CN114181921A

CN114181921A - 沼泽红假单胞菌5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及应用

Info

Publication number: CN114181921A
Application number: CN202210142094.0A
Authority: CN
Inventors: 王智文; 何桂美; 姜玫如; 崔真真; 孙曦; 陈涛
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2022-02-16
Filing date: 2022-02-16
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2042-02-16
Also published as: CN114181921B

Abstract

本发明公开了沼泽红假单胞菌5‑氨基乙酰丙酸合成酶突变体及应用，所述沼泽红假单胞菌5‑氨基乙酰丙酸合成酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的沼泽红假单胞菌5‑氨基乙酰丙酸合成酶突变体不仅相较于未突变的5‑氨基乙酰丙酸合成酶提高了酶活性，而且还提高了解调较高浓度血红素反馈抑制的能力，这使得本发明的宿主细胞生产5‑ALA的能力得到显著提升，约提升了40%。

Description

沼泽红假单胞菌5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）来源的5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及应用。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-minolevulinic acid，5-ALA)是生物体合成血红素、叶绿素、VB₁₂等四吡咯化合物的前体物，广泛存在于动物、植物和微生物中。5-ALA作为一种内源性物质，对人和动物无毒且绿色高效，在环境中易降解且无残留，因此它在医药、食品和农业等领域得到了广泛的应用。目前，5-ALA已被临床应用于改善人体代谢类疾病、癌症的诊断和治疗以及新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的治疗。研究表明5-ALA能有效抑制COVID-19病原体SARS-CoV-2对细胞的感染，具有安全性、耐受性和有效性。其抗病毒作用可在人类和非人类细胞中检测到，没有明显的细胞毒性，可通过口服途径摄入。此外，5-ALA和柠檬酸亚铁钠（SFC）协同作用对SARS-CoV-2变异具有抗病毒作用，且具有提高呼吸效率的能力，对呼吸困难的COVID-19患者的治疗作用更大^[1-3]。现今生产5-ALA的化学合成方法收率较低，工艺复杂^[4]，而生物合成方法具有可持续性和经济性，特别是利用代谢工程策略实现5-ALA的高产量生物合成^[5]，具有重要的应用价值。在自然界中，5-ALA的生物合成主要有两种途径，分别为C4途径和C5途径^[6-7]。C4途径以琥珀酰CoA和甘氨酸为前体物，通过5-氨基乙酰丙酸合成酶（ALAS，由hemA基因编码）一步催化生成5-ALA，与C5途径相比较，它的合成途径更短，催化机理更简单^[8]，因而被广泛应用于5-ALA的生物合成。

目前，在模式菌株中通过代谢工程改造异源表达5-ALA合成酶生产5-ALA的策略中，较为常见的5-ALA合成酶来源有沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）、荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）以及类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）。但它们都存在催化效率低和严重的血红素反馈抑制等缺点，这极大地限制其在5-ALA生物合成中的应用。近年来，随着酶工程和蛋白质工程技术的快速发展，通过理性设计提高酶的催化活性等性质已被广泛应用。因此，亟需开发出酶活性高或者能够解除血红素反馈抑制的5-ALA合成酶，以实现低成本、高水平生物合成5-ALA。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种沼泽红假单胞菌5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体。

本发明的第二个目的是提供编码上述合成酶突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供包含上述基因的表达载体。

本发明的第四个目的是提供包含上述表达载体的宿主细胞。

本发明的第五个目的是提供上述宿主细胞发酵生产5-氨基乙酰丙酸的应用。

本发明的技术方案概述如下：

沼泽红假单胞菌5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体，所述合成酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

编码上述合成酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

包含上述基因的表达载体。

包含上述表达载体的宿主细胞。

上述宿主细胞发酵生产5-氨基乙酰丙酸的应用。

本发明的优点：

本发明的沼泽红假单胞菌5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体不仅相较于未突变的5-氨基乙酰丙酸合成酶提高了酶活性，而且还提高了解除或缓解较高浓度血红素反馈抑制的能力，这使得本发明的宿主细胞生产5-ALA的能力得到显著提升，约提升了40.1%。

具体实施方式

术语定义

宿主细胞

本文所用的术语“宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即能够产生本发明5-ALA合成酶的宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要本发明的5-ALA合成酶能在该宿主细胞中表达。

例如，适用于本发明的宿主细胞来自(但不限于)大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、荚膜红细菌(Rhodopseudomonas capsulatusla)、沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonaspalustris）和希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）等。

在具体实施方式中，5-ALA合成酶突变体酶活力提高，且在15 μM血红素存在下，所述的5-ALA合成酶突变体能够保持较高的酶活力。

本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。除非另有说明，所有技术和科学术语都具有本领域所知的常见含义。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。

实施例1. 一种沼泽红假单胞菌5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）合成酶突变体的构建

质粒的构建：选择KEGG数据库中的沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris BisB5）来源的5-ALA合成酶基因hemA，根据宿主细胞谷氨酸棒杆菌的密码子偏爱性进行密码子优化，并在金唯智公司合成如SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列。以它为模板，利用SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示序列为引物进行PCR扩增，得到片段1；以同样的的核苷酸序列为模板，利用SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列为引物进行PCR扩增，得到片段2。对上述所得的PCR产物片段1和片段2进行胶回收和纯化。随后，以片段1和片段2为模板，利用SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7所示序列为引物进行融合PCR扩增，得到片段3，进行胶回收和纯化。最后选择基本载体pET28a(+)和酶切位点NdeI和XhoI，利用E.coli DH5α感受态，通过酶切酶连的方式构建质粒pET28a-hemA-C132A（即获得SEQ ID NO. 2所示的5-ALA合成酶突变体的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示）。构建的质粒由金唯智公司进行测序。然后，同样以上述在金唯智合成的SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列为模板，利用SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7所示序列的引物进行PCR扩增，对PCR产物进行胶回收和纯化，以上述同样的方式构建质粒pET28a-hemA。

PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物各2μL，dNTP 1μL，phanta Buffer 25μL，灭菌的双蒸水17μL，DNA聚合酶1μL，总体积50μL。

PCR反应条件：95℃ 3min，30个循环(95℃ 20s, 58℃ 20s, 72℃ 1min)，72℃10min，4℃ 10min。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行回收和纯化。

本发明所用的DNA聚合酶、限制性核酸内切酶和DNA连接酶均来自Thermo FisherFermentas；酵母浸粉、胰蛋白胨、葡萄糖、甘氨酸、抗生素等购自上海生工生物工程有限公司；MOPS购自天津所罗门公司；5-氨基乙酰丙酸盐、血红素等购自Sigma公司；冰乙酸、对二甲氨基苯甲醛等购自天津市大茂化学试剂厂；

质粒提取试剂盒购自康宁生命科学有限公司，琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒和纯化试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司，相关操作均严格按照说明书执行。

质粒构建测序验证由金唯智完成；

E.coli DH5α感受态细胞、E.coli BL21感受态细胞的制备由常规技术制备；

LB培养基成分：酵母浸粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，固体培养基中添加2％的琼脂粉。

CGIII培养基成分：酵母浸粉10g/L，胰蛋白胨10g/L，MOPS 21g/L，NaCl 2.5g/L，用5M的NaOH溶液调节PH=7。

BHI培养基成分：脑心浸液肉汤粉74g/L。

抗生素浓度为：卡那霉素40μg/mL和25μg/mL。

5-ALA的检测方法：取250μL的5-氨基乙酰丙酸盐标准品或稀释的发酵液或酶活力测定反应终止后的反应液，加入125μL pH=4.6的乙酸钠缓冲液，然后加入62.5μL的乙酰丙酮，100℃金属浴温浴15min，冷却至室温后加入440μL现配的Modified Ehrlich's reagent试剂(0.2g对二甲氨基苯甲醛，1mL冰醋酸，1mL高氯酸，冰乙酸定容到10mL)混匀，室温反应20min后测反应液在554nm波长下的吸光值。利用测定5-氨基乙酰丙酸盐标准品得到的标准曲线计算发酵液或者酶活力测定反应终止后的反应液中的5-ALA含量。

实施例2. 5-ALA合成酶突变体酶学性质的检测

表达5-ALA合成酶工程菌株的构建：通过化转的形式将构建好的pET28a-hemA和突变型质粒pET28a-hemA-C132A分别导入到E. coli BL21感受态中，制备得到表达5-ALA合成酶工程菌株：BL21-pET28a-hemA和BL21-pET28a-hemA-C132A。

（1）菌体培养：将上述工程菌株单菌落分别接种于5mL含有40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h。转接到5mL含有40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，待种子长浓后，转接到装有200mL含40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基的1L三角瓶中，待OD600到0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度为16℃，诱导时间为12h，4500rpm离心，去上清，收集菌体。

（2）蛋白纯化：

1.Buffer A : 25mM Tris，150mM NaCl，20mM咪唑, pH7.5（buffer中添加1mM的DTT现用现加）；Buffer B : 25mM Tris，150mM NaCl，500mM咪唑，pH7.5（buffer中添加1mM的DTT现用现加）。

2.菌体用适量的buffer A悬浮，转移到50mL离心管中，放置于冰上。

3.高压均质机（压力800-1000bar）破碎4次，破碎后4℃、4500rpm离心40min。

4.利用重力柱纯化蛋白：平衡柱子后，加入镍填料后，利用双蒸水冲柱子三次，再利用的bufferA冲柱子三次，下面接离心管，然后上样。上样完成后，用不同浓度的咪唑进行洗脱（如表1所示），收集流出液。

5.蛋白洗脱后，首先利用Buffer B冲柱子，然后换成Buffer A冲，最后用20%乙醇保存柱子。

表1 不同浓度的咪唑的洗脱液

咪唑浓度(mM)	Buffer A (20mM)	Buffer B(500mM)
			20mM	60	0
50mM	54	6
			100mM	48	12
150mM	42	18
			200mM	36	24

（3）咪唑的去除和蛋白的浓缩：通过超滤管浓缩的方法去除咪唑。选择孔径为10kD的超滤管，将全部的蛋白洗脱液倒入超滤管中，不断添加50mM的Tris-HCl缓冲液，在4℃条件下，4000rpm离心，去除咪唑，浓缩蛋白。

（4）蛋白浓度的测定：蛋白浓度测定参照说明书，使用Thermo Scientific公司的BCA蛋白定量试剂盒完成。

（5）酶活力的测定：酶反应体系中反应液各组分浓度如表2所示，37℃水浴中反应10min后向体系中加入60μL的10％三氯乙酸溶液终止反应。之后检测酶反应体系中5-ALA的生成量。5-ALA的检测方法如“实施例1”部分所述。酶活力单位U定义为：37℃时，每分钟内产生1μmol 5-ALA所需的酶量。

表2 酶反应体系

反应体系组分名称	所需体积（μL）	终浓度
			1M Glycine	20	0.1M
1M MgCl<sub>2</sub>	2	10mM
			1M Tris-HCl（PH=7.5）	2.08	50mM
10mM PLP	5.4	0.27mM
			8mM succinyl-CoA	5	0.2mM
5-ALA合成酶(2mg/mL)	5	50μg/mL
			50mM Tris-HCl	定容反应体系到200μL	50mM

（6）解除血红素反馈抑制能力的测定：在反应体系中加入终浓度为15μM的血红素，并按照上述测定方法测定此时剩余的酶活力，与没有添加血红素时的酶活力对比，如表3所示。用于表征5-ALA合成酶突变体解调血红素反馈抑制的能力。

表3 5-ALA合成酶酶活力分析

5-ALA合成酶	血红素不存在时5-ALA合成酶的酶活力(U/mg)	15 μM血红素存在时的5-ALA合成酶剩余酶活力比例
			野生型HemA	0.122	64%
突变型HemA-C132A	0.135	82%

实施例3. 5-ALA合成酶突变体在5-ALA合成中的应用

在谷氨酸棒杆菌中验证5-ALA合成酶突变体对5-ALA合成的影响。

质粒的构建：以psod*核苷酸序列（SEQ ID NO:12）为模板，利用SEQ ID NO:8和SEQID NO:9 所示核苷酸序列为引物进行PCR扩增，得到psod*片段；以“实施例1”所构建的质粒pET28a-hemA和pET28a-hemA-C132A为模板，利用SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示序列为引物进行PCR扩增，得到野生型hemA片段4和突变型hemA-C132A片段5。然后，利用SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:11 所示核苷酸序列为引物，将片段4和片段5分别与psod*片段进行融合PCR，以pEC-ΔlacIq-Δtrc为原始质粒（其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示）选择KpnI和XbaI这两个酶切位点，按照“实施例1”所示方法，构建质粒并命名为pEC-ΔlacIq-Δtrc-Psod*- hemA和pEC-ΔlacIq-Δtrc-Psod*- hemA-C132A。

产5-ALA工程菌株的构建：

选择谷氨酸棒杆菌为宿主细胞，具体菌株为谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）Cev-18-5，已于2017年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌株保藏编号CGMCC No. 15040。

将上述构建好的质粒通过电转的形式导入到Cev-18-5的感受态细胞中，得到菌株Cev-18-5-pEC-ΔlacIq-Δtrc-Psod*- hemA，Cev-18-5-pEC-ΔlacIq-Δtrc-Psod*-hemA-C132A。

将Cev-18-5-pEC-ΔlacIq-Δtrc-Psod*- hemA和Cev-18-5-pEC-ΔlacIq-Δtrc-Psod*- hemA-C132A单菌落分别接种5mL含有25μg/mL卡那霉素的BHI液体培养基，30℃，220rpm培养12h，接着按照1%的接种量转接二级种子于含有50mLCGIII培养基的250mL三角瓶中。12h后，按照初始OD₆₀₀=0.5接种于有50mL CGIII培养基的250mL三角瓶中。添加终浓度为25μg/mL卡那霉素和30 g/L葡萄糖，于30 ℃，220 rpm的摇床中培养。培养到8小时，添加终浓度为7.5 g/L的甘氨酸。诱导培养约54h左右收集发酵液，检测5-ALA的浓度。5-ALA的检测方法如“实施例1”部分所述。所构建的菌株摇瓶发酵结果见表4。突变后的5-ALA合成酶使得宿主菌株5-ALA产量得到提升。

表4 5-ALA合成酶突变体对5-ALA合成的影响

不同菌株	5-ALA相对产量
		Cev-18-5-pEC-ΔlacIq-Δtrc-Psod*- hemA	1.0
Cev-18-5-pEC-ΔlacIq-Δtrc-Psod*- hemA-C132A	1.4

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献

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[2]Negoro H, Chatziantoniou C, Razzaque MS. Therapeutic potential of5-aminolevulinic acid and sodium-ferrous citrate for viral insults: relevanceto the COVID-19 crisis[J]. Expert Review of anti-infective Therapy, 2022.

[3]Sakurai Y, Tun MMN, Kurosaki Y, et al. 5-amino levulinic acidinhibits SARS-CoV-2 infection in vitro[J]. 2021, 545: 203-207.

[4]Kang Z, Ding W, Gong X, et al. Recent advances in production of 5-aminolevulinic acid using biological strategies[J]. World Journal ofMicrobiology and Biotechnology, 2017, 33(11)33, 200.

[5]Tan SI, You SC, Shih IT, et al. Quantification, regulation andproduction of 5-aminolevulinic acid by green fluorescent protein inrecombinant Escherichia coli[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,2020, 129(4): 387-394.

[6]Kang DK, Kim S, Chi WJ, et al. Cloning and expression of theRhodobacter capsulatus hemA gene in E. coli for the production of 5-aminolevulinic acid[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2004, 14:1327–1332.

[7]Woodard SI, Dailey HA. Regulation of heme biosynthesis inEscherichia coli[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1995, 316, 110–115.

Lili F, Ya Z, Jing F, et al. Metabolic Engineering of Corynebacterium glutamicum for Efficient Production of 5-Aminolevulinic Acid[J].Biotechnology and Bioengineering, 2016, 113(6): 1284-1293.。

序列表

<110> 天津大学

<120> 沼泽红假单胞菌5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 403

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asn Tyr Glu Ala Tyr Phe Arg Arg Gln Leu Asp Gly Leu His Arg

1 5 10 15

Glu Gly Arg Tyr Arg Val Phe Ala Asp Leu Glu Arg His Ala Gly Ser

20 25 30

Phe Pro Arg Ala Thr His His Arg Pro Glu Gly Ala Gly Asp Val Thr

35 40 45

Val Trp Cys Ser Asn Asp Tyr Leu Gly Met Gly Gln His Pro Ala Val

50 55 60

Leu Thr Ala Met His Glu Ala Leu Asp Ser Cys Gly Ala Gly Ala Gly

65 70 75 80

Gly Thr Arg Asn Ile Ala Gly Thr Asn His Tyr His Val Leu Leu Glu

85 90 95

Gln Glu Leu Ala Ala Leu His Gly Lys Glu Ser Ala Leu Leu Phe Thr

100 105 110

Ser Gly Tyr Val Ser Asn Trp Ala Ser Leu Ser Thr Leu Ala Ser Arg

115 120 125

Met Pro Gly Ala Val Ile Leu Ser Asp Glu Leu Asn His Ala Ser Met

130 135 140

Ile Glu Gly Ile Arg His Ser Arg Ser Glu Thr Arg Ile Phe Ala His

145 150 155 160

Asn Asp Pro Arg Asp Leu Glu Arg Lys Leu Ala Asp Leu Asp Pro His

165 170 175

Ala Pro Lys Leu Val Ala Phe Glu Ser Val Tyr Ser Met Asp Gly Asp

180 185 190

Ile Ala Pro Ile Ala Glu Ile Cys Asp Val Ala Asp Ala His Asn Ala

195 200 205

Met Thr Tyr Leu Asp Glu Val His Gly Val Gly Leu Tyr Gly Pro Asn

210 215 220

Gly Gly Gly Ile Ala Asp Arg Glu Gly Ile Ser His Arg Leu Thr Ile

225 230 235 240

Ile Glu Gly Thr Leu Ala Lys Ala Phe Gly Val Val Gly Gly Tyr Ile

245 250 255

Ala Gly Ser Ser Ala Val Cys Asp Phe Val Arg Ser Phe Ala Ser Gly

260 265 270

Phe Ile Phe Ser Thr Ser Pro Pro Pro Ala Val Ala Ala Gly Ala Leu

275 280 285

Ala Ser Ile Arg His Leu Arg Ala Ser Ser Ala Glu Arg Glu Arg His

290 295 300

Gln Asp Arg Val Ala Arg Leu Arg Ala Arg Leu Asp Gln Ala Gly Val

305 310 315 320

Ala His Met Pro Asn Pro Ser His Ile Val Pro Val Met Val Gly Asp

325 330 335

Ala Ala Leu Cys Lys Gln Ile Ser Asp Glu Leu Ile Ser Arg Tyr Gly

340 345 350

Ile Tyr Val Gln Pro Ile Asn Tyr Pro Thr Val Pro Arg Gly Thr Glu

355 360 365

Arg Leu Arg Ile Thr Pro Ser Pro Gln His Thr Asp Ala Asp Ile Glu

370 375 380

His Leu Val Gln Ala Leu Ser Glu Ile Trp Thr Arg Val Gly Leu Ala

385 390 395 400

Lys Ala Ala

<210> 2

<211> 1212

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaactacg aagcctactt ccgtcgccag ctggatggtc tgcatcgcga aggccgctac 60

cgtgtgttcg ccgatctgga acgtcatgcc ggttccttcc cacgcgcaac ccatcaccgt 120

ccagagggtg ccggcgacgt caccgtctgg tgctccaacg attatctggg tatgggtcag 180

catccagcag tgctgaccgc catgcacgaa gcactggatt cttgcggcgc cggtgccggt 240

ggcactcgta acattgccgg caccaaccac taccacgtgc tgctggagca agaactcgca 300

gcactgcacg gcaaggaatc cgcactcctc ttcacctccg gctatgtctc caactgggcc 360

tctctgtcca ctctggcatc ccgcatgccg ggcgccgtga tcctctccga cgaactgaat 420

cacgcctcca tgatcgaagg catccgtcac tcccgctctg aaacccgcat ctttgcccac 480

aacgatcctc gcgatctgga acgtaagctc gcagatctgg atcctcacgc cccaaagctg 540

gtcgcattcg agtccgtgta ctccatggac ggcgatatcg ccccaatcgc agaaatctgc 600

gacgtggccg atgcacacaa cgccatgacc tatctggatg aggtccacgg tgtcggcctc 660

tacggtccaa acggcggtgg tatcgccgat cgcgaaggca tttcccaccg tctgaccatc 720

atcgaaggca ctctggccaa ggcattcggt gtggtcggtg gctacattgc cggctcttcc 780

gccgtgtgcg acttcgtgcg ctcctttgcc tccggcttta tcttctctac ctctcctcca 840

ccagccgtgg cagccggcgc actggcctct atccgtcatc tccgcgcatc ctctgccgag 900

cgcgaacgtc atcaagatcg cgtcgcacgt ctgcgcgcac gtctggatca agccggcgtg 960

gcacacatgc caaacccatc tcacatcgtg ccagtgatgg tcggtgacgc agccctctgc 1020

aaacagatct ctgacgagct catctcccgc tatggcatct acgtgcagcc tatcaactat 1080

ccaaccgtgc cacgcggcac cgagcgtctc cgtatcactc catccccaca acacaccgac 1140

gccgatatcg aacacctcgt gcaagcactg tccgaaatct ggactcgcgt gggcctcgca 1200

aaagccgcct aa 1212

<210> 3

<211> 1212

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaactacg aagcctactt ccgtcgccag ctggatggtc tgcatcgcga aggccgctac 60

cgtgtgttcg ccgatctgga acgtcatgcc ggttccttcc cacgcgcaac ccatcaccgt 120

ccagagggtg ccggcgacgt caccgtctgg tgctccaacg attatctggg tatgggtcag 180

catccagcag tgctgaccgc catgcacgaa gcactggatt cttgcggcgc cggtgccggt 240

ggcactcgta acattgccgg caccaaccac taccacgtgc tgctggagca agaactcgca 300

gcactgcacg gcaaggaatc cgcactcctc ttcacctccg gctatgtctc caactgggcc 360

tctctgtcca ctctggcatc ccgcatgccg ggctgcgtga tcctctccga cgaactgaat 420

cacgcctcca tgatcgaagg catccgtcac tcccgctctg aaacccgcat ctttgcccac 480

aacgatcctc gcgatctgga acgtaagctc gcagatctgg atcctcacgc cccaaagctg 540

gtcgcattcg agtccgtgta ctccatggac ggcgatatcg ccccaatcgc agaaatctgc 600

gacgtggccg atgcacacaa cgccatgacc tatctggatg aggtccacgg tgtcggcctc 660

tacggtccaa acggcggtgg tatcgccgat cgcgaaggca tttcccaccg tctgaccatc 720

atcgaaggca ctctggccaa ggcattcggt gtggtcggtg gctacattgc cggctcttcc 780

gccgtgtgcg acttcgtgcg ctcctttgcc tccggcttta tcttctctac ctctcctcca 840

ccagccgtgg cagccggcgc actggcctct atccgtcatc tccgcgcatc ctctgccgag 900

cgcgaacgtc atcaagatcg cgtcgcacgt ctgcgcgcac gtctggatca agccggcgtg 960

gcacacatgc caaacccatc tcacatcgtg ccagtgatgg tcggtgacgc agccctctgc 1020

aaacagatct ctgacgagct catctcccgc tatggcatct acgtgcagcc tatcaactat 1080

ccaaccgtgc cacgcggcac cgagcgtctc cgtatcactc catccccaca acacaccgac 1140

gccgatatcg aacacctcgt gcaagcactg tccgaaatct ggactcgcgt gggcctcgca 1200

aaagccgcct aa 1212

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tacgcatatg aactacgaag cctacttccg tcgc 34

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cggagaggat cacggcgccc ggcatgc 27

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcccgcatgc cgggcgccgt gatcctctcc gac 33

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cttactcgag ttaggcggct tttgcgaggc ccac 34

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgcggtacc tagctgccaa ttattccggg 30

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acggaagtag gcttcgtagt tcatgggtaa aaaatccttt cgtaggtt 48

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgaaaggatt ttttacccat gaactacgaa gcctacttcc gtcgc 45

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgtatctaga ttaggcggct tttgcgagg 29

<210> 12

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tagctgccaa ttattccggg cttgtgaccc gctacccgat aaataggtcg gctgaaaaat 60

ttcgttgcaa tatcaacaaa aaggcctatc attgggaggt gtcgcaccaa gtacttttgc 120

gaagcgccat ctgacggatt ttcaaaagat gtatatgctc ggtgcggaaa cctacgaaag 180

gattttttac cc 192

<210> 13

<211> 5655

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gagctcggta cccggggatc ctctagagtc gacctgcagg catgcaagct tggctgtttt 60

ggcggatgag agaagatttt cagcctgata cagattaaat cagaacgcag aagcggtctg 120

ataaaacaga atttgcctgg cggcagtagc gcggtggtcc cacctgaccc catgccgaac 180

tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt agtgtggggt ctccccatgc gagagtaggg 240

aactgccagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat 300

ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat ccgccgggag cggatttgaa 360

cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg ggcaggacgc ccgccataaa ctgccaggca 420

tcaaattaag cagaaggcca tcctgacgga tggccttttt gcgtttctac aaactctttt 480

tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgaattaatt ccgctagatg 540

acgtgcggct tcgacctcct gggcgtggcg cttgttggcg cgctcgcggc tggctgcggc 600

acgacacgcg tctgagcagt attttgcgcg ccgtcctcgt gggtcaggcc ggggtgggat 660

caggccaccg cagtaggcgc agctgatgcg atcctccact actgcgcgtc ctcctggcgc 720

tgccgagcac gcagctcgtc ggccagctct tcaaggtcgg ccacaagcgt ttctaggtcg 780

ctcgcggcac ttgcccagtc gcgtgatgct ggcgcgtctg tcgtatcgag ggcgcggaaa 840

aatccgatca ccgtttttaa atcgacggcg gcatcgagtg cgtcggactc cagcgcgaca 900

tcggagagat ccaccgctga tgcttcaggc cagttttggt acttcgtcgt gaaggtcatg 960

acaccattat aacgaacgtt cgttaaaaat tctagcccca attctgataa tttcttccgg 1020

cactcctgcg aaaacctgcg agacttcttg cccagaaaaa acgccaagcg cagcggttac 1080

cgcacttttt ttccaggtga tttcaccctg accagcgaag cggcacttta gtgcatgagg 1140

tgtgcccctg gtttcccctc tttggagggt tcaacccaaa aaagcacaca agcaaaaatg 1200

aaaatcatca tgagcaagtt ggtgcgaagc agcaacgcgc tagctccaaa aaggtctcca 1260

ggatctcgag gagatttttg agggggaggg agtcgaggaa gagccagagc agaaggcggg 1320

gaaccgttct ctgccgacag cgtgagcccc ccttaaaaat caggccgggg aggaaccggg 1380

gagggatcag agctaggagc gagacaccct aaaggggggg aaccgttttc tgctgacggt 1440

gtttcgttta ttagttttca gcccgtggat agcggagggt gagggcaagt gagagccaga 1500

gcaaggacgg gacccctaaa ggggggaacc gttttctgct gacggtgttt cgtttattag 1560

ttttcagccc gtggacggcc gcgtttagct tccattccaa gtgcctttct gacttgttgg 1620

atgcgccttt cactgacacc tagttcgcct gcaagctcac gagtcgaggg atcagcaacc 1680

gattgagaac gggcatccag gatcgcagtt ttgacgcgaa gttcgagcaa ctcgcctgtc 1740

atttctcggc gtttgtttgc ttccgctaat cgctgtcgcg tctcctgcgc atacttactt 1800

tctgggtcag cccatctgcg tgcattcgat gtagctgcgc cccgtcgccc catcgtcgct 1860

agagctttcc gccctcggct gctctgcgtt tccacccgac gagcagggac gactggctgg 1920

cctttagcca cgtagccgcg cacacgacgc gccatcgtca ggcgatcacg catggcggga 1980

agatccggct cccggccgtc tgcaccgacc gcctgggcaa cgttgtacgc cacttcatac 2040

gcgtcgatga tcttggcatc ttttaggcgc tcaccagcag ctttgagctg gtatcccacg 2100

gtcaacgcgt ggcgaaacgc ggtctcgtcg cgcgctcgct ctggatttgt ccagagcact 2160

cgcacgccgt cgatcaggtc gccggacgcg tccagggcgc tcggcaggct cgcgtccaaa 2220

atcgctagcg ccttggcttc tgcggtggcg cgttgtgccg cttcaatgcg ggcgcgtccg 2280

ctggaaaagt cctgctcaat gtactttttc ggcttctgtg atccggtcat cgttcgagca 2340

atctccatta ggtcggccag ccgatccaca cgatcatgct ggcagtgcca tttataggct 2400

gtcggatcgt ctgagacgtg cagcggccac cggctcagcc tatgcgaaaa agcctggtca 2460

gcgccgaaaa cacgagtcat ttcttccgtc gttgcagcca gcaggcgcat atttgggctg 2520

gttttacctg ctgcggcata caccgggtca atgagccaga tgagctggca tttcccgctc 2580

agcggattca cgccgatcca agccggcgct ttttctaggc gtgcccattt ctctaaaatc 2640

gcgtagacct gcgggtttac gtgctcaatc ttcccgccgg cctggtggct gggcacatcg 2700

atgtcaagca cgatcaccgc ggcatgttgc gcgtgcgtca gcgcaacgta ctggcaccgc 2760

gtcagcgctt ttgagccagc ccggtagagc tttggttggg tttcgccggt atccgggttt 2820

ttaatccagg cgctcgcgaa atctcttgtc ttgctgccct ggaagctttc gcgtcccagg 2880

tgagcgagca gttcgcggcg atcttctgcc gtccagccgc gtgagccgca gcgcatagct 2940

tcggggtggg tgtcgaacag atcggcggac aatttccacg cgctagctgt gactgtgtcc 3000

tgcggatcgg ctagagtcat gtcttgagtg ctttctccca gctgatgact gggggttagc 3060

cgacgccctg tgagttcccg ctcacggggc gttcaacttt ttcaggtatt tgtgcagctt 3120

atcgtgtttt cttcgtaaat gaacgcttaa ctaccttgtt aaacgtggca aataggcagg 3180

attgatgggg atctagcttc acgctgccgc aagcactcag ggcgcaaggg ctgctaaagg 3240

aagcggaaca cgtagaaagc cagtccgcag aaacggtgct gaccccggat gaatgtcagc 3300

tactgggcta tctggacaag ggaaaacgca agcgcaaaga gaaagcaggt agcttgcagt 3360

gggcttacat ggcgatagct agactgggcg gttttatgga cagcaagcga accggaattg 3420

ccagctgggg cgccctctgg taaggttggg aagccctgca aagtaaactg gatggctttc 3480

ttgccgccaa ggatctgatg gcgcagggga tcaagatctg atcaagagac aggatgagga 3540

tcgtttcgca tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag 3600

aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc 3660

cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg 3720

aatgaactcc aagacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc 3780

gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg 3840

ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct 3900

gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg 3960

aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat 4020

ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgg 4080

atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg 4140

gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc 4200

tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct 4260

gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat 4320

cgccttcttg acgagttctt ctgagcggga ctctggggtt cgcggaatca tgaccaaaat 4380

cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 4440

ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 4500

accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 4560

cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 4620

cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 4680

tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 4740

taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 4800

gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 4860

agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 4920

ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 4980

acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 5040

caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 5100

tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc 5160

tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgcct 5220

gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat ggtgcactct 5280

cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat acactccgct atcgctacgt 5340

gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct 5400

tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt 5460

cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc agatcaattc gcgcgcgaag 5520

gcgaagcggc atgcatttac gttgacacca tcgaatggtg caaaaccttt cgcggtatgg 5580

catgatagcg cccggaagag agtcaattca gggtggtgaa tgtgaaacca gtaacgttat 5640

acgatgtcgc agagt 5655

Claims

1.沼泽红假单胞菌5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体，其特征是所述合成酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

2.编码权利要求1所述沼泽红假单胞菌5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体的基因，其特征是所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

3.包含权利要求2所述基因的表达载体。

4.包含权利要求3所述表达载体的宿主细胞。

5.权利要求4所述宿主细胞发酵生产5-氨基乙酰丙酸的应用。