CN101144810B - 色谱快速试验的测定范围扩大 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及样品中分析物定量测定的方法和器具。
Description
技术领域
本发明涉及样品分析定量测定的方法和器具。
背景技术
分析物例如药品、妊娠激素、传染性疾病或CARDIAC标记物的快速测定用普遍分析方法利用免疫学试纸。在这一方面,广泛使用纯粹目视法读数的定性试验(例如CARDIAC D-dimer、Trop T sensitive等)以及借助于读数器具评估的定量试验(例如ElecsysproBNP,RocheCARDIAC proBNP等)。
这样的定量免疫学试纸的特征尤其在于其操作简便。该试纸通常基于如下事实:该试纸含有一种试剂,能通过与该样品中的分析物反应而导致一种可检测信号。该可检测信号通常在一段规定时间之后通过反射度测量来测定。在该分析物与试剂接触与信号测定之间的这段时间要选择得尽可能长。这确保了该试剂与分析物之间的长反应时间,从而确保此类试纸的最高可能灵敏度。然而,由于反应动力学的原因,在这样一个长反应期之后,再也不可能定量测定样品中以高浓度存在的分析物。
因此,这样的试纸,与惯常实验室分析系统例如Elecsys(RocheDiagnostics公司)、IM(Abbott公司)、Dimension(Dade Behring公司)相比,其性能仍有颇大弱点。尤其测量精度和动态测量范围,诸如与溶液中的反应相比,试纸受到颇大损害。当测定需要高灵敏度以及尽可能大测量范围时,这限制了其用途。尤其对于患者的紧急护理来说,若能提供一种一方面因其高灵敏度而能将某些疾病可靠地排除、另一方面也会提供大测量范围的试验或方法,对主治医生会是非常有帮助的。分析物的大测量范围是风险分级和治疗监测特别希望的。试验的测量范围扩大,对于那些该病情特有的分析物或标记物的浓度与病情的严重性相关的病情会是特别希望的。在这样的情况下,标记物浓度提高(例如NT-proBNP)会指出患者风险状况增大。
发明内容
因此,本发明的一个目的是提供一种使样品中分析物定量测量范围扩大的方法。
这个目的是通过样品中分析物的定量测定达到的,该定量测定包含
(a)提供一种当与该分析物接触时能发生一种会产生可检测信号的反应的分析物特异性物质,
(b)提供至少2幅校正图,这些图是通过使每种情况下相同的分析物特异性物质与不同数量的、每种情况下相同的试验分析物反应每种情况下预定的反应时间产生的,
(c)使该分析物特异性物质与一种含有要检测的分析物的样品接触,
(d)在第一预定反应时间测量该信号,为此提供按照(b)的第一校正图,
(e)核对按照(d)测量的信号是否能以所希望的精度定量测定该分析物,
(f)(i)若达到所希望的精度,就根据按照(d)测定的信号定量测定该分析物,或
(ii)在第二预定反应时间测量该信号,为此提供按照(b)的第二校正图,
(g)核对按照(f)(ii)测量的信号是否能以所希望的精度定量测定该分析物,和
(h)(i)若达到所希望的精度,就根据按照(f)(ii)测量的信号定量测定该分析物,或
(ii)在至少一个进一步预定反应时间继续该测定(对应于
(f)(ii)、(g)、(h) (i) ),
即任选地
(i)在第三预定反应时间测量该信号,为此提供按照(b)的第三校正图,
(j)核对按照(i)测量的信号是否能以所希望的精度定量测定该分析物,和
(k)(i)若达到所希望的精度,就根据按照(i)测量的信号定量测定该分析物,或
(ii)在至少一个进一步预定反应时间继续该测定。
该方法的步骤(f)(ii)、(g)和(h)(i)可以像所希望的那样经常重复。在一种较好的实施方案中,这些步骤重复2次或3次,即产生或提供2个或3个预定反应时间的2幅或3幅校正图。
本发明的另一方面涉及样品中分析物的定量测定方法,包含
(a)提供一种当与该分析物接触时能发生一种会产生可检测信号的反应的分析物特异性物质,
(b)提供至少2幅校正图,这些图是通过使每种情况下相同的分析物特异性物质与不同数量的、每种情况下相同的试验分析物反应每种情况下预定的反应时间产生的,
(c)使该分析物特异性物质与一种含有要检测的分析物的样品接触,
(d)在第一预定反应时间测量第一信号,为此提供了按照(b)的第一校正图,
(e)在第二预定反应时间测量第二信号,为此提供了按照(b)的第二校正图,
(f)任选地测量一个进一步的信号,
(g)核对按照(d)、(e)或(f)测量的信号中哪一个能达到该分析物定量测定的足够精度,和
(h)根据能达到足够精度的信号定量测定该分析物。
附图说明
图1:
6min、8min和12min后CARDIAC-proBNP的反射度动力学。反射度[%]对由Elecsys-proBNP参考试验测定的proBNP浓度[pg/ml]作图。
图2:
使用CARDIAC-proBNP试纸的按照本发明方法与Elecsys-proBNP试验之间的方法比较。
具体实施方式
为了核对第一测量信号或第二测量信号能否以更大精度定量测定该分析物,在一种较好实施方案中根据所提供的至少2幅校正图界定了实验浓度极限。超过这一极限的分析物浓度是按照2个反应时间中较短的那一个评估的,而落到这一极限以下的分析物浓度是按照2个反应时间中较长的那一个确定的。如果发现该分析物浓度超过该短反应时间之后的极限,即确定高分析物浓度,则该方法可以在此时停止。
令人惊讶地发现,按照本发明的方法,与先有技术的已知方法相比,能使测量范围的上限增大3倍以上。因此,按照本发明的方法提高了主治医生的诊断能力。
按照本发明的试验的延展的测量范围也使得能省去额外的、往往费力的试验(例如侵入式诊断方法等)。
如同以下详细描述的,按照本发明的方法能比先有技术上已经描述的方法或试验更快地测定浓度,对样品中的高分析物浓度尤其如此。例如,由于NT-proBNP的血液水平与心脏机能障碍的程度相关,因而按照本发明的方法使得能更迅速地评价处于紧急状况的患者的心脏特有状态。这产生了如下优点:当急性心脏事件例如急性心肌梗塞发生时,患者可以比用当前诊断程序的病例在更早的时间得到确认和充分治疗。按照本发明的方法和尤其在急性心脏事件的病例中做出更快诊断的能力,使主治医生能更快地启动适当对策,从而可以减少其它心脏并发症和死亡率。
在本发明的较好实施方案中,使用较好从体液衍生的液体样品。特别好地使用血液、血浆、血清、唾液或尿样品。
要定量测定的分析物较好选自核酸、脂类、碳水化合物、蛋白质,尤其选自DNA、RNA、抗体、抗原、代谢产物、激素、病毒、微生物、细胞、心脏特异性标记物、神经激素标记物、局部缺血标记物和肌肉特异性标记物。
脂类的较好实例包括胆固醇、HDL胆固醇和甘油三酯。一种特别好的碳水化合物分析物是葡萄糖。要测定的酶的实例包括碱性磷酸酯酶和淀粉酶。尿酸、胆红素和尿后胆色素原是代谢产物的较好实例。
神经激素标记物的实例包括心房(A型)钠尿肽(ANP)、B型钠尿肽(BNP)、或各前肽的N-末端片断NT-ProANP和NT-ProBNP。
局部缺血标记物的实例包括局部缺血改性清蛋白(IMA)、脂肪酸结合蛋白、游离脂肪酸、妊娠关联的血浆蛋白A、糖原磷酰酶同工酶BB和鞘氨醇-1-磷酸酯。
肌红蛋白和肌酸激酶MB(CK-MB)是肌肉特异性标记物的较好实例。
CD40是血小板活化标记物的较好实例。
较好的心脏特异性局部缺血-坏死标记物是肌钙蛋白T或肌钙蛋白I。
在一种特别好的实施方案中,测定了至少一种CARDIAC标记物或心脏特异性标记物,这较好又选自肌钙蛋白T、肌红蛋白、D-二聚体和NT-proBNP。
该分析物特异性物质较好选自可以结合到该分析物上的受体、抗体、抗原、植物凝血素、核酸、和核酸类似物。该分析物特异性物质较好还偶合到一种检测试剂上或偶合到一种当它结合到该分析物上时能产生一种可检测信号的酶上。在一种较好的实施方案中,该分析物对该分析物特异性物质的结合,借助于反应直接导致一种可检测信号。在一种进一步实施方案中,在该分析物结合到该分析物特异性物质上之后可以添加一种底质,所述底质要么由该分析物要么由该分析物特异性物质转化,同时发出一种可检测信号。较好的检测系统是诸如胶体金属微粒尤其金、荧光纳米微粒例如胶乳、up-converting磷、量子dots或超顺磁微粒。
较好按照本发明测定的分析物BNP或NT-proBNP的检测描述于,例如,Struthers(Eur.Heart J.20(1999),1374-1375),Hunt et al.,Clin.Endocrinol.47(1997,287-296),Talwar et al.(Eur.Heart J.20(1999),1736-1744)以及EP-0648228和WO 00/45176。
在一种较好的实施方案中,该分析物与分析物特异性物质之间的反应是一种免疫学反应。
在本发明的意义上,一幅“校正图”要理解为一种函数,该函数是通过将所定义的试验分析物数量分配给描述该可检测信号的所定参数而衍生的。在这种方法中,将所定义的试验分析物数量分配给一种描述此方法中所定义的信号的参数。从多个较好独立测定衍生的平均值也可以用来产生校正图。
描述该可检测信号的参数较好是描述作为该分析物与该分析物特异性物质反应的结果的任何波长的光的吸收或发射的参数。描述该信号的参数的较好实例是反射度、发射值和吸收值。进而,也可以诸如使用磁性微粒,因而也可以考虑磁场(磁场状态)作为描述该信号的参数。
描述该可检测信号的参数较好是通过使在每种情况下都相同的分析物特异性物质与不同数量的、在每种情况下相同的分析物反应在每种情况下预定的反应时间测量的。为此,让各数量的、在每种情况下相同的试验分析物与在每种情况下相同的分析物特异性物质反应并在预定的反应时间之后测量该可检测信号。这意味着以在每种情况下都不同数量使用相同的分析物特异性物质和每种情况下相同的试验分析物来产生校正图。为产生一幅校正图,要为每个预定反应时间试验分析物数量向信号描述性参数的分配的相应数目进行5~50个不同数量的试验分析物即不同的个体反应、较好10~40个个体反应、最好10~25个个体反应。
在产生该校正图之前,实验测定值也可以遭遇一个动力学评估过程,在这种情况下由该评估过程确定的值可以用来产生该校正图。
该试验分析物和要定量检测的分析物较好相同。
在按照本发明的方法中,所产生的校正图用来作为核对从该分析物特异性物质与样品中的分析物的反应所产生的测量信号是否足以以所希望的精度定量测定该分析物的依据。该精度可以用特定领域中已知的、考虑到信号幅度或准确性的任何评估程序核对。
在本发明的较好实施方案中,将该分析物与分析物特异性物质之间的预定反应时间之后测定的信号与为相应预定反应时间提供的校正图加以比较。当所观察的校正图有所有预定校正曲线中相应数量试验分析物的最大斜率时,达到要测定的分析物数量的所希望精度。
用于确定校正图的至少2个预定反应时间是这样选择的:使得能检测样品中分析物的较高浓度,而且也达到所需要的试验灵敏度。为了达到所需要的试验灵敏度,有尽可能长的反应时间是必要的。用较短的反应时间,在分析物特异性物质与分析物之间就生成较少的络合物、较好免疫络合物。从而检测到相应较低的信号强度。反之,在低分析物浓度的情况下,生成太少的络合物、较好免疫络合物,而且该试验的灵敏度也丧失。然而,在高浓度的情况下,实质上可得到更多的络合物,因而即使用短的反应时间也能检测到清晰的信号和高信号强度。通过将确保所需灵敏度的长反应时间与用来检测较高浓度的短反应时间组合,可观地增大了分析物与分析物特异性物质之间的反应的定量测量范围。
由于这个理由,选择关于分析物与分析物特异性物质的反应的长反应时间作为其后该分析物与分析物特异性物质之间的反应处于饱和范围或处于静止状态的预定反应时间。较好选择进一步的预定反应时间是相应较短的,使得在这些预定的短反应时间上该分析物特异性物质与分析物之间的反应不在饱和范围内或不处于静止状态。较好选择一个对应于长反应时间的大约一半的时间作为至少一个短反应时间。
该分析物特异性物质较好在任何一种载体上、较好试纸或快速试纸(也简称为试剂载体或器具)上提供。进而,一种(或多种)分析物当然也能用液体试验测定。然而,较好的是在试验器具(试验载体、首先试纸)上的测定,在该器具上用来测定该分析物的分析物特异性物质或试剂位于一个或多个区域中呈干的-且在与样品接触后可溶的-形式,其中可检测信号是在一个检测区、较好在该检测区的一个独立区域中检测的。所有商业上可得的、尤其适合于在预定的固定时间值之后定量测定分析物的试纸均可用于按照本发明的方法。
按照本发明的方法可以使所使用的试纸的测量范围的极限扩大2~5倍、较好3倍以上。
按照本发明的另一个方面,在同一载体上除要定量测定的分析物外还能定性和/或定量测定进一步的分析物。在该载体上,相应地存在多种分析物特异性物质。在这种情况下,还可以适当使用与分析物特异性物质偶合的检测试剂,这使得能借助于一种单一试验格式例如酶促试验、电化学发光试验、荧光或吸收试验、或比浊法试验来定量或定性测定所有分析物。当然,在一种单一试纸上可以存在用于不同分析物特异性物质的不同检测试剂。
在一种特别好的实施方案中,使用的是Roche-CARDIAC-proBNP试纸。
因此,按照本发明的方法可以使处于60~3000pg/ml范围内的Roche-CARDIAC-proBNP试纸的测量范围扩大到60~10000pg/ml的范围。因此,本发明的一种较好实施方案涉及一种分析物浓度的定量测定,其中该分析物又较好选自肌钙蛋白T、肌红蛋白、D-二聚体和NT-proBNP。在NT-proBNP的情况下,测定是例如在3000~10000pg/ml范围内进行的,反应物特异性物质与反应物之间的短反应时间为3~9分钟、较好8分钟。60~3000pg/ml浓度范围内的NT-proBNP的测定较好用10~15分钟、更好12分钟的长反应时间进行。
分析物与分析物特异性物质之间的反应所产生的可检测信号较好用光学方法、尤其用反射光度法或荧光法检测或电化学发光法定量测定。其它较好的定量测定方法包括介电常数变化、电导率变化、磁场变化、或偏振光旋光角变化等的测量。
在本发明的一种进一步较好实施方案中,该方法是以自动化形式、较好以自动化分析仪进行的。
本发明的另一个方面涉及一种用于实施按照本发明的方法的器具。这种器具包含一个用来储存曾经为一种分析物产生的校正图的储存元件。储存元件的实例包括所有常用数据载体例如ROM键、硬盘、CDs、软盘、DVDs、USB棒等。然后,可以为多种分析物样品的相继定量测定提供所储存的校正图。
按照本发明的方法尤其可以用来识别有急性冠状综合征的患者,尤其可以用于改善急性冠状事件的早期检测,例如改善急性心肌梗塞的早期检测。
本发明进一步用以下实施例说明。
实施例
使用一种CARDIAC-proBNP试纸产生6、8和12min反应时间后的校正图。各proBNP数量是用Elecsys-proBNP参考方法(图1)测定的。该校正图显示斜率随反应时间减少而减少。结果,在>3000pg/ml的较高浓度时信号幅度、因而灵敏度提高。
按照本发明使用的CARDIAC-proBNP试验与Elecsys-proBNP试验(图2)之间的方法比较,是通过评估12分钟后60~2800pg/ml的浓度范围和8分钟后>2800pg/ml的浓度(对应于实验测定或定义的反射度值)得到的。
用Elecsys-proBNP参考方法的测定的比较显示,按照本发明以2个不同反应时间进行的CARDIAC-proBNP试验有60~10000pg/ml的定量测量范围。与测量范围上限为3000pg/ml的12min后惯常评估相比,使测量范围的上限提高3倍以上。
Claims (15)
1.样品中分析物的定量测定方法,包含
(a)提供一种当与该分析物接触时能发生一种会产生可检测信号的反应的分析物特异性物质,
(b)提供至少2幅校正图,这些图是通过使每种情况下相同的分析物特异性物质与不同数量的、每种情况下相同的试验分析物反应每种情况下预定的反应时间产生的,
(c)使该分析物特异性物质与一种含有要检测的分析物的样品接触,
(d)在第一预定反应时间测量该信号,为此提供按照(b)的第一校正图,
(e)核对按照(d)测量的信号是否能以所希望的精度定量测定该分析物,
(f)(i)若达到所希望的精度,就根据按照(d)测定的信号定量测定该分析物,或
(ii)在第二预定反应时间测量该信号,为此提供按照(b)的第二校正图,
(g)核对按照(f)(ii)测量的信号是否能以所希望的精度定量测定该分析物,和
(h)(i)若达到所希望的精度,就根据按照(f)(ii)测量的信号定量测定该分析物,或
(ii)在至少一个进一步预定反应时间继续该测定(对应于(f)(ii)、(g)、(h)(i)),
其中使用从体液衍生的样品,和
其中该分析物选自核酸、脂类、碳水化合物和蛋白质。
2.样品中分析物的定量测定方法,包含
(a)提供一种当与该分析物接触时能发生一种会产生可检测信号的反应的分析物特异性物质,
(b)提供至少2幅校正图,这些图是通过使每种情况下相同的分析物特异性物质与不同数量的、每种情况下相同的试验分析物反应每种情况下预定的反应时间产生的,
(c)使该分析物特异性物质与一种含有要检测的分析物的样品接触,
(d)在第一预定反应时间测量第一信号,为此提供了按照(b)的第一校正图,
(e)在第二预定反应时间测量第二信号,为此提供了按照(b)的第二校正图,
(f)任选地测量一个进一步的信号,
(g)核对按照(d)、(e)或(f)测量的信号中哪一个能达到该分析物定量测定的足够精度,和
(h)根据能达到足够精度的信号定量测定该分析物,
其中使用从体液衍生的样品,和
其中该分析物选自核酸、脂类、碳水化合物和蛋白质。
3.按照权利要求1或权利要求2的方法,其特征在于该分析物定量测定的精度是使用校正图的斜率核对的。
4.按照权利要求1或3的方法,其特征在于该试验分析物和要定量测定的分析物相同。
5.按照权利要求1或权利要求2的方法,其特征在于测定2幅或3幅校正图。
6.按照权利要求1或权利要求2的方法,其特征在于使用任何载体,较好一种试纸来提供该分析物特异性物质。
7.按照权利要求1或权利要求2的方法,其特征在于使要测定的分析物的测量范围的极限扩大2~5倍、较好3倍以上。
8.按照权利要求1或权利要求2的方法,其特征在于使用从血液、血浆、血清、唾液或尿液样品衍生的样品。
9.按照权利要求1或权利要求2的方法,其特征在于在与要定量测定的分析物同时定性和/或定量地测定另外的分析物。
10.按照权利要求1或权利要求2的方法,其特征在于该分析物选自DNA、RNA、抗体、抗原、代谢产物、激素、病毒、微生物、细胞、心脏特异性标记物、神经激素标记物、局部缺血标记物和肌肉特异性标记物。
11.按照权利要求1或权利要求2的方法,其特征在于测定至少一种心脏特异性标记物,该标记物选自肌钙蛋白T、肌红蛋白、D-二聚体、和NT-proBNP。
12.按照权利要求1或权利要求2的方法,其特征在于该分析物特异性物质选自抗体、能与该分析物结合的受体、抗原、外源凝集素、核酸和核酸类似物,该分析物特异性物质较好能与检测试剂偶合。
13.按照权利要求1或权利要求2的方法,其特征在于分析物与分析物特异性物质之间的反应较好是一种免疫学反应。
14.按照权利要求1或权利要求2的方法,其特征在于该定量测定是用光学方法、尤其用反射光度法或荧光法检测或电化学发光进行的。
15.按照权利要求1或权利要求2的方法,其特征在于该方法以自动化方式进行。
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