biossíntese de L- treonina são inibidas por L-treonina como o produto final. Portanto, para construir uma bactéria que produz L-treonina, uma modificação de genes do sistema de biossíntese de L-treonina, de forma que as enzimas codificadas não sejam submetidas à inibiçáo de realimentação por L-treonina, é benéfica. Os genes de thrA, ihrB e thrC mencionadas acima constituem o operon de treonina, e o operon de treonina tem uma estrutura atenuadora. A expressão do operon de treonina é inibida por isoleucina e treonina presentes no meio de cultura, e é suprimida por atenuação. A modificação mencionada acima pode ser alcançada pela remoção da seqüência líder na região de atenuação (SEQ ID NO: 6), ou pela remoção do atenuador (SEQ ID NO: 1) (Publicação Internacional de Patente WOÓ2/26993; Biotechnology Letters, Vol. 24, No. 21 de Novembro de 2002; Publicação Internacional de Patente W005/049808, W09S/04715, W003/097839). Em particular, é desejável se modificai· o operou de treonina de forma que a seqüência dos nucleotídeos 188 a 310 seja removida da seqüência de SEQ ID NO: 1. Alternativamente, a modificação do operou de treonina, de forma que a seqüência dos nucleotídeos 148 a 310 seja removida da seqüência da SEQ ID NO: 1, é também desejável.

Um promotor nativo existe em uma região à montante do operon de treonina, e pode ser substituído com um promotor não-nativo (refere-se à W098/04715). Alternativamente, o operon de treonina pode ser construído de forma que a expressão dos genes envolvidos na biossíntese de treonina seja regulada pelo repressor e pelo promotor de fago lãmbda (referência à Patente Européia No. 0593792). Além disso, uma bactéria de Escherichia modificada, de forma que ela não seja submetida à inibição de realimentação por L-treonina, pode também ser obtida pela seleção de uma cepa resistente a ácido α-amino-p-hidroxivalérico (AI-IV) (referencia a W003/097S39).

Além disso, cópias múltiplas do operon de treonina que foi modificado, de forma que ele não seja submetido à inibição de realimentação por L-treonina, preferivelinente pode estar presente. Alternativamente, o operon é ligado a um promotor forte de forma que a expressão seja aumentada. O número de cópias do operon de L-treonina pode ser aumentado pela sua amplificação usando um plasmideo e/ou o transferindo para um cromossomo usando um transposon, fago Mu, ou semelhante (Patente U.S. 5.175.107).

Além disso, um gene de aspartoquinase III (lys Cj que tenha sido modificado, de forma que não seja submetido à inibição de realimentação por L-lisina, é preferivelmente usado. Tal gene lys C pode ser obtido pelo método descrito na Patente U.S. 5.932.453. Em adição às enzimas de biossíntese de L-treonina, é também preferível se aumentai" a expressão de genes referentes à via glicolítica, ciclo TCA5 ou cadeia de respiração, genes que regulam a expressão de um gene, e genes de captação de sacarídeos. Exemplos dos genes que têm um efeito na produção de L-treonina incluem o gene transidrogenase (pntAB) (Patente Européia No. 733712), o gene fosfoenolpiruvato carboxilase (pepC) (Publicação Intemacional de Patenie WG95/06114, US2005-G136518), o gene fosfoenolpiruvato sintase (pps) (Patente Européia No. 877090), e o gene piíuvato carboxilase de bactérias corineformes ou Bacillus (Publicação Internacional de Patente W099/1S22S; Publicação de Patente Européia No. 1092776).

Além disso, é também preferível se aumentar a expressão de um gene que confere resistência a L-treonina, ou um gene que confere resistência a L-homoserina, ou ambos em combinação com um hospedeiro. Exemplos de um gene que confere resistência incluem o gene rhtA (Res. Microbiol., 2003 Mar., 154(2): 123-35), o gene rhtB (Publicação de Patente Européia No. 0994190), o gene rhtC (Publicação de Patente Européia No. 1013765), o gene yfiK, e o gene yeaS (Publicação de Patente Européia No. 101671U). Além disso, os métodos para conferir resistência a L-treonina a um hospedeiro são descritos na Publicação de Patente Européia No. 0994190 e na Publicação Internacional de Patente W090/04636.

As atividades de enzimas codificadas pelos genes mencionados acima podem ser aumentadas pelo aumento da expressão dos genes, por exemplo, pelo aumento dos números de cópias dos genes nas células usados técnicas de recombinação de genes. Por exemplo, um fragmento de DNA contendo um gene alvo pode ser ligado a um vetor que funciona em um microorganismo hospedeiro, preferivelmente um vetor do tipo multi-copia, e o microorganismo de hospedeiro pode ser transformado com este Dis7A de vetor. Quando um gene de Escherichia coli for usado como o gene alvo, ele pode ser obtido pela preparação de iniciadores pela referência à seqüência de genes conhecida em Escherichia eoli MG1655 ou W3110 registrado no GenBanJc e realização de uma reação de cadeia de polimerase (PCR) usando DNA cromossomal de Eseherichia coli como um padrão (referência a White, T.J. et ai., Trends Genet. 5, 1S5 (19S9)). Os genes alvo de outros microorganismos podem também sei* obtidos de DNAs cromossomais ou coleções de DNA cromossoma) dos microorganismos por PCR usando iniciadores preparados baseados na informação de genes para os microorganismos ou informação de seqüência do GenBanl;, ou hibridização usando um oligonucleotídeo preparado baseado na informação de seqüência mencionada acima como uma sonda. DNA cromossoma] pode ser preparado a partir de um microorganismo doador, por exemplo, pelo método de Saito and Miura (refer to H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963); Text for Bioengineering Experimenis, Edited bv the Society for Bioscience and Bioengineering, Japão, pp.97-98, Baifukan, 1992), dentre outros.

Além disso, como as seqüências de nucleotídeos de genes que codificam uma enzima alvo podem variar dependendo da espécie das bactérias ou cepas de bactérias Eseheriehia, o gene alvo para a presente invenção não é limitado a genes ou seqüências de genes conhecidas registradas no GenBanlL, e pode ser um gene mutante ou modificado artificialmente. Tai gene mutante ou modificado pode codificar uma proteína que tem uma seqüência que inclui substituições, deleções, inserções, adições, ou semelhantes, de um ou vários resíduos de aminoácidos em um ou mais sítios, contanto que a função da proteína alvo codificada, isto é, a capacidade de produção de L-treonma, pode ser melhorada por amplificação do gene. O número pretendido pelo termo "vários" usando aqui varia dependendo das posições dos resíduos de aminoácidos na estrutura tridimensional da proteína e do tipo dos resíduos de aminoácidos. Contudo, ele é especificamente de 1 a 20, preferível mente de 1 a 10, mais preferivelmente de 1 a 5.

A substituição mencionada acima é preferivelmente uma substituição consei*vativa, que é uma mutação neutra que não causa mudança funciona]. A mutação conservativa é uma mutação em que substituição ocorre entre Phe, Trp e Tyr quando o local de substituição for um aminoácido aromático, dentre Leu, Ile e Vai, quando o local de substituição for um aminoácido hidrofóbico, entre Gin e Asn quando o local de substituição for um aminoácido polar, dentre Lys, Arg e His quando o local de substituição for um aminoácido básico, entre Asp e Glu quando o local de substituição for um aminoácido ácido, e entre Ser e Tlir quando o local de substituição for um aminoácido tendo um grupo hidroxila. Mais especificamente, exemplos da substituição conservativa incluem a substituição de Ser ou Thr por Ala, substituição de Gln, His ou Lys for Arg, substituição de Glu, Gln, Lys, His ou Asp por Asn, substituição de Asn, Giu ou Gln por Asp, substituição de Ser ou Ala por Cys, substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg por Gln, substituição de Gly, Asn, Gln, Lys ou Asp por Glu, substituição de Pro por Gly, substituição de Asn, Lys, Gln, Arg ou Tyr por ITis, substituição de Leu, Met, Val ou Phe por lie, substituição de Ue, Met, Val ou Phe por Leu, substituição de Asn, Glu, Gln, His ou Arg por Lys, substituição de Ile, Leu, Val ou Phe por Met, substituição de Trp, Tyr, Met, lie ou Leu por Phe, substituição de Thr ou Ala por Ser, substituição de Ser ou Ala por Thr, substituição cie Phe ou Tyr por Tip, substituição de His, Phe ou Trp por Tyr and substituição de Met, Ile ou Leu por Vai.

Além disso, um gene homólogo pode também ser usado, contanto que ele tenha a mesma função que o gene alvo. Especificamente, o gene homólogo deve codificar uma proteína que tenha uma homologia de 80% ou mais, preferivelmente 90%. ou mais, mais preferivelmente 95% ou mais, particularmente preferivelmente 97% ou mais, com relação a uma seqüência de uma proteína conhecida. Além disso, como a degeneração de um gene varia dependendo do hospedeiro no qual o gene é introduzido, um gene com substituições de códons que pode facilmente ser usado em um hospedeiro pode ser usado. Similamiente, contanto que a capacidade de produção de L-treonina do gene alvo possa ser melhorada por amplificação do gene, o gene pode ser estendido ou encurtado no terminal N ou no terminal C. O comprimento da extensão ou encurtamento é, por exemplo, 50 ou menos, preferivelmente 20 ou menos, mais preferivelmente 10 ou menos, particularmente preferivelmente 5 ou menos, em termos do número de resíduos de aminoáeidos. Mais especificamente, a proteína pode ter uma seqüência de aminoáeidos que é encurtada por 5-50 resíduos de aminoáeidos no terminal N e/ou no terminal C.

Um gene homólogo ao gene alvo pode ser obtido pela modificação da seqüência de nucleotídeos por, por exemplo, mutagênese específica para um local, de forma que a proteína codificada inclua substituições, deleções, inserções ou adições de resíduos de aminoáeidos em um loca) específico. Além disso, tal gene pode também ser obtido por tratamento de mutação conhecidos, corno descrito abaixo. Exemplos destes tratamento de mutação incluem um método de tratamento da seqüência de nucleotídeos do gene alvo in vitro com hidroxilamina ou semelhante, um método de tratamento de um microorganismo tendo o gene, por exemplo, uma bactéria de Escherichia, coin irradiação de UV ou agente de mutagênese típico, tal como N-metil-N'-nitiO-N-nitiOsoguanidina (NTG) ou etil metanosulfonato (EMS), e um método de introdução de uma mutação por PCR inclinado a erro. Além disso, as substituições, deleções, inserções, adições, inversões, ou semelhantes mencionadas acima, de resíduos de aminoáeidos incluem mutações de ocoirência natural (mutante ou variante), tais como mutações baseadas em diferenças individuais e/ou diferenças de espécies do microorganismo tendo o gene alvo. Se estes genes codificarem uma proteína que melhore a capacidade de produção de L-treonina quando seus níveis de expressão forem aumentados puderem ser confirmados, por exemplo, pela introdução destes genes em uma cepa tipo selvagem ou em uma cepa tendo capacidade de produção de L-treonina de Escherichia coli e examinar se a capacidade de produção de L-treonina é melhorada.

O gene alvo pode também ser DNA que hibridiza com urna seqüência de nucleotídeos alvo, ou uma seqüência complementar desta, ou uma sonda preparada a partir destas seqüências sob condições estringentes e codifica uma proteína que melhora a capacidade de produção de L-treonina de bactérias Eseheriehia pelo aumento da expressão. As "condições estringentes" referidas aqui incluem condições sob as quais um híbrido específico é formado, e um híbrido nâo-específíco não é formado. É difícil se expressar claramente esta condição pelo uso de qualquer valor numérico. Contudo, por exemplo, as condições estringentes incluem condições sob as quais DNAs tendo alta homologia, por exemplo, DNAs tendo uma homologia de 50% ou mais, preferivelmente Ó0°'o ou mais, mais preferivelmente 70% ou mais, mais preferivelmente S0? o ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais, mais preferivelmente 95% ou mais, mais preferivelmente 97% ou mais, hibridizam entre si, mas DNAs tendo uma homologia menor que aquela acima não hibridizam entre si. Alternativamente, as condições estringentes são exemplificadas pela lavagem uma vez, preferivelmente de 2 a 3 vezes, sob condições para hibridização em uma concentração de sal que são típicas para a lavagem em hibridização de Southern, i.e., 1 χ SSC5 0,1%. SDS a 60°C, preferivelmente 0,1 χ SSC, OJ0 ó SDS a 68°C.

Então, urn DNA recombinante é preparado pela ligação do gene alvo amplificado por PCR a um DNA vetor que pode funcional na célula de um microorganismo hospedeiro. Tal vetor inclui um vetor autonomamente replicável na célula do microorganismo hospedeiro. Exemplos do vetor autonomamente replicável em células de Eseheriehia eoli incluem pUC19, PUClSf PHSG299, pHSG399, pHSG39S, pACYC184, (pHSG e pACYC são disponibilizados pe]a Takara Bio Inc. ), RSFl 010, pBR322, pMW219 (pMW é disponibilizado pela Nippon Gene), dentre outros.

Llm DNA recombinante preparado como descrito acima pode ser introduzido em um microorganismo por um método de transformação conhecido. Exemplos incluem um método de tratamento de células receptoras com cloreto cie cálcio, de forma a aumentar a permeabilidade de DNA, que foi relatado para Eschenchia eoli K-12 (Mandei, M. and Higa, A., J. MoL Biol., 53, 159 (1970)), um método de preparação de células competentes a partir de células que estão em fase de crescimento, seguido pela introdução de DNA nelas, que foi relatado para BaeiUus suhiilis (Duncan, CIT., Wilson, G.A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)), dentre outros. Em adição a estes, um método de fabricação de células receptoras de DNA em protoplastos ou esferoplastos, que pode facilmente captar DNA recombinanbte, seguido pela introdução do DNA recombinante nas células receptoras de DNA, que é conhecido por ser aplicável a Bacillus subtilis, actinomicetes, e leveduras (Chang, S. and Cohen, S.N., Molec. Gen. Genet., 16S, 111, 1979; Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 39S, 1978; Hinnen, A., Hicks, J-B. and Fink, G.R., Proc. Natk Sei. USA, 75, 1929 (197S)), podem ser usados.

O aumento do número de cópias de um gene pode também ser alcancado pela introdução de cópias múltiplas do gene no DNA cromossoma! de urn microorganismo. Para se introduzir cópias múltiplas, uma recombinação homóloga pode ser realizada pelo uso de uma seqüência cujas cópias múltiplas existem em um DNA cromossoma! como alvos. Como seqüências cujas cópias múltiplas existem em um DNA cromossomal, DNA repetitivo e repetições invertidas existentes no final cie um elemento de transporte podem ser usados. Um gene alvo pode também ser introduzido em um gene desnecessário em um cromossoma por recombinação homóloga, ou um gene alvo pode ser introduzido em uma região não necessária em tandem. Alternativamente, como descrito na Patente Japonea No. 2-1099S5, é também possível se incorporar um gene alvo em um transposon, e permitir que ele seja transferido para introduzir cópias múltiplas dos genes em um DNA cromossoma] (referência à Patente U.S. 5.595.889). Se o gene alvo tiver sido transferido para um cromossomo pode ser confirmado por hibridização de Southem usando uma parte do gene alvo como uma sonda.

Além disso, em adição ao aumento do número de cópias do gene, a expressão do gene alvo pode seu aumentada pela substituição de uma seqüência de controle de expressão, tal como um promotor do gene alvo em um DNA cromossoma! ou plasmídeo com um mais forte, amplificação de um regulador que aumenta a expressão, ou deleção/atenuação de um regulador que diminui a expressão como descrito na Publicação Internacional de Patente WOuO/18935. Por exemplo, o promotor de lac, o promotor de trp, o promotor de trc, o promotor de Pr derivado do fago lámbda, dentre outros, são conhecidos como promotores fortes. Além disso, o promotor do gene alvo pode ser modificado para sei" mais forte pela introdução de uma substituição de nucleotídeos na região promotora. A avaliação da potência do promotor, bem como uma descrição de promotores fortes conhecidos, são mostradas em Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128). Além disso, é sabido que a substituição de um espaçador entre o local de ligação de ribossomos (RBS) e o códon inicial, particularmente, substituição de vários nucleotídeos na seqüência imediatamente à montante do códon inicial, tem um grande impacto na eficiência de tradução de mRNA, e estes nucleotídeos podem ser modificados. Uma região de controle de expressão, tal como um promotor, pode também ser determinada usando-se um vetor de busca de promotor ou um programa de software de análise de genes, tal como GENETYX. A expressão do gene alvo é aumentada pela substituição ou modificação destes promotores. A seqüência de controle de expressão pode ser substituídas pelo uso, por exemplo, de um plasmídeo sensível à temperatura.

Como resultado do aumento na atividade por tais métodos, a atividade enzimática aumenta em pelo menos 10%, 25%, 50%, 100%, 200%, 400%, 600%, ou 1000% quando comparado com uma cepa tipo selvagem ou cepa não modificada. Além disso, estas técnicas para aumentar a atividade enzimática pode ser implementada em combinação com outra ou em combinação com um aumento da atividade enzimática. Exemplos de bactéria Escherichia que servem como referência incluem, como cepas do tipo selvagem, Escheriehia coli W3110 (ATCC 27325), Eseheriehia coli MGl 655 (ATCC 47076), dentre outros, que são derivados de uma cepa K12 tipo selvagem de protótipo.

Além disso, na bactéria da presente invenção, a atividade de uma enzima que catalisa uma reação que deriva da via biossintética de L- treonina e produz um composto diferente de L-treonina pode ser diminuída ou deficiente. Exemplos de tal enzima incluem treonina desidrogenase, treonina desaminase, e treonina desidratase. As cepas tendo estas enzimas com atividade diminuída ou deficiente são descritas nas Publicações Internacionais de Patentes W095/23S64, W096/17930, W003/080S43, W004/087S95, dentre outras.

Além disso, na bactéria da presente invenção, a atividade de uma enzima envolvida na via glicolítica, ciclo de TCA, ou cadeia de respiração que adversamente afeta adversamente a produção de L-treonina, uma enzima que regula a expressão de gene, ou uma enzima de um sistema de biossíntese de subproduto pode ser diminuída ou ser tornada deficiente, em adição a uma enzima do sistema de degradação de L-treonina. Exemplos de um gene que codifica tal enzima incluem o gene que codifica o fator a(sigma) de RNA polimerase (ípoS, Publicação Internacional de Patente WOO1/05939 e W003/074719), gene de fosfoenol piruvato carboxilase (pckA, Publicação Iiitemacional de Patente W002/29080), o gene fosfoglucose isomerase (pgi, Molecular and General Genetics, 217(1): 126-31 (1989)), o gene piruvato oxidase (poxB, Publicação Internacional de Patente WG02/290S0), e assim dentre outros.

Par diminuir ou eliminar a atividade de uma enzima como descrito acima, uma mutação que diminui ou elimina a atividade intracelular da enzima pode ser introduzida no gene da enzima mencionada acima em um cromossomo por um tratamento de mutação típico. Ela é alcançada por, por exemplo, deleção de um gene que codifica uma enzima em um cromossomo por recombinação de genes, modificação de uma seqüência de controle de expressão, tal como um promotor e a seqüência de Shine-Dalgarno (SD), dentre outros. Além disso, ela também pode ser alcançada pela introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos (mutação de sem sentido), introdução de um códon de parada ( mutação sem sentido), introdução de uma mutação de mudança na estrutura, que adiciona ou deleta um ou dois nueleotídeos, ou deleção de uma parte ou de toda a região de um gene (Journal of Biological Chemistry, 272: 8611-8617 (1997)) em uma região que codifica uma enzima em um cromossomo. Alem disso, a atividade enzimátiea pode também sei- diminuída ou eliminada pela construção de um gene que codifica uma enzima mutante em que uma região de codificação é cleletada, e substituição deste gene por um gene normal em um cromossoma pela recombinação homóloga ou semelhante, ou introdução de um transponson ou fator IS no gene. Além disso, ela pode sei alcançada pela inibição da expressão com um RNA anti-senso (Proceedings of lhe National Academy of Sciences, USA, 95 5511-5515 (1998); Joumal of Biological Chemistry, 266, 20S33-20S39 (1991)).

Para se introduzir uma mutação que diminua ou elimine a atividade de uma enzima, como mencionado acima, por recombinação de genes, por exemplo, o seguinte método é usado. Um gene tipo mutante pode ser substituído por um gene alvo em um cromossomo pela modificação de uma seqüência parcial do gene alvo para preparar um gene mutante mutado de forma que uma enzima de funcionamento normal não seja produzida, e transformação de uma bactéria de Escherichia com um DNA contendo este gene para provocar a reeombinação do gene mutante e do gene no cromossomo. Tal mutação específica para um local que utiliza substituição de genes pela reeombinação homóloga é conhecida, e exemplos destes incluem um método de uso de urn DNA linear, um método de uso de um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível à temperatura (Patente U.S. 6,303,383; Patente Japonesa No. 05-007491), dentre outros. Além disso, a mutação específica para um local por substituição de genes utilizando reeombinação homóloga pode também ser realizada pelo uso de um plasmídeo que não tem capacidade de replicação em um hospedeiro.

Como resultado da diminuição na atividade ou expressão por tais métodos, a atividade enzimática diminui em 75%, 50%, 25%, ou 10% quando comparada com uma cepa tipo selvagem ou cepa não modificada, ou a atividade é completamente eliminada. Além disso, dois ou mais destes métodos para diminuir a atividade enzimática podem ser implementados em combinação, ou eles podem ser usados em combinação com o aumento da atividade enzimática descrita acima. Exemplos de uma bactéria de Escherichia que serve como uma referência incluem Escheriehia eoli W3110 (ATCC 27325 ), Eseheriehia eoli MGl 655 (ATCC 47076), dentre outros, que são derivados de uma cepa K12 do tipo selvagem de protótipo.

A bactéria de produção de L-treonina usada para a presente invenção pode ser uma cepa que é modificada de forma que ela possa se assemelhar a sacarose como uma fonte de carbono. Poi- exemplo, uma cepa que se assemelha a sacarose pode ser obtida da cepa de E. eoli Hl55 por transdução de PI, usando sua capacidade de crescer com sacarose como a fonte de carbono única como urn índice. Urna bactéria de produção de L- treonina que pode se assemelhar a sacarose como uma fonte de carbono pode sei- construída por referência à Publicação Internacional de Patente W090/04636.

Além disso, em adição à manipulação genética mencionada acima, exemplos do método para construir uma bactéria de produção de L- treonina incluem um método de tratamento de uma bactéria de Escherichia por irradiação de UV ou com um agente de mutagênese típico, tal como N- metil-N'-nitrc>-N-riitrosoguanidina (NTG) e ácido nitroso para obter cepas resistentes a um L-aminoácido ou análogo de L-aminoácido ou cepas auxotrópicas de L-aminoácido, e seleção de uma cepa que tenha melhorado a capacidade de produção de L-treonina. Exemplos destes incluem a cepa mutante resistente a borrelidina (Patente U.S. 5.939.307), cepa mutante resistente a ácido diarninosuccíriico (Publicação Internacional de Patente WG00/09661), cepa mutante resistente a α-metilserina (Publicação Internacional de Patente WQ00/09661), cepa mutante resistente a íluoropimvato (Publicação Internacional cie Patente WO00/09661), cepa mutante resistente a ácido acético (Patente U.S. 5,919,670), cepa mutante resistente a treonina (Publicação Internacional de Patente W090/04636), e cepa mutante resistente a AI-IV (Genetika, 16: 206 (197S )). Exemplos de bactérias de produção de L-treonina que podem ser usadas para a presente invenção

Exemplos de bactérias de Escheriehia conferidos com uma capacidade de produção de L-treonina que podem sei- usadas para a presente invenção vão ser descritos abaixo. Contudo, as bactérias que podem ser usadas para a presente invenção não são limitadas a estes exemplos, contanto que a bactéria tenha uma capacidade de produzir L-treonina.

Como um exemplo de bactéria de produção de L-treonina que pode ser usado para a presente invenção, a cepa de Eseherichia coli VKPM B-3996 (Patente U.S. 5,175,107) é englobada. A cepa VKPM B-3996 foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Rússia, 117545 Moseou, 1 Dorozliny proezd. 1) em 19 de novembro de 1987 com um número de registro de VKPM B-3996. Esta cepa VKPM B-3996 tem o plasmídeo pVIC40 (Publicação Internacional de Patente WU90/04636) obtido pela inserção dos genes biossintéricos cie treonina (operon de treonina thrABC) em PAYC32, que é um plasmídeo de vetor hospedeiro amplo tendo um marcador de resistência a estreptomicina (referência a Chistorerdov5 A.Y., Tsygankov, Y.D., Plasmid, 1986, 16, 161- 167). Em pVIC40, a inibição de realimentação de aspartoquinase I- homoserina desidrogenase I codificada por thrA no operon de treonina por L- treonina é eliminada.

Como um exemplo de bactéria de produção de L-treonina que pode ser usada para a presente invenção, a cepa de Escherichia coli VKPM B- 53IS (Patente EP 0593792) é também englobada. A cepa VKPM B-5318 foi depositada na Russian National Collection of Indusü-ial Microorganisms ( VKPM) (Rússia, 117545 Moscou, 1 Dorozlmy proezd. 1) em 03 de maio de 1990 com um número de registro de VKPM B-5318. Esta cepa VKPM B- 5318 não requer isoleucina, tem o repressor de Cl sensível à temperatura, promotor de PR, e o operon de treonina. Isto é, os genes relacionados com a biossíntese de treonina, em que a região atenuadora e a região de regulação de transcrição nativa são deletadas, e são localizadas à jusante do gene para a região com terminal N da proteína Cto do fago lâmbda. Além disso, esta cepa contém um DNA de plasmídeo recombinante que foi construído de forma que a expressão dos genes envolvidos na biossíntese de treonina sejam regulados pelo repressor e pelo promotor do fago lâmbda.

A Escherichia eoli. 427T23 (Patente U.S. 5,631,157) também pode ser exemplificada como um exemplo preferido da bactéria de produção de L-treonina. A cepa 427T23 tem homoserina desidrogenase que não está submetida à inibição de realimentação por L-treonina. Também, esta cepa tem atenuado a atividade de treonina desaminase e pode usar sacarose como uma fonte de carbono. A cepa 427T23 foi depositada na American Type Culture Collection com um número de acesso ATCC 98082.

A Icat-13 de Eschevichia eoli (Patente U.S. 5.175.107) pode também ser preferivelmente usada como a bactéria de produção de L- treonina. A cepa kat-13 é resistente a borrelidina, tem homoserina desidrogenase que não está submetida à inibição de realimentação por L- treonina, atividade de treonina desaminase atenuada, e pode usai' sacarose como uma fonte de carbono.

A cepa de Eseheriehia eoli TDH6) (Patente Japonesa No. 2001-346578) transformada com genes que codificam enzimas de biossíntes de treonina pode também ser preferivelmente usada como a bactéria de produção de L-treonina. A cepa de TDHtS é deficiente na atividade de treonina desidrogenase, e foi obtida pela remoção de pVIC40 que carrega os genes que codificam as enzimas de biossíntese de treonina da cepa B-3996 (Patente U.S. 5.631.157), e foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), (Rússia, 117545 Moscou, 1 Dorozhny proezd. 1) com um número de acesso de VKPM B-3420.

Além disso, outros exemplos da bactéria de produção de L- treonina que podem ser usados para a presente invenção incluem as seguintes cepas de bactéria:

Escherichia eoli MG-442 (CMIMB-1628, Patente U.S. 4,278,765)

Eseheriehia eoli VL334/pYN7 (Patente U.S. 4,278,765) Eseheriehia eoli H-4225 (FERM BP-1236, Patente U.S. 5,017,483)

Eseheriehia eoli H-7256 (FERM BP-2137) Eseheriehia eoli DSM9807 (KCCM-10168) EXEMPLOS

A presente invenção vai ser explicada mais especificamente com referência aos seguintes exemplos. Contudo, a presente invenção não é limitada a estes exemplos.

Exemplo li Efeito de Regulação de enxofre inicialmente adicionado na cultura alimentada em bateiada

Primeiramente, o efeito de se limitar o enxofre no meio inicial da cultura principal até urna concentração predeterminada ou menor durante a produção de L-treonina foi examinado em uma cultura alimentada por bateladas.

A cepa VKPM B-5318 foi cultivada em uma placa de meio de ágar LB (10 g/l de tripton, 5 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de NaCl, 15 g/l de ágar) contendo 20 mg/l de sulfato de estreptomicina a 37°C por 24 horas, e 1/10 das células na placa foram raspados de uma placa e inoculados em 50 ml de meio LB (10 g/l de tripton, 5 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de NaCl) contendo 20 mg/l de sulfato de estreptomicina em um frasco para realizar uma cultura de sementes a 40°C e 144 rpm por 6 horas.

Após o término da cultura de semente, o meio de cultura de semente em um volume equivalente a 16% do volume do meio de cultura foi inoculado em um fementador cie jarro de 1 1 carregado com 300 ml do meio de cultura principal, e a cultura foi realizada a 40°C e em pH 7,0. A composição do meio de cultura principal é mostrada abaixo. Composição do meio de cultura principal:

Sacarose 27 s/L

extrato de levedura 1,8 íi/L

KHiPO/i 1 S e/L

NaCl 0,6 g/L

MgSO4-7H20 0,36 g/L

FeSO4-7Ii20 18 mg/L MnSCMH2O IS mg/L

Sulfato de estreptomicina 20 mg/L

Sulfato de amònio foi apropriadamente adicionado de forma que o teor de enxofre inicialmente adicionado seja 0,78 a 0,10 g/l em termos de teor de enxofre.

A cultura foi ajustada para pH 7,0 durante a cultura pela adição de gás de amônia. Após o sacarídeo no meio ser consumido, 600 g/l de uma solução aquosa de sacarose foram adicionados para realizar uma cultura alimentada em batelada.

Após 42 horas da cultura, a concentração de L-treonina foi determinada por HPLC.

Como resultado, o rendimento da fermentação de L-treonina aumentou com uma diminuição no enxofre, e um aumento notável, particularmente, em uma concentração de enxofre de 0,29 g/l ou menor, como mostrado na Tabela 1. Tabela 1

<table>table see original document page 36</column></row><table>

Exemplo 2: Efeito de Regulação de enxofre no meio de alimentação em uma cultura alimentada em batelada

Primeiramente, da mesma maneira que no Exemplo 1, a cepa de VKPM B-531S foi cultivada em uma placa de meio de ágar LB (10 g/l de tripton, 5 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de NaCl, 15 g/l de ágar) contendo 20 mg/l de sulfato de estreptomicina a 37°C por 24 horas, e 1/10 das células na placa foram raspados de uma placa e inoculados em 50 ml de meio LB (10 g/l de tripton, 5 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de NaCl) contendo 20 mg/l de sulfato de estreptomicina em um frasco para realizar uma cultura de sementes a 40°C e 144 rpm por 6 horas. (J)

Após o término da cultura de semente, o meio de cultura de semente em um volume equivalente a 16% do volume do meio de cultura foi inoculado em um fermentador de jarro de 1 1 carregado com 300 ml do meio cie cultura principal, e a cultura foi realizada a 40°C e em pH 7,0. A composição do meio de cultura principal era a mesma usada no Exemplo 1.

A cultura foi ajustada para pH 7,0 durante a cultura pela adição de gás de amônia. Após o sacarídeo no meio ser consumido, a fermentação foi realizada com a adição de um meio de alimentação contendo sacarose, e ajustada de forma que a concentração de enxofre no meio de fermentação esteja em um nível predeterminado ou menor. Os resultados são mostrados na Tabela 2. A concentração de enxofre no meio de alimentação foi controlada para ser de 0 a 1,22 g/l, e a cultura foi controlada de forma que o meio de fermentação contenha 0,144 a 0,54S g/l de enxofre em todo o período de cultura de meio.

Como resultado, foi confirmado que o rendimento de L- treonina foi melhorado também na cultura alimentada em batelada pela regulação da concentração de enxofre no meio de fermentação até 0,35 g/l ou menor. Tabela 2

(<table>table see original document page 37</column></row><table>

Aplicabilidade Industrial

De acordo com a presente invenção, o rendimento da fermentação e a produção de L-treonina podem ser melhorados em um método para a produção de L-treonina por fermentação usando um microorganismo que pertence ao gênero Escherichia que tem uma capacidade de produção de L-treonina. LISTAGEM DA SEQÜÊNCIA

<110> Ajinomoto Co., Inc.

<120> Método para produzir L-treonina

<130> C58 6-C6078

<150> JP2005-189106

<151> 2005-06-29

<150> JP2006-119334

<151> 2006-04-24

<160> 6

<170> PatentIn versão 3.1

<210> 1

<211> 5040

<212> DNA

<213> Escherichia coli <220>

<221> promotor

<222> (71)..(99)

<223> fator Sigma 70; predita +1 inicio em 106 <220>

<221> promotor

<222> (104)..(132)

<223> fator Sigma 70; predita +1 inicio em 139 <220>

<221> promotor

<222> (139)..(219)

<223> fator Sigma 70; predita +1 início em 219 <220>

<221> CDS

< 2 2 2 > (190) .. (255) <223> peptideo líder

< 2 2 0 >

<221> atenuador

<222> (273).. (307)

<220>

<221> CDS

<222> (337)..(2799)

< 2 2 3 > thrA

<220>

<221> CDS

<222> (2801) .. (3733)

<223> thrB

< 2 2 0 >

<221> CDS

<222> (3734)..(5020)

<223> thrC agcttttcat tctgactgca acgggcaata tgtctctgtg tggattaaaa aaagagtgtc 60

tgatagcagc ttctgaactg gttacctgcc gtgagtaaat taaaatttta ttgacttagg 120

tcactaaata ctttaaccaa tataggcata gcgcacagac agataaaaat tacagagcac 180

acaacatcc atg aaa cgc att age acc acc att acc acc acc ate acc att 231 Met Lys Arg Ile Ser Thr Thr Ile Thr Thr Thr Ile Thr Ile 15 10

acc aca ggt aac ggt gcg ggc tga cgcgtacagg aaacacagaa aaaagcccgc 285

Thr Thr Gly Asn Gly Ala Gly 15 20

acctgacagt gcgggctttt tttttcgacc aaaggtaacg aggtaacaac c atg cga 342

Met Arg

gtg ttg aag ttc ggc ggt aca tca gtg gea aat gea gaa cgt ttt ccg 390

Val Leu Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asn Ala Glu Arg Phe Leu 25 30 35

cgt gtt gcc gat att ctg gaa age aat gcc agg cag ggg cag gtg gcc 4 38

Arg Val Ala Asp Ile Leu Glu Ser Asn Ala Arg Gln Gly Gln Val Ala 40 45 50 55

acc gtc etc tet gcc ccc gcc aaa ate acc aac cac ctg gtg gcg atg 486

Thr Val Leu Ser Ala Pro Ala Lys Ile Thr Asn His Leu Val Ala Met 60 65 70

att gaa aaa acc att age ggc cag gat gct tta ccc aat ate age gat 534

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Gly Gln Asp Ala Leu Pro Asn Ile Ser Asp 75 80 85

gcc gaa cgt att ttt gcc gaa ctt ttg acg gga etc gcc gcc gcc cag 582

Ala Glu Arg Ile Phe Ala Glu Leu Leu Thr Gly Leu Ala Ala Ala Gln 90 95 100

ccg ggg ttc ccg ctg gcg caa ttg aaa act ttc gtc gat cag gaa ttt 630

Pro Gly Phe Pro Leu Ala Gln Leu Lys Thr Phe Val Asp Gln Glu Phe 105 110 115

gcc caa ata aaa cat gtc ctg cat ggc att agt ttg ttg ggg cag tgc 678

Ala Gln Ile Lys His Val Leu His Gly Ile Ser Leu Leu Gly Gln Cys 120 125 130 135

ccg gat age ate aac gct gcg ctg att tgc cgt ggc gag aaa atg tcg 726

Pro Asp Ser Ile Asn Ala Ala Leu Ile Cys Arg Gly Glu Lys Met Ser 140 145 150

ate gcc att atg gcc ggc gta tta gaa gcg cgc ggt cac aac gtt act 774

Ile Ala Ile Met Ala Gly Val Leu Glu Ala Arg Gly His Asn Val Thr 155 160 165

gtt ate gat ccg gtc gaa aaa ctg ctg gea gtg ggg cat tac ctc gaa 822

Val Ile Asp Pro Val Glu Lys Leu Leu Ala Val Gly His Tyr Leu Glu 170 175 180

tet acc gtc gat att gct gag tcc acc cgc cgt att gcg gea age cgc 870

Ser Thr Val Asp Ile Ala Glu Ser Thr Arg Arg Ile Ala Ala Ser Arg 185 190 195 att ccg gct Ile Pro Ala 200

gaa aaa ggc Glu Lys Gly

gct gcg gtg Ala Ala Val

acg gac gct Thr Asp Val 250

gcg agg ttg Ala Arg Leu 265

tac ttc ggc Tyr Phe Gly 280

cag ttc cag Gln Phe Gln

cca ggt acg Pro Gly Thr

aag ggc att Lys Gly Ile 330

ccg ggg atg Pro Gly Met 345

atg tca cgc Met Ser Arg 360

gaa tac age Glu Tyr Ser

gaa cgg gea Glu Arg Ala

ctg gag ccg Leu Glu Pro 410

ggt gat ggt Gly Asp Gly 425

gea ctg gcc Ala Leu Ala

gat cac atg Asp His Met 205

gaa ctg gcg Glu Leu Val 220

ctg gct gcc Leu Ala Ala 235

gac ggg gtc Asp Gly Val

ttg aag tcg Leu Lys Ser

gct aaa gcc Ala Lys Val 235

ate cct tgc Ile Pro Cys 300

ctc ate ggt Leu Ile Gly 315

tcc aac ctg Ser Asn Leu

aaa ggg atg Lys Gly Met

gcc cgt att Ala Arg Ile 365

ate agt ttc Ile Ser Phe 380

atg cag gaa Met Gln Glu 395

ctg gea gtg Leu Ala Val

atg cgc acc Met Arg Thr

cgc gcc aat Arg Ala Asn

gtg ctg atg Val Leu Met

gtg ctt gga Val Leu Gly

tgt tLa cgc Cys Leu Arg 240

tat acc tgc Tyr Thr Cys 255

atg tcc tac Met Ser Tyr 270

ctt cac ccc Leu His Pro

ctg att aaa Leu Ile Lys

gcc age cgt Ala Ser Arg 320

aat aac atg Asn Asn Met 335

gtc ggc atg Val Gly Met 350

tcc gtg gtg Ser Val Val

tgc gtt cca

Pwc- TT- 1 ρ — ~

gag ttc tac Glu Phe Tyr 400

acg gaa cgg Thr Glu Arg 415

ttg cgt ggg Leu Arg Gly 4 30

ate aac att Ile Asn Ile

gea ggt ttc Ala Gly Phe 210

cgc aac ggt Arg Asn Gly 225

gcc gat tgt Ala Asp Cys

gac ccg cgc Asp Pro Arg

cag gaa gcg Gln Glu Ala 275

cgc acc att Arg Thr Ile 290

aat acc gga Asn Thr Gly 305

gat gaa gac Asp Glu Asp

gea atg ttc Ala Met Phe

gcg gcg cgc Ala Ala Arg 355

ctg att acg Leu Ile Thr 370

caa age gac Gln Ser Asp 385

ctg gaa ctg Leu Glu Leu

ctg gcc att Leu Ala IIe

ate tcg gcg Ile Ser Ala 435

gtc gcc att Val Ala Ile

acc gcc ggt Thr Ala Gly

tcc gac tac Ser Asp Tyr 230

tgc gag att Cys Glu Ile 245

cag gtg ccc Gln Val Pro 260

atg gag ccc Met Glu Leu

acc ccc ate Thr Pro Ile

aat cct caa Asn Pro Gln 310

gaa cca ceg Glu Leu Pro 325

— -Jw^ ^

Ser Val Ser 340

gtc ttt gea Val Phe Ala

caa tca tet Gln Ser Ser

tgt gtg cga Cys VaI Arg 390

aaa gaa ggc Lys Glu Gly 405

ate tcg gtg Ile Ser Val 420

aaa ttc ttt Lys Phe Phe

gct cag gga Ala Gln Gly

aat 918

Asn

215

tet 966

Ser

tgg 1014

Trp

gat 1062

Asp

tcc 1110

Ser

gcc 1158

Ala

295

gea 1206

Ala

gtc 1254

Val

ι ^ rs o j.

Gly

gcg 1350

Ala

tcc 1398

Ser

375

gct 14 4 6

AIa

tta 1494

Leu

gta 1542

Val

gcc 1590

Ala

tet 1638

Ser tct gaa cgc Ser Glu Arg

ggc gtg cgc Gly Val Arg

gaa gtg ttt Glu Val Phe

caa ctg aag Gln Leu Lys 505

cgt gtc tgc Arg Val Cys 520

ggc ctt aat Gly Leu Asn

ccg ttt aat Pro Phe Asn

ctg aac ccg Leu Asn Pro 570

caa tat gcc Gln Tyr Ala 585

aaa aag gcc Lys Lys Ala 600

gcg gcg gaa Ala Ala Glu

gct gga tta Ala Gly Leu

gat gaa ttg Asp Glu Leu 650

ate ttc ggc Ile Phe Gly 665

ctg gcg cgg Leu Ala Arg 680

tct ggt atg

445

tca ate tct Ser Ile Ser 460

gtt act cat Val Thr His 475

gtg acc ggc Val Ile Gly

cgt cag caa Arg Gln Gln

ggt gtt gcc Gly Val Ala 525

ctg gaa aac Leu Glu Asn 540

ctc ggg cgc Leu Gly Arg 555

gtc act gtt Val Ile Val

gac ttc ctg Asp Phe Leu

aac acc tcg Asn Thr Ser 605

aaa tcg cgg Lys Ser Arg 620

ccg gtt att Pro Val Ile 635

atg aag ttc Met Lys Phe

aag tta gac Lvs Leu Asp

gaa atg ggt Glu Met Gly 685

gat gtg gcg

gtc gtg gta Val Val Val

cag atg ctg Gln Met Leu 480

gtc ggt ggc Val Gly Gly 495

age tgg ctg Ser Trp Leu 510

aac tcg aag Asn Ser Lys

tgg cag gaa Trp Gln Glu

tta att cgc Leu Ile Arg 560

gac tgc act Asp Cys Thr 575

cgc gaa ggt Arg Glu Gly 590

tcg atg gat Ser Met Asp

cgt aaa ttc Arg Lys Phe

gag aac ctg Glu Asn Leu 640

tcc ggc att Ser Glv Ile 655

gaa ggc atg Glu Gly Met 670

tat acc gaa Tyr Thr Glu

cgt aaa cta

450

aat aac gat Asn Asn Asp 465

ttc aac acc Phe Asn Thr

gtt ggc ggt Val Gly Gly

aag aat aaa Lys Asn Lys 515

gct ctg ctc Ala Leu Leu 530

gaa ctg gcg Glu Leu Ala 54 5

ctc gtg aaa Leu Val Lys

tcc age cag Ser Ser Gln

ttc cac gtt Phe.His Val 595

cac tac cat Tyr Tyr His 610

ccc tat gac Leu Tyr Asp 625

caa aat ctg Gln Asn Leu

ctt tct ggt Leu Ser Gly

agt ttc tcc Ser Phe Ser 675

ccg gac ccg Pro Asp Pro 690

ttg att ctc

gat gcg acc Asp Ala Thr 470

gat cag gct Asp Gln Val 485

gcg ctg ctg Ala Leu Leu 500

cat ate gac His Ile Asp

acc aat gta Thr Asn Val

caa gcc aaa Gln Ala Lys 550

gaa tat cat Glu Tyr His 565

gea gtg gcg Ala Val Ala 580

gtc acg ccg Val Thr Pro

cag ttg cgt Gln Leu Arg

dw^ aac gtc Thr Asn Val 630

ctc aat gea Leu Asn Ala 645

tcg ctt tct Ser Leu Ser 660

gag gcg acc Glu Ala Thr

cga gat gat Arg Asp Asp

gct cgt gaa

455

act 168 6

Thr

ate 1734

Ile

gag 1782

Glu

tta 1830

Leu

cat 1878

His

535

gag 1926

Glu

ctg 1974

Leu

gat 2022

Asp

aac 2070

Asn

tat 2118

Tyr

615

ggg 2166

Gly

ggt 2214

tat 2262

Tyr

acg 2310

ctt 2358

Leu

695

acg 2406 Ser Gly Met Asp Val Ala Arg Lys Leu Leu Ile Leu Ala Arg Glu Thr 700 705 710

gga cgt gaa ctg gag ctg gcg gat att gaa att gaa cct gtg ctg ccc 2454

Gly Arg Glu Leu Glu Leu Ala Asp Ile Glu Ile Glu Pro Val Leu Pro 715 720 725

gca gag ttt aac gcc gag ggt gat gtt gcc gct ttt atg gcg aat ctg 2502

Ala Glu Phe Asn Ala Glu Gly Asp Val Ala Ala Phe Met Ala Asn Leu 730 735 740

tca caa ctc gac gat ctc ttt gcc gcg cgc gtg gcg aag gcc cgt gat 2550

Ser Gln Leu Asp Asp Leu Phe Ala Ala Arg Val Ala Lys Ala Arg Asp 745 750 755

gaa gga aaa gtt ttg cgc tat gtt ggc aat att gat gaa gat ggc gtc 2598

Glu Gly Lys Val Leu Arg Tyr Val Gly Asn Ile Asp Glu Asp Gly Val 760 765 770 775

tgc cgc gtg aag att gcc gaa gtg gat ggt aat gat ccg ctg ttc aaa 264 6

Cys Arg Val Lys Ile Ala Glu Val Asp Gly Asn Asp Pro Leu Phe Lys 780 785 790

gtg aaa aat ggc gaa aac gcc ctg gcc ttc tat age cac tat tat cag 2694

Val Lys Asn Gly Glu Asn Ala Leu Ala Phe Tyr Ser His Tyr Tyr Gln 795 800 805

ccg ctg ccg ttg gta ctg cgc gga tat ggt gcg ggc aat gac gtt aca 2742

Pro Leu Pro Leu Val Leu Arg Gly Tyr Gly Ala Gly Asn Asp Val Thr 810 815 820

gct gcc ggt gtc ttt gct gat ctg cta cgt acc ctc tca tgg aag tta 2790

Ala Ala Gly Val Phe Ala Asp Leu Leu Arg Thr Leu Ser Trp Lys Leu 825 830 835

gga gtc tga c atg gtt aaa gtt tat gcc ccg gct tcc agt gcc aat atg 2839 Gly Val Met Val Lys Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Ala Asn Met

840 845 850

age gtc ggg ttt gat gtg ctc ggg gcg gcg gtg aca cct gtt gat ggt 2887

Ser Val Gly Phe Asp Val Leu Gly Ala Ala Val Thr Pro Val Asp Gly 055 860 865 870

gca ttg ctc gga gat gta gtc acg gtt gag gcg gca gag aca ttc agt 2935

Ala Leu Leu Gly Asp Val Val Thr Val Glu Ala Ala Glu Thr Phe Ser 875 880 885

ctc aac aac ctc gga cgc ttt gcc gat aag ctg ccg tca gaa cca cgg 2983

Leu Asn Asn Leu Gly Arg Phe Ala Asp Lys Leu Pro Ser Glu Pro Arg 890 895 900

gaa aat ate gtt tat cag tgc tgg gag cgt ttt tgc cag gaa ctg ggt 3031

Glu Asn Ile Val Tyr Gln Cys Trp Glu Arg Phe Cys Gln Glu Leu Gly 905 910 915

aag caa att cca gtg gcg atg acc ctg gaa aag aat atg ccg ate ggt 307 9

Lys Gln Ile Pro Val Ala Met Thr Leu Glu Lys Asn Met Pro Ile Gly 920 925 930

tcg ggc tta ggc tcc agt gcc tgt tcg gtg gtc gcg gcg ctg atg gcg 3127

Ser Gly Leu Gly Ser Ser Ala Cys Ser Val Val Ala Ala Leu Met Ala 935 940 945 950 atg aat gaa cac tgc ggc aag ccg ctt aat gac act cgt ttg ctg gct 3175

Met Asn Glu His Cys Gly Lys Pro Leu Asn Asp Thr Arg Leu Leu Ala 955 960 965

ttg atg ggc gag ctg gaa ggc cgt ate tcc ggc age att cat tac gac 3223

Leu Met Gly Glu Leu Glu Gly Arg Ile Ser Gly Ser Ile His Tyr Asp 970 975 930

aac gtg gea ccg tgt ttt ctc ggc ggt atg cag ttg atg ate gaa gaa 3271

Asn Val Ala Pro Cys Phe Leu Gly Gly Met Gln Leu Met Ile Glu Glu 985 990 995

aac gac ate ate age cag caa gtg cca ggg ttt gat gag tgg ctg 3316

Asn Asp Ile Ile Ser Gln Gln Val Pro Gly Phe Asd Glu Trp Leu 1000 1005 1010

tgg gtg ctg gcg tat ccg ggg att aaa gtc tcg acg gea gaa gcc 3361

Trp Val Leu Ala Tyr Pro Gly Ile Lys Val Ser Thr Ala Glu Ala 1015 1020 1025

agg gct att tta ccg gcg cag tat cgc cgc cag gat tgc att gcg 3406

Arg Ala Ile Leu Pro Ala Gln Tyr Arg Arg Gln Asp Cys Ile Ala 1030 1035 1040

cac ggg cga cat ccg gea ggc fcc att cac gcc tgc tat tcc cgt 3451

His Gly Arg His Leu Ala Gly Phe Ile His Ala Cys Tyr Ser Arg 1045 1050 1055

cag cct gag ctt gcc gcg aag ctg atg aaa gat gtt ate gct gaa 34 96

Gln Pro Glu Leu Ala Ala Lys Leu Met Lys Asp Val Ile Ala Glu 1060 1065 1070

ccc tac cgt gaa cgg tta ctg cca ggc ttc cgg cag gcg cgg cag 3541

Pro Tyr Arg Glu Arg Leu Leu Pro Gly Phe Arg Gln Ala Arg Gln 1075 1080 1085

gcg gtc gcg gaa ate ggc gcg gta gcg age ggt ate tcc ggc tcc 358 6

Ala Val Ala Glu Ile Gly Ala Val Ala Ser Gly Ile Ser Gly Ser 1090 1095 1100

ggc ccg acc ttg ttc gct ctg tgt gac aag ccg gaa acc gcc cag 3631

Gly Pro Thr Leu Phe Ala Leu Cys Asp Lys Pro Glu Thr Ala Gln 1105 1110 1115

cgc gtt gcc gac tgg ttg ggt aag aac tac ctg caa aat cag gaa 3676

Arg Val Ala Asp Trp Leu Gly Lys Asn Tyr Leu Gln Asn Gln Glu 1120 1125 1130

ggt ttt gtt cat att tgc cgg ctg gat acg gcg ggc gea cga gta 3721

Gly Phe Val His Ile Cys Arg Leu Asp Thr Ala Gly Ala Arg Val 1135 1140 1145

ctg gaa aac taa atg aaa ctc tac aat ctg aaa gat cac aac gag 3766

Leu Glu Asn Met Lys Leu Tyr Asn Leu Lys Asp His Asn Glu

"-150 1155 1160

cag gtc age ttt gcg caa gcc gta acc cag ggg ttg ggc aaa aat 3811

Gln Val Ser Phe Ala Gln Ala Val Thr Gln Gly Leu Gly Lys Asn 1165 1170 1175

cag ggg ctg ttt ttt ccg cac gac ctg ccg gaa ttc age ctg act 3856

Gln Gly Leu Phe Phe Pro His Asp Leu Pro Glu Phe Ser Leu Thr 1180 1185 1190 gaa att gat gag atg ctg aag ctg gat ttt gtc acc cgc agt gcg 3901

Glu Ile Asp Glu Met Leu Lys Leu Asp Phe Val Thr Arg Ser Ala 1195 1200 1205

aag ate ctc tcg gcg ttt att ggt gat gaa ate cca cag gaa ate 394 6

Lys Ile Leu Ser Ala Phe Ile Gly Asp Glu Ile Pro Gln Glu Ile 1210 1215 1220

ctg gaa gag cgc gtg cgc gcg gcg ttt gcc ttc ccg gct ccg gtc 3991

Leu Glu Glu Arg Val Arg Ala Ala Phe Ala Phe Pro Ala Pro Val 1225 1230 1235

gcc aat gtt gaa age gat gtc ggt tgt ctg gaa ttg ttc cac ggg 4036

Ala Asn Val Glu Ser Asp Val Gly Cys Leu Glu Leu Phe His Gly 1240 1245 1250

cca acg ctg gea ttt aaa gat ttc ggc ggt cgc ttt atg gea caa 4 081

Pro Thr Leu Ala Phe Lys Asp Phe Gly Gly Arg Phe Met Ala Gln 1255 1260 1265

atg ctg acc cat ate gcg ggt gat aag cca gtg acc att ctg acc 412 6

Met Leu Thr His Ile Ala Gly Asp Lys Pro Val Thr Ile Leu Thr 1270 1275 1280

gcg acc tcc ggt gat acc gga gcg gea gtg gct cat gct ttc tac 4171

Ala Thr Ser Gly Asp Thr Gly Ala Ala Val Ala His Ala Phe Tyr 1285 1290 1295

ggt tta ccg aat gtg aaa gtg gtt ate ctc tat cca cga ggc aaa 4216

Gly Leu Pro Asn Val Lys Val Val Ile Leu Tyr Pro Arg Gly Lys 1300 1305 1310

ate agt cca ctg caa gaa aaa ctg ttc tgt aca ttg ggc ggc aat 4261

Ile Ser Pro Leu Gln Glu Lys Leu Phe Cys Thr Leu Gly Gly Asn 1315 1320 1325

ate gaa act gtt gcc ate gac ggc gat ttc gat gcc tgt cag gcg 4 30 6

Ile Glu Thr Val Ala Ile Asp Gly Asp Phe Asp Ala Cys Gln Ala 1330 1335 1340

ccg gcg aag cag gcg ttt gat gat gaa gaa ctg aaa gtg gea cta 4351

Leu Val Lys Gln Ala Phe Asp Asp Glu Glu Leu Lys Val Ala Leu 1345 1350 1355

ggg tta aac tcg gct aac tcg att aac ate age cgt ttg ctg gcg 4396

Gly Leu Asn Ser Ala Asn Ser Ile Asn Ile Ser Arg Leu Leu Ala 1360 1365 1370

cag att tgc tac tac ttt gaa gct gtt gcg cag ctg ccg cag gag 4 441

Gln Ile Cys Tyr Tyr Phe Glu Ala Val Ala Gln Leu Pro Gln Glu 1375 1380 1385

acg cgc aac cag ctg gtt gtc tcg gtg cca age gga aac ttc ggc 4486

Thr Arg Asn Gln Leu Val Val Ser Val Pro Ser Gly Asn Phe Glv 1390 1395 ~ 1400

gat ttg acg gcg ggt ctg ctg gcg aag tca ctc ggt ctg ccg gtg 4531

Asp Leu Thr Ala Gly Leu Leu Ala Lys Ser Leu Gly Leu Pro Val 1405 1410 1415

aaa cgt ttt att gct gcg acc aac gtg aac gat acc gtg cca cgt 4576

Lys Arg Phe Iie Aia Aia Thr Asn Val Asn Asp Thr Val Pro Ara ttc ctg cac gac ggt cag tgg tca ccc aaa gcg act cag gcg acg 4621

Phe Leu His Asp Gly Gln Trp Ser Pro Lys Ala Thr Gln Ala Thr 1435 1440 1445

tca tcc aac gcg atg gac gtg agt cag ccg aac aac tgg ccg cgt 4 666

Leu Ser Asn Ala Met Asp Val Ser Gln Pro Asn Asn Trp Pro Arg 1450 1455 1460

gcg gaa gag ttg ttc cgc cgc aaa ate tgg caa ctg aaa gag ctg 4711

Val Glu Glu Leu Phe Arg Arg Lys Ile Trp Gln Leu Lys Glu Leu 1465 1470 1475

ggt tat gea gcc gtg gat gat gaa acc acg caa cag aca atg cgt 4756

Gly Tyr Ala Ala Val Asp Asp Glu Thr Thr Gln Gln Thr Met Arg 1480 1485 1490

gag tta aaa gaa ctg ggc tac act tcg gag ccg cac gct gcc gta 4801

Glu Leu Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Ser Glu Pro His Ala Ala Val 1495 1500 1505

gct tat cgt gcg ctg cgt gat cag ttg aat cca ggc gaa tat ggc 484 6

Ala Tyr Arg Ala Leu Arg Asp Gln Leu Asn Pro Gly Glu Tyr Gly 1510 1515 ~ 1520

ttg ttc ctc ggc acc gcg cat ccg gcg aaa ttt aaa gag age gtg 4891

Leu Phe Leu Gly Thr Ala His Pro Ala Lys Phe Lys Glu Ser Val 1525 1530 1535

gaa gcg att ctc ggt gaa acg ttg gat ctg cca aaa gag ctg gea 4 936

Glu Ala Ile Leu Gly Glu Thr Leu Asp Leu Pro Lys Glu Leu Ala 1540 1545 1550

gaa cgt gct gat tta ccc ttg ctt tca cat aat ctg ccc gcc gat 4981

Glu Arg Ala Asp Leu Pro Leu Leu Ser His Asn Leu Pro Ala Asp 1555 1560 1565

ttt gct gcg ttg cgt aaa ttg atg atg aat cat cag taa aatetattea 5030 Phe Ala Ala Leu Arg Lys Leu Met Met Asn His Gln 1570 1575

ttatctcaat 5040

<D

<210> 2 <211> 21 <212> PRT

<213> Escherichia coli <4 00> 2

Met Lys Arg Ile Ser Thr Thr Ile Thr Thr Thr Ile Thr Ile Thr Thr !5 10 15

Gly Asn Gly Ala Gly 20

<210> 3

<211> 820 V O Τ^Τ-,ΓΠ <213> Escherichia coli

<400> 3

Met Arg Val Leu Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asn Ala Glu Arg 15 10 15

Phe Leu Arg Val Ala Asp Ile Leu Glu Ser Asn Ala Arg Gln Gly Gln 20 25 30

Val Ala Thr Val Leu Ser Ala Pro Ala Lys Ile Thr Asn His Leu Val 35 40 45

Ala Met Ile Glu Lys Thr Ile Ser Gly Gln Asp Ala Leu Pro Asn Ile 50 55 60

Ser Asp Ala Glu Arg Ile Phe Ala Glu Leu Leu Thr Gly Leu Ala Ala 65 70 75 80

Ala Gln Pro Gly Phe Pro Leu Ala Gln Leu Lys Thr Phe Val Asp Gln 85 90 95

Glu Phe Ala Gln Ile Lys His Val Leu His Gly Ile Ser Leu Leu Gly 100 105 110

Gln Cys Pro Asp Ser Ile Asn Ala Ala Leu Ile Cys Arg Gly Glu Lys 115 120 125

Met Ser Ile Ala Ile Met Ala Gly Val Leu Glu Ala Arg Gly His Asn 130 135 140

Val Thr Val Ile Asp Pro Val Glu Lys Leu Leu Ala Val Gly His Tyr 145 150 155 160

Leu Glu Ser Thr Val Asp Ile Ala Glu Ser Thr Arg Arg Ile Ala Ala 165 170 175

Ser Arg Ile Pro Ala Asp His Met Val Leu Met Ala Gly Phe Thr Ala 180 185 190

Gly Asn Glu Lys Gly Glu Leu Val Val Leu Gly Arg Asn Gly Ser Asp 195 200 205

Tyr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Cys Leu Arg Ala Asp Cys Cys Glu 210 215 220

Ile Trp Thr Asp Val Asp Gly VaI Tyr Thr Cys Asp Pro Arg Gln Val 225 230 235 240

Pro Asp Ala Arg Leu Leu Lys Ser Met Ser Tyr Gln Glu Ala Met Glu 245 250 255

Leu Ser Tyr Phe Gly Ala Lys Val Leu His Pro Arg Thr Ile Thr Pro 260 265 270

Iie Ala GIn Phe Gln Ile Pro Cys Leu He Lys Asn Thr Gly Asn Pro 275 280 285

Gln Ala Pro Gly Thr Leu Ile Gly Ala Ser Arg Asp Glu Asp Glu Leu 290 295 300

<D

Pro Val Lys Gly Ile Ser Asn Leu Asn Asn Mer Ala Met Phe Ser Val 305 310 315 320 Ser Gly Pro Gly

Ala Ala Met Ser 340

Ser Ser Glu Tyr 355

Arg Ala Glu Arg 370

Gly Leu Leu Glu 385

Val Val Gly Asp

Phe Ala Ala Leu 420

Gly Ser Ser Glu 435

Thr Thr Gly Val 450

Val Ile Glu Val 465

Leu Glu Gln Leu

Asp Leu Arg Val 500

Val His Gly Leu 515

Lys Glu Pro Phe 530

His Leu Leu Asn 545

Ala Asp Gln Tyr

Pro Asn Lys Lys 580

Arg Tyr Ala Ala 595

Val Gly Ala Gly 610

Ala Gly Asp Glu 625

Met Lys Gly Met 325

Arg Ala Arg Ile

Ser Ile Ser Phe 360

Ala Met Gln Glu 375

Pro Leu Ala Val 390

Gly Met Arg Thr 405

Ala Arg Ala Asn

Arg Ser Ile Ser 440

Arg Val Thr His 455

Phe Val Ile Gly 470

Lys Arg Gln Gln 485

Cys Gly Val Ala

Asn Leu Glu Asn 520

Asn Leu Gly Arg 535

Pro Val Ile Val 550

Ala Asp Phe Leu 565

Ala Asn Thr Ser

Glu Lys Ser Arg 600

Leu Pro Val Ile 615

Leu Met Lys Phe 630

Val Gly Met Ala 330

Ser Val Val Leu 345

Cys Val Pro Gln

Glu Phe Tyr Leu 380

Thr Glu Arg Leu 395

Leu Arg Gly Ile 410

Ile Asn Ile Val 425

Val Val Val Asn

Gln Met Leu Phe 460

Val Gly Gly Val 475

Ser Trp Leu Lys 490

Asn Ser Lys Ala 505

Trp Gln Glu Glu

Leu Ile Arg Leu 5 4 0

Asp Cys Thr Ser 555

Arg Glu Gly Phe 570

Ser Met Asp Tyr 585

Arg Lys Phe Leu

Glu Asn Leu Gln 620

Ser Gly IIe Leu 635

Ala Arg Val Phe 335

Ile Thr Gln Ser 350

Ser Asp Cys Val 365

Glu Leu Lys Glu

Ala Ile Ile Ser 400

Ser Ala Lys Phe 415

Ala Ile Ala Gln 430

Asn Asp Asp Ala 4 45

Asn Thr Asp Gln

Gly Gly Ala Leu 480

Asn Lys His Ile 495

Leu Leu Thr Asn 510

Leu Ala Gln Ala 525

Val Lys Glu Tyr

Ser Gln Ala Val 560

His Val VaI Thr 575

Tyr His Gln Leu 590

Tyr Asp Thr Asn 605

Asn Leu Leu Asn

Ser Gly Ser Leu 640

Ser Tyr Ile Phe Gly Lys Leu Asp Glu Gly Met Ser Phe Ser Glu Ala 645 650 655 Thr Thr Leu Ala 660

Asp Leu Ser Gly 675

Glu Thr Gly Arg 690

Leu Pro Ala Glu 705

Asn Leu Ser Gln

Arg Asp Glu Gly 740

Gly Val Cys Arg 755

Phe Lys Val Lys 770

Tyr Gln Pro Leu 785

Val Thr Ala Ala

Lys Leu Gly Val 820

Arg Glu Met Gly

Met Asp Val Ala 680

Glu Leu Glu Leu 695

Phe Asn Ala Glu 710

Leu Asp Asp Leu 725

Lys Val Leu Arg

Val Lys Ile Ala 760

Asn Gly Glu Asn 775

Pro Leu Val Leu 790

Gly Val Phe Ala 805

Tyr Thr Glu Pro 665

Arg Lys Leu Leu

Ala Asp Ile Glu 700

Gly Asp Val Ala 715

Phe Ala Ala Arg 730

Tyr Val Gly Asn 745

Glu Val Asp Gly

Ala Leu Ala Phe 780

Arg Gly Tyr Gly 795

Asp Leu Leu Arn 810

Asp Pro Arg Asp 670

Ile Leu Ala Arg 685

Ile Glu Pro Val

Ala fhe Met Ala 720

Val Ala Lys Ala 735

Ile Asp Glu Asp 750

Asn Asp Pro Leu 765

Tyr Ser His Tyr

Ala Gly Asn Asp 800

Thr Leu Ser Trp 815

<210> 4

<211> 310

<212> PRT

<213> Escherichia coli

Met Val Lys Val 1

Phe Asp Val Leu 20

Gly Asp Val Val 35

Leu Gly Arg Phe 50

Val Tvr Gln Cys 65

Pro Val Ala Met

Gly Ser Ser Ala 100

Tyr Ala Pro Ala 5

Gly Ala Ala Val

Thr Val Glu Ala 40

Ala Asp Lys Leu 55

Trp Glu Arg Phe 70

Thr Leu Glu Lys 85

Cys Ser Val Val

Ser Ser Ala Asn 10

Thr Pro Val Asp 25

Ala Glu Thr Phe

Pro Ser Glu Pro 60

Cvs Gln Glu Leu 75

Asn Met Pro Ile 90

Ala Ala Leu Met 105

Met Ser Val Gly 15

Gly Ala Leu Leu 30

Ser Leu Asn Asn 45

Arg Glu Asn Ile

Gly Lys Gln Ile 80

Gly Ser Gly Leu 95

Ala Met Asn Glu 110 His Cys Gly Lys Pro Leu Asn Asp Thr Arg Leu Leu Ala Leu Met Gly 115 120 125

Glu Leu Glu Gly Arg Ile Ser Gly Ser Ile His Tyr Asp Asn Val Ala 130 135 140

Pro Cys Phe Leu Gly Gly Met Gln Leu Met Ile Glu Glu Asn Asp Ile 145 150 155 160

Ile Ser Gln Gln Val Pro Gly Phe Asp Glu Trp Leu Trp Val Leu Ala 165 170 175

Tyr Pro Gly Ile Lys Val Ser Thr Ala Glu Ala Arg Ala Ile Leu Pro 180 185 190

Ala Gln Tyr Arg Arg Gln Asp Cys Ile Ala His Gly Arg His Leu Ala 195 200 205

Gly Phe Ile His Ala Cys Tyr Ser Arg Gln Pro Glu Leu Ala Ala Lys 210 215 220

Leu Met Lys Asp Val Ile Ala Glu Pro Tyr Arg Glu Arg Leu Leu Pro 225 230 235 240

Gly Phe Arg Gln Ala Arg Gln Ala Val Ala Glu Ile Gly Ala Val Ala 245 250 255

Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Pro Thr Leu Phe Ala Leu Cys Asp Lys 260 265 270

Pro Glu Thr Ala Gln Arg Val Ala Asp Trp Leu Gly Lys Asn Tyr Leu 275 280 285

Gln Asn Gln Glu Gly Phe Val His Ile Cys Arg Leu Asp Thr Ala Gly

290 295 300

Ala Arg Val Leu Glu Asn 305 310

S+

O

<210> 5 <211> 428 <212> PRT

<213> Escherichia coli <4 00> 5

Met Lys Leu Tyr Asn Leu Lys Asp His Asn Glu Gln Val Ser Phe Ala 15 10 15

Gln Ala Val Thr Gln Gly Leu Gly Lys Asn Gln Gly Leu Phe Phe Pro 20 25 30

His Asp Leu Pro Glu Phe Ser Leu Thr Glu Ile Asp Glu Met Leu Lys 35 40 45

Leu Asp Phe Val Thr Arg Ser Ala Lys Ile Leu Ser Ala Phe Ile Gly 50 55 60

Asp Glu Ile Pro Gln Glu Ile Leu Glu Glu Arg Val Arg Ala Ala Phe 65 70 75 80 Ala Phe Pro Ala

Glu Leu Phe His 100

Phe Met Ala Gln 115

Ile Leu Thr Ala 130

Phe Tyr Gly Leu 14 5

Lys Ile Ser Pro

Ile Glu Thr Val 180

Val Lys Gln Ala 195

Asn Ser Ala Asn 210

Pro Val Ala Asn 85

Gly Pro Thr Leu

Met Leu Thr His 120

Thr Ser Gly Asp 135

Pro Asn Val Lys 150

Leu Gln Glu Lys 165

Ala Ile Asp Gly

Phe Asp Asp Glu 200

Ser Ile Asn Ile 215

Val Glu Ser Asp 90

Ala Phe Lys Asp 105

Ile Ala Gly Asp

Thr Gly Ala Ala 140

Val Val Ile Leu 155

Leu Phe Cys Thr 170

Asp Phe Asp Ala 185

Glu Leu Lys Val

Ser Arg Leu Leu 220

Val Gly Cys Leu 95

Phe Gly Gly Arg 110

Lys Pro Val Thr 125

Val Ala His Ala

Tyr Pro Arg Gly 160

Leu Gly Gly Asn 175

Cys Gln Ala Leu 190

Ala Leu Gly Leu 205

Ala Gln Ile Cys

Tyr Tyr Phe Glu Ala Val Ala Gln Leu Pro Gln Glu Thr Arg Asn Gln 225 230 235 240

Leu Val Val Ser Val Pro Ser Gly Asn Phe Gly Asp Leu Thr Ala Gly 245 250 255

Leu Leu Ala Lys Ser Leu Gly Leu Pro Val Lys Arg Phe Ile Ala Ala 260 265 270

Thr Asn Val Asn Asp Thr Val Pro Arg Phe Leu His Asp Gly Gln Trp 275 280 285

Ser Pro Lys Ala Thr Gln Ala Thr Leu Ser Asn Ala Met Asp Val Ser 290 295 300

Gln Pro Asn Asn Trp Pro Arg Val Glu Glu Leu Phe Arg Arg Lys Ile 305 310 315 320

Trp Gln Leu Lys Glu Leu Gly Tyr Ala Ala Val Asp Asp Glu Thr Thr 325 330 335

Gln Gln Thr Met Arg Glu Leu Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Ser Glu Pro 340 345 350

His Ala Ala Val Ala Tyr Arg Ala Leu Arg Asp Gln Leu Asn Pro Gly 355 360 365

Glu Tyr Gly Leu Phe Leu Gly Thr Ala His Pro Ala Lys Phe Lys Glu 370 375 380

Ser Val Glu Ala Ile Leu Gly Glu Thr Leu Asp Leu Pro Lys Glu Leu 385 390 395 400

Ala Glu Arg Ala Asp Leu Pro Leu Leu Ser His Asn Leu Pro Ala Asp 405 410 415 Phe Ala Ala Leu Arg Lys Leu Met Met Asn His Gln 420 425

<210> 6 <211> 66 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> <222> (1) - - (66) <223> seqüência lider

<4 00> 6

atgaaacgca ttagcaccac cattaccacc accatcacca ttaccacagg taacggtgcg 60

ggctga

66

Claims (19)

1. Método para produzir L-treonina, caracterizado pelo fato de que compreende: a) cultivai- um microorganismo que pertence ao gênero Escherichia que tem uma capacidade de produzir L-treonina, em um meio de fermentação contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, e uma fonte de enxofre, b) coletar L-treonina da cultura, em que a concentração de enxofre no meio é regulada de forma que ela esteja em um nível predeterminado ou menor.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração de enxofre no meio de fermentação é regulada de forma que ela seja 0,35 g/l ou menor.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é Eseherichia eoli,

4. Método de acordo corn qualquer uma das reivindicações 1 a .3, caracterizado pelo fato de que uma enzima de biossíntese de L-treonina no microorganismo é modificada de forma que a enzima não seja submetida à inibição de realimentação por L-treonina.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a enzima de biossíntese de L-treonina é selecionada do grupo que consiste de aspartoquinase, homoserina quinase, treionina quinase, e combinações das mesmas.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a .5, caracterizado pelo fato de que a fonte de enxofre é selecionada do grupo que consiste de sul fatos, tiosulfatos, sulfitos, cisteína, cistina, glutationa, e combinações dos mesmos.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a .6, caracterizado pelo fato de que o método de cultura é selecionado do grupo que consiste de um método de cultura em batelada, um método de cultura alimentado em batelada, e um método de cultura contínuo.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o método de cultura é um método de cultura alimentado em batelada ou um método de cultura contínuo, e em que um meio de alimentação contendo uma fonte de enxofre é adicionado à cultura em um fermentado]-.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o dito meio de alimentação também contém uma fonte de carbono e um nutriente tendo um efeito de promoção de crescimento, e em que o dito jneio de alimentação é adicionado à cultura no fermentador continuamente ou intermitentemente, de forma que a concentração da fonte de carbono na cultura seja mantida em 30 g/l ou menor após o final do crescimento logaritmo do microorganismo.

10. Método para produzir aditivo de alimentação de animal baseado em caldo de fermentação, caracterizado pelo fato de que compreende: a) cultivar um microorganismo que pertence ao gênero Escherichia que tem uma capacidade de produzir L-treonina, em um meio de fermentação contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, e uma fonte de enxofre, b) conduzir a fermentação, em que a concentração de enxofre no meio é regulada de forma que ela esteja em uni nível predeterminado ou menor, c) secar o caldo de fermentação bruto até um teor de água de 10% ou menos em peso.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a concentração de enxofre no meio de fermentação é regulado de forma que seja 0,35 g/l ou menor.

12. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é Escherichia coli.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que uma enzima de biossíntese de L- treonina no microorganismo é modificada de forma que a enzima não seja submetida à inibicão de realimentação por L-treonina.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a enzima de biossíntese de L-treonina é selecionada do grupo que consiste de aspartoquinase, hornoserina quinase, treonina quinase, e combinações das mesmas.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações IOa 14, caracterizado pelo fato de que a fonte de enxofre é selecionada do grupo que consiste de sulfatos, tiosulfatos, sulfitos, cisteína, cistina, glutationa, e combinações dos mesmos.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizado pelo fato de que o método de cultura é selecionado do grupo que consiste de um método de cultura em batelada, um método de cultura alimentado em batelada, e um método de cultura contínuo.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o método de cultura é um método de cultura alimentado em batelada ou um método de cultura contínuo, e em que um meio de alimentação contendo uma fonte de enxofre é adicionado à cultura em um ferrnentador.

18. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o dito meio de alimentação também contém uma fonte de carbono e um nutriente tendo um efeito de promoção de crescimento, e em que o dito meio de alimentação é adicionado à cultura no ferrnentador continuamente ou intermitentemente, de forma que a concentração da fonte de carbono na cultura seja mantida em 30 g/l ou menor após o final do crescimento logaritmo do microorganismo.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações .10 a 18, caracterizado pelo fato de que mais que 95% de L-treonina são incluídos no dito aditivo de alimentação.