CN101175501A - 由植物物种生产葡糖胺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及由植物产生葡糖胺的方法，其中将鲜植物材料或再水合的干燥植物材料或植物提取物于70至110℃的温度加热10小时以上，特征在于在收获之前的植物培养期间添加起葡糖胺前体作用的肥料。

Description

由植物物种生产葡糖胺

发明领域

本发明涉及产生植物原料的方法，所述植物原料含有的葡糖胺水平等于或高于0.5％(wt)干物质。

发明背景

葡糖胺的用途

纯葡糖胺在关节疾病中的用途广泛描述于专利和科学文献中，通常与其它化合物和多种天然来源的提取物组合使用。纯葡糖胺作为盐酸葡糖胺或硫酸葡糖胺添加，并来自甲壳类动物水解。例如，WO2000/0074696描述了“治疗关节组织炎症或变性例如关节炎、包含葡糖胺和雷公藤(Trypterygium wilfordii)、女贞(Ligustrum lucidum)和/或光叶丁公藤(Erycibeschmidtii)的草药组合物”，其中将纯葡糖胺与植物制品混合。其他专利涉及作为膳食增补物的植物糖类组合物(EP 1 172 041或EP 923 382)，其中葡糖胺来自几丁质，也就是说，又是来自贝类水解。

在过去的十年中，葡糖胺作为抗骨关节炎剂的用途得到集中发展。推测葡糖胺是对诸如骨关节炎这类关节疾病的唯一活性化合物(直至目前，仅寻找到例如非甾体抗炎药物的症状治疗有效)。

也已显示葡糖胺通过抑制MMP(基质金属蛋白酶)如MMP1、MMP3和MMP13的产生而预防软骨退化。有意义的是，葡糖胺也与皮肤的老化过程有关，皮肤老化主要以弹性的持续丧失和水分损失为特征。皮肤老化反映为重大的结构变化和组成改变。最显著的是，与年轻皮肤相比，老化皮肤中胶原蛋白和葡胺聚糖(glycosaminoglycan)较少。由皮肤产生的葡胺聚糖分子包括透明质酸(聚右旋葡萄糖醛酸-n-乙酰基右旋葡糖胺)、硫酸软骨素及硫酸皮肤素。皮肤细胞产生较高量的透明质酸以应答脱落。透明质酸具有巨大的水合能力。

抑制MMP-1与抑制聚多聚糖/胶原蛋白的降解有关，并因此也与皮肤老化有关：MMP-1可以由紫外线诱导，并被认为是皮肤老化的标志物。US 2002/119107的发明基于选择性抑制MMP-1，要求保护使人类皮肤免于胶原蛋白降解的局部应用组合物。US 2004/037901要求保护抑制皮肤老化影响的不良体征的疗法，包括抑制金属蛋白酶表达的迷迭香植物提取物。

已显示葡糖胺显著改善皮肤干燥和脱落。葡糖胺增加皮肤水分含量并改善皮肤光滑度。这些发现提示，长期摄入葡糖胺对于改善皮肤水分含量和光滑度有效。

已显示含葡糖胺的口服增补物在服用该增补物的一组女性中引起可见皱纹数量的减少(34％)和细纹数量的减少(34％)。使用含葡糖胺、矿物和多种抗氧化剂化合物的口服增补物能够潜在地改善可见皱纹和细纹的外观。

US 6 413 525描述了充分脱落皮肤的方法。具体而言，该发明涉及含有N-乙酰葡糖胺形式的氨基糖的局部应用组合物：当年轻皮肤细胞在脱落后暴露时，它们产生更大量的透明质酸，所述透明质酸是由交替重复的右旋葡萄糖醛酸和N-乙酰右旋葡糖胺分子链组成的葡胺聚糖。已知N-乙酰右旋葡糖胺是活细胞产生透明质酸的限速因素。局部应用葡糖胺有助于透明质酸的持续产生。

在例如JP 59 013 708(软化并湿润皮肤)或美国专利5 866 142(用于脱落皮肤的组合物)中也公开了含有N-乙酰右旋葡糖胺的其它局部应用组合物。

葡糖胺的来源

葡糖胺即2-氨基-2-脱氧右旋葡萄糖，为天然存在的果糖衍生物，并且是糖蛋白及蛋白聚糖的主要成分、许多真核蛋白质的重要组分。它是粘多糖(mucopolysaccharide)和几丁质的主要成分。葡胺聚糖(粘多糖)为掺入到结缔组织、皮肤、腱、韧带和软骨中的大复合物。

葡糖胺的工业来源

工业葡糖胺是由甲壳类动物几丁质(衍生自N-乙酰右旋葡糖胺的复杂糖类)酸水解获得的纯化合物。例如，美国专利6 486 307描述了改进的几丁质酸水解方法：通过将几丁质碾磨至极细的大小，并用浓盐酸进行消化，来生产葡糖胺盐酸盐的方法。

也可以由甲壳类动物酶促水解来产生葡糖胺。例如，美国专利5 998173描述了利用几丁质酶家族的整套酶水解甲壳动物甲壳的几丁质，而由几丁质直接生产N-乙酰右旋葡糖胺的新方法。

保护微生物发酵方法的专利也已有递交，其中培养的微生物生物合成葡糖胺。例如，US 6 372 457描述了利用遗传修饰微生物通过发酵生产葡糖胺的方法和材料。

所有这些方法涉及与甲壳类动物提取物相竞争而生产纯提取葡糖胺。

GB 649 791涉及干燥菊苣(chicory)方面的改进。此专利的方法包括步骤：

-切削菊苣根，

-在好氧条件下于基本上不超过70℃的温度(最佳温度为50至55℃)发酵菊苣根7至8小时，和

-于150℃快速干燥菊苣大约30分钟。

这些条件不能够产生葡糖胺。

Carvalho等人在题为“inulin production by Vernonia herbacea asinfluenced by mineral fertilization and time of harvest”(Revista brasileirade botanica，1998)的出版物中表明，在含菊粉植物培养期间添加肥料并不提高菊粉含量。

在WO2005/053710中发现，按照一种特殊的烘干方法，能够由几种植物原料形成葡糖胺，由此获得每千克干重150至1000mg的葡糖胺含量。

发明概述

本发明第一方面描述了从植物获得葡糖胺的新方法，在收获植物材料并对其进行加热处理之前使用氮基肥料(nitrogen-based fertilizer)。氮基肥料起葡糖胺前体的作用，以获得含葡糖胺水平高于0.5％干重(5g/kg干重)的植物原料。本发明因此能够在植物材料中获得高于现有技术中先前所描述的(如WO2005/053710所反映的)葡糖胺含量。从而，为获得文献中描述的葡糖胺的活性剂量，需要更少的植物材料或植物提取物。因此，该方法在工业规模上更为有用。

上述肥料可在收获植物材料之前几小时至长达几周在田间或溶液培养体系中添加。

发明详述

在本说明书中，术语“加热”(以及由此派生的“加热的”)应理解为70-110℃温度范围超过10小时、优选小于1周的加热处理。此加热处理可描述为干燥处理。所述加热处理还可以以在相同温度和时间条件下进行的液体浸渍的形式存在，以代替干燥处理。

在本说明书中，“游离葡糖胺”应理解为非聚合的葡糖胺。

在本说明书中，“高量葡糖胺”应理解为葡糖胺的量高于痕量葡糖胺，高于相应新鲜(未干燥的)材料中的量，并高于文献或专利中所引述的任何含量。应当将其理解为葡糖胺以高于每公斤原料干物质0.5％的量存在。

在本说明书中，将“植物”和“植物材料”视为同义词。“植物”、“植物材料”或“植物提取物”应理解为能够根据本发明的加热处理产生葡糖胺的任何植物材料，以及能够通过技术人员已知的任何提取方法、根据本发明的加热处理从所述植物材料产生葡糖胺的任何类型的植物提取物。例如，含有一定量葡糖胺的植物可以是经历过本发明处理的干燥的或者再水合的植物材料。含有一定量葡糖胺的植物提取物可以是经历过本发明处理的由所述植物提取的水性溶液。

从而，本发明一方面描述了从植物获得葡糖胺的新方法。

关于本发明的第一个目的，根据本发明处理植物或植物提取物，以使之含有高量的天然游离葡糖胺。

在优选的实施方案中，植物或植物提取物来自植物任何部位，例如叶、茎、果实、种子、根、谷粒或细胞培养物。在植物原料的受控加热处理后，植物或植物提取物可以是视植物来源而定的叶、根和/或果实的干燥、冻干提取物形式、或新鲜植物、或富含葡糖胺的级分。

在一个实施方案中，植物物种的培养在田间或溶液培养体系中完成。

在优选的实施方案中，植物物种的培养在溶液培养体系中完成。

选择能够通过本发明方法产生游离葡糖胺的植物或植物提取物；特别是可以从含蔗糖、果糖或菊粉的植物物种中选择，如菊苣属(Cichorium)、胡萝卜属(Daucus)、向日葵属(Helianthus)、甜菜属(Beta)。

例如，在一个实施方案中，植物材料或植物提取物可以来自例如菊苣(Cichorium intybus)根、胡萝卜(Daucus carota)根、菊芋(Jerusalemartichoke)(Helianthus tuberosum)茎、甜菜(Beta vulgaris)根。

在优选的实施方案中，植物物种为菊苣，用于在田间或溶液培养体系中生产比利时菊苣(Belgian endive)：即菊苣(chicon)、维特罗夫菊苣(witloofchicory)、菊苣菜(witloof)、法国菊苣(French endive)、怀特苣荬菜(whiteendive)、荷兰苣(Dutch chicory)、菊苣(succory)、普通菊苣(common chicory)或意大利蒲公英(Italian dandelion)。“维特罗夫菊苣”为大多数栽培植物的园艺家所采用的常用名，而“比利时菊苣”更常用于杂货店售卖给消费者的最终产品。苣荬菜是菊苣根顶端芽的二次生长。一次生长发生在由种子长出的田间植物上。二次生长不在田间发生，通常在厂房暗处发生。每一个具有一个主芽的根引起菊苣(苣荬菜)发育。

在最优选的实施方案中，菊苣的培养在溶液培养体系中完成。将菊苣根置于重复循环的培养液中，营养液中的营养物(包括负责形成更多葡糖胺的肥料)促进从菊苣根底部萌发的饲养根生长。这些饲养根作为贯穿菊苣根维管系统的泵而起作用。也就是说，技术人员将会认可此实例的许多变通形式，从而覆盖大范围的处理和混合物，从而为多种应用合理调整本发明化合物的天然存在水平。

在一个实施方案中，在起葡糖胺前体作用的肥料的存在下使用本文的苣荬菜生产体系，其中菊苣根与地上部分(苣荬菜)同时收获。

在另一实施方案中，在本文的苣荬菜商业生产之后，将菊苣根再次置于起葡糖胺前体作用的肥料存在的溶液培养条件下。

在一个实施方案中，根据本发明处理的新鲜植物材料，或根据本发明处理然后干燥以及随后再水合的植物材料，均可用作为原料，以便加工获得根据本发明的具有高葡糖胺含量的植物材料。

在优选的实施方案中，使用新鲜植物材料。

根据本发明，以多种方式使用起葡糖胺前体作用的氮基肥料培养植物，所获得的葡糖胺的数量比WO 2005/053710高得多(高于5g/kg菊苣根干物质)。

如WO2005/053710中所公开的那样，其中描述的干燥方法是在植物中大量获得葡糖胺的一种方式：利用WO2005/053710中所述干燥方法能够获得的葡糖胺水平为：500mg/kg菊苣根干物质、100mg/kg胡萝卜根干物质或50mg/kg菊芋茎或甜菜根干物质。

在培养期间事先接触了氮基肥料的新鲜、干燥或再水合的植物原料，利用液体浸渍或干燥方法在低于110℃的温度，优选在70至110℃的温度，最优选在70至91℃或以下的温度进行加热，加热10小时以上，优选小于1周，优选10至120小时，例如12至50小时，这取决于植物物种和植物器官。如果温度太低和/或加热时间太短，将不能有效产生葡糖胺或产生太慢，导致方法在经济上不可行。相反，如果温度太高和/或加热时间太长，则产生葡糖胺但随后被逐步降解。

因此，为了获得至少5g葡糖胺/kg相应经加热处理植物材料干物质的葡糖胺含量，需要选择温度和时间。

最优选的实例包括在烘箱中以85℃的温度干燥48至72小时。

根据本发明的肥料是能够形成糖-氮化合物缩合反应的化合物，所述缩合反应是形成葡糖胺所必需的。优选肥料存在于铵盐之中。这类铵盐的实例有硝酸铵或硫酸铵等等。优选的葡糖胺前体为硫酸铵，其在根据本发明的方法中表现出令人惊讶的优良结果。

肥料在收获植物材料之前使用几小时至长达几周。也就是说，技术人员将会认可此实例的许多变通形式，从而覆盖大范围的肥料施用，从而为多种应用合理调整本发明化合物的天然存在水平。

关于导致葡糖胺形成的最终处理，WO2005/053710中描述了制备植物材料的一种合适的方法：收获植物材料、切削并在烘箱或工业干燥器中在低于110℃，优选在80至105℃、最优91℃或以下的温度进行干燥，干燥10小时以上，优选小于1周，优选10至120小时，例如12至50小时，这取决于植物物种和植物器官。尽管不希望受任何理论束缚，我们认为优选将植物材料切削成片或块，优选最大宽度为5mm。本发明人确实认为，为实现最佳的热动力学交换，这对于本发明很重要。

在收获植物材料之前添加起葡糖胺前体作用的肥料，能够显著提高上述反应，在无前体的情况下，每千克干重仅几百毫克的葡糖胺，而每千克相应植物材料干物质可达至少5g葡糖胺。

本发明的方法直接产生游离形式的葡糖胺。不希望受任何理论束缚，认为所述方法生产的葡糖胺至少半数为游离形式，并且甚至生产的葡糖胺几乎全为游离形式。实际上，认为根据本发明的方法，生产的葡糖胺至少50％、至少70％并且甚至至少90％为游离形式。这是本发明的另一优势，相比之下，用于生产葡糖胺的已知技术中，例如，为了从复合物分子如几丁质、糖蛋白或蛋白聚糖中释放游离葡糖胺，水解步骤是强制性的。

根据本发明的植物或植物提取物可用于制备食品组合物，而无需进一步处理或提取。所述组合物可以是营养平衡的食品或宠物食品、膳食增补物、治疗或药物组合物的形式。

实施例

下列实施例是对本发明范围内一些产品及制备所述产品的方法的举例说明。它们无论如何不应视为是对本发明的限制。可以对本发明进行改变和修饰。即，技术人员将认识到这些实施例的许多变通形式以覆盖大范围的配方、成分、处理和混合物，从而为多种应用合理调整本发明化合物的天然存在水平。

实施例1：

在菊苣(苣荬菜)溶液培养生产周期期间以肥料处理的新鲜菊苣根

采用本文生产苣荬菜的方法，在溶液培养条件下于20℃、80％相对湿度暗处培养菊苣根，为期21天。营养液含有0.1M硫酸铵。21天后，收获菊苣和根。将根切削成块(0.5×0.5×0.5cm)，然后在烘箱中于91℃干燥40小时。

分析：

葡糖胺的提取

将2g碾碎的经所述干燥的菊苣根用20ml水于室温提取1分钟。在Schleicher&Schultz(n°597)过滤器上过滤溶液或对其进行离心。利用阳离子交换柱(Oasis cartridge WATERS，MCX type，ref.186 000 776)进行溶液纯化步骤。用2％(v/v)的MeOH/NH₄OH对基质上捕获的碱性化合物进行洗脱。过滤后，将小份等分式样直接注射到LC系统(DIONEX)上。分离：

通过HPAE/PED系统利用离子交换PA1柱(4*250mm)以DIONEX DX500设备进行分析。

程序：

洗脱(％)

时间(分)	H2O	0.1 M NaOH	0.25 NaOH	注释
					0	85	15	0	平衡
60	85	15	0
					60.1	0	0	100	洗涤
70	0	0	100

70.1	85	15	0	平衡
					90	85	15	0

流速：1ml/分。注射体积：20μl。标准：购自Sigma的葡糖胺(ref：G4875)。

在这些条件下，葡糖胺的保留时间约为11分钟，易于检测，以对适当处理的菊苣提取物进一步定量。在本实施例中通过此法定量的浓度为5000mg/kg干重，相反，无前体时小于900mg/kg，而未经加热处理或商购的干燥菊苣根小于10mg/kg。

因此，有可能对产生苣荬菜的物价稳定副产品植物材料实施本发明。葡糖胺存在的证实：

为了证实菊苣植物提取物中存在葡糖胺，用三种不同的定性技术进行了评估。

薄层层析(TLC)

纯葡糖胺和植物提取物在HPTLC(高效薄层层析)硅胶板(Merck，ref.1.05642)上以乙酸乙酯/MeOH/水(50/50/10；V/V/V)作为洗脱液进行分析。洗脱后，向硅胶板上喷洒1％茚三酮乙酸溶液，并于120℃加热10分钟。参照和提取物以相同的速率因子(rate factor)(Rf)出现粉/蓝色斑点。

化学降解

在茚三酮的存在下，葡糖胺发生氧化脱氨基作用，导致释放阿拉伯糖，后者可通过常规的糖LC分析容易地检测。明确地证实了对照和菊苣提取物中阿拉伯糖的存在。

葡糖胺的衍生

如Zhongming等人：“Determination of nutraceuticals，glucosaminehydrochloride in raw materials，dosage form and plasma using pre-columnderivation with UV HPLC.In J.of Pharmaceut.and Biomed.Analysis，1999(20)，807-814”所述，对纯的化合物以及植物提取物进行反相层析，使用以异硫氰酸苯酯(phenylisothiocyanate)衍生的预柱，并通过紫外检测(λ＝254nm)。

纯的化合物以及菊苣提取物中都检测到衍生葡糖胺对应的峰。

质谱分析

以正离子电离模式通过电喷雾质谱分析植物提取物，以证实葡糖胺的存在。质谱仪为时间飞行仪器(Micromass公司的LCT，使用Z-spray界面)。标准葡糖胺给出m/z 180.0887的离子。此离子碎片见于所分析的植物提取物。

实施例2：

在菊苣(苣荬菜)溶液培养生产周期之后以肥料处理的新鲜菊苣根

在收获用于平常商业生产的在本文条件下培养的苣荬菜之后，对剩余的根进行相同的处理。再次将根置于与实施例1相同的溶液培养条件下，用含1M硫酸铵的营养液进行二次培养周期。

第5天收获根，然后如实施例所述进行处理(切削、干燥)。结果葡糖胺的浓度为10g/kg干重。

此为有可能对产生苣荬菜的物价稳定副产品植物材料实施本发明的另一实例。

Claims (11)

1.由植物产生葡糖胺的方法，其中将鲜植物材料或再水合的干燥植物材料或植物提取物于70至110℃的温度加热10小时以上，其特征在于：在收获之前的植物培养期间添加起葡糖胺前体作用的肥料。

2.根据权利要求1的方法，其中肥料为能够形成葡糖胺产生所必需的糖-氮化合物缩合反应的化合物，且优选为铵盐。

3.根据权利要求1至2的方法，其中肥料为培养植物所用的氮基肥料。

4.根据权利要求1至3的方法，其中植物物种属于菊苣属、胡萝卜属、向日葵属和/或甜菜属。

5.根据权利要求1至4的方法，其中植物为菊苣、胡萝卜、菊芋和/或甜菜。

6.根据权利要求5的方法，其中在溶液培养条件下生产菊苣。

7.根据权利要求6的方法，其中在生产苣荬菜之前或之后向菊苣根溶液培养的营养液中添加肥料。

8.根据权利要求7的方法，其中苣荬菜生产所得的根用作葡糖胺的来源。

9.植物或植物提取物，其中以kg植物材料(干重)计，含有至少5g葡糖胺，优选至少7.5g/kg，且更优选高于10g/kg。

10.根据权利要求9的植物或植物提取物，其中至少部分葡糖胺为游离形式，优选至少半数葡糖胺为游离形式。

11.根据权利要求9或10的植物或植物提取物，其中植物属于菊苣属、胡萝卜属、向日葵属或甜菜属。