CN101148662B

CN101148662B - 一种异源表达和纯化人艾滋病病毒辅助受体ccr5的方法

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Publication number: CN101148662B
Application number: CN200710092672XA
Authority: CN
Inventors: 胡宗利; 陈绪清; 陈国平; 潘宇; 杨妤欣; 胡廷章
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2007-09-06
Filing date: 2007-09-06
Publication date: 2011-10-05
Anticipated expiration: 2027-09-06
Also published as: CN101148662A

Abstract

本发明公开了一种异源表达和纯化人艾滋病病毒辅助受体CCR5的方法，该方法主要包括步骤：构建诱导型GST-CCR5融合蛋白表达载体并转化粟酒酵母；鉴定粟酒酵母转化子；GST-CCR5融合蛋白在粟酒酵母中的诱导表达；确认CCR5基因在粟酒酵母中得到表达；分离和纯化GST-CCR5融合蛋白；检测分离纯化的GST-CCR5融合蛋白；鉴定分离纯化的GST-CCR5融合蛋白；从GST-CCR5融合蛋白中的分离和纯化人类CCR5蛋白。本发明的方法可以应用于在粟酒酵母中表达高等动植物的膜蛋白，并且获得的蛋白质具有翻译后的修饰作用和生物活性。表达的膜蛋白对于研究其晶体结构和高通量药物筛选有应用价值。

Description

一种异源表达和纯化人艾滋病病毒辅助受体CCR5的方法

技术领域

本发明涉及一种表达和纯化蛋白的方法，尤其涉及一种异源表达和纯化人艾滋病病毒辅助受体CCR5(C-C chemokine receptor type 5)的方法。

背景技术

艾滋病病毒HIV及其引起的艾滋病(AIDs)严重威胁着人类健康，已经成为人类社会面临的重大灾难。目前艾滋病病毒已导致了全球4200万人的感染，2800万人死亡。我国艾滋病感染者累计数量已近100万人，即使能有效控制，我国艾滋病患者2010年也将达到1500万。因此，艾滋病的预防和治疗已成为全世界共同关注的重大课题。目前，采用高效抗逆转录的病毒疗法可以极大地降低体内HIV的病毒数量、延缓病情进展，但存在毒副反应严重及病毒变异产生对治疗的抵抗，不能完全控制艾滋病病毒侵染健康细胞，难于从根本上恢复艾滋病人的正常免疫功能及价格昂贵等问题，迫切需要寻求控制HIV的新途径，开发新的治疗药物和治疗方案。

近年来，对HIV侵染机制的大量研究发现，亲巨噬细胞型(M-tropic)病毒株感染靶细胞时的主要辅助受体CCR5是影响艾滋病病毒侵染过程的一个关键因子(David et al.，2000)。CCR5是β-趋化因子RANTES、MIP-1α和MIP-1β的受体，具有7个跨膜区，属于G蛋白偶联受体，其主要功能是通过与其相应的配体结合而诱导炎症细胞的迁移与聚集。这些β-趋化因子与受体CCR5结合可抑制HIV-1的感染；在侵染过程中，CCR5几乎被所有的早期HIV-1和相关的HIV-2及猴免疫缺陷性病毒SIV利用；缺失32对碱基的CCR5等位基因的纯合子突变个体不仅对HIV-1的侵染具有高度的抵抗能力，而且免疫功能正常。

由于CCR5是影响艾滋病病毒侵染过程的一个关键因子，如果降低它在靶细胞内的表达水平或通过趋化因子、趋化因子类似物或某些小分子化合物等与CCR5的竞争结合，就可以抑制艾滋病病毒与CCR5的结合，从而控制艾滋病病毒的侵染，达到预防和治疗艾滋病的目的。所以，针对艾滋病病毒对细胞的侵染过程，以CCR5为靶标设计开发抗艾滋病药物已成为一个重要的研究热点。以CCR5为靶标筛选抗艾滋病药物已有较多研究，已取得一定进展。β-趋化因子RANTES、MIP-1α、MIP-1β能够抑制HIV-1感染，但是会同时引起炎症反应，副作用较大，而且这些天然趋化因子在细胞内稳定性差、与CCR5的亲和力低；针对天然趋化因子的缺陷，人们筛选出了稳定性好、亲和力强的趋化因子修饰体，如AOP-RANTES，但趋化因子修饰体存在潜在的趋化活性、异源蛋白的免疫原性等问题。此外，以中国仓鼠卵巢法等体系，通过抑制趋化因子RANTES、MIP-1α等与CCR5的结合，已筛选了一些与CCR5具有较强亲和力的天然或人工合成的小分子化合物，如从海洋动物海黄瓜提取物中筛选到的两种新三萜糖苷，及人工合成的小分子化合物SCH-C(肟哌啶)，其中SCH-C已进入临床试验阶段。据报道，日本ONO公司最近向英国医药公司GlaxoSmithKline转让了可抑制艾滋病病毒与CCR5结合的小分子化合物ONO-4128，英国医药公司GlaxoSmithKline将于近期进行临床试验.

虽然以CCR5为靶标筛选抗艾滋病药物已取得一些进展，并显示出巨大的应用前景。但是，由于CCR5属于膜蛋白，其大量生产、分离纯化极其困难，目前国内外尚未见到能成功分离和纯化CCR5蛋白质的报道。因此，针对以CCR5为靶标筛选抗艾滋病药物主要是用中国仓鼠卵巢法等活细胞体系，极大地限制了筛选效率。鉴于CCR5在艾滋病侵染机制研究和药物筛选中的重要地位，国内外许多实验室都正在试图进行CCR5立体结构的研究，用于定向设计和虚拟筛选CCR5结合配体。Yang等以膜蛋白--细菌视紫红质为模板，通过计算机分析，模拟出了CCR5的立体结构模型，但其真实性尚有待进一步证实。

膜蛋白CCR5的结构、功能研究、以CCR5为靶标的药物开发及其抗体的生产需要毫克数量级以上的、高度纯化的膜蛋白。但是要获得毫克数量级以上的、高度纯化的膜蛋白非常困难，主要原因在于：(1)天然膜蛋白含量低，绝大多数低于微克数量级；(2)膜蛋白难于体外表达，迄今未见膜蛋白高效表达体系的报道；(3)膜蛋白不稳定，分离、纯化过程比较困难。至今，仅几十种天然含量丰富或易于生产的膜蛋白获得了具有原子分辨率的三维结构，仅占所有已经解析出三维结构蛋白质的0.2％。虽然国际上已有少数天然含量丰富或易于生产的膜蛋白作为抗原成功地开发出了抗体，由于缺乏大量高度纯化的膜蛋白，目前国际上销售的多数膜蛋白抗体质量较差，难于用来进行科学研究。如目前销售的艾滋病病毒辅助受体CCR5抗体，是美国ProSci Incorporated公司根据CCR5蛋白质的序列，利用化学方法合成的N端20个氨基酸残基通过免疫白兔生产的，售价每100μg高达$225，但质量较差，难于检测靶标CCR5蛋白。因此，目前制约膜蛋白结构生物学及其功能研究、药物开发及膜蛋白抗体生产的主要因素是膜蛋白的高效表达及分离方法。

基于膜蛋白CCR5的重要性，为了获得毫克数量级以上CCR5，研究其高效表达和纯化的关键技术是该领域的技术发展趋势。建立一套全新的、稳定的、重复性好的高效表达和纯化膜蛋白CCR5的体系，表达和纯化毫克数量级以上的CCR5具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种异源表达和纯化人艾滋病病毒辅助受体CCR5的方法，建立适合于膜蛋白CCR5的表达和纯化体系，用于初步表达和纯化人艾滋病病毒辅助受体CCR5蛋白，解决了膜蛋白CCR5结构和功能研究、药物开发和抗体生产中的一个关键制约因素。

该方法主要包括以下步骤：

(1)构建诱导型GST-CCR5(谷胱甘肽-S-转移酶-CCR5)融合蛋白表达载体；

(2)GST-CCR5融合蛋白表达载体转化粟酒酵母，得到粟酒酵母转化子；

(3)筛选和鉴定粟酒酵母转化子；

(4)GST-CCR5融合蛋白在粟酒酵母中的诱导表达；

(5)确证CCR5能在粟酒酵母中获得表达；

(6)分离和纯化GST-CCR5融合蛋白；

(7)检测分离纯化的GST-CCR5融合蛋白；

(8)鉴定分离纯化的GST-CCR5融合蛋白；

(9)从GST-CCR5融合蛋白中分离和纯化人类CCR5蛋白。

本发明的优选实施例中，在上述步骤(1)中，采用包含大肠杆菌复制起始序列Co1E1，粟酒酵母自主复制序列ars1，粟酒酵母启动子P_nmt1的质粒pESP-2，及采用人类CCR5 cDNA序列全长构建所述的诱导型GST-CCR5融合蛋白表达载体。

本发明的优选实施例中，上述步骤(2)中，采用醋酸锂方法，将所述的GST-CCR5融合蛋白表达载体转化粟酒酵母细胞。

本发明的优选实施例中，上述步骤(3)中，采用亮氨酸营养缺陷型或PCR扩增法筛选鉴定所述的粟酒酵母转化子。

本发明的优选实施例中，上述步骤(4)中包括采用含有硫胺素的培养基YES、不含硫胺素的基本培养基EMM培养所述的酵母细胞。根据启动子P_nmt1表达活性受培养基中硫胺素含量严格调控的特点，首先采用含有硫胺素的培养基YES培养所述的酵母细胞，使粟酒酵母转化菌迅速、大量生长，而抑制外源蛋白的表达。然后收集和充分洗涤酵母细胞去除YES丰富培养基中所含的硫胺素，采用不含硫胺素的基本培养基EMM培养所述的酵母细胞，从而诱导人类CCR5的异源表达。

本发明的优选实施例中，所述的GST-CCR5融合蛋白在粟酒酵母中诱导表达的条件为：于所述的YES培养基上扩大培养到OD600＝1.4，于所述的EMM培养基上继续诱导培养18小时。

本发明的优选实施例中，上述步骤(5)中，采用Northern印迹方法鉴定粟酒酵母转化子中CCR5基因经过诱导后的的表达水平。

本发明的优选实施例中，上述步骤(6)中，采用超高速离心和亲和层析的方法分离和纯化GST-CCR5融合蛋白，即破碎酵母细胞后，采用离心沉淀法首先去除细胞碎片，然后通过超高速离心机进行离心，使酵母细胞的细胞膜及其上的膜蛋白一同沉淀，从而使膜蛋白与其它水溶性蛋白质分开。

本发明的优选实施例中，所述的亲和层析的方法是谷胱苷肽-S-转移酶标签亲和层析方法。即用含去垢剂的缓冲液从细胞膜中将膜蛋白溶解出来，然后用GST亲和树脂结合异源表达的GST-CCR5，经过多次洗涤GST亲和树脂去除其它可能附着的酵母细胞膜蛋白，使酵母中异源表达的GST-CCR5得到纯化。最后用还原型谷胱甘肽溶液将纯化的异源GST-CCR5从GST亲和树脂上洗脱下来。

本发明的优选实施例中，上述步骤(7)中，采用SDS-PAGE电泳检测分离纯化的GST-CCR5融合蛋白。

本发明的优选实施例中，上述步骤(8)中，采用蛋白质印迹鉴定分离纯化的GST-CCR5融合蛋白。

本发明的优选实施例中，上述步骤(9)中包括采用凝血蛋白酶切割GST-CCR5融合蛋白。

本发明的优选实施例中，上述步骤(9)中还包括利用谷胱苷肽琼脂糖吸附GST及未裂解的GST-CCR5融合蛋白纯化外源蛋白CCR5。

根据本发明的方法，异源表达的人类CCR5蛋白产量为20mg/L。

本发明的优点是：构建了人类膜蛋白CCR5表达载体，通过粟酒酵母表达体系，使难于从人体内大量分离纯化，并且难于通过体外异源表达纯化的人类膜蛋白CCR5，首次在体外大量表达并获得纯化。此外，粟酒酵母表达体系生产出的蛋白质具有翻译后的修饰作用和生物活性，表达的人类膜蛋白CCR5对于研究其晶体结构，高通量药物筛选和抗体生产具有重要的应用价值，解决了抗艾滋病药物开发的瓶颈问题，对人类艾滋病的防治具有重要意义。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1为诱导型GST-CCR5融合蛋白表达载体的构建；

图2为粟酒酵母转化子的PCR扩增电泳图；

图3为粟酒酵母转化子的Northern印迹检测图；

图4为GST层析纯化GST-CCR5的SDS-PAGE电泳图；

图5为分离纯化GST-CCR5的蛋白质印迹图；

图6为本发明的步骤示意图。

具体实施方式

材料：

1.Taq DNA聚合酶、PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶(Takara公司产品，中国大连)

2.pMD18-T载体克隆试剂盒(Takara公司产品，中国大连)

3.T4 DNA连接酶(Takara公司产品，中国大连)

4.去磷酸化酶CIAP，限制性内切酶BamHI(Takara公司产品，中国大连)

5.DL2000 plus(北京全世公司产品，中国北京)

6.Unstained Protein Molecular Weight Marker(Fermentas公司产品，前苏联立陶宛)

7.Rediprime II DNA Labelling system探针标记试剂盒及Hybond N尼龙膜(Phamarcia公司产品；瑞典)

8.RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司产品，前苏联立陶宛)

9.RNAultra总RNA提取试剂盒(天为时代公司产品，中国北京)

10.DNA产物纯化试剂盒、离心柱型普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天为时代公司产品，中国北京)

11.凝血酶Thrombin(Sigma公司产品，美国)

12.GSTrap FF柱(GE公司产品，美国)

13.粟酒酵母菌SP-Q01(Invitrogen公司产品，美国)

14.质粒载体pESP-2(Invitrogen公司产品，美国)

15.大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara公司产品，中国大连)

注：以下所涉及的试剂均为市售产品。

16.LB培养基

酵母提取物 5g

胰蛋白胨 10g

NaCl 10g

固体培养基：加入2％(w/v)琼脂粉

溶于1000ml去离子水中，并用1mol/L的NaOH调节pH值至7.0，高压蒸汽灭菌。

17.YPD培养基

酵母提取物10g

蛋白胨 20g

葡萄糖 20g

固体培养基：加入2％(w/v)琼脂粉

溶于1000ml去离子水中，高压蒸汽灭菌。

18.YES培养基

5g酵母提取物；

30g葡萄糖；

225mg腺嘌呤；

225mg L-组氨酸；

225mg L-亮氨酸；

225mg尿嘧啶；

225mg L-赖氨酸.

溶于1000ml去离子水中，高压蒸汽灭菌。

19.EMM培养基

3g 邻苯二甲酸氢钾(potassium hydrogen phthalate)(14.7mM)；

2.2g Na₂HPO₄(15.5mM)；

5g NH₄Cl(93.5mM)；

20g 葡萄糖(2％w/v)；

20ml 50×盐组分；

1ml 维生素组分；

0.1ml微量元素组分。

溶于1000ml去离子水中，高压蒸汽灭菌。

其中，

50×盐组分配方(每升)：

52.5g MgCl₂.6H₂O(0.26M)；

0.735g CaCl₂.2H₂O(4.99mM)；

50g KCl (0.67M)；

2g Na₂SO₄(14.1mM)。

维生素组分配方(每升)：

1g泛酸 (4.20mM)；

10g烟酸 (81.2mM)；

10g肌醇 (55.5 mM)；

10mg生物素(40.8μM)。

微量元素组分配方(每升)：

5g硼酸 (80.9mM)；

4g MnSO₄ (23.7mM)；

4g ZnSO₄.7H₂O (13.9mM)；

2g FeCl₃.6H₂O (7.4mM)；

0.4g钼酸铵 (2.47mM)；

1g KI (6.02mM)；

0.4g CuSO₄.5H₂O(1.6mM)；

10g柠檬酸(47.6mM)

实施例1人类CCR5 cDNA的克隆

利用RNAultra总RNA提取试剂盒从健康人外周血单核细胞(PBMC)中提取总RNA，根据RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit操作说明合成cDNA第一链。根据Gen bank中CCR5 cDNA序列设计PCR引物C1和C2，这两条引物的5′端分别有保护碱基和BamH I酶切位点，上游引物C1/下游引物C2分别为SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：7。

PCR的反应体系为100ul，其中含引物C1和C2各20pmol，200μmol的dNTP，4ul cDNA第一链合成反应液，5×PrimeSTAR^TM反应缓冲液20ul，高保真的PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶5U。PCR的反应条件为：第一阶段95℃预变性5分钟；第二阶段94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环35次；第三阶段72℃延伸5分钟。所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见约1000bp大小电泳带，将PCR产物回收、纯化后加入dATP，Taq DNA聚合酶，10×PCR反应缓冲液，72℃反应30分钟，DNA纯化试剂盒过柱纯化PCR产物，取适量纯化PCR产物与pMD18-T载体连接。连接产物通过CaCl₂转化法转化JM109大肠杆菌感受态细胞，经氨苄青霉素和蓝白筛选后，挑取LB平板上的白色菌落于LB液体培养基中37℃振荡过夜，次日提取质粒DNA，用BamH I进行酶切鉴定，对于有1000bp大小DNA片段出现的重组质粒进行测序，测序结果表明阳性重组质粒多克隆位点中插入的DNA片段即是完整的人类CCR5 cDNA(SEQ ID NO：5)，该重组质粒命名为pMD18-CCR5。

实施例2诱导型GST-CCR5融合蛋白表达载体的构建

采用包含大肠杆菌复制起始序列Co1E1(SEQ ID NO：1)、粟酒酵母自主复制序列ars1(SEQ ID NO：2)、粟酒酵母中严格受硫胺素浓度调控的启动子P_nmt1全长序列(SEQ ID NO：3)、GST全长序列(SEQ ID NO：4)以及具有Thrombin识别位点的质粒pESP-2和重组质粒PMD18-CCR5，构建诱导型GST-CCR5融合蛋白表达载体。具体构建过程如下(图1)：

BamH I酶切质粒PMD18-CCR5，回收纯化CCR5 cDNA片段，同时利用BamH I酶切质粒pESP-2并进行去磷酸化处理，将CCR5 cDNA片段与去磷酸化处理后的质粒pESP-2连接，连接产物通过CaCl₂转化法转化JM109大肠杆菌感受态细胞，经氨苄青霉素筛选后，挑取LB平板上的转化菌进行PCR筛选，PCR引物为C1和C2，PCR的反应体系为25ul，其中含引物C1和C2各10pmol，200μmol的dNTP，1ul菌液，10×PCR反应缓冲液2.5ul，Taq DNA聚合酶1U。PCR的反应条件同以上实施例1。挑取能够PCR扩增出约1000bp的菌落进行测序。测序结果表明阳性重组质粒中插入了CCR5 cDNA片段并且方向正确，该重组质粒命名为pESP-CCR5。

实施例3诱导型GST-CCR5融合蛋白表达载体转化粟酒酵母

挑选1个粟酒酵母SP-Q01单菌落，接入到10ml培养基YPD中，在28℃摇床中以180-200rpm的转速过夜培养。取1.5ml过夜培养液加入到50ml新鲜培养基YPD，在28℃摇床中以180-200rpm的转速培养至OD₆₀₀＝0.5左右(约5个小时)，在室温下用50ml的离心管以3000rpm的转速离心5分钟，去除上清，收集酵母细胞沉淀，细胞沉淀悬浮于6ml 1×TE中，然后在室温下以3000rpm的转速离心5分钟，去除上清，细胞沉淀最后悬浮于0.5-1.0mlTE/LiAC(0.1M LiAC，1×TE)中，制备成酵母感受态细胞。取100μl酵母感受态细胞用于表达质粒的转化。

取5μl含CCR5基因的粟酒酵母表达载体质粒DNA和10μl浓度为10μg/μl的鲑鱼精DNA(鲑鱼精DNA先煮沸2分钟，然后在冰上迅速冷却)，加入到上述制备的100μl感受态细胞中，充分混匀，然后加入600μl PEG/LiAC/TE缓冲液(8ml 50％PEG4000，1ml 1M LiAC，1ml 10×TE)，并经过窝旋充分混匀，将混匀的酵母感受态细胞放置在30℃的摇床上以200rpm的转速振荡培养30-50分钟。然后再向酵母感受态细胞中加入70μl DMSO并轻轻颠倒充分混匀(禁止窝旋)，将混匀后的酵母细胞放置在42℃水浴锅中水浴培养15分钟，接着将酵母细胞放置在冰上冷却2分钟。然后以13000rpm的转速离心5-10秒，去除上清液，用150μl的1×TE重悬酵母细胞沉淀，接着以13000rpm的转速离心5-10秒，用150μl的1×TE重悬沉淀酵母细胞，从其中取50μl酵母细胞铺EMM培养基+25μM硫胺素的平板。用石蜡封口膜密封平板，倒置在28℃的培养箱中培养3-4天，平板上生长出的酵母单菌落即为含CCR5基因表达载体的酵母转化子SP-CCR5。

实施例4 粟酒酵母转化子的筛选和鉴定

1)亮氨酸营养缺陷型筛选

用CCR5表达载体转化粟酒酵母感受态细胞后，将50-100μl酵母转化产物均匀涂在含1.2％琼脂的培养基EMM+25μM硫胺素平板上，用石蜡封口膜密封平板，于28℃培养3-4天。由于表达载体pESP-CCR5上含有LEU2-d基因，可以互补SP-Q01菌株中亮氨酸营养缺陷，包含有表达载体pESP-CCR5的粟酒酵母菌才能在EMM培养基上生长。

2)PCR扩增法鉴定粟酒酵母转化子

在平板上出现酵母转化子SP-CCR5后，用接种针挑选单克隆在含1.2％琼脂的培养基EMM+25μM硫胺素平板上进行划线培养，同时利用粟酒酵母表达载体上的特异性引物YF和YR(SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9)进行PCR鉴定，鉴定结果如图2所示，其中分子量标记物是DL2000 plus(分子量从大到小为：5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp)，从图2中可以看出，扩增鉴定得到的片段分子量与异源CCR5基因片段分子量基本相同，酵母转化子中含有异源CCR5基因，证明CCR5表达载体成功转化至粟酒酵母细胞中。

实施例5 GST-CCR5融合蛋白在粟酒酵母中的诱导表达

将经过划线培养鉴定出的转化子接种到10ml液体培养基YES中，28℃，200rpm振荡培养16小时。取3ml过夜培养的液体培养物接种至100ml新鲜的液体培养基YES中，28℃，200rpm振荡培养至OD600＝1.4(约7小时)，用无菌的离心管以5000rpm的转速在室温下离心5分钟，收集酵母培养物，用50ml无菌水重悬细胞，以5000rpm的转速在室温下离心5分钟，去上清液，加入50ml无菌水再次重悬细胞，以5000rpm的转速在室温下离心5分钟，去上清液。用200ml无菌的液体培养基EMM重悬沉淀的细胞，并将细胞悬液转移至无菌的1000ml三角瓶中，28℃，以200rpm的转速振荡培养16小时。由于培养基EMM中不含硫胺素，从而解除了硫胺素对启动子P_nmyl的阻遏作用，使得由启动子P_nmt1驱动的GST-CCR5融合蛋白获得诱导表达。取10ml诱导培养液提取总RNA，采CCR5的部分cDNA序列为探针，利用Northern印迹检测转化子SP-CCR5中CCR5基因经过诱导后的转录水平，Northern印迹结果如图3所示，从图3可以看出，经过诱导后，异源CCR5基因在酵母转化子SP-CCR5中获得了高效率的转录。

实施例6 酵母异源表达的GST-CCR5分离和纯化体系的建立

本发明采用超高速离心和亲和层析的方法建立粟酒酵母异源表达的GST-CCR5分离和纯化体系，具体如下：

将经过诱导表达的粟酒酵母转化子SP-CCR5培养物以5000rpm的转速在4℃下进行离心收集，去上清液后，细胞沉淀用无菌水重悬洗涤2次。以5000rpm的转速在4℃下进行离心，去上清液后，细胞沉淀用50ml细胞裂解液重悬(细胞裂解液组成如下：50mM Tris-Cl，pH7.4；5mM EDTA；300mM NaCl；0.5％IGEPAL；100mM NaF；1mM EGTA；1mM Na₃V₄)，将细胞悬液转移至高压均质机(NS1001LPanda2K)的上样杯中，在1300Mpa下循环3次，进行细胞破碎(50ml细胞悬液约破碎5分钟)，于冰上收集细胞匀浆液。4℃，10000rpm离心20分钟，弃沉淀，取上清液，4℃，45,000rpm超高速离心1.5小时，使酵母细胞的细胞膜及膜上的膜蛋白一同沉淀从而使膜蛋白与其它水溶性蛋白质分开，小心去除上清液(内含细胞中水溶性蛋白质)，收集沉淀。然后用5ml含1％triton X-100的细胞裂解液溶解沉淀，将膜蛋白从细胞膜中溶解出来，然后于4℃，45,000rpm超高速离心30分钟，取上清液，用GST亲和树脂预装柱(GSTrap FF)进行亲和层析，纯化异源表达的融合蛋白(GST-CCR5蛋白)。

GSTrap FF亲和层析过程如下：

1.将GSTrap FF柱安装到Bio-Rad的Biologic LP层析系统上；

2.用3倍样品体积的PBS缓冲液(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH7.3)以1.0ml/分钟的流速进行平衡GSTrap FF柱；

3.以0.2ml/分钟的流速进行上样；

4.用3倍样品体积的PBS缓冲液，以1.0ml/分钟的流速洗涤GSTrap FF柱，去除其它可能附着的酵母细胞膜蛋白，使在酵母中异源表达的GST-CCR5蛋白得到纯化；

5.用2倍样品体积的洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl，10mM还原型谷胱甘肽，pH8.0)以0.2ml/分钟的流速，将纯化的异源GST-CCR5蛋白从GST亲和树脂上洗脱下来，同时收集洗脱成分；

6.将收集到的异源表达GST-CCR5蛋白溶液进行低温抽真空浓缩，将浓缩的膜蛋白用于SDS-PAGE检测和-80℃低温保存。

实施例7 SDS-PAGE电泳检测分离纯化的GST-CCR5蛋白

将浓缩的GST-CCR5蛋白溶于400μl含1％triton X-100的PBS缓冲液中，取30μl蛋白溶液，加入30μl的2×蛋白质上样缓冲液(3.55ml去离子水，1.25ml 0.5M Tris-HCl，pH6.8，2.5ml甘油，2.0ml 10％(w/v)SDS，0.2ml 0.5％(w/v)溴酚蓝，0.5ml巯基乙醇)，用12％的SDS-PAGE进行电泳，然后用考马斯亮蓝R-250染色液(50％甲醇，10％乙酸，0.05％考马斯亮蓝R-250)进行染色。经过脱色后，融合蛋白电泳分离结果如图4，其中分子量标记物是Unstained Protein Molecular Weight Marker(分子量从大到小为：116.0kDa，66.2kDa，45.0kDa，35.0kDa，25.0kDa，18.4kDa，14.4kDa)。从图4可以看出，经过GST亲和层析纯化的GST-CCR5蛋白只有一条单一的条带，其分子量大小与理论值相符。

实施例8蛋白质印迹鉴定分离纯化的GST-CCR5蛋白

分离纯化的GST-CCR5蛋白经过SDS-PAGE电泳后，通过电转移将PAGE胶上的蛋白质转移至尼龙膜上。尼龙膜用高浓度蛋白质进行封闭，然后用GST抗体进行结合反应，用洗液漂洗尼龙膜，加显色试剂进行显色。蛋白质印迹结果如图5所示。从蛋白质印迹结果可以看出，纯化出的蛋白质为含GST的CCR5蛋白。

实施例9人类膜蛋白CCR5从GST-CCR5融合蛋白中的分离和纯化

根据分离纯化出来的GST-CCR5融合蛋白具有Thrombin识别位点的特点，在已纯化的融合蛋白溶液中加入1/500～1/100凝血蛋白酶(Thrombin)，于25℃下温育1h，切割释放出GST成分，酶切反应液再流经GSTrap FF柱，利用柱中谷胱苷肽琼脂糖的吸附作用，吸附掉GST及未裂解的融合蛋白，纯化出异源表达蛋白CCR5。

根据本发明的方法，异源表达CCR5蛋白产量为20mg/L。

本发明提供的上述在粟酒酵母中进行异源表达和纯化膜蛋白——艾滋病病毒辅助受体CCR5的方法步骤示意图如图6所示，本发明的实验结果表明，通过将CCR5基因连接到酵母中严格受硫胺素浓度调控的启动子P_nmt1及GST后，构建GST-CCR5融合蛋白表达载体，将该表达载体转化到粟酒酵母感受态细胞中后，异源融合蛋白GST-CCR5在酵母中获得了表达。采用超高速离心和亲和层析等方法，使在酵母中获得异源表达的CCR5蛋白质得到了分离和纯化。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

序列表

<110>重庆大学

<120>一种异源表达和纯化人艾滋病病毒辅助受体CCR5的方法

<130>

<160>9

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>668

<212>DNA

<213>大肠杆菌复制起始序列ColE1的核苷酸序列

<400>1

gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 60

caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 120

ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 180

tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 240

ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 300

tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 360

cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 420

gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 480

ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 540

gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 600

agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 660

tttgctca 668

<210>2

<211>1206

<212>DNA

<213>粟酒酵母自主复制序列arsl的核苷酸序列

<400>2

gaattcgagt ctaactcctt aaccactcgg acatagtgac ttatctgaca ctcattgtaa 60

attaatatat atataggcat tttgtttagt taaaggtact taagtaatta gtataaacga 120

accaatttta taatcaggaa gttaagtgaa tggtagcaca tgtcgtaaaa attgtgaatt 180

tttattgaat aatattttaa atacaagcct ttctagacta ggtatactca taaacatata 240

tgagcaaaag gatagaggag attacattgc atcttctaca aatttattta ttgcccttta 300

ctgaaaaatt aaataatgag tactaaatga taaaaagcgc tcagtacaag aaagattgca 360

aaaatattgc attcttcatg aattaaagtt gcatataagg catattgaaa gtaatagtac 420

taaaacagca gttagcgaaa attaatagaa ttatattcgc aagacaattg tgacattaaa 480

ttaaaaaatt gtagaatttt tactatcctc tttaaacgcca tgagccttta taaaaaggtt 540

aaattagttt taacattctt tttttgagta agagtttaca atttatcaaa acctgtgtta 600

ttatattcat tagtttcaat ttattagcat ctagagaaaa atcaattggc agttacattg 660

ttggaattta tgaagaaaaa gaatctacaa cggagaataa gttgctgatc gctttcccta 720

aaattgtata ttttgctgag cttattttga catttcgttg aagttttctc taattcgcat 780

tcattttaag taaaacaatg agaaataaaa ttacaaaaaa tacaaattaa aatacaattt 840

ttagctataa ttatagacga tgcccttgta tcccattctg tctcgcttgc ccctactttt 900

tatcttttat ataccataat gaacgctgcc gctactaacc ataccccgat tttacatttc 960

ggactcccaa ggacgtacaa aatagaaaac tatagaaaaa aataatcaga aaatagcatg 1020

tcatctcttt gtaaaacgcg tttgcaagaa gaaaggaaac aatggagaag agatcatcca 1080

tttgtatgta aattttagta aacttgaaga aatcactaac aacttctctt acttagggat 1140

tctatgcaaa accttgtaaa tcatctgatg gaggactcga tttaatgaat tggaaggttg 1200

gaattc 1206

<210>3

<211>1174

<212>DNA

<213>粟酒酵母启动子Pnmt1的核苷酸序列

<400>3

agaggatcag aaaattatcg ccataaaaga cagaataagt catcagcggt tgtttcattt 60

cctatatttt ttttttattt ttttattttt taataaggga aaatttaacg tctaaggata 120

cagaagattg ttagcacatt aaagtaataa aggcttaagt agtaagtgcc ttagcatgtt 180

attgtatttc aaaggacata atctaaaata ataacaatat catttctcac aagttattca 240

attttctttt ttttttctaa taatatcaag aatgtattat ttgtttgaca taagtcaact 300

aatttattta atatgctgga ttaatcttgc agacatgtaa attaacaagt tttagtcaaa 360

taacgttgaa gtttcaatga actcaaataa tttctctttt tttttatata accataatct 420

gatttatatt ttccgcagga tcaactgaag ttatgacatt tggattggat cacttataac 480

cttggtcgcc aaataataca aaaatcagcg ttataaaaca aagaaggttt ttgttaagaa 540

attaatcctc tttcttgata agaaagttga accgaaattg cagatactga tatatgaaaa 600

taatacccac aattttggga atagcgcaag cctcaattta aacaataggt gaggacacat 660

gataatgacc tcaatgattg ttagaagaaa agagcctcat tacaaaatcg aaaaatgaat 720

ggttgggtac aagtttccaa aacatggtaa agtggacttt gcgtatgaga cgtaaataga 780

aaaaaacact tgttatatgt tttctagaat tattgttgtc tctttatggt tggatgatgc 840

aaaatagtaa tttcggttag ttgctgtaaa acaccacgag acaaatagat atggatattt 900

attaaatcag gaaaaacgta actctcggct actggatggt tcagtcaccc aacgattact 960

ggggagagaa aacagggcaa aagcaaagct taaaggaatc cgattgtcat tcggcaatgt 1020

gcagcgaaac taaaaaccgg ataatggacc tgttaatcga aacattgaag atatataaag 1080

gaagaggaat cctggcatat catcaattga ataagttgaa ttaattattt caatctcatt 1140

ctcactttct gacttatagt cgctttgtta aatc 1174

<210>4

<211>651

<212>DNA

<213>全长GST(谷胱苷肽-S-转移酶)基因cDNA的核苷酸序列

<400>4

atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60

ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120

tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180

ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240

atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300

gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360

gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420

acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480

gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540

aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600

tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc a 651

<210>5

<211>1059

<212>DNA

<213>人艾滋病病毒辅助受体CCR5基因cDNA的核苷酸序列

<400>5

atggattatc aagtgtcaag tccaatctat gacatcaatt attatacatc ggagccctgc 60

caaaaaatca atgtgaagca aatcgcagcc cgcctcctgc ctccgctcta ctcactggtg 120

ttcatctttg gttttgtggg caacatgctg gtcatcctca tcctgataaa ctgcaaaagg 180

ctgaagagca tgactgacat ctacctgctc aacctggcca tctctgacct gtttttcctt 240

cttactgtcc ccttctgggc tcactatgct gccgcccagt gggactttgg aaatacaatg 300

tgtcaactct tgacagggct ctattttata ggcttcttct ctggaatctt cttcatcatc 360

ctcctgacaa tcgataggta cctggctgtc gtccatgctg tgtttgcttt aaagccagg 420

acggtcacct ttggggtggt gacaagtgtg atcacttggg tggtggctgt gtttgcgtct 480

ctcccaggaa tcatctttac cagatctcaa aaagaaggtc ttcattacac ctgcagctct 540

cattttccat acagtcagta tcaattctgg aagaatttcc agacattaaa gatagtcatc 600

ttggggctgg tcctgccgct gcttgtcatg gtcatctgct actcgggaat cctaaaaact 660

ctgcttcggt gtcgaaatga gaagaagagg cacagggctg tgaggcttat cttcaccatc 720

ataattgttt attttctctt ctgggctccc tacaacattg tccttctcct gaacaccttc 780

caggaattct ttggcctgaa taattgcagt agctctaaca ggttggacca agctatgcag 840

gtgacagaga ctcttgggat gacgcactgc tgcatcaacc ccatcatcta tgcctttgtc 900

ggggagaagt tcagaaacta cctcttagtc ttcttccaaa agcacattgc caaacgcttc 960

tgcaaatgct gttctatttt ccagcaagag gctcccgagc gagcaagctc agtttacacc 1020

cgatccactg gggagcagga aatatctgtg ggcttgtga 1059

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>根据人艾滋病病毒辅助受体CCR5基因cDNA设计合成的上游引物序列

<400>6

gcgaagctta tggattatca agtgtcaagt 30

<210>7

<211>33

<212>DNA

<213>根据人艾滋病病毒辅助受体CCR5基因cDNA设计合成的下游引物序列

<400>7

gcgaagcttt cacaagccca cagatatttc ctg 33

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>根据粟酒酵母表达载体多克隆位点两端的核苷酸序列设计合成的上游引物序列

<400>8

gtacttgaaa tccagcaagt atatagc 27

<210>9

<211>33

<212>DNA

<213>根据粟酒酵母表达载体多克隆位点两端的核苷酸序列设计合成的下游引物序列

<400>9

caaaatcgta atatgcagct tgaatgggct tcc 33

Claims

1.一种异源表达和纯化人艾滋病病毒辅助受体CCR5的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)构建如附图1所示的诱导型GST-CCR5融合蛋白表达载体；

(2)将GST-CCR5融合蛋白表达载体转化粟酒酵母菌SP-Q01，筛选和鉴定粟酒酵母转化子；

(3)GST-CCR5融合蛋白在粟酒酵母中的诱导表达；

(4)确证CCR5基因在粟酒酵母中得到表达；

(5)分离和纯化GST-CCR5融合蛋白；

(6)检测分离纯化的GST-CCR5融合蛋白；

(7)鉴定分离纯化的GST-CCR5融合蛋白；

(8)人艾滋病病毒辅助受体CCR5从GST-CCR5融合蛋白中的分离和纯化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于上述步骤(1)中，采用包含大肠杆菌复制起始序列Co1E1，粟酒酵母自主复制序列ars1，粟酒酵母启动子P_nmt1的质粒pESP-2，及采用人类CCR5 cDNA序列全长构建如附图1所述的诱导型GST-CCR5融合蛋白表达载体。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于上述步骤(2)中，采用醋酸锂方法，将构建的表达载体转化到粟酒酵母细胞中，然后利用亮氨酸营养缺陷型筛选和PCR扩增法鉴定粟酒酵母转化子。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于上述步骤(3)中，先采用含有硫胺素的培养基YES使粟酒酵母转化菌迅速、大量生长，而抑制外源蛋白的表达，然后在不含硫胺素的基本培养基EMM上培养酵母细胞，从而诱导人艾滋病病毒辅助受体CCR5的异源表达，根据诱导条件的优化，获得了人类CCR5在粟酒酵母中诱导表达的较佳条件为：YES培养基上扩大培养到0D600＝1.4，然后于EMM培养基上诱导培养18小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于上述步骤(4)中，采用Northern印迹方法鉴定粟酒酵母转化子中CCR5基因经过诱导后的的表达水平。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于上述步骤(5)中，采用超高速离心和谷胱苷肽-S-转移酶标签亲和层析的方法分离和纯化GST-CCR5融合蛋白。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于上述步骤(6)中，采用SDS-PAGE电泳检测分离纯化的GST-CCR5融合蛋白。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于上述步骤(7)中，采用蛋白质印迹鉴定分离纯化的GST-CCR5融合蛋白。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于上述步骤(8)中，采用Thrombin切割GST-CCR5融合蛋白释放出GST，然后利用谷胱苷肽琼脂糖吸附掉GST及未裂解的融合蛋白，纯化外源蛋白CCR5。