CN101157895A - 一种利用气升式生物反应器生产食用菌液体菌种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用气升式生物反应器，规模化进行食用菌液体菌种生产的方法。该方法是将食用菌斜面菌种，在无菌条件下，接入一级菌种用气升式生物反应器内的液体培养基中，室温培养，形成一级液体菌种；将发酵完成的一级菌种，在无菌条件下，分接至二级菌种用气升式生物反应器的各单元液体培养基中，经过15－22天二级连续培养，可获得大量食用菌液体菌种。该方法操作简单，安全可靠，价格低廉，无需摇床、设备简单，特别适用个体菇农使用，从而解决了个体菇农无法生产食用菌液体菌种的现状。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用气升式生物反应器进行食用菌菌种液体培养，规模化生产食用菌液体菌种的方法。
背景技术
蘑菇类大型食用菌生产步骤可分为三步：制备菌种；制备栽培料并将菌种接入栽培料；出菇管理和收获。菌种制备又分为固体菌种制备和液体菌种制备。目前常用的菌种制备方法主要是固体菌种制备，其主要步骤为：斜面母种→固体原种→原种扩繁→栽培种。该方法在食用菌生产中已广泛应用，但缺点非常明显：1、制种时间长，从母种→栽培种需要150天时间；2、全部为手工操作，需要大量人工；3、占用设备和场地大，时间长。由于以上原因，固体菌种的制备一般由专门的菌种生产单位来完成，造成菌种生产与食用菌生产脱节，菌种成本过高，严重制约了食用菌生产的发展。
食用菌菌种的另一个制备方法为液体菌种制备。其主要步骤为：斜面母种→摇瓶液体菌种→发酵罐液体菌种，液体制种相对于固体制种有着明显的优势：1、制种时间短，整个制种周期仅需20-30天；2、用功省，用工量只及固体制种的1/20-1/10，占用场地很小；3、液体菌种的纯度高，菌龄一致，因而其菌袋的发菌时间可缩短1/3且出菇整齐，产品的质量好。液体制种方法必将取代固体制种方法，成为今后食用菌生产中制种技术的主要方法。
常规的食用菌液体制种主要设备是搅拌式发酵罐，它主要由发酵主罐、搅拌系统、供养系统、控温系统及其它分析检测系统组成。它的开发主要是为生物工程菌的发酵而设计的，目的是为了获得高附加值的基因工程产品，其操作技术要求高，设备投资大，因此，将它移置到食用菌液体菌种的生产是不合适的，该设备也没有真正在食用菌生产中得到推广应用。
由于蘑菇类食用菌大都是好氧真菌，生长需要充足的氧气供应。因此，相对于搅拌式发酵罐，气升式生物反应器是更好的液体制种设备。气升式生物反应器主要由主罐、空气发生及过滤系统、控温系统、pH控制系统、溶氧测定系统、消泡及蒸气消毒系统组成。它提供的氧气远较搅拌式发酵罐大，非常适于食用菌液体菌种的培养。但是气升式生物反应器是专门为植物细胞培养而设计的，目的是为了获得高附加值的细胞工程次生代谢产物，它的操作技术难度大，设备投资也很高。由于当前我国食用菌生产的主体是分散经营的个体种植户，他们没有足够的资金购买昂贵的设备，它们缺乏相关的技术知识，难以在生产中正确地使用和操作这些设备，因此，发酵罐和气升式生物反应器均不适用于我国食用菌生产的现状，气升式生物反应器在食用菌生产中的应用未见报道，正是由于这个原因，食用菌液体制种生产工艺至今没有得到普及和推广。市场急需的是面向个体菇农的，小型化的，操作简便、价格低廉的液体菌种生产设备。
本发明所提供的“简易气升式生物反应器”是利用中国专利ZL200420107291.6的气升式生物反应器，该反应器正是面向个体菇农户，实现小型化的，操作简便、价格低廉的液体菌种生产设备。目前食用菌菌种的液体培养已经非常成熟，先后有近百个食用菌品种的液体培养获得成功，但仅限于三角瓶的培养，本发明提供的是利用气升式生物反应器进行食用菌液体菌种生产方法。
发明内容
本发明目的在于，提供一种利用气升式生物反应器，规模化进行食用菌液体菌种生产的方法。该方法是将食用菌斜面菌种，在无菌条件下，接入一级菌种用气升式生物反应器内的液体培养基中，室温培养，形成一级液体菌种；将发酵完成的一级菌种，在无菌条件下，分接至二级菌种用气升式生物反应器的各单元液体培养基中，室温培养获得二级生产用液体菌种，在生产过程结束后，在无菌条件下，取出每瓶中的空气分布器及连接管，将罐上塑料盖盖好，即可用于食用菌生产。该方法操作简单，安全可靠，价格低廉，适用于个体菇农户使用，从而解决了个体菇农无法生产食用菌液体菌种的现状。
本发明所述的一种利用气升式生物反应器生产食用菌液体菌种的方法，按下列步骤进行：
a、取一支食用菌斜面菌种，在无菌条件下，取1-2cm2大小的菌块，接入一级菌种用气升式生物反应器内的液体培养基0.1-1.0％蛋白胨，0.1-1.0％酵母提取物，2-6％蔗糖，0.1-0.3％磷酸氢二钾，0.1-0.3％硫酸镁，10％小麦水，pH6.0-7.5中，加入消泡剂植物油7.5-20ml/瓶，室温培养10-15天，通气量0.8-1.2L/(min瓶)，形成一级液体菌种；
b、将发酵完成的一级菌种，在无菌条件下，分接至二级菌种用气升式生物反应器的各单元液体培养基0.1-1.0％蛋白胨，0.1-1.0％酵母提取物，2-6％蔗糖，0.1-0.3％磷酸氢二钾，0.1-0.3％硫酸镁，10％小麦水，pH6.0-7.5中，加入消泡剂植物油7.5-20ml/瓶，每瓶接种量为10-20ml，通气量为0.8-1.2L/(min瓶)，室温培养5-7天，获得二级生产用液体菌种，在生产过程结束后，在无菌条件下，取出每瓶中的空气分布器及连接管，将罐上塑料盖盖好，即可用于食用菌生产。
步骤a气升式生物反应器的容积为2L/瓶，装液量为1.5-1.8L/瓶。
步骤a、b中加入消泡剂选用一种或数种的植物油。
步骤a中涉及的一级菌种用气升式生物反应器为单罐。
步骤b涉及的一级菌种分接至二级罐中，二级罐为48个罐。
步骤a、b中加入液体培养基的反应器需进行整体消毒，消毒方式为：将气泵与空气过滤器断开，用夹子将空气过滤器与橡皮塞之间的硅胶管夹死，将整个气升式生物反应器及其所有连接管，放入消毒锅中100-105℃，消毒8小时。
步骤a、b中所涉及的培养基配方中的小麦水的制备方法为：50g小麦加入300ml自来水，煮至200ml，过滤备用。
本发明所述的方法中的气升式生物反应器是在中国专利ZL200420107291.6的进一步改进简化的气升式生物反应器，是由罐体(1)、硅胶管(2)(8)、空气分布器(3)、气泵(4)、橡胶塞(5)、玻璃管(6)(7)、和空气过滤器(9)组成。在罐体(1)瓶口内通过橡胶塞(5)插入玻璃管(6)、(7)，玻璃管(6)的一端通过硅胶管(2)固定空气分布器(3)，另一端通过空气过滤器(9)与气泵(4)相连，玻璃管(7)的一端与硅胶管(8)连接。
本发明所述步骤a一级菌种用气升式生物反应器为单罐，每套由一个2L主罐(食品级无毒PC塑料瓶，耐温-20-120℃)，一个微型气泵(220V，4.5W)，一个空气过滤器，一个空气分布器及连接管组成。
本发明所述步骤b二级菌种用气升式生物反应器为一组48套(每套包括一个主罐，一个空气分布器，一个空气过滤器)气升式生物反应器，一个小型气泵(80-120W，220V，排气量70-120L/min)及气体分配器组成，总容积为96L。
本发明所述的气升式生物反应器专用液体培养基由0.1-1.0％蛋白胨，0.1-1.0％酵母提取物，2-6％蔗糖，0.1-0.3％磷酸氢二钾，0.1-0.3％硫酸镁，10％小麦水组成，pH6.0-7.5，附加7.5-20ml植物油(小麦水的制备方法为：50g小麦加入300ml自来水，煮至200ml，过滤备用)。
本发明所述的消毒方法为：将整个气升式生物反应器(除气泵外)连带罐内培养基一起放入消毒锅内，将空气过滤器和罐体之间的硅胶管夹死，100-105℃消毒8小时。
附图说明
图1为本发明气升式生物反应器示意图
具体实施方式
实施例1
首先将一级菌种使用的气升式反应器打开罐体(1)上口处的橡胶塞(5)，装入1.5L/瓶液体培养基0.1％蛋白胨，1.0％酵母提取物，2％蔗糖，0.1％磷酸氢二钾，0.3％硫酸镁，10％小麦水，pH6.0，每瓶附加20ml植物油，将插有玻璃管(6)(7)的橡胶塞(5)固定在罐体(1)的上口处，将气泵(4)与空气过滤器(9)断开，把空气过滤器(9)和罐体(1)之间的硅胶管夹死，将整个气升式生物反应器(除气泵外)连带罐内培养基一起放入消毒锅内，100℃消毒8小时，取出放置在超净台上，打开橡胶塞(5)；
取一支阿魏菇斜面菌种，在无菌条件下，切取1cm2大小的菌块，接入一级菌种用气升式生物反应器单罐内的液体培养基中，开启气泵(4)，调节通气量至0.8-1.2L/(min瓶)，使得培养液中的阿魏菇菌丝随气泡的移动上下翻滚，在一级菌种用气升式生物反应器内，室温培养13-15天，形成一级液体菌种；
将发酵完成的一级阿魏菇菌种，在无菌条件下，分接至二级菌种用气升式生物反应器的48个罐体(1)内液体培养基中(二级发酵所用液体培养基的组成和消毒方式与一级发酵培养基相同)，每瓶接种量为10ml，开启气泵(4)，调节通气量至0.8-1.2L/(min瓶)，使得培养液中的阿魏菇菌丝随气泡的移动上下翻滚，室温培养7天，获得二级生产用液体菌种，在生产过程结束后，在无菌条件下，打开瓶塞(5)，取出每瓶中的空气分布器(3)，将罐上塑料盖盖好，即可用于食用菌生产。
实施例2
首先将一级菌种使用的气升式反应器打开罐体(1)上口处的橡胶塞(5)，装入1.6L/瓶液体培养基0.5％蛋白胨，0.5％酵母提取物，4％蔗糖，0.3％磷酸氢二钾，0.1％硫酸镁，10％小麦水，pH7.5，每瓶附加7.5ml植物油，将插有玻璃管(6)(7)的橡胶塞(5)固定在罐体(1)的上口处，将气泵(4)与空气过滤器(9)断开，把空气过滤器(9)和罐体(1)之间的硅胶管夹死，将整个气升式生物反应器(除气泵外)连带罐内培养基一起放入消毒锅内，102℃消毒8小时，取出放置在超净台上，打开橡胶塞(5)；
取一支草菇斜面菌种，在无菌条件下，切取1.5cm2大小的菌块，接入一级菌种用气升式生物反应器单罐内的液体培养基中，开启气泵(4)，调节通气量至0.8-1.2L/(min瓶)，使得培养液中的草菇菌丝随气泡的移动上下翻滚，在一级菌种用气升式生物反应器内，室温培养10-12天，形成一级液体菌种；
将发酵完成的一级草菇菌种，在无菌条件下，分接至二级菌种用气升式生物反应器的48个罐体(1)内液体培养基中(二级发酵所用液体培养基的组成和消毒方式与一级发酵培养基相同)，每瓶接种量为20ml，开启气泵(4)，调节通气量至0.8-1.2L/(min瓶)，使得培养液中的草菇菌丝随气泡的移动上下翻滚，室温培养5天，获得二级生产用液体菌种。在生产过程结束后，在无菌条件下，打开瓶塞(5)，取出每瓶中的空气分布器(3)，将罐上塑料盖盖好，即可用于食用菌生产。
实施例3
首先将一级菌种使用的气升式反应器打开罐体(1)上口处的橡胶塞(5)，装入1.7L/瓶液体培养基1.0％蛋白胨，0.1％酵母提取物，6％蔗糖，0.2％磷酸氢二钾，0.2％硫酸镁，10％小麦水，pH7.0，每瓶附加15ml植物油，将插有玻璃管(6)(7)的橡胶塞(5)固定在罐体(1)的上口处，将气泵(4)与空气过滤器(9)断开，把空气过滤器(9)和罐体(1)之间的硅胶管夹死，将整个气升式生物反应器(除气泵外)连带罐内培养基一起放入消毒锅内，105℃消毒8小时，取出放置在超净台上，打开橡胶塞(5)；
取一支平菇斜面菌种，在无菌条件下，切取2cm2大小的菌块，接入一级菌种用气升式生物反应器单罐内的液体培养基中，开启气泵(4)，调节通气量至0.8-1.2L/(min瓶)，使得培养液中的平菇菌丝随气泡的移动上下翻滚，在一级菌种用气升式生物反应器内，室温培养11-13天，形成一级液体菌种；
将发酵完成的一级平菇菌种，在无菌条件下，分接至二级菌种用气升式生物反应器的48个罐体(1)内液体培养基中(二级发酵所用液体培养基的组成和消毒方式与一级发酵培养基相同)，每瓶接种量为15ml，开启气泵(4)，调节通气量至0.8-1.2L/(min瓶)，使得培养液中的平菇菌丝随气泡的移动上下翻滚，室温培养6天，获得二级生产用液体菌种。在生产过程结束后，在无菌条件下，打开瓶塞(5)，取出每瓶中的空气分布器(3)，将罐上塑料盖盖好，即可用于食用菌生产。
实施例4
首先将一级菌种使用的气升式反应器打开罐体(1)上口处的橡胶塞(5)，装入1.8L/瓶液体培养基0.6％蛋白胨，0.3％酵母提取物，5％蔗糖，0.1％磷酸氢二钾，0.2％硫酸镁，10％小麦水，pH6.5，每瓶附加10ml植物油，将插有玻璃管(6)(7)的橡胶塞(5)固定在罐体(1)的上口处，将气泵(4)与空气过滤器(9)断开，把空气过滤器(9)和罐体(1)之间的硅胶管夹死，将整个气升式生物反应器(除气泵外)连带罐内培养基一起放入消毒锅内，103℃消毒8小时，取出放置在超净台上，打开橡胶塞(5)；
取一支金针菇斜面菌种，在无菌条件下，切取1cm2大小的菌块，接入一级菌种用气升式生物反应器单罐内的液体培养基中，开启气泵(4)，调节通气量至0.8-1.2L/(min瓶)，使得培养液中的金针菇菌丝随气泡的移动上下翻滚，在一级菌种用气升式生物反应器内，室温培养10-13天，形成一级液体菌种；
将发酵完成的一级金针菇菌种，在无菌条件下，分接至二级菌种用气升式生物反应器的48个罐体(1)内液体培养基中(二级发酵所用液体培养基的组成和消毒方式与一级发酵培养基相同)，每瓶接种量为10ml，开启气泵(4)，调节通气量至0.8-1.2L/(min瓶)，使得培养液中的金针菇菌丝随气泡的移动上下翻滚，室温培养5天，获得二级生产用液体菌种。在生产过程结束后，在无菌条件下，打开瓶塞(5)，取出每瓶中的空气分布器(3)，将罐上塑料盖盖好，即可用于食用菌生产。
实施例5
首先将一级菌种使用的气升式反应器打开罐体(1)上口处的橡胶塞(5)，装入1.6L/瓶液体培养基0.2％蛋白胨，0.8％酵母提取物，3％蔗糖，0.3％磷酸氢二钾，0.2％硫酸镁，10％小麦水，pH7.0，每瓶附加12ml植物油，将插有玻璃管(6)(7)的橡胶塞(5)固定在罐体(1)的上口处，将气泵(4)与空气过滤器(9)断开，把空气过滤器(9)和罐体(1)之间的硅胶管夹死，将整个气升式生物反应器(除气泵外)连带罐内培养基一起放入消毒锅内，105℃消毒8小时，取出放置在超净台上，打开橡胶塞(5)；
取一支双孢菇斜面菌种，在无菌条件下，切取2cm2大小的菌块，接入一级菌种用气升式生物反应器单罐内的液体培养基中，开启气泵(4)，调节通气量至0.8-1.2L/(min瓶)，使得培养液中的双孢菇菌丝随气泡的移动上下翻滚，在一级菌种用气升式生物反应器内，室温培养12-15天，形成一级液体菌种；
将发酵完成的一级双孢菇菌种，在无菌条件下，分接至二级菌种用气升式生物反应器的48个罐体(1)内液体培养基中(二级发酵所用液体培养基的组成和消毒方式与一级发酵培养基相同)，每瓶接种量为20ml，开启气泵(4)，调节通气量至0.8-1.2L/(min瓶)，使得培养液中的双孢菇菌丝随气泡的移动上下翻滚，室温培养6天，获得二级生产用液体菌种。在生产过程结束后，在无菌条件下，打开瓶塞(5)，取出每瓶中的空气分布器(3)，将罐体瓶口处用已灭菌的塑料盖盖好，即可用于食用菌生产。
Claims (7)
1.一种利用气升式生物反应器生产食用菌液体菌种的方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、取一支食用菌斜面菌种，在无菌条件下，取1-2cm2大小的菌块，接入一级菌种用气升式生物反应器内的液体培养基0.1-1.0％蛋白胨，0.1-1.0％酵母提取物，2-6％蔗糖，0.1-0.3％磷酸氢二钾，0.1-0.3％硫酸镁，10％小麦水，pH6.0-7.5中，加入消泡剂植物油7.5-20ml/瓶，室温培养10-15天，通气量0.8-1.2L/(min瓶)，形成一级液体菌种；
b、将发酵完成的一级菌种，在无菌条件下，分接至二级菌种用气升式生物反应器各单元的液体培养基0.1-1.0％蛋白胨，0.1-1.0％酵母提取物，2-6％蔗糖，0.1-0.3％磷酸氢二钾，0.1-0.3％硫酸镁，10％小麦水，pH6.0-7.5中，加入消泡剂植物油7.5-20ml/瓶，每瓶接种量为10-20ml，通气量为0.8-1.2L/(min瓶)，室温培养5-7天，获得二级生产用液体菌种，在生产过程结束后，在无菌条件下，取出每瓶中的空气分布器及连接管，将罐上塑料盖盖好，即可用于食用菌生产。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a气升式生物反应器的容积为2L/瓶，装液量为1.5-1.8L/瓶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a、b中加入消泡剂选用一种或数种植物油。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中涉及的一级菌种用气升式生物反应器为单罐。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b涉及的一级菌种分接至二级罐中，二级罐为48个罐。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a、b中加入液体培养基的反应器需进行整体消毒，消毒方式为：将气泵与空气过滤器断开，用夹子将空气过滤器与橡皮塞之间的硅胶管夹死，将整个气升式生物反应器及其所有连接管，放入消毒锅中100-105℃，消毒8小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a、b中所涉及的培养基配方中的小麦水的制备方法为：50g小麦加入300ml自来水，煮至200ml，过滤备用。
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