CN105941145B - 一种山兰种子的萌发方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农业技术领域，特别涉及一种山兰种子的萌发方法。该萌发方法包括：将山兰种子加入种子萌发培养基中进行萌发培养；种子萌发培养基包括基本培养基、NAA、6‑BA。本发明提供的萌发方法可有效促进山兰种子的萌发。

Description

一种山兰种子的萌发方法

技术领域

本发明涉及农业技术领域，特别涉及一种山兰种子的萌发方法。

背景技术

山兰Oreorchis patens(Lindl.)Lindl.是兰科山兰属多年生草本植物，广泛分布于我国西南、华中、西北和东北各地，其干燥球茎入药，甘、辛，寒，有小毒。具有滋阴清肺、化痰止咳的功效，用于痈疳疮肿，瘰疬，无名肿毒，常作山慈菇习用品入药。

山兰的植物学特征：山兰须状根聚生于球茎底部和根状茎相连的球茎底部，球茎卵球形、近椭圆形或长锥形，有2圈环纹，具3节，常2～5个相连生于匍匐状短根状茎上，外被撕裂成纤维状的鞘。叶片1～2枚，生于球茎顶端，草质，纵叶脉6条，线形或狭披针形，叶长13～32cm。花葶从球茎第一节侧面发出，直立，长22～40cm，中下部有2～3枚筒状鞘；多花排成10～16cm长的总状花序，疏生21～34朵花，花黄褐色至淡黄色。蒴果呈豆荚形，长约1.0～2.5cm，种子细小极多，约2000～2500粒，种子棕色，长扁梭形，长0.8mm，宽0.2mm。

山兰的繁殖特点：山兰有有性繁殖和分生繁殖两种繁殖方式。和其它兰科植物一样，种子的萌发需要共生菌的参与，种子在第一年10月份成熟后蒴果开裂落地，第二年4月下旬在共生菌参与下萌发形成原球茎，愈伤状原球茎不断呈叉状分支分生多级，呈扇面状，外形似姜，长3～4cm，宽4～7cm，老的部分至新生部分颜色由土黄色渐变为白色，顶端分生旺盛，当原球茎分生至4～6级时，原球茎顶端停止分生，在第三年7月上旬分化产生1片叶子长出地面，根毛开始生长，当叶片长到一定大小时，叶片下端与原球茎相连处开始膨大，形成小球茎，小球茎不断膨大，第四年长到一定大小的球茎5月上旬开始抽葶，花葶露出地面并开花结果，7月上旬横走茎分化产生的叶片长出地面，形成新生植株，新生植株地下部分围绕横走茎产生须根，并且新生植株根部膨大形成新的球茎。在同一个球茎上每年可产生1～3个新生球茎。

从2007年以来，山兰用量增加，价格上升，受利益驱动，野生山兰遭到掠夺式采挖，资源遭受毁灭性破坏，被列为吉林省三级保护植物，开展人工栽培是解决这一矛盾的根本途径，种苗来源成为制约山兰规模化栽培的关键。由于山兰自然繁殖困难，繁殖系数低，严重制约了山兰的扩大生产。目前，还未有报道涉及能够有效促进山兰种子萌发的研究。因此，急需提供一种可有效促进山兰种子萌发的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种山兰种子的萌发方法。该萌发方法可有效促进山兰种子的萌发。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种山兰种子的萌发方法，包括：将山兰种子加入种子萌发培养基中进行萌发培养；种子萌发培养基包括基本培养基、NAA、6-BA。

萘乙酸，(1-Naphthaleneacetic acid，简称NAA)，是一种有机化合物，性质稳定，但易潮解，见光变色，应避光保存，萘乙酸分α型和β型，α型活力比β型强，通常所说的萘乙酸即指α型。熔点为134.5-135.5℃。不溶于水，微溶于热水，易溶于乙醇、乙醚、丙酮、苯和醋酸及氯仿。萘乙酸钠盐能溶于水，在一般有机溶剂中稳定。萘乙酸系萘类具有生长素类活性的植物生长调节剂，由根、茎、叶吸收。萘乙酸广泛用于农业、林业、蔬菜、花卉、果树等领域，诱发不定根形成，提高树木扦插成活率，提高座果率，防止采前落果。

6-BA是6-苄氨基腺嘌呤，别名：6-苄氨基嘌呤、细胞分裂素，英文通用名：6-Benzylaminopurine，分子式：C₁₂H₁₁N₅。6-BA具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点，因而被广泛采用，并且是组织培养者最喜爱的细胞分裂素。BA的主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。可用于提高茶叶、烟草的质量及产量，蔬菜、水果的保鲜和无根豆芽的培育，明显提高果品及叶片的品质。

作为优选，种子萌发培养基中NAA的浓度为0.1～1.0mg/L，6-BA的浓度为0.5～5.0mg/L。

优选地，种子萌发培养基中NAA的浓度为0.5mg/L，6-BA的浓度为2.0mg/L。

在本发明提供的一些实施例中，种子萌发培养基中NAA的浓度为0.1mg/L，6-BA的浓度为0.5mg/L。

在本发明提供的另一些实施例中，种子萌发培养基中NAA的浓度为1.0mg/L，6-BA的浓度为5.0mg/L。

作为优选，基本培养基为MS培养基。由于山兰种子需要60d才能萌发，萌发后需要100d培养才能完成胚的分化，且山兰种子细小，继代操作不便，需要在同一培养基里面长时间培养，培养基水分蒸发和外植体分泌物使培养基酸碱度变化、颜色变褐，阻碍种子发育，因此需要选用酸碱缓冲能力强的MS培养基。

作为优选，种子萌发培养基还包括活性炭。活性炭可有效防止培养基颜色变褐阻碍种子发育。

作为优选，活性炭在种子萌发培养基中的添加量为1～3g/L。

优选地，活性炭在种子萌发培养基中的添加量为2g/L。

作为优选，萌发培养的温度为20～25℃。

在本发明提供的一些实施例中，萌发培养的温度为20～24℃。

作为优选，萌发培养的空气湿度为65％～75％。

作为优选，在山兰种子萌发培养过程中，在山兰种子萌发之前采用黑暗条件进行培养；待山兰种子萌发之后进行光照培养。

作为优选，光照培养的光暗周期为12h/12h。

作为优选，光照培养的光照强度为小于等于2000lx。

作为优选，光照培养采用逐渐增加光照的方式进行培养。种子萌发后进行光照培养，逐渐增加光照强度，可避免突然强光照射造成幼胚褐化。

在本发明提供的一些实施例中，逐渐增加光照的方式具体为：50lx培养15d至幼胚呈浅绿色，再增加至1000lx培养15d至幼胚芽绿色，然后增加至2000lx正常培养。

作为优选，在萌发培养之前还包括对山兰种子进行消毒的操作。

优选地，消毒为：山兰种子先用酒精消毒，再用升汞消毒。

在本发明提供的一些实施例中，山兰种子用75％酒精消毒50s，无菌水冲洗5次，0.15％升汞连续消毒2次，时间分别为4min、6min，无菌水冲洗5次。

本发明提供了一种山兰种子的萌发方法。该萌发方法包括：将山兰种子加入种子萌发培养基中进行萌发培养；种子萌发培养基包括基本培养基、NAA、6-BA。本发明至少具有如下有益效果之一：

1、本发明提供的萌发方法可有效促进山兰种子的萌发，萌发率与采集种子时种子的成熟度及生理状况有关，在本实施例中萌发率可达96.57％～99.14；

2、NAA和6-BA含量组合对球茎的不同发育途径诱导效果显著，NAA含量降低利于原球茎分化，6-BA含量的适当增加利于横走茎分化，当NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L时，对球茎的三种发育途径均有较好的诱导效果；

3、由于山兰种子需要长时间培养，MS培养基酸碱缓冲能力强，可减缓培养基的酸碱变化，防止培养基在短时间内酸碱变化较大阻碍种子发育；

4、本发明先采用黑暗条件对山兰种子进行萌发培养，种子萌发之后再采用逐渐增加光照强度的方式进行光照培养，可有效提高山兰种子萌发率。

附图说明

图1示山兰种子结构和种胚萌发阶段；其中1示山兰种子外形；2示无胚乳种子；3示胚细胞吸水膨胀；4示心形胚；5示鱼雷形胚；6-8示子叶胚的形成；9示原球茎；10示球茎；

图2示山兰种子自然萌发过程；其中1示第1年播种的山兰种子；2示山兰根际共生菌丝；3示播种第2年原球茎产生；4示第3年原球茎分化出1年生植株。

具体实施方式

本发明公开了一种山兰种子的萌发方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

培养条件、计数标准和统计方法：

无特殊说明情况下，用于山兰种子萌发的培养室温度为22±2℃，空气湿度65％-75％，光暗周期为12h/12h；

以肉眼能观察到白点为种子萌发标准，此时种子突破种皮，在显微镜下为心形胚；

试验结果用SAS 8.0软件分析。

本发明提供的一种山兰种子的萌发方法中所用种子、球茎、试剂等均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

本实施例通过对影响球茎不同发育途径激素搭配的研究和影响种子无菌萌发的培养基和光照条件的研究得出适宜种子无菌萌发的条件，并通过对种子萌发过程中胚形态变化的研究，阐明种子萌发过程中6个阶段的形态特征。

材料：试验材料采集于中国农业科学院特产研究所山兰栽培基地，球茎采集挖于2014年9月15日，选取1年生球茎，除去泥土、纤维外壳，用锋利刀片贴球茎切去须根、叶和花葶，选取外表光滑、无腐烂、黑斑的球茎为试验材料。蒴果采集于2015年8月14日和8月27日，选取外形饱满光滑完整、颜色浅绿微黄、无虫咬、缺刻、扭曲和黑斑的朔果为试验材料，用剪刀贴花葶将蒴果剪下，放入冰盒中，避免挤破蒴果和脱水。

材料消毒和接种：球茎和蒴果分别用洗衣粉水浸泡5-10min，置自来水下冲洗8h，在无菌条件下，球茎用75％酒精消毒50s，无菌水冲洗5次，0.3％升汞连续消毒2次(4min+8min)，无菌水冲洗5次，球茎2/3埋入添加0.2％活性炭的1/4MS培养基中弱光(40lx)培养，72 h后使球茎全部露出培养基继续弱光培养2周至球茎表面浅绿色，逐渐增加光照强度至2000lx。蒴果用75％酒精消毒50s，无菌水冲洗5次，0.15％升汞连续消毒2次(4min+6min)，无菌水冲洗5次，5个蒴果为1组，将蒴果剖开，种子混匀后平均撒入5个培养瓶中并摇匀，每瓶约35粒种子。

然后，本申请就激素组合对球茎发育途径的影响、MS培养基盐含量对种子萌发的影响、光照强度对种子萌发的影响进行了研究，并观察了种子萌发过程形态变化。具体试验方法及结果如下：

1、NAA和6-BA含量组合对球茎发育途径的影响

将球茎接种于添加0.2％活性炭的1/4MS培养基中，分别加入NAA 0.1mg/L+6-BA0.5mg/L、NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L、NAA 1.0mg/L+6-BA 5.0mg/L，每处理3重复，每重复30个球茎，弱光培养60d后统计原球茎、横走茎和正常发育球茎的诱导率。试验结果见表1。

表1NAA和6-BA含量组合对球茎发育途径的影响

注：同列内无相同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，小写字母表示差异显著(P<0.05)。

表1试验结果表明，NAA和6-BA含量组合对球茎的不同发育途径诱导效果显著，NAA含量降低利于原球茎分化，6-BA含量的适当增加利于横走茎分化，当NAA 0.5mg/L+6-BA2.0mg/L时，对球茎的三种发育途径均有较好的诱导效果。因此，NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L组合可作为山兰种子无菌萌发的激素条件。

2、MS培养基盐含量对种子萌发的影响

将种子接撒播于添加NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L的MS、1/2MS和1/4MS培养基中，每处理3重复，每重复15瓶，弱光培养160d后统计萌发个数。试验结果见表2。

表2MS培养基盐含量对种子萌发数的影响

表2试验结果表明，种子在MS和1/2MS培养基中萌发数均高于1/4MS，且达到显著水平，种子在1/2MS培养基萌发数高于1/4MS，但差异不显著，由于山兰种子萌发需要约60d时间，萌发后需要生长100d时间才能继代培养，且山兰种子细小，继代操作不便，需要在同一培养基里面长时间培养，培养基水分蒸发和外植体分泌物使培养基酸碱度变化、颜色变褐，阻碍种子发育，因此，萌发数稍低但是酸碱缓冲能力强的MS培养基更适合作为种子萌发的培养基。

3、光照强度对种子萌发的影响

将种子撒播于MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L的培养基中，每处理3重复，每重复15瓶，分别置于光照强度为0lx、40lx、2000lx条件下培养，培养170d后统计萌发个数。试验结果见表3。

表3光照强度对种子萌发的影响

表3试验结果表明，光照强度对种子萌发影响显著，种子萌发数随光照减弱而增加，完全黑暗条件下种子萌发效果最好，光照对植物形态建成具有重要作用，黑暗条件利于萌发种子向原球茎途径分化，光照条件利于萌发种子向球茎途径发育，根据培养需要及时进行继代培养。

4、种子萌发过程形态变化

种子内部结构用石蜡切片方法进行观察，外部形态和萌发过程用光学显微镜观察。

显微镜下山兰种子带翼长约800μm，宽约44μm，种子居中，长约111μm，石蜡切片显示种子为无胚乳种子，仅有分化不完全的胚细胞，接种60d后种子开始萌发，萌发速度不同步，160d左右达到最大萌发数，发育速度快的种胚形成原球茎并分化出球茎，弱光条件下种子萌发过程中形态变化如图1所示，分为6个阶段：

第1阶段，种子胚性细胞先吸水膨胀，变为黄绿色，种子仍被种皮包被(图1-3)；

第2阶段，种子发育成心形胚，变为黄绿色，种胚撑破种皮(图1-4)；

第3阶段，种子发育成鱼雷形胚，胚顶端黄绿色，胚根开始分化根毛，种胚脱掉种皮(图1-5)；

第4阶段，种胚继续生长并分化出第1片黄绿色子叶，培根分化出大量根毛，形成完整的胚(图1-6～图1-8)；

第5阶段，成熟种胚继续分化为1级分枝的黄绿色原球茎(图1-9)；

第6阶段，原球茎分化出浅绿色的球茎(图1-10)。

由图1可知，种子自然萌发与无菌萌发所观察到的形态变化有差异，自然状况下只观察到原球茎和球茎的分化，而无菌培养条件下观察到种子是由胚性细胞经过胚的分化阶段后才分化出原球茎和球茎，是由于自然状况下原球茎形成后原来胚的部分营养被吸收后腐烂掉，而在水分和养分充足的培养基中胚的部分被保留了下来(图1-10)。

结论：

1、本研究得出山兰种子适合在黑暗条件萌发；

2、无菌萌发的培养基为MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L；

3、山兰种子萌发过程分为6个阶段：胚性细胞吸水膨胀阶段、心形胚阶段、鱼雷形胚阶段、子叶胚阶段、原球茎形成阶段和球茎分化阶段。

实施例2

将种子撒播于MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L的培养基中，3次重复，每重复15瓶，置于光照强度为0lx(即黑暗条件)条件下培养。接种60d后种子开始萌发，种子萌发后进行光照培养，逐渐增加光照的方式具体为：50lx培养15d至幼胚呈浅绿色，再增加至1000lx培养15d至幼胚芽绿色，然后增加至2000lx正常培养。培养170d后统计萌发个数。同时以自然播种为对照，播种方法为：在10月中旬，蒴果变褐色开裂时，采集蒴果，随机选3块自然生长地，每块15m²，每块地均匀播撒30个蒴果约75000粒种子，以分化出1年生植株为萌发标准(图2-4)，统计结果均标准化为35粒种子的萌发数，试验结果见表4。

表4种子无菌萌发与自然播种萌发情况比较

表4试验结果表明，本发明试验方法下的山兰种子的萌发效果显著好于自然条件下的萌发效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种山兰种子的萌发方法，其特征在于，包括：将山兰种子加入种子萌发培养基中进行萌发培养；所述种子萌发培养基由MS培养基、0.5mg/L NAA、2.0mg/L 6-BA组成。

2.根据权利要求1所述的萌发方法，其特征在于，所述种子萌发培养基还包括活性炭。

3.根据权利要求2所述的萌发方法，其特征在于，所述活性炭在种子萌发培养基中的添加量为1～3g/L。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的萌发方法，其特征在于，所述萌发培养的温度为20～25℃。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的萌发方法，其特征在于，所述萌发培养的空气湿度为65％～75％。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的萌发方法，其特征在于，在山兰种子萌发培养过程中，在山兰种子萌发之前采用黑暗条件进行培养；待山兰种子萌发之后进行光照培养。

7.根据权利要求6所述的萌发方法，其特征在于，所述光照培养的光暗周期为12h/12h；所述光照培养的光照强度小于等于2000lx；所述光照培养采用逐渐增加光照的方式进行培养。