CN101180951B - 兰花组织培养快速繁殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种兰花组织培养快速繁殖方法，其包括诱导培养、增殖及继代培养，诱导培养所用诱导培养基是以改良MS为基本培养基并附加其他成分的半固体培养基；而增殖及继代培养所用培养基则为以改良MS为基本培养基并附加其他成分的液固二相培养基，并结合了控温摇床温和摇动培养，从而实现了高效诱导和增殖、减轻褐化和有效继代的目的，特别适合于兰花的组织培养。

Description

兰花组织培养快速繁殖方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体是兰花组织培养快速繁殖方法，主要是通过兰花幼芽或种子在诱导培养基上诱导出初始(类)原球茎，然后通过液固二相增殖培养基在温控摇床内控温、控速摇动培养达到高效增殖目的。
背景技术
原球茎或类原球茎，是兰科植物特有的一种再生方式，诱导和增殖培养原球茎或类原球茎，是兰科植物获得快速繁殖的有效途径。兰科植物，其种子、幼芽一般通过组织培养大都能诱导出原球茎或类原球茎，统称为(类)原球茎，再通过分化和生根培养就能形成大量微型植株，因此，(类)原球茎的诱导和快速繁殖是兰科植物工厂化生产小苗的关键技术。
兰科植物是繁殖最困难的一类单子叶植物，尤其是中国兰花，一般繁殖系数很低，最多一年2～3倍，而那些名贵品种繁殖系数更低些，一般在0.5～1之间，如莳养不当，可能越养越少。随着前几年掏兰热毁灭性破坏，国兰种质资源已濒临灭绝的边缘。因此，加快兰花、特别是中国兰花繁殖速度，更好地保护中国兰花品种资源，使颇具天姿国香的中国兰花能走进千家万户，已成为当前我国兰花科学研究的重点和热点。
传统的兰花繁殖方法多采用分株繁殖法，繁殖系数小，产业化程度低，远远不能满足市场消费需求。虽有一些中国兰花组织培养研究报导，但组织培养成功的限于个别种，且原球茎生长易于褐化，研究进展缓慢。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种兰花组织培养快速繁殖方法，以达到高效诱导和增殖、减轻褐化和有效继代的目的。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该兰花组织培养快速繁殖方法，其特征在于包括以下步骤：
a、诱导培养；将兰科植物的种子或幼芽接种在诱导培养基上，诱导出芝麻粒大小的初始原球茎或类原球茎；所述诱导培养基是以改良MS为基本培养基并附加其他成分的半固体培养基，具体成分和含量为：KNO3 1200～1500mg/L、NH4NO3 1000～1350mg/L、KH2PO4 110～140mg/L、MgSO4·7H2O 230～300mg/L、CaCl2 200～280mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、C6H12O6·2H2O 100mg/L、NH2·CH2·COOH 2mg/L、C12H17ClN4OS·HCl 0.1mg/L、C8H11O3N·HCl 0.5mg/L、NC5H4COOH 0.5mg/L、蔗糖20～30mg/L、6-BA 0.01～0.5mg/L、活性炭0.01～0.1％、琼脂糖4～5g/L，pH值5.0～5.4；
b、增殖及继代培养；将初始原球茎或类原球茎转接到增殖培养基上进行增殖培养，每隔四周，将增殖后的初始原球茎或类原球茎切割后进行继代培养，使原球茎或类原球茎快速增殖，继代培养所用培养基与所述增殖培养基相同；所述增殖培养基是以改良MS为基本培养基并附加其他成分的液固二相培养基，其中上层为液相培养基，下层为固相培养基；所述液相培养基的具体成分和含量为：KNO3 600～1200mg/L、NH4NO3500～1100mg/L、KH2PO4 50～120mg/L、MgSO4·7H2O 120～250mg/L、CaCl2 100～250mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、C6H12O6·2H2O 100mg/L、NH2·CH2·COOH2mg/L、C12H17ClN4OS·HCl 0.1mg/L、C8H11O3N·HCl 0.5mg/L、NC5H4COOH 0.5mg/L、蔗糖30mg/L、6-BA 0.1～1mg/L、NAA0.01～0.5mg/L、活性炭0.1～0.5％、香蕉泥0～100g/L，pH值5.2～5.4；所述固相培养基与所述液相培养基相比，仅在于其还添加有琼脂糖6～7g/L。
所述诱导培养所采用的培养条件为：先于20℃～25℃条件下暗培15～20天，然后在20℃～25℃、1000～1500Lux条件下诱导培养2～3个月。
所述增殖培养及继代培养所采用的培养条件相同，培养条件为：在温控摇床内摇动培养，摇床温度23℃～25℃，摇床转速10～150rpm。
本发明的优点：通过选择合适的诱导培养基、增殖培养基及继代培养基并结合控温摇床温和摇动培养实现高效增殖，兼备了液体培养基和固体培养基的长处，一方面保持了原球茎或类原球茎固体培养基生长健壮的优势，另一方面发挥了液体培养基快速增殖的长处；而且由于原球茎或类原球茎根植于固体培养基，避免了液体培养摇动乃至滚动摩擦所带来的组织褐化现象，使组织生长条件更加优越。再者，诱导培养基其无机盐含量较传统MS培养基相比约减少了20％～35％；增殖培养基其无机盐含量较传统MS培养基相比约减少了30％～50％。
具体实施方式
下面结合兰科兰属植物代表种春兰的初始原球茎(或类原球茎)高效诱导和增殖培养来说明兰花组织培养快速繁殖方法具体实施方式：
实施例1、春兰幼芽初始原球茎诱导和增殖培养：
原球茎诱导阶段：
选择具有健壮、无病幼芽的春兰植株预先防菌或杀菌处理1～2周，用自来水冲洗干净，用无菌手术刀切下幼芽，用75％的酒精擦净或置于75％酒精里浸泡1min左右，取出用无菌水冲洗1次，再在0.1％HgCl2中浸泡15min，取出用无菌水冲洗2～3次，用无菌滤纸吸干水分，剥离幼芽外叶，取茎尖置于半固体状的以改良MS基本培养基和附加成分混配的原球茎诱导培养基，诱导培养基成分及含量为：KNO3 1200～1500mg/L、NH4NO3 1000～1350mg/L、KH2PO4 110～140mg/L、MgSO4·7H2O 230～300mg/L、CaCl2200～280mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、C6H12O6·2H2O 100mg/L、NH2·CH2·COOH 2mg/L、C12H17ClN4OS·HCl 0.1mg/L、C8H11O3N·HCl 0.5mg/L、NC5H4COOH 0.5mg/L，附加成分为蔗糖(Sugar)20～30mg/L、6-BA 0.01～0.5mg/L、活性炭(AC)0.01～0.1％、琼脂糖(Agar)4～5g/L，pH值5.0～5.4。茎尖朝上。培养条件：置于23℃±1℃光照培养箱，先暗培养2～3周，再转到1500Lux条件下光照培养，转接3～4次，约2～3个月，可见籽麻粒大小初始原球茎(或类原球茎)。
原球茎增殖培养和继代培养阶段：
将初始(类)原球茎转接到增殖培养基上进行增殖培养，每隔四周，将增值后的初始(类)原球茎切割后进行继代培养，使(类)原球茎快速增殖，继代培养所用培养基与所述增值培养基相同；所述增殖培养基是以改良MS为基本培养基并附加其他成分的液固二相培养基，其中上层为液相培养基，下层为固相培养基；所述液相培养基的具体成分和含量为：KNO3 600～1200mg/L、NH4NO3 500～1100mg/L、KH2PO4 50～120mg/L、MgSO4·7H2O 120～250mg/L、CaCl2 100～250mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、C6H12O6·2H2O 100mg/L、NH2·CH2·COOH 2mg/L、C12H17ClN4OS·HCl0.1mg/L、C8H11O3N·HCl 0.5mg/L、NC5H4COOH 0.5mg/L，其无机盐含量较传统MS培养基相比约减少30％～50％。附加成分为Sugar 30mg/L、6-BA 0.1～1mg/L、NAA 0.01～0.5mg/L、AC 0.1～0.5％、香蕉泥0～100g/L，下层固体培养基添加Agar 6～7g/L(上层液体培养基不添加)，pH值5.0～5.4。培养条件：在温控摇床内摇动培养，摇床温度24℃±1℃，摇床转速60rpm。转接1～2次，可使原球茎或类原球茎快速增殖，增殖速度比单一液体培养基或固体培养基快3～4倍，且生长健壮。
实施例2、春兰种子初始原球茎诱导和增殖培养
原球茎诱导阶段：
选择发育正常、无病的春兰种荚8～9成熟时剪下，置于低温冰箱(4℃)2～3d，先用自来水冲洗，再用75％酒精擦洗干净，浸泡于0.1％HgCl2中20min，取出用无菌水冲洗2～3次，用无菌滤纸洗干水分，用无菌手术刀解剖种荚，取少许种子接种于半固体改良MS基本培养基和附加成分混配的原球茎诱导培养基，诱导培养基的成分和含量为：KNO3 1200～1500mg/L、NH4NO3 1000～1350mg/L、KH2PO4 110～140mg/L、MgSO4·7H2O230～300mg/L、CaCl2 200～280mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、C6H12O6·2H2O100mg/L、NH2·CH2·COOH 2mg/L、C12H17ClN4OS·HCl 0.1mg/L、C8H11O3N·HCl0.5mg/L、NC5H4COOH 0.5mg/L，附加成分为Sugar 20～30mg/L、6-BA 0.01～0.5mg/L、AC 0.01～0.1％、Agar4～5g/L，pH值5.0～5.4。置于光照培养箱暗培2～3周，再置于1000Lux光培养，23℃±1℃，短则2～3个月，长则5～6个月，可诱导出初始原球茎或类原球茎。
原球茎增殖培养和继代培养阶段：
将初始(类)原球茎转接到增殖培养基上进行增殖培养，每隔四周，将增值后的初始(类)原球茎切割后进行继代培养，使(类)原球茎快速增殖，继代培养所用培养基与所述增值培养基相同；所述增殖培养基是以改良MS为基本培养基并附加其他成分的液固二相培养基，其中上层为液相培养基，下层为固相培养基；所述液相培养基的具体成分和含量为：KNO3 600～1200mg/L、NH4NO3 500～1100mg/L、KH2PO4 50～120mg/L、MgSO4·7H2O 120～250mg/L、CaCl2 100～250mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、C6H12O6·2H2O 100mg/L、NH2·CH2·COOH 2mg/L、C12H17ClN4OS·HCl0.1mg/L、C8H11O3N·HCl 0.5mg/L、NC5H4COOH 0.5mg/L，其无机盐含量较传统MS培养基相比约减少30％～50％。附加成分为Sugar 30mg/L、6-BA 0.1～1mg/L、NAA 0.01～0.5mg/L、AC 0.1～0.5％、香蕉泥0～100g/L，下层固体培养基添加Agar 6～7g/L(上层液体培养基不添加)，pH值5.0～5.4。培养条件：在温控摇床内摇动培养，摇床温度24℃±1℃，摇床转速60rpm。转接1～2次，可使原球茎或类原球茎快速增殖，增殖速度比单一液体培养基或固体培养基快3～4倍，且生长健壮。
本发明兰花组织培养快速繁殖方法，通过改良MS基本培养基混配适当的其他物质获得的诱导培养基诱导兰科植物幼芽或种子初始原球茎(或类原球茎)，再通过以改良MS基本培养基混配适当的其他物质获得的液固二相培养基结合控温摇床温和摇动途径来获得原球茎(或类原球茎)高效增殖和继代，其具通用性，既适用于春兰、建兰、墨兰、寒兰、蕙兰等国兰用幼芽或种子诱导的原球茎或类原球茎高效增殖和继代培养，也适用于卡特兰、大花蕙兰、石斛兰、兜兰、文心兰、万代兰等洋兰用幼芽或种子诱导的原球茎(或类原球茎)高效增殖和继代培养。
本发明也适用于通过原球茎(或类原球茎)途径的转基因培养。

Claims (3)

1.一种兰花组织培养快速繁殖方法，其特征在于包括以下步骤：
a、诱导培养；将兰科植物的种子或幼芽接种在诱导培养基上，诱导出芝麻粒大小的初始原球茎或类原球茎；所述诱导培养基是以改良MS为基本培养基并附加其他成分的半固体培养基，具体成分和含量为：KNO3 1200～1500mg/L、NH4NO3 1000～1350mg/L、KH2PO4 110～140mg/L、MgSO4·7H2O 230～300mg/L、CaCl2 200～280mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、C6H12O6·2H2O 100mg/L、NH2·CH2·COOH 2mg/L、C12H17ClN4OS·HCl 0.1mg/L、C8H11O3N·HCl 0.5mg/L、NC5H4COOH 0.5mg/L、蔗糖20～30mg/L、6-BA 0.01～0.5mg/L、活性炭0.01～0.1％、琼脂糖4～5g/L，pH值5.0～5.4；
b、增殖及继代培养；将初始原球茎或类原球茎转接到增殖培养基上进行增殖培养，每隔四周，将增殖后的初始原球茎或类原球茎切割后进行继代培养，使原球茎或类原球茎快速增殖，继代培养所用培养基与所述增殖培养基相同；所述增殖培养基是以改良MS为基本培养基并附加其他成分的液固二相培养基，其中上层为液相培养基，下层为固相培养基；所述液相培养基的具体成分和含量为：KNO3 600～1200mg/L、NH4NO3500～1100mg/L、KH2PO4 50～120mg/L、MgSO4·7H2O 120～250mg/L、CaCl2 100～250mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、C6H12O6·2H2O 100mg/L、NH2·CH2·COOH2mg/L、C12H17ClN4OS·HCl 0.1mg/L、C8H11O3N·HCl 0.5mg/L、NC5H4COOH 0.5mg/L、蔗糖30mg/L、6-BA 0.1～1mg/L、NAA 0.01～0.5mg/L、活性炭0.1～0.5％、香蕉泥0～100g/L，pH值5.2～5.4；所述固相培养基与所述液相培养基相比，仅在于其还添加有琼脂糖6～7g/L。
2.根据权利要求1所述的兰花组织培养快速繁殖方法，其特征在于所述诱导培养所采用的培养条件为：先于20℃～25℃条件下暗培15～20天，然后在20℃～25℃、1000～1500Lux条件下诱导培养2～3个月。
3.根据权利要求1所述的兰花组织培养快速繁殖方法，其特征在于所述增殖培养及继代培养所采用的培养条件相同，培养条件为：在温控摇床内摇动培养，摇床温度23℃～25℃，摇床转速10～150rpm。
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