CN113196058A - 测定分析 - Google Patents

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Abstract

提供了一种确定样品中分析物的量的方法,该方法包括以下步骤:检测捕获的分析物与检测分子反应产生的信号,对信号结果应用数学变换函数,并使用计算机对分析物浓度与变换检测信号的双相标准曲线使用方程进行数学建模。还提供了一种用于对校准数据建模的方法、一种编程为对分析物浓度与变换检测信号的双相标准曲线进行数学建模的计算机,以及还提供了用于确定样品中分析物的量的部件盒。

Description

测定分析
技术领域
本发明涉及用于流体中的可溶性分析物的计算机辅助定量的系统和方法。
背景技术
可溶性分析物的定量经常发生在许多生物、医学、研究、工业、食品生产和安全领域。分析物可以包括,例如,抗体、其他蛋白质、肽、药用分子(小分子和大分子)和激素。利用免疫系统中产生的称为“抗体”的蛋白质分子的亲和力和特异性,在“免疫测定”中对可溶性分析物进行定量始于1950年代对血浆样品中胰岛素的测量(Yalow RS,Berson SA.Assayof plasma insulin in human subjects by immunological methods.Nature.1959;184(Suppl 21):1648-1649)。对分析物检测的放射性信号的依赖被使用基于酶的颜色生成作为信号放大的途径所取代。这催生了酶免疫测定法(EIA)的产生(Van Weemen BK,SchuursAHWM.Immunoassay using antigen-enzyme conjugates.FEBS Lett.1971;15(3):232-236)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)(Engvall E,Perlmann P.Enzyme-linkedimmunosorbent assay(ELISA):quantitative assay of immunoglobulinG.Immunochemistry.1971;8(9):871-874)。这些常见形式的测定系统包括在测定中对分析物分子定量之前结合(或“捕获”)分析物分子的分子或抗体。捕获分子本身最常通过附着在一般固体平台(基底)上而被固定。基底通常是平面材料或“珠状”颗粒。在这样一种称为“三明治免疫测定法”的常见测定形式中,如图1所示,捕获抗体分子12与基底14结合。然后通过不同的抗体(“检测抗体”,16)与分析物10的结合来揭示捕获抗体分子12对分析物10的捕获。已经连接到检测抗体分子16的信号部分提供了分析物存在于捕获分子上的指示。因此,信号产生表明检测抗体的结合并因此表明存在分析物。连接到检测抗体分子16的信号部分通常包括荧光或化学发光化合物,以便可以使用照相机或荧光计,或用于在酶的位置诱导颜色变化的酶检测产生的信号,从而可以通过吸光度检测颜色。信号部分还可以引发电化学反应,也可以通过颜色或发射的变化来检测。
在分析物相对较小的情况下,通常会产生“竞争性”测定形式,其中分析物与捕获抗体的相互作用是通过其与另一分子(“非分析物竞争分子”)竞争与捕获抗体相互作用的能力来检测的。在这种情况下,非分析物竞争分子本身可以通过与非分析物竞争分子相连的检测部分成为检测信号的来源。
免疫测定法的替代形式包括邻位依赖性测定法(proximity-dependent assay)。在一个实例中,捕获抗体连接到第一类型的珠子上,而检测抗体连接到第二类型的珠子上。第一类型的珠子发射第一类型的激发发射,其激发来自第二类型的珠子的第二类型的发射。因此,第二类型珠子的发射需要与第一类型珠子非常接近,因此取决于捕获物和分析物之间的相互作用以及检测抗体和分析物之间的同时相互作用。Perki nElmer已经在Alphalisa系统中演示了这样的系统。邻位依赖性测定法的另一个例子是邻位连接测定法(proximity ligation assay),其中不同种类衍生的检测抗体在不同位点与固定的分析物结合,而第二抗体分别识别不同种类的检测抗体恒定区与第一抗体结合。第二抗体附着有独特的短链DNA,DNA链可以作为放大信号生成,参与滚环DNA合成。
尽管引入了荧光和化学发光作为替代信号系统,但测定灵敏度仍然是免疫测定法的使用的重要限制因素。许多分析物分子以相对较低的水平存在,利用现有的测定技术能力并不总是可以测量到的,因此分析物分子的定量受到所采用的测量系统灵敏度的限制。因此,测定灵敏度不足已成为可溶性分析物免疫测定中最重要的“问题”之一(J.Comley,ELISA Assays:recent innovations take analyte detection to new levels.DrugDiscovery World,2012)。例如,等级顶端的免疫/炎症反应起始分子以相对较低的水平存在。在这组分析物中,肿瘤坏死因子(TNF)在循环血液中以低至毫微微克每毫升(fg/ml)的浓度起作用。TNF在驱动免疫疾病中的重要性和监测其水平的重要性体现在2017年十大畅销药物中存在三种不同的TNF抑制药物。
因此,仅在与健康相关的生物学中,监测涉及疾病产生和维持的低丰度但强大的分子活动的能力对于了解生理学、监测疾病、开发治疗剂和监测药物疗效至关重要。
在进行免疫测定法以对可溶性分析物定量时,有必要构建校准曲线,通常称为“标准曲线”,将一系列已知浓度的分析物与信号强度结果作图。对于非竞争性免疫测定法,这会产生在最低分析物浓度下信号水平最低,随着信号逐渐增加到最高分析物浓度的图。而在竞争性测定法中,非竞争性图的形状是成镜像的,最高信号在最低分析物浓度下产生,随着分析物浓度的增加,信号逐渐降低。通过绘制与捕获抗体结合的非竞争性分子的抑制程度的图,可以将竞争性测定法的图转换为与非竞争性的图相同的格式,在最低分析物浓度下给出最低抑制值,随着分析物浓度的增加而逐渐升高抑制程度。这提供了一种应用一些方程进行标准曲线拟合的便捷方式,其中方程中的信号值被替换为信号生成的抑制程度的值。
标准曲线图是用方程进行数学建模的,该方程用于对未知样品的分析物浓度进行定量。使用的曲线拟合模型的类型以及模型对结果的拟合对结果的准确性以及检测和定量的灵敏度有直接影响。
颜色的吸光度与有色分子浓度不是线性相关的,当对颜色浓度作图时,颜色生成形成矩形双曲线。因此,在基于酶的颜色生成中,就像在酶放大作为ELISA中的信号源一样,当颜色吸光度作为信号针对分析物浓度的对数绘图时,标准曲线内绘制的数据点的分布实际上可以是线性的。抗原分析物对抗体的占有率也与分析物浓度形成矩形双曲线。随着将更灵敏的信号系统引入ELISA系统,例如荧光和化学发光,这些系统能够在更大的浓度范围内(测定“动态范围”)对分析物进行定量。随着动态范围的增加,以对数(log)形式格式化分析物浓度轴更加实用。因此,大约三到四个对数单位的测定动态范围会在信号和分析物浓度对数之间产生S形曲线。
分析S形曲线以生成信号和分析物浓度之间的关系,需要对曲线拟合进行logistic回归,随后对来自测试样品的信号进行插值,以对其中的分析物进行定量。两种logistic方程模型普遍用于模拟S形曲线拟合中分析物-捕获抗体相互作用的行为:四参数logistic方程(4-PL)和五参数logistic方程(5-PL)。
四参数logistic方程模型(4-PL)
4-PL方程包含四个与曲线图形属性相关的参数。(G.M.Raab.Comparison of aLogistic and a Mass-Action Curve for RadioimmunoassayData.Clin.Chem.CLIN.CHEM.29(10),1757-1761.1983;D.Finney.Response Curves forRadioimmunoassay.Clin.Chem.,29(10),1762-1766,1983;R.A.Dudley,P.Edwards,R.P.Ekins,D.J.Finney,I.G.M.McKenzie,G.M.Raab,D.Rodbard,andR.P.C.Rodgers.Guidelines for Immunoassay Data Processing.Clin.Chem.,31(8),1264-1271,1985;P Strohner,D Sarrach,and J G.Reich.Use of a modified bindingmodel for the investigation of affinity dependence on antibody concentrationin immunoassay systems.Journal of Immunological Methods 203,113-122,1997;P.G.Gottschalk,J.R.Dunn.The five-parameter logistic:Acharacterization andcomparison with the four-parameter logistic.Analytical Biochemistry 343,54-65,2005)
方程如下:
y=d+a-d
1+(x/c)b
其中:y=响应或信号
d=无限分析物浓度下的估计响应
a=零分析物浓度下的估计响应
x=分析物浓度
c=校准曲线上的拐点,表明预计会产生50%最大信号的分析物浓度(相当于结合研究中的解离常数Kd)
b=定义曲线斜率的斜率因子。
一旦根据一组数据创建了4-PL方程,就可以确定所有四个参数的值,然后可以使用该方程根据测定信号数据(y)计算未知浓度(x)。
五参数logistic方程模型(5-PL)
用于对可溶性分析物定量的免疫测定标准曲线可能是不对称的,通常使用5-PL方程来尝试提供更好的拟合。5-PL方程包括不对称的附加参数。
方程如下:
y=d+a-b
[1+(x/c)b]g
其中:y=响应
d=无限分析物浓度下的估计响应
a=零分析物浓度下的估计响应
x=分析物浓度
c=校准曲线上的拐点,表明预计会产生50%最大检测信号的分析物浓度(相当于结合研究中的解离常数Kd)
b=定义曲线斜率的斜率因子。
g=不对称因子
不变的是,4-PL和5-PL应用了一系列可选的权重,以改变下部或上部区域中的点对曲线位置的影响程度。1/Y2通常作为默认加权选项提供。
通过一组数据点产生最佳拟合的logistic方程类型取决于测定标准曲线的形状。然而,无论是4-PL还是5-PL方程都不能很好地拟合许多可溶性分析物免疫测定的低浓度区域。由于曲线拟合在较低浓度范围内的不可靠性,使用这两个方程生成的许多标准曲线在其较低区域过早地被截断。与在低分析物浓度下降低的信噪比无关,4-PL和5-PL曲线拟合的不良拟合可能是由于它们提供的模型中的假设,限制了曲线拟合远离正确拟合S形免疫测定曲线的下部分。
一些新技术已设计用于改进低浓度水平的分析物检测。然而,其中一些技术仅关注相对较低的浓度范围,并且在某些情况下具有相对较低的样品通量(Quanterix Simoatechnology),或者在能够在单个测定室内(“复用(Multiplexing)”)同时测量多种分析物方面的通量较低(Singulex,Chimera)。
希望提供一种改进的方法用于流体中的可溶性分析物的定量,特别是在低浓度下,同时保持动态范围。需要改进结合有分析物浓度和信号生成之间关系建模的系统,以在保持或扩展测定动态范围的同时进一步提高测定灵敏度。
发明内容
根据本发明的第一方面,提供了一种用于确定样品中分析物含量的方法,包括以下步骤:
(a)提供多个已知浓度的分析物样品;
(b)提供分析物捕获分子和检测分子,该分析物捕获分子和检测分子均适合与分析物结合,其中检测分子包括用于识别与分析物的反应的信号传输装置;
(c)将分析物样品与分析物捕获分子和检测分子混合,以形成分析物-捕获分子-检测分子复合物;
(d)检测分析物与检测分子反应所产生的信号;
(e)将数学变换函数应用于检测到的信号;
(f)使用计算机对分析物浓度与步骤(e)的变换检测信号的双相标准曲线进行数学建模,使用以下方程:
Figure BDA0003114534520000051
其中f是数学变换函数,其放大了测定范围内相对于较高浓度的较低浓度的信号值;
Y是在分析物浓度下产生的信号[L];
Bmax1是由较高亲和力的分析物-捕获分子相互作用产生的最大信号;
Kd1是较高亲和力的分析物-捕获分子相互作用的解离常数;
Bmax2是由较低亲和力的分析物-捕获分子相互作用产生的最大信号;和
Kd2是低亲和力分析物-捕获分子相互作用的解离常数;
(g)提供未知浓度的分析物样品;
(h)提供分析物捕获分子和检测分子,该分析物捕获分子和检测分子均适合与分析物结合,其中检测分子包括用于识别与分析物的反应的信号传输装置;
(i)将分析物样品与分析物捕获分子和检测分子混合,以形成分析物-捕获分子-检测分子复合物;
(j)检测分析物与检测分子反应所产生的信号;
(k)将数学变换函数应用于步骤(iv)的检测信号;和
(l)通过使用步骤(f)中生成的双相标准曲线将步骤(k)的变换检测信号与分析物浓度相关联,确定样品中分析物的量。
本发明的另一方面提供了一种用于对测定的校准数据建模的方法,包括以下步骤:
(a)提供多个已知浓度的分析物样品;
(b)提供分析物捕获分子和检测分子,该分析物捕获分子和检测分子均适合与分析物结合,其中检测分子包括用于识别与分析物的反应的信号传输装置;
(c)将分析物样品与分析物捕获分子和检测分子混合,以形成分析物-捕获分子-检测分子复合物;
(d)检测分析物与检测分子反应所产生的信号;
(e)对检测到的信号应用数学变换函数;
(f)使用计算机对分析物浓度与步骤(e)的变换检测信号的双相标准曲线进行数学建模,使用以下等式:
Figure BDA0003114534520000061
其中f是数学变换函数,其放大了测定范围内相对于较高浓度的较低浓度的信号值;
Y是在分析物浓度下产生的信号[L];
Bmax1是由较高亲和力的分析物-捕获分子相互作用产生的最大信号;
Kd1是较高亲和力的分析物-捕获分子相互作用的解离常数;
Bmax2是由较低亲和力的分析物-捕获分子相互作用产生的最大信号;和
Kd2是较低亲和力分析物-捕获分子相互作用的解离常数。
本发明的另一方面提供了一种计算机,该计算机被编程为使用以下方程对分析物浓度与变换检测信号的双相标准曲线进行数学建模:
Figure BDA0003114534520000071
其中f是数学变换函数,其放大了测定范围内相对于较高浓度的较低浓度的信号值,如前文所定义;
Y是在分析物浓度下产生的信号[L];
Bmax1是由较高亲和力的分析物-捕获分子相互作用产生的最大信号;
Kd1是较高亲和力的分析物-捕获分子相互作用的解离常数;
Bmax2是由较低亲和力的分析物-捕获分子相互作用产生的最大信号;和
Kd2是较低亲和力分析物-捕获分子相互作用的解离常数。
测定法是用于对分析物检测或定量的程序。该测定法可以是免疫测定法。该测定法优选地是三明治型测定法。
数学变换函数f在测定范围内相对于较高浓度的较低浓度放大信号值。可以使用任何达到该结果的数学变换。变换函数可以选自由以下组成的组,包括:lognx、ln x、ASINH(x)和
Figure BDA0003114534520000072
Figure BDA0003114534520000073
其中x=变换的信号结果,n介于2和100之间。优选地n介于5和10之间,更优选地n=10。
步骤(f)中的方程还可以包括与分析物浓度为零时的背景信号传输(Bkd)相关的项:
Figure BDA0003114534520000074
Bkd是[L]=0(零)时获得的“背景”信号。
其中在变换和标准曲线生成之前,从总信号数据中减去背景(Bkd)信号值,或其影响未在计算中建模,然后从方程中删除fBkd项。
步骤(f)中的方程还可包括与非特异性信号传输(NS)相关的项f(NS×[L]),其随分析物浓度而变化:
Figure BDA0003114534520000075
NS是来自分析物与[L]的非特异性结合的信号变化斜率。
在转化和标准曲线生成之前,从总信号数据中来自减去分析物非特异性结合(NS×[L])的信号值,或其影响未在计算中建模,然后从方程中删除f(NS×[L])项。
步骤(f)中的方程可包括与分析物浓度为零时的背景信号传输(Bkd)相关的项和与非特异性信号传输(NS)相关的项f(NS×[L]),其随分析物浓度而变化:
Figure BDA0003114534520000081
优选地,步骤(a)中已知浓度的样品数量至少为六个。更优选地,步骤(a)中已知浓度的样品数量至少为七个。
检测分子或作为示例抗体的信号传输装置可以选自由以下组成的组:颜色生成标记、化学发光标记、荧光标记、磷光标记、生物发光标记、电化学发光标记、晶体发光标记、白炽标记或辐射标记。
在两种方法中的步骤(d)和(j)中,可以使用各种成像设备来检测信号,例如,X射线探测器,α、β和γ辐射探测器,CCD照相机成像设备,CMOS照相机成像设备,磷光成像仪,荧光计,流式细胞仪,时间分辨荧光光谱仪,荧光偏振分析仪,定量聚合链式反应指示仪(reporter)和分光光度计。可以使用X射线胶片检测信号。可以使用磷光成像仪检测化学发光。紫外线(UV)和可见光(颜色)可以通过使用分光光度计或紫外线/颜色敏感的CCD或CMOS照相机测得吸光度来检测。
该方程还可以包括与分析物浓度为零时的背景信号传输Bkd相关的项:
Figure BDA0003114534520000082
该方程还可包括与非特异性信号传输NS相关的项f(NS×[L]),其随分析物浓度而变化:
Figure BDA0003114534520000083
如上文所述,该方程可包括与分析物浓度为零时的背景信号传输(Bkd)有关的项,以及与非特异性信号传输(NS)相关的项f(NS×[L]),其随分析物浓度而变化:
Figure BDA0003114534520000084
本发明的另一方面提供了用于确定样品中分析物含量的部件盒,包括:
涂有适合与分析物结合的分析物捕获分子的至少一个测定基底;
适合与分析物结合的至少一种检测分子,该检测分子包括信号传输装置以识别与分析物的反应;和
一组用于对测定的校准数据建模的指令,包括以下步骤:
(i)将多个已知浓度的分析物样品添加到测定基底中;
(ii)将检测分子加入到测定基底中;
(iii)检测分析物与检测分子反应所产生的信号;
(iv)将数学变换函数应用于检测信号;和
(v)使用计算机对分析物浓度与步骤(e)的变换检测信号的双相标准曲线进行数学建模,使用以下等式:
Figure BDA0003114534520000091
其中f是数学变换函数,其放大了测定范围内相对于较高浓度的较低浓度的信号值;
Y是在分析物浓度下产生的信号[L];
Bmax1是由较高亲和力的分析物-捕获分子相互作用产生的最大信号;
Kd1是较高亲和力的分析物-捕获分子相互作用的解离常数;
Bmax2是由较低亲和力的分析物-捕获分子相互作用产生的最大信号;和
Kd2是较低亲和力分析物-捕获分子相互作用的解离常数。
盒中的至少一种测定基底可以是多孔板的形式。或者,至少一种测定基底可以是颗粒或珠子的形式。
检测分子可以作为浓缩溶液或以冷冻干燥(冻干)形式提供。
部件盒还可包括至少一种校准分析物样品。校准分析物样品是用于制备步骤(i)中已知浓度的分析物样品中的分析物样品。校准分析物样品可以作为浓缩溶液或以冷冻干燥(冻干)形式提供。
本发明提供了一种改进的用于流体中的可溶性分析物的定量方法。与现有技术方法相比,本发明允许以增加的动态和定量下限(LLOQ)进行测定,例如免疫测定法。
附图说明
在附图中:
图1示出了三明治免疫测定法;
图2至11示出了与十种不同示例分析物的免疫测定有关的绘制的一系列标准曲线;将双相曲线建模与5-PL曲线建模和双位点曲线建模进行比较;
图2示出了分析物CXCL16的标准曲线;
图3示出了分析物EOTAXIN 1的标准曲线;
图4示出了分析物EOTAXIN 3的标准曲线;
图5示出了分析物粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的标准曲线;
图6示出了分析物细胞间粘附分子1(ICAM-1)的标准曲线;
图7示出了分析物干扰素γ(IFNγ)的标准曲线;
图8示出了分析物白细胞介素1β(IL-1β)的标准曲线;
图9示出了分析物白细胞介素2(IL-2)的标准曲线;
图10示出了分析物白细胞介素2受体α(IL-2RA)的标准曲线;和
图11示出了分析物白细胞介素4(IL-4)的标准曲线。
具体实施方式
一般而言,本发明涉及一种在广泛的分析物浓度范围内,特别是在低分析物浓度下,检测样品中分析物的量的方法。许多分析物测定技术是本领域已知的,包括许多免疫测定技术。术语“测定”在本文中用于表示对可溶性分析物的检测或定量的程序。免疫测定法是适用于本发明的一类测定的示例。术语“分析物”在本文中用于表示要检测或定量的任何分子或物质。术语“样品”在本文中用于表示含有或怀疑含有感兴趣的分析物的任何物质的等分试样。样品可以包括例如生物样品、或环境样品或工业样品。术语“捕获分子”在本文中用于表示附着于基底的分子,在随后或同时将检测分子与附着于捕获分子的分析物结合之前,其可用于结合被检测或定量的特定分析物。术语“分析物-捕获抗体复合物”或“分析物-捕获分子复合物”在本文中用于表示包含与被检测或定量的分析物结合的捕获抗体或分子的复合物。术语“检测分子”在本文中用于表示也可以附着于基底并与被检测或定量的特定分析物结合的抗体或分子,并且包括可以与信号传输装置耦合的检测抗体或分子,从而可以检测与捕获抗体或分子结合的分析物。当分析物同时暴露于捕获和检测抗体或分子时,检测抗体或分子可以在分析物与捕获抗体或分子结合并形成分析物-捕获分子复合物之前、同时或之后与分析物结合。因此,检测分子或抗体还可与分析物形成复合物,称为“分析物-检测分子复合物”或“分析物-检测抗体复合物”,其可在分析物与捕获抗体或分子结合之前形成。
与捕获和检测分子或抗体与分析物结合的顺序无关,捕获和检测分子或抗体都与分析物结合而形成复合物,在本文中称为“分析物-捕获分子-检测分子-复合物”。
检测分子或抗体可以是二级的,即,例如,首先没有信号传输部分的检测分子或抗体与捕获的分析物结合,然后是携带(例如缀合到)信号传输部分的第二检测分子或抗体与第一检测抗体结合。此外,检测分子或抗体可以与对另一携带信号传输部分的分子具有亲和力并与其结合的部分缀合。一个常见的例子是使用携带生物素分子的检测抗体。生物素对亲和素样分子具有非常高的亲和力,例如链霉亲和素和中性亲和素。在这种情况下,亲和素样分子携带信号传输部分。因此,信号传输通过与检测抗体直接或间接结合的标记提供,或者在竞争性测定的情况下可以直接连接到非分析物竞争分子。例如,标记可以选自由以下组成的组:生色标记、化学发光标记、荧光标记、磷光标记、生物发光标记、电化学发光标记、晶体发光标记、白炽标记或辐射标记。
可以使用多种成像设备检测信号,例如X射线检测器,α、β和γ辐射检测器,CCD照相机成像设备,CMOS照相机成像设备,磷光成像仪,荧光计,流式细胞仪,时间分辨荧光光谱仪,荧光偏振分析仪,定量聚合链反应指示仪和分光光度计。可以使用X射线胶片检测信号。可以使用磷光成像仪检测化学发光。紫外线(UV)和可见光(颜色)可以通过使用分光光度计或紫外线/颜色敏感的CCD或CMOS照相机测得吸光度来检测。
一般而言,免疫测定涉及将含有分析物的溶液与固定在基底上的捕获抗体一起孵育作为第一步。在“直接免疫测定法”的某些情况下,分析物被固定在基底上,用于随后的抗体检测。在涉及多个洗涤步骤的系统中,包含分析物的溶液在孵育期后被去除,该孵育期通常可以是非常短的几分钟到多个小时,并且通常在4℃到37℃之间的温度下进行,但通常在环境温度下进行。在与含有分析物的溶液一起孵育之后,可以进行洗涤步骤以去除多余的未连接的分析物和含有分析物的溶液,然后与含有检测抗体的溶液一起孵育。这种孵育的时间和温度可以与分析物溶液和捕获抗体孵育的时间和温度相同。与检测抗体孵育后,如果检测抗体连接了信号传输标记,则在测量信号之前可以进行另一洗涤步骤,或者与连接有信号传输标记的第二检测抗体或其他类型的信号传输系统(例如基于亲和素的系统)进一步孵育,其中生物素与检测抗体相连接,并和与亲和素相关(例如连接有信号传输标记的亲和素本身、链霉亲和素或中性亲和素)的分子一起孵育。与抗体相比,在亲和素系统中孵育的时间通常较短,因为基于亲和素的分子对生物素具有极高的亲和力。在大多数情况下,在测定结束时进行洗涤步骤,然后再进行信号检测。
在避免洗涤步骤的系统中,含有分析物的溶液可以同时与捕获抗体和检测抗体一起孵育。例如,来自Perkin Elmer的Alphalisa邻位测定法就是这种情况。在一些系统中,将含有分析物的溶液与捕获抗体和检测抗体同时一起孵育后,再与信号产生溶液一起孵育(无事先洗涤步骤)。这种系统的一个例子是来自Abcam的Fireplex系统。因此,测定法设计的许多不同和其他配置,其中一些在本文描述用于在测定系统中的可溶性分析物的定量,并且将是本领域技术人员所熟知的,并包括在本文描述的本发明的应用中。
使用4-PL或5-PL曲线拟合模型获得的标准曲线通常不能很好地拟合在低浓度的数据点。这些方程的采用将图形拟合限制为仅应用数据的单相建模,因此通常不能通过一系列点的曲线进行充分拟合。在应用4-PL和5-PL曲线拟合模型时做出的假设是分析物浓度和信号之间的关系是单相的,与分析物结合分子和分析物之间的单一亲和状态相互作用一致。这种单相相互作用的假设在许多测定类型的标准曲线的建模中得到保留。在现有技术的免疫测定标准曲线拟合中,从4-PL和5-PL在免疫测定标准曲线拟合中使用的最初构想,到现在在免疫测定中推广它们的使用,这一假设也得到了保留。这在最近对免疫测定中曲线拟合的回顾以及当前已发表的纳入当前商业免疫测定试剂盒中的曲线拟合模型的说明中得到了证明(D.Davis,A.Zhang,C.Etienne and I.Huang.Principles of CurveFitting for Multiplex Sandwich Immunoa ssays.Bio-PlexTMsuspension array systemtech note 2861;https://www.abcam.com/primary-antibodies/kd-value-a-quantitive-measurement-of-antibody-affi nity)。这是一个可理解的假设,因为两个单独的分子-配体相互作用事件的模型无法将免疫测定标准曲线分解为两个阶段,从而生成双相建模。这在本文中也得到了证明,其中双位点分子-配体相互作用模型产生的曲线拟合比4-PL和5-PL模型更差(图2-11)。在配体-受体结合领域,有方程用于描述当蛋白质分子具有两类非相互作用结合位点时的结合的配体分子的浓度[L]b(FEBS Letters 392(1996)245-249):
Figure BDA0003114534520000121
其中[L]是游离配体浓度,K1、[R1]和K2、[R2]分别是解离常数和结合位点类别1和2的结合能力。
然而,使用这个方程作为免疫测定标准曲线数据的曲线拟合模型并不能很好地拟合数据点,甚至没有对数据点实际有用的拟合(见图2-11),并且这种建模提供的拟合明显比5-PL模型差(表1)。
与测定曲线拟合和指示中的既定教导相反,由于双位点模型未能提供免疫测定数据的函数曲线拟合,免疫测定曲线拟合应该用单相建模进行,发明人发现免疫测定标准曲线可以通过信号数据变换和双相曲线拟合的组合更好地建模。
发明人假设该双位点结合方程不能很好地拟合数据,因为在低浓度分析物下的结合通常给出非常低的信号值。发明人已经发现,通过对信号结果应用数学变换函数,相对于来自较高分析物浓度的信号,放大曲线的较低分析物浓度处的信号,新的双相曲线模型提供了一种曲线拟合,与5-PL模型相比,在可溶性分析物免疫测定的较低浓度区域中,分析物定量的准确性在统计学上具有显著改进(见表1、2、3、4和5)。这种改进包括(1)增加的拟合优度(r2增加与平方和(SSQ)减少),(2)测量为定量下限(LLOQ)减少的测定的灵敏度和(3)测定动态范围的增加。
在免疫测定中分析物与抗体结合期间检测到的信号包括三个主要成分。首先,是来自分析物与抗体的特异性相互作用的信号。其次,是来自分析物与测定系统中成分的非特异性相互作用的信号。第三,是在没有分析物的情况下来自系统的背景信号。测量背景(Bkd)和非特异性结合的方法是本测定领域技术人员公知的。例如,在应用上文所述的信号变换和双相建模的组合中,可以通过包含为零浓度分析物的测定构建的标准曲线中的点提供背景信号(即在没有分析物的情况下产生的信号)。在没有捕获抗体或使用同型的抗体的情况下,可以从标准曲线的生成中量化非特定结合,但对分析物缺乏显著的亲和力。
在本发明的优选实施例中,系统包含以下方程1,该方程对以下三个信号成分进行建模:
方程1
Figure BDA0003114534520000131
其中f是数学变换函数,在相对于测定范围内较高浓度的较低浓度下放大信号值,包括但不完全包括以下变换因子:
lognx、ln x、ASINH(x),、和
Figure BDA0003114534520000132
Figure BDA0003114534520000133
其中x=信号值以及n介于2和100之间。在优选实施例中,n=10。
在特别优选的实施例中,计算f=log10x和信号结果的以10为底数的对数。
Y是在分析物浓度下产生的信号[L];
Bmax1是由较高亲和力的分析物-捕获分子相互作用产生的最大信号;
Kd1是较高亲和力的分析物-捕获分子相互作用的解离常数;
Bmax2是由较低亲和力的分析物-捕获分子相互作用产生的最大信号;和
Kd2是较低亲和力分析物-捕获分子相互作用的解离常数。
NS是来自分析物与[L]非特定结合的信号变化的斜率。
Bkd是[L]=0(零)时获得的“背景”信号。
如果在变换和标准曲线生成之前,从总信号数据中减去背景(Bkd)信号值,或者其影响未在计算中建模,则从方程1中删除fBkd项,提供方程2:
方程2
Figure BDA0003114534520000141
如果从变换和标准曲线生成之前的总信号数据中减去来自分析物非特异性结合的信号值(NS×[L]),或其影响未在计算中建模,则从方程1中删除f(NS×[L])项,提供方程3:
方程3
Figure BDA0003114534520000142
如果从变换和标准曲线生成之前的总信号数据中减去来自分析物非特异性结合(NS×[L])和背景(Bkd)的信号值,或其影响未在计算中建模,则从方程1中删除f(NS×[L])和fBkd项,提供方程4:
方程4
Figure BDA0003114534520000143
此处描述的系统将在计算中加入用于选择将四个方程(1-4)中的哪一个应用于曲线拟合的选项,方程1-4将作为曲线拟合选项,和本领域技术人员所熟知的通常提供给免疫测定曲线拟合的各种选项。此处描述的选项将与一系列权重选项一起提供,这些选项也是测定曲线拟合领域技术人员所熟知的,包括但并不完全包括1/y、1/y2、1/x、1/x2和1/yk,其中k是任何数字。
示例
图2至11示出了从免疫测定中收集的数据点集的图形表示,该免疫测定对10个不同的分析物进行定量。每个示例都是通过将一系列分析物浓度与Luminex Milliplex珠子一起孵育产生的,该珠子与分析物的捕获抗体缀合。在Aeirtec孵育缓冲液中,在环境温度下进行了18小时的孵育。在洗涤以去除未结合的分析物后,将珠子在Aeirtec孵育缓冲液中与对每种分析物具有特异性的300纳米/毫升的生物素缀合的检测抗体在室温下一起孵育18小时。在洗涤以去除未结合的检测抗体后,将珠子在Aeirtec孵育缓冲液中与0.5微克/毫升的R-藻红蛋白缀合的链亲和素(链亲和素PE)一起在环境温度下以孵育1小时。在洗涤以去除未结合的链亲和素PE后,珠子在Luminex 200分析仪上用xPONENT 3.1软件进行分析。然后将信号数据传输到计算机,该计算机编程为用于将方程建模应用于标准曲线数据。对于每种分析物,6个图形在图2-11中说明了,在每种情况下,图形被标记为“a”到“e”:在每个示例中,标记为“a”和“b”的图形作为本发明的示例使用,将log(10)变换(f=log10x,其中x是信号结果)与本发明中的双相曲线拟合模型(方程1)相结合,以拟合标准曲线,“b”图是“a”图数据在较低浓度范围内的放大视图。在每一个示例中,标记为“c”和“d”的图形都使用现有技术5-PL曲线拟合模型以拟合所显示的标准曲线,“d”图是“c”图数据在较低浓度范围内的放大视图。而且,在每个示例中,标记为“e”和“f”的图形使用双位点结合模型以拟合所显示的标准曲线,“f”图是“e”图数据在较低浓度范围内的放大视图。在没有显示“f”图的情况下,标准曲线不拟合在较低浓度范围内的点。
表1总结了每个示例的R2值。R2是衡量数据点与拟合回归线的接近程度的统计学指标。数值1.0表示所有点都集中在行上,因此R2越接近1.0,模型就越拟合数据。从对所有图形的比较中可以明显看出,本发明的组合变换和双相模型提供了最佳的拟合。
表1-示例的R2值汇总。
Figure BDA0003114534520000151
Figure BDA0003114534520000161
,应用1/y2权重:**,使用f=Ln变换,赋予f=Log(10)相同的值
加权平方和(SSQ 1/Y2)也表示了每种情况中标准曲线的拟合性。为了获得最佳拟合,应最小化加权平方和,即数据的y值与曲线的y值的相对距离应最小化。零值表示所有点都集中在标准曲线上。表2总结了每个示例的SSQ 1/Y2加权值。
表2-示例的SSQ 1/Y2*加权值汇总。
Figure BDA0003114534520000162
Figure BDA0003114534520000171
,应用1/y2加权;**,使用f=ln x变换,赋予f=log10x相同的值
表3展示了R2和SSQ值的显著差异,这些值来自对相同17种不同分析物的5-PL建模与组合变换和双相建模示例之间的这些指数的比较。表3说明了使用应用于信号结果(x)的四种不同变换函数的结果,即:f=log10x;
Figure BDA0003114534520000172
f=x0.14562;和f=ASINH(x)。
当P值(在表3中提供)小于0.05时,按照惯例,比较的两个值之间存在统计学上的显著差异。关于R2和SSQ值,与双相模型组合的变换和5-PL模型之间的差异的P值在所有情况下都小于0.005到0.002,这意味着随机发生这些模型的曲线拟合性能之间差异幅度的可能性可以忽略不计(<1/200至<1/500)。总之,这种拟合改善的严格一致性提供了所有测试的变换函数,这些变换函数放大了在相对于较高分析物浓度范围的较低分析物浓度范围内获得的信号值,这表明应用于信号的变换实现这种信号放大都将导致更好的曲线拟合。
表3.用于5-PL建模的R2和SSQ的几何平均值以及使用双相建模的变换示例
Figure BDA0003114534520000173
Figure BDA0003114534520000181
,应用1/y2加权
因此,可以应用其他方法来将在分析物浓度较低区域获得的信号放大到比较高区域更大的程度,放大程度与信号大小成反比,并且是本领域技术人员已知的,并且熟悉数据变换。
表1-3中的数据是从三明治ELISA测定中获得的,其中捕获抗体附着在作为基底的珠子上,并将检测抗体以溶液添加到不含基底的测定中。表4中显示在三明治ELISA形式中生成的标准曲线的检查结果,其中捕获和检测抗体都在测定外附着到基底上。这些测定是根据制造商的说明使用Alphalisa邻位测定系统进行的。再次,该检查再次证明,当使用上文所述的具有双相曲线建模的组合信号变换时,曲线拟合的R2和SSQ值均具有高度统计学显著的改善。总的来说,因此这些发现说明本发明在至少包括不同形式的三明治ELISA以及邻位和非邻位测定的一系列ELISA形式中提供了显著益处。
表4.5-PL的R2和SSQ的几何平均值,以及Alphalisa邻位测定生成的标准曲线中的变换和双相建模。
Figure BDA0003114534520000182
Figure BDA0003114534520000191
使用加权的建模也可以变化。使用1/y2进行加权是标准曲线拟合中常见的默认选项之一。可以应用通常是默认选项的其他加权选项,但产生的曲线拟合比双相曲线拟合中的1/y2加权差,包括以下:1/y,1/x和1/x2。在某些情况下,使用权重1/y2的曲线拟合质量会被使用权重1/yn所超越,其中Y增加到除2以外的其他值的幂,但这最好作为1/yn的选项提供,其中n介于1.5和10之间。
与双相建模组合的信号变换提供的曲线拟合的显著改进的表明曲线将更准确地对较低的分析物浓度进行定量,从而提供更高的测定灵敏度。通过比较每种方法的定量上限(ULOQ)、定量下限(LLOQ)和动态范围,可以进一步比较在测定灵敏度方面与双相模型组合的信号变换和5-PL模型方法,这是ULOQ和LLOQ之间的差异。表5说明了从17种不同分析物获得的结果中每一种的几何平均值。
表5-与双相模型组合的变换和5-PL模型之间的ULOQ、LLOQ和动态范围的比较。
Figure BDA0003114534520000192
从表5可以看出,与本发明的组合双相模型相的变换提供了比5-PL模型更高的ULOQ和更低的LLOQ,产生了更大的动态范围。实际上,LLOQ提高了近9倍,动态范围提高了近10倍。同样,当P值(在表5中提供)小于0.05时,按照惯例,比较的两个值之间存在统计学上的显著差异。关于LLOQ和动态范围,与双相模型组合的变换和5-PL模型之间的差异的P值小于0.00003,这意味着随机出现的这些模型的分析物定量性能之间的差异幅度的可能性可忽略不计(<0.003%或<1/300,000)。由组合信号变换和双相建模提供的测定灵敏度的高度统计学显著增加(降低的LLOQ),而ULOQ保持不变(P=0.28,无显著差异)产生动态范围的统计显著增加,这也表明随机发生机会为<0.003%或<1/300,000。
本发明可以作为盒提供,该盒包括进行测定所需的组分和使用该组分进行未知分析物浓度样品中的分析物浓度定量的说明。这样的盒将包括至少一个涂覆有适合与分析物结合的分析物捕获分子的测定基底。这可以是多孔板的形式,例如96孔板。或者,测定基底可以是涂覆有分析物捕获分子的颗粒或珠子的形式。该盒还将包括至少一种适合与分析物结合的检测分子。该盒还将包括操作软件的说明,以在含有未知浓度分析物的样品中实现以下分析物浓度的定量。
该盒可能包括所讨论分析物的浓缩样品,称为“校准分析物样品”,以使用户能够在一系列已知浓度下进行测定。或者,用户可以提供他们自己的校准分析物样品。优选使用至少六种已知浓度的分析物进行测定。将来自校准标准中已知分析物浓度测定的检测到的分析物值传递到计算机软件并通过应用作为本发明的一部分提供的方程中的可选变换之一进行变换。然后通过软件将来自已知分析物浓度检测的变换值相对于已知分析物浓度绘制在图形(“校准图”或“标准曲线”)中,以可视化分析物检测值与分析物浓度之间的关系。分析物浓度设置在对数值轴上以方便说明关系。该软件应用本发明中提供的方程作为选项。可以应用提供最佳拟合点的方程来定义变换后的分析物检测值与已知分析物浓度之间的关系。然后应用曲线拟合,并在校准图上绘制一条最佳拟合线。
当选择了本发明内的方程式来定义变换后的分析物检测值和分析物浓度之间的关系时,含有未知分析物浓度的样品内的分析物浓度值可以通过软件应用选定的方程对校准图进行插值而获得。来自未知分析物浓度样品的测定的分析物检测值,以与校准标准值相同的方式变换,用于通过使用所选方程的插值获得样品内的分析物浓度值。
总而言之,本发明中提供的测定数据的建模在(1)曲线拟合、(2)测定灵敏度和(3)动态范围方面比常规方法产生显著改善。

Claims (23)

1.一种用于确定样品中分析物的量的方法,包括以下步骤:
(a)提供多个已知浓度的分析物样品;
(b)提供分析物捕获分子和检测分子,所述分析物捕获分子和检测分子均适合与分析物结合,其中检测分子包括用于识别与分析物的反应的信号传输装置;
(c)将分析物样品与分析物捕获分子和检测分子混合,以形成分析物-捕获分子-检测分子复合物;
(d)检测分析物与检测分子反应所产生的信号;
(e)将数学变换函数应用于检测信号;
(f)使用计算机对分析物浓度与步骤(e)的变换检测信号的双相标准曲线进行数学建模,使用以下方程:
Figure FDA0003114534510000011
其中f是数学变换函数,其放大了测定范围内相对于较高浓度的较低浓度的信号值;
Y是在分析物浓度下产生的信号[L];
Bmax1是由较高亲和力的分析物-捕获分子相互作用产生的最大信号;
Kd1是较高亲和力的分析物-捕获分子相互作用的解离常数;
Bmax2是由较低亲和力的分析物-捕获分子相互作用产生的最大信号;和
Kd2是较低亲和力的分析物-捕获分子相互作用的解离常数;
(g)提供未知浓度的分析物样品;
(h)提供分析物捕获分子和检测分子,所述分析物捕获分子和检测分子均适合与所述分析物结合,其中所述检测分子包括用于识别与所述分析物的反应的信号装置;
(i)将分析物样品与分析物捕获分子和检测分子混合,以形成分析物-捕获分子-检测分子复合物;
(j)检测分析物与检测分子反应所产生的信号;
(k)将数学变换函数应用于步骤(iv)的检测信号;和
(l)通过使用步骤(f)中生成的双相标准曲线,将步骤(k)的变换检测信号与分析物浓度相关联,确定样品中分析物的量。
2.根据权利要求1所述的用于确定样品中分析物的量的方法,其中步骤(f)中的方程还包括与分析物浓度为零时的背景信号传输Bkd相关的项:
Figure FDA0003114534510000021
3.根据权利要求1所述的用于确定样品中分析物的量的方法,其中步骤(f)中的方程还包括与非特异性信号传输NS相关的项f(NS×[L]),其随分析物浓度而变化:
Figure FDA0003114534510000022
4.根据权利要求1所述的用于确定样品中分析物的量的方法,其中步骤(f)中的方程还包括与分析物浓度为零时的背景信号传输Bkd相关的项,以及与非特异性信号传输NS相关的项f(NS×[L]),其随分析物浓度而变化:
Figure FDA0003114534510000023
5.根据前述权利要求中任一项所述的用于确定样品中分析物的量的方法,其中在步骤(f)中应用于信号结果的变换函数f选自包括以下的组:lognx、lnx、ASINH(x)、和
Figure FDA0003114534510000024
其中x=要变换的信号结果,n介于2和100之间。
6.根据前述权利要求中任一项所述的用于确定样品中分析物的量的方法,其中步骤(a)中已知浓度的样品的数量至少为六个。
7.根据前述权利要求中任一项所述的用于确定样品中分析物的量的方法,其中所述检测分子的信号传输装置选包括以下的组:生色标记、化学发光标记、荧光标记、磷光标记、生物发光标记、电化学发光标记、晶体发光标记、白炽标记或辐射标记。
8.根据前述权利要求中任一项所述的用于确定样品中分析物的量的方法,其中在步骤(d)和(j)中使用选自包括以下的组的设备检测信号:x射线检测器,α、β和γ辐射探测器,CCD照相机成像设备,CMOS照相机成像设备,磷光成像仪,荧光计,流式细胞仪,时间分辨荧光光谱仪,荧光偏振分析仪,定量聚合链反应指示仪和分光光度计。
9.根据前述权利要求中任一项所述的用于确定样品中分析物的量的方法,其中所述测定是免疫测定。
10.一种用于对测定的校准数据建模的方法,包括以下步骤:
(a)提供多个已知浓度的分析物样品;
(b)提供分析物捕获分子和检测分子,所述分析物捕获分子和检测分子均适合与分析物结合,其中检测分子包括用于识别与分析物的反应的信号传输装置;
(c)将分析物样品与分析物捕获分子和检测分子混合,以形成分析物-捕获分子-检测分子复合物;
(d)检测分析物与检测分子反应所产生的信号;
(e)将数学变换函数应用于检测信号;
(f)使用计算机对分析物浓度与步骤(e)的变换检测信号的双相标准曲线进行数学建模,使用以下方程:
Figure FDA0003114534510000031
其中f是数学变换函数,其放大了测定范围内相对于较高浓度的较低浓度的信号值;
Y是在分析物浓度下产生的信号[L];
Bmax1是由较高亲和力的分析物-捕获分子相互作用产生的最大信号;
Kd1是较高亲和力的分析物-捕获分子相互作用的解离常数;
Bmax2是由较低亲和力的分析物-捕获分子相互作用产生的最大信号;和
Kd2是较低亲和力的分析物-捕获分子相互作用的解离常数。
11.根据权利要求10所述的用于对测定的校准数据建模的方法,其中步骤(f)中的方程还包括与分析物浓度为零时的背景信号传输Bkd相关的项:
Figure FDA0003114534510000032
12.根据权利要求10所述的用于对测定的校准数据建模的方法,其中步骤(f)中的方程还包括与非特异性信号传输NS有关的项f(NS×[L]),其随分析物浓度而变化:
Figure FDA0003114534510000033
13.根据权利要求10所述的用于对测定的校准数据建模的方法,其中步骤(f)中的方程还包括与分析物浓度为零时的背景信号传输Bkd相关的项和与非特异性信号传输NS相关的项f(NS×[L]),其随分析物浓度而变化:
Figure FDA0003114534510000034
14.根据权利要求10至13中任一项所述的用于对测定的校准数据建模的方法,其中应用于步骤(f)中的信号结果的变换函数f选自包括以下的组:lognx、lnx、ASINH(x)、和
Figure FDA0003114534510000035
Figure FDA0003114534510000036
其中x=要变换的信号结果,n介于2和100之间。
15.一种编程为对分析物浓度与变换检测信号的双相标准曲线进行数学建模的计算机,其使用以下方程:
Figure FDA0003114534510000041
其中f是数学变换函数,其放大了测定范围内相对于较高浓度的较低浓度的信号值;
Y是在分析物浓度下产生的信号[L];
Bmax1是由较高亲和力的分析物-捕获分子相互作用产生的最大信号;
Kd1是较高亲和力的分析物-捕获分子相互作用的解离常数;
Bmax2是由较低亲和力的分析物-捕获分子相互作用产生的最大信号;和
Kd2是较低亲和力分析物-捕获分子相互作用的解离常数。
16.根据权利要求15所述的编程为对分析物浓度与变换检测信号的双相标准曲线进行数学建模的计算机,其中所述方程还包括与分析物浓度为零时的背景信号传输Bkd相关的项:
Figure FDA0003114534510000042
17.根据权利要求15所述的编程为对分析物浓度与变换检测信号的双相标准曲线进行数学建模的计算机,其中所述方程还包括与非特异性信号传输NS相关的项f(NS×[L]),其随分析物浓度而变化:
Figure FDA0003114534510000043
18.根据权利要求15所述的编程为对分析物浓度与变换检测信号的双相标准曲线进行数学建模的计算机,其中所述方程还包括与分析物浓度为零时的背景信号传输Bkd相关的项,以及与非特异性信号传输NS相关的项f(NS×[L]),其随分析物浓度而变化:
Figure FDA0003114534510000044
19.根据权利要求15至18中任一项所述的编程为对分析物浓度与变换检测信号的双相标准曲线进行数学建模的计算机,其中应用于信号结果的变换函数f选自包括以下的组:lognx、lnx、ASINH(x)、和
Figure FDA0003114534510000045
Figure FDA0003114534510000046
其中x=要变换的信号结果,n介于2和100之间。
20.一种用于确定样品中分析物的量的部件盒,包括:
至少一种测定基底,其涂有适合与分析物结合的分析物捕获分子;
至少一种检测分子,其适合与分析物结合,所述检测分子包括信号传输装置以识别与分析物的反应;和
一组用于对测定的校准数据建模的指令,包括以下步骤:
(i)将多个已知浓度的分析物样品添加到测定基底中,分析物的每个样品独立测定;
(ii)将检测分子添加到测定基底中;
(iii)检测由每个分析物样品与检测分子反应产生的信号;
(iv)将数学变换函数应用于检测信号;和
(v)使用计算机对分析物浓度与步骤(e)的变换检测信号的双相标准曲线进行数学建模,使用以下方程:
Figure FDA0003114534510000051
其中f是数学变换函数,其放大了测定范围内相对于较高浓度的较低浓度的信号值;
Y是在分析物浓度下产生的信号[L];
Bmax1是由较高亲和力的分析物-捕获分子相互作用产生的最大信号;
Kd1是较高亲和力的分析物-捕获分子相互作用的解离常数;
Bmax2是由较低亲和力的分析物-捕获分子相互作用产生的最大信号;和
Kd2是较低亲和力的分析物-捕获分子相互作用的解离常数。
21.根据权利要求20所述的部件盒,其中所述至少一种测定基底是多孔板。
22.根据权利要求20所述的部件盒,其中所述至少一种测定基底是颗粒或珠子。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的部件盒,还包括至少一个校准分析物样品。
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