CN107904218B - 一种单宁酶固态发酵培养基制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种单宁酶固态发酵培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1固态发酵培养基原料预处理；步骤2固体基质外加营养液制备；步骤3培养料制备及灭菌。本发明还包括一种单宁酶固态发酵培养基的应用。本发明所述的单宁酶固态发酵培养基制备方法及其应用，充分利用农林废弃物杨梅叶、杨梅枝和水稻秸秆作为固态发酵基质生产高经济价值的单宁酶，实现了农林废弃物的高值化利用，对进一步完善我国南方几大杨梅产区和水稻产区的废弃综合物利用产业链具有推动作用。

Description

一种单宁酶固态发酵培养基制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及单宁酶制备领域，特别涉及一种单宁酶固态发酵培养基制备方法及其应用。
背景技术
单宁酶(Tannase，EC3.1.1.20) 全称单宁酯酰水解酶，可以水解没食子酸单宁生成没食子酸和葡萄糖。单宁酶在自然界中有相当广泛的分布，早在20世纪20年代就有人在进行黑曲霉培养时发现菌丝内含有单宁酶，以后又陆续发现各类微生物，包括真菌、酵母、细菌都能产生单宁酶；单宁酶还存在于一些富含单宁的植物材料中，例如茶叶提取物中可以检测到单宁酶。
随着经济的发展和人们生活水平的提高，单宁酶已广泛应用于饮料、酿酒、食品、医药、化工、制革、化妆品等领域，特别是在制备药用中间体没食子酸和食品抗氧化剂没食子酸丙酯，以及在处理茶叶的“冷后浑”和啤酒沉淀等方面，有重要应用价值。
杨梅在我国南方的浙江、福建两省部分地区有较大面积种植，每年修剪杨梅枝条都会产生大量的杨梅叶和嫩枝。水稻在我国南方地区的地位和北方的小麦相当，水稻秸秆更是一种廉价的农业副产物；通过将这些农林副产物与外加营养液的配合，可以发酵生产高经济价值的单宁酶，实现了这些废弃物的高价值转化，同时也可有助于解决环境污染问题。
菌丝体接种易于大规模培养和工厂化生产，并能够提供稳定的菌种来源，跨越过孢子萌发和菌体生长调整阶段，单宁酶合成周期得以提前。此外因已含有少量单宁酶的菌丝体在接种前被强制打碎成小段的菌体，接种在固态发酵培养基中后能够强烈的刺激微生物生长并利用营养物快速合成单宁酶。
发明内容
针对上述问题，本发明目的在于提供一种可以实现生产高经济价值的单宁酶，又可以实现农林废弃物的高值化利用的单宁酶固态发酵培养基制备方法及其应用。
为达到上述目的，本发明的提出的技术方案为：一种单宁酶固态发酵培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1固态发酵培养基原料预处理：取应季修剪的杨梅枝叶，按叶和枝条分开；新鲜杨梅叶用热风吹至半风干，再将半风干的杨梅叶转入烘箱中烘干；杨梅枝直接用烘箱烘干；取烘干的杨梅叶粉碎过筛，取筛下物备用；将烘干的杨梅枝扎成小段，粉碎后过筛，取筛下物备用；取烘干或者晒干的水稻秸秆，截成小段，备用；将杨梅叶粉末、杨梅枝粉末及水稻秆段按照质量比1：1：1-3：3：1的比例混合，充分搅拌均匀，让水稻秆均匀分布在粉末中；
步骤2固体基质外加营养液制备：
准备下述重量份的原料：
葡萄糖 40-60g，
单宁酸 3-8g，
玉米浆 3-8mL，
硫酸铵 10-30g，
将上述原材料完全溶解于1L去离子水中；调节营养液pH至5-6，获得固体基质外加营养液；
步骤3培养料制备及灭菌：将混合均匀的杨梅叶粉末、杨梅枝粉末及水稻秆段作为固体基质，与固体基质外加营养液按照质量体积比1：2-1：3（m/v），混合并搅拌均匀制备获得培养料；培养料经灭菌后获得单宁酶固态发酵培养基。
进一步的，步骤1所述的新鲜杨梅叶用热风吹至半风干为将新鲜杨梅叶用30-50℃热风吹16-32小时，使新鲜杨梅叶水分逐步丢失但叶表维持绿色。
进一步的，步骤1所述的半风干的杨梅叶采用70-90℃烘干。
进一步的，步骤1中所述的烘干的杨梅叶粉碎后过30-50目筛。
进一步的，步骤1中所述的杨梅枝粉碎后过10-30目筛。
进一步的，步骤1中所述的水稻秸秆截成长度为0.2-0.3cm的小段。
进一步的，步骤2中所述的pH优选为5.5。
进一步的，步骤3所述的灭菌方法为121℃高压蒸汽灭菌10 min。
本发明还包括一种单宁酶固态发酵培养基的应用，其特征在于：采用上述的单宁酶固态发酵培养基应用于单宁酶的制备。
进一步的，所述的单宁酶的制备包括以下步骤：
步骤1：将产单宁酶丝状真菌菌株打碎制备菌体悬液接入固态发酵培养基中，搅拌均匀；
步骤2：遮光，恒温静置培养，发酵后可获得最高单宁酶。
进一步的，所述的产单宁酶丝状真菌菌株为米曲霉菌丝体。
进一步的，步骤1中每15 g单宁酶固态发酵培养基加入8 mL菌体悬液。
进一步的，步骤2中恒温稳定为25-35℃。
进一步的，所述的发酵时间为72-120 h。
采用上述技术方案，本发明所述的单宁酶固态发酵培养基制备方法及其应用，充分利用农林废弃物杨梅叶、杨梅枝和水稻秸秆作为固态发酵基质生产高经济价值的单宁酶，实现了农林废弃物的高值化利用，对进一步完善我国几大杨梅产区和水稻产区的废弃综合物利用产业链具有推动作用。
具体实施方式
下面结合具体实施列，对本发明做进一步说明。
实施例1
（1）单宁酶固态发酵培养基的制备
步骤1固态发酵培养基原料预处理：取应季修剪的杨梅枝叶，按叶和枝条分开；新鲜杨梅叶用将新鲜杨梅叶用40℃热风吹24小时，使新鲜杨梅叶水分逐步丢失但叶表维持绿色的半风干状态，再将半风干的杨梅叶转入烘箱中在80℃下烘干；杨梅枝直接用烘箱在80℃下烘干；取烘干的杨梅叶粉碎过40目筛，取筛下物备用；将烘干的杨梅枝扎成小段，粉碎后过20目筛，取筛下物备用；取烘干或者晒干的水稻秸秆，截成0.2-0.3cm小段，备用；将杨梅叶粉末、杨梅枝粉末及水稻秆段按照质量比2：2：1的比例混合，充分搅拌均匀，让水稻秆均匀分布在粉末中；
步骤2固体基质外加营养液制备：
准备下述重量份的原料：
葡萄糖 50 g，
单宁酶 5 g，
玉米浆 5 mL，
硫酸铵 20 g，
将上述原材料完全溶解于1L去离子水中；调节营养液pH至5.5，获得固体基质外加营养液；
步骤3培养料制备及灭菌：将混合均匀的杨梅叶粉末、杨梅枝粉末及水稻秆段作为固体基质，与固体基质外加营养液按照质量体积比1：2（m/v），即1 kg固体基质中加入2 L固体基质外加营养液，混合并搅拌均匀制备获得培养料；取混合均匀的培养料15 g装入500mL锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌10 min后获得单宁酶固态发酵培养基；
（2）单宁酶的制备
步骤1：将培养3天的米曲霉菌丝体打碎制备菌体悬液按照每瓶培养基接种8 mL的接种量接入固态发酵培养基中，搅拌均匀；
步骤2：遮光，恒温30℃静置培养，发酵96 h后分离获得单宁酶产量260 U/gds。
实施例2
（1）单宁酶固态发酵培养基的制备
步骤1固态发酵培养基原料预处理：取应季修剪的杨梅枝叶，按叶和枝条分开；新鲜杨梅叶用将新鲜杨梅叶用50℃热风吹16小时，使新鲜杨梅叶水分逐步丢失但叶表维持绿色的半风干状态，再将半风干的杨梅叶转入烘箱中在90℃下烘干；杨梅枝直接用烘箱在90℃下烘干；取烘干的杨梅叶粉碎过50目筛，取筛下物备用；将烘干的杨梅枝扎成小段，粉碎后过30目筛，取筛下物备用；取烘干或者晒干的水稻秸秆，截成0.2-0.3cm小段，备用；将杨梅叶粉末、杨梅枝粉末及水稻秆段按照质量比3：3：1的比例混合，充分搅拌均匀，让水稻秆均匀分布在粉末中；
步骤2固体基质外加营养液制备：
准备下述重量份的原料：
葡萄糖 40g，
单宁酸 8g，
玉米浆 3mL，
硫酸铵 10g，
将上述原材料完全溶解于1L去离子水中；调节营养液pH至5，获得固体基质外加营养液；
步骤3培养料制备及灭菌：将混合均匀的杨梅叶粉末、杨梅枝粉末及水稻秆段作为固体基质，与固体基质外加营养液按照质量体积比1：2.5（m/v），即1kg固体基质中加入2.5L固体基质外加营养液，混合并搅拌均匀制备获得培养料；取混合均匀的培养料15 g装入500mL锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌10 min后获得单宁酶固态发酵培养基；
（2）单宁酶的制备
步骤1：将培养3天的米曲霉菌丝体打碎制备菌体悬液按照每瓶培养基接种8 mL的接种量接入固态发酵培养基中，搅拌均匀；
步骤2：遮光，恒温25℃静置培养，发酵120 h后分离获得单宁酶产量248 U/gds。
实施例3
（1）单宁酶固态发酵培养基的制备
步骤1固态发酵培养基原料预处理：取应季修剪的杨梅枝叶，按叶和枝条分开；新鲜杨梅叶用将新鲜杨梅叶用30℃热风吹32小时，使新鲜杨梅叶水分逐步丢失但叶表维持绿色的半风干状态，再将半风干的杨梅叶转入烘箱中在70℃下烘干；杨梅枝直接用烘箱在70℃下烘干；取烘干的杨梅叶粉碎过30目筛，取筛下物备用；将烘干的杨梅枝扎成小段，粉碎后过10目筛，取筛下物备用；取烘干或者晒干的水稻秸秆，截成0.2-0.3cm小段，备用；将杨梅叶粉末、杨梅枝粉末及水稻秆段按照质量比2：2：1的比例混合，充分搅拌均匀，让水稻秆均匀分布在粉末中；
步骤2固体基质外加营养液制备：
准备下述重量份的原料：
葡萄糖 60g，
单宁酸 3g，
玉米浆 8mL，
硫酸铵 30g，
将上述原材料完全溶解于1L去离子水中；调节营养液pH至6，获得固体基质外加营养液；
步骤3培养料制备及灭菌：将混合均匀的杨梅叶粉末、杨梅枝粉末及水稻秆段作为固体基质，与固体基质外加营养液按照质量体积比1：3（m/v），即1kg固体基质中加入3L固体基质外加营养液，混合并搅拌均匀制备获得培养料；取混合均匀的培养料15 g装入500 mL锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌10 min后获得单宁酶固态发酵培养基；
（2）单宁酶的制备
步骤1：将培养3天的米曲霉菌丝体打碎制备菌体悬液按照每瓶培养基接种8 mL的接种量接入固态发酵培养基中，搅拌均匀；
步骤2：遮光，恒温35℃静置培养，发酵72 h后分离获得单宁酶产量239 U/gds。
尽管结合优选实施方案具体展示和介绍了本发明，但所属领域的技术人员应该明白，在不脱离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围内，在形式上和细节上对本发明做出各种变化，均为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种单宁酶固态发酵培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1固态发酵培养基原料预处理：取应季修剪的杨梅枝叶，按叶和枝条分开；新鲜杨梅叶用热风吹至半风干，再将半风干的杨梅叶转入烘箱中烘干；杨梅枝直接用烘箱烘干；取烘干的杨梅叶粉碎过筛，取筛下物备用；将烘干的杨梅枝扎成小段，粉碎后过筛，取筛下物备用；取烘干或者晒干的水稻秸秆，截成小段，备用；将杨梅叶粉末、杨梅枝粉末及水稻秆段按照质量比(1：1：1)-(3：3：1)的比例混合，充分搅拌均匀，让水稻秆均匀分布在粉末中；
步骤2固体基质外加营养液制备：
准备下述重量份的原料：
葡萄糖40-60g，
单宁酸3-8g，
玉米浆3-8mL，
硫酸铵10-30g，
将上述原材料完全溶解于1L去离子水中；调节营养液pH至5-6，获得固体基质外加营养液；
步骤3培养料制备及灭菌：将混合均匀的杨梅叶粉末、杨梅枝粉末及水稻秆段作为固体基质，与固体基质外加营养液按照质量体积比(1：2)-(1：3)，混合并搅拌均匀制备获得培养料；培养料经灭菌后获得单宁酶固态发酵培养基。
2.根据权利要求1所述的一种单宁酶固态发酵培养基的制备方法，其特征在于，步骤1所述的新鲜杨梅叶用热风吹至半风干为将新鲜杨梅叶用30-50℃热风吹12-24小时，使新鲜杨梅叶水分逐步丢失但叶表维持绿色；步骤1所述的半风干的杨梅叶采用70-90℃烘干。
3.根据权利要求1所述的一种单宁酶固态发酵培养基的制备方法，其特征在于，步骤1中所述的烘干的杨梅叶粉碎后过30-50目筛；步骤1中所述的杨梅枝粉碎后过10-30目筛；步骤1中所述的水稻秸秆截成长度为0.2-0.3cm的小段。
4.根据权利要求1所述的一种单宁酶固态发酵培养基的制备方法，其特征在于，步骤2中所述的pH为5.5。
5.根据权利要求1所述的一种单宁酶固态发酵培养基的制备方法，其特征在于，步骤3所述的灭菌方法为121℃高压蒸汽灭菌10min。
6.一种单宁酶固态发酵培养基的应用，其特征在于：采用权利要求1-5任一权利要求所述的单宁酶固态发酵培养基应用于单宁酶的制备。
7.根据权利要求6所述的一种单宁酶固态发酵培养基的应用，其特征在于：单宁酶的制备包括以下步骤：
步骤1：将产单宁酶丝状真菌菌株打碎制备菌体悬液接入固态发酵培养基中，搅拌均匀；
步骤2：遮光，恒温静置培养，发酵后可获得单宁酶。
8.根据权利要求7所述的一种单宁酶固态发酵培养基的应用，其特征在于：所述的产单宁酶丝状真菌菌株为米曲霉。
9.根据权利要求7所述的一种单宁酶固态发酵培养基的应用，其特征在于：步骤1中每15g单宁酶固态发酵培养基加入8mL菌体悬液。
10.根据权利要求7所述的一种单宁酶固态发酵培养基的应用，其特征在于：步骤2中恒温稳定为25-35℃，所述的发酵时间为72-120h。
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