ES2533467T3

ES2533467T3 - Ampliación del rango de medición de ensayos cromatográficos rápidos

Info

Publication number: ES2533467T3
Application number: ES07017673.0T
Authority: ES
Inventors: Jürgen Spinke; Marcel Thiele; Jürgen Schäffler; Andreas Nufer
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2006-09-11
Filing date: 2007-09-10
Publication date: 2015-04-10
Anticipated expiration: 2027-09-10
Also published as: US20140322703A1; HK1118608A1; EP1909206A1; CA2600221A1; US9285376B2; US20080070234A1; CN101144810A; JP2008070366A; CN101144810B; CA2600221C; JP4823178B2

Abstract

Método de determinación cuantitativa de un analito en una muestra, que comprende (a) preparación de una sustancia específica del analito que al entrar en contacto con él es capaz de reaccionar con el mismo produciendo una señal detectable, de manera que para proporcionar la sustancia específica del analito se usa una tira de ensayo; (b) elaboración de, al menos, dos gráficos de calibración obtenidos respectivamente por reacción de la misma sustancia específica del analito con diferentes cantidades de un mismo analito, para unos tiempos de reacción prefijados respectivamente; (c) puesta en contacto de la sustancia específica del analito con una muestra que contiene el analito buscado; (d) medición de la señal correspondiente a un primer tiempo de reacción prefijado, para el cual existe un primer gráfico de calibración según (b); (e) comprobación de que la señal medida en (d) permite una determinación cuantitativa del analito con una exactitud deseada, que para el analito buscado se logra cuando el gráfico de calibración considerado presenta la mayor pendiente de todas las curvas de calibración elaboradas respecto a la correspondiente cantidad del analito buscado; (f) (i) determinación cuantitativa del analito basada en la señal medida en (d) cuando se alcanza la exactitud deseada, de modo que para determinar cuantitativamente el analito, la señal medida según (d) se compara con el primer gráfico de calibración elaborado para el primer tiempo de reacción prefijado, o (ii) medición de la señal correspondiente a un segundo tiempo de reacción prefijado, para el cual existe un segundo gráfico de calibración según (b); (g) comprobación de que la señal medida en (f) (ii) permita una determinación cuantitativa del analito con una exactitud deseada, que para el analito buscado se logra cuando el gráfico de calibración considerado presenta la mayor pendiente de todas las curvas de calibración elaboradas respecto a la correspondiente cantidad del analito buscado; y (h) (i) determinación cuantitativa del analito basada en la señal medida en (f) (ii) cuando se alcanza la exactitud deseada, de modo que para determinar cuantitativamente el analito, la señal medida según (f) (ii) se compara con el segundo gráfico de calibración elaborado para el segundo tiempo de reacción prefijado, o (ii) continuación de la determinación para al menos otro tiempo de reacción prefijado correspondiente a (f) (ii), (g), (h) (i)

Description

Ampliación del rango de medición de ensayos cromatográficos rápidos

La presente invención se refiere a métodos y dispositivos de determinación cuantitativa de un analito en una muestra

Un método de análisis ampliamente utilizado para la determinación rápida de analilos como por ejemplo drogas, honnonas del embarazo, enfermedades infecciosas o marcadores cardiacos recurre al empleo de tiras de ensayo inmunológicas. Para ello se usan en general ensayos tanto cualitativos (p.ej. CARDIAC O-Dimer, Trop T sensitive, etc.) como cuantitativos, que se valoran mediante un aparato lector (p.ej. Elecsys® proBNP, Rache CARDIAC proBNP, etc.).

Estas tiras de ensayo inmunológicas para detenninación cuantitativa se caracterizan sobre todo por su facilidad de manejo. El fundamento general de las tiras de ensayo es la reacción del reactivo contenido en ellas con un analito de la muestra y la consiguiente producción de una señal detectable, que suele medirse por remisión al cabo de un tiempo prefijado. El lapso de tiempo transcurrido entre la puesta en contacto del anal ita con el reactivo y la medición de la señal se elige lo más largo posible. De esta manera se asegura un largo tiempo de reacción entre el reactivo y el analito y por lo tanto que estas tiras tenga la mayor sensibilidad posible. Sin embargo, debido a la cinética de las reacciones, tras un tiempo de reacción tan largo ya no es posible determinar cuantitativamente analitos presentes en la muestra a una concentración elevada

Por eso, en comparación con sistemas analiticos de laboratorio corrientes, como p.ej. Elecsys (Roche Diagnostics), 1M (Abbott), Dimension (Dade Behring), estas tiras de ensayo aún tienen claramente puntos débiles en cuanto a eficiencia. En concreto la exactitud de la medición y su rango dinámico son mucho peores en las tiras de ensayo, por ejemplo en comparación con las reacciones en solución. Esto limita su uso para la determinación de analitos que requieren una gran sensibilidad y también un rango de medición lo más amplio posible. Sobre todo, en caso de asistencia médica de urgencia a pacientes seria de mucha ayuda para el médico tratante disponer de un ensayo o de un método de gran sensibilidad que por una parte permitiera descartar con seguridad ciertas enfermedades y por otra parte ofreciera un amplio rango de medición. En particular, para la estratificación de riesgos y para el control

terapéutico es deseable que el rango de medición de un analito sea amplio. La ampliación del rango de medición de los ensayos es especialmente importante para aquellos estados patológicos en que la concentración de un analito o marcador caracteristico del estado tiene relación con la gravedad del estado patológico. En tales casos una mayor concentración de marcador (p.ej. NT-proBNP) puede ser indicio de una grave situación de peligro para el paciente.

Por tanto uno de los objetos de la presente invención era proporcionar un método para ampliar el rango de medición cuantitativa de un analito en una muestra.

Este objetivo se resuelve mediante la determinación cuantitativa de un analito en una muestra, incluyendo

(a): preparación de una sustancia especifica del analito que al entrar en contacto con él es capaz de reaccionar con el mismo produciendo una señal detectable, de manera que para proporcionar la sustancia especifica del analito se usa una tira de ensayo;

(b): elaboración de, al menos, dos gráficos de calibración obtenidos respectivamente por reacción de la misma sustancia especifica del analito con diferentes cantidades de un mismo analito, para unos tiempos de reacción prefijados respectivamente;

(c): puesta en contacto de la sustancia especifica del analito con una muestra que contiene el analito buscado;

(d): medición de la señal correspondiente a un primer tiempo de reacción prefijado, para el cual existe un primer gráfico de calibración según (b);

(e): comprobación de que la señal medida en (d) permite una determinación cuantitativa del analito con una exactitud deseada, que para el analito buscado se logra cuando el gráfico de calibración considerado presenta la mayor pendiente de todas las curvas de calibración elaboradas respecto a la correspondiente cantidad del analito buscado;

(1)

(i): determinación cuantitativa del analito basada en la señal medida en (d) cuando se alcanza la exactitud deseada, o

(ii): medición de la señal correspondiente a un segunda tiempo de reacción prefijada, para el cual existe un segundo grafico de calibración según (b);

(g): comprobación de que la señal medida en (f) (ii) permita una determinación cuantitativa del analito con una exactitud deseada, que para el analito buscado se logra cuando el grafico de calibración considerado presenta la mayor pendiente de todas las curvas de calibración elaboradas respecto a la correspondiente cantidad del analito buscado; y

(h)

(i): determinación cuantitativa del analito basada en la señal medida en (f) (ii) cuando se alcanza la exactitud deseada, o

(ii): continuación de la determinación para al menos otro tiempo de reacción prefijado correspondiente a (f) (ii), (9 ), (h) (i),

es decir, dado el caso,

(i): medición de la señal correspondiente a un tercer tiempo de reacción prefijado, para el cual existe un tercer gráfico de calibración según (b);

(j): comprobación de que la señal medida en (i) permite una determinación cuantitativa del analito con una

5 exactitud deseada, que para el analito buscado se logra cuando el gráfico de calibración considerado presenta la mayor pendiente de todas las curvas de calibración elaboradas respecto a la correspondiente cantidad del analito buscado; Y

<kl

(i) determinación cuantitativa del anal ita basada en la señal medida en (i) cuando se alcanza la exactitud 10 deseada, o

(ii) continuación de la determinación para al menos otro tiempo de reacción prefijado

Los pasos (f) (ji), (g) y (h) (i) del método se pueden repetir tantas veces como se quiera. En una forma de ejecución preferida se repiten dos o tres veces, es decir, se elaboran o establecen respectivamente dos o tres gráficos de 15 calibración para dos o tres tiempos de reacción prefijados.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de determinación cuantitativa de un analito en una muestra, que comprende

(a) preparación de una sustancia especifica del analito que al entrar en contacto con él es capaz de reaccionar

20 con el mismo produciendo una señal detectable, de manera que para proporcionar la sustancia especifica del analito se usa una tira de ensayo;

(b) elaboración de, al menos, dos gráficos de calibración obtenidos respectivamente por reacción de la misma sustancia específica del analito con diferentes cantidades de un mismo analito, para unos tiempos de reacción prefijados respectivamente;

25 (c) puesta en contacto de la sustancia específica del analito con una muestra que contiene el analito buscado;

(d): medición de una primera señal correspondiente a un primer tiempo de reacción prefijado, para el cual existe un primer grafico de calibración según (b);

(e): medición de una segunda señal correspondiente a un segundo tiempo de reacción prefijado, para el cual

existe un segundo grafico de calibración según (b); 30 (f) medición opcional de otra señal;

(g) comprobación de cuál de las señales medidas según (d), (e ) o (f) permite determinar cuantitativamente el analito con suficiente exactitud, de modo que la exactitud deseada para el anal ita buscado se logra cuando el gráfico de calibración considerado presenta la mayor pendiente de todas las curvas de calibración elaboradas respecto a la correspondiente cantidad del analito buscado, y

35 (h) determinación cuantitativa del analito basada en la señal que permite una exactitud suficiente.

En una forma de ejecución preferida, para comprobar si la primera o la segunda señal medida permite determinar cuantitativamente el analito con una mayor exactitud, se establece un valor limite de concentración empírico basado como mínimo en los dos gráficos de cal ibración elaborados. Las concentraciones de analito superiores a este valor

40 limite se evalúan según el tiempo de reacción mas corto de ambos, mientras que las concentraciones de analito inferiores a este valor límite se evalúan según el tiempo de reacción mas largo de ambos. Si se comprueba que la concentración de analito supera el valor límite tras el tiempo de reacción más corto, es decir, si se determina una elevada concentración de analito, el proceso se puede finalizar en este momento.

45 Sorprendentemente se comprobó que, en comparación con los métodos conocidos del estado técnico, el método de la presente invención permite aumentar más del triple el limite superior de medición Por lo tanto el método de la presente invención mejora la capacidad diagnóstica de un médico tratante.

Dado el caso, el rango de medición ampliado según la presente invención permite prescindir de ensayos adicionales 50 o complejos (p.ej. métodos de diagnóstico invasivos).

Como se describe detalladamente más adelante, los métodos de la presente invención permiten una determinación más rápida de las concentraciones de analito en una muestra, sobre todo si son elevadas, en comparación con los métodos o ensayos descritos en el estado técnico. Asi por ejemplo, como el nivel de NT-proBNP en la sangre esta 55 relacionado con el grado de disfunción cardíaca, los métodos de la presente invención permiten valorar con rapidez el estado cardioespecífico de un paciente en situaciones de urgencia. Una ventaja derivada de ello es que en caso de incidentes cardiacos agudos, como por ejemplo un infarto de miocardio agudo, los pacientes pueden identificarse en una fase más temprana y ser tratados adecuadamente, en comparación con los procedimientos diagnósticos actuales. Con los métodos de la presente invención y el diagnóstico más rápido, sobre todo en caso de un incidente

60 cardiaco agudo, el médico tratante puede iniciar antes las contramedidas apropiadas y reducir otras complicaciones cardíacas, así como la frecuencia de casos mortales.

En una forma de ejecución preferida de la presente invención se emplea una muestra liquida, preferiblemente procedente de un líquido corporal. Con especial preferencia se usa una muestra de sangre, plasma, suero, saliva u 65 orina.

El analito objeto de determinación cuantitativa se elige preferiblemente entre acidos nucleicos, lípidos, hidratos de carbono, proteínas, y en particular entre ADN, ARN, anticuerpos, antígenos, productos metabólicos, hormonas, virus, microorganismos, células, marcadores cardioespecíficos, marcadores neurohormonales, marcadores isquémicos y marcadores musculares especificas.

Como ejemplos preferidos de lípidos cabe citar el colesterol, el colesterol HDL y los triglicéridos Un analito del tipo hidrato de carbono especialmente preferido es la glucosa. Como ejemplos de enzimas determinables cabe citar las fosfatasas y amilasas alcalinas. El ácido úrico, la bilirrubina y el urobilinógeno son ejemplos preferidos de productos metabólicos

10 Como ejemplos de marcadores neurohormonales cabe citar el péptido natriurético atnal (tipo A) (ANP), el péptido natriurético tipo B (BNP) o fragmentos N-terminales de los respectivos propéptidos NT-ProANP y NTProBNP.

Como ejemplos de marcadores isquémicos cabe citar la albúmina modificada por isquemia (IMA), la proteina fijadora 15 de ácidos grasos, los ácidos grasos libres, la proteína A plasmática asociada al embarazo, el isoenzima BB de la glucógeno fosforilasa y la esfingosina-1-fosfato.

La mioglobina y la crealina-cinasa MB (CK-MB) son ejemplos preferidos de marcadores musculares específicos.

20 El CD 40 es un ejemplo preferido de marcador de la activación plaquetaria.

Los marcadores isquémico-necróticos cardioespecíficos preferidos son la troponina T o la troponina 1.

En una forma de ejecución especialmente preferida se determina al menos un marcador cardíaco o cardioespecífico 25 elegido también con preferencia entre troponina T, mioglobina, dímero D y NT-proBNP.

La sustancia especifica del analito se elige preferiblemente entre los receptores, anticuerpos, antígenos, lectinas, acidos nucleícos y analogos de écidos nucleícos capaces de fijar el analito. La sustancía especifica del anal ita esta preferiblemente acoplada a un reactivo de detección o a un enzima, que al unirse al analito generan una señal 30 detectable. En una forma de ejecuciÓn preferida la unión del anal ita a la sustancia específica del analito produce directamente por reacción una señal detectable. En otra forma de ejecución, tras la unión del analito a la sustancia específica del analito se puede añadir un substrato que es transformado por el analito o por la sustancia especifica del anal ita emitiendo una señal detectable. Como sistemas de detección se prefieren p.ej. las partículas metélicas coloidales, sobre todo de oro, las nanoparticulas fluorescentes, p.ej. de látex, fosfatos de conversión ascendente,

35 puntos cuánticos o partículas superparamagnéticas.

La detección de los analitos BNP o NT-proBNP determinados con preferencia por la presente invención está descrita por ejemplo en Richards y otros (Circulation 97(1998) 1921-1929), Struthers (Eur. Heart J. 20 (1999), 1374-1375), Hunt y otros, Clin. Endocrinol. 47 (1997, 287-296), Talwar y otros (Eur. Heart. J. 20 (1999), 1736-1744), Darba y

40 otros (Am. J. Cardiol. 78 (1996), 286-287), asi como en las patentes EP-O 648 228 Y WO 00f45176.

En una forma de ejecución preferida la reacción la reacción el analito y la sustancia específica del analito es de tipo inmunológico.

45 Según la presente invención se entiende por "gráfico de calibración" una función resultante de asignar cantidades definidas de analito de ensayo a parametros específicos que expresan la señal detectable. Se asigna una cantidad definida de analito de ensayo a un parámetro especifico que expresa la señal detectable. Para elaborar los gráficos de calibración también se pueden utilizar valores promedio de varias mediciones preferiblemente independientes.

50 Los parámetros que expresan la señal detectable son preferiblemente parámetros que representan una adsorción o emisión de luz de cualquier longitud de onda como resultado de la reacción del analito con la sustancia especifica del analito. Como ejemplos preferidos de parámetros que expresan la señal cabe mencionar los valores de remisión, emisión y adsorción. Además se pueden usar p.ej. partículas magnéticas y por tanto como parámetros descriptores de la señal también pueden tenerse en cuenta los campos magnéticos (estados del campo magnético)

55 En cada caso los parámetros que expresan la señal detectable se miden preferiblemente mediante la reacción de la misma sustancia específica del analito con distintas cantidades de un mismo analito de ensayo para un respectivo tiempo de reacción prefijado. Para ello se hace reaccionar la correspondiente cantidad del mismo analito de ensayo con la misma sustancia especifica del analito y tras el tiempo de reacción prefijado se mide la señal detectable, es

60 decir, para elaborar un gréfico de calibración se emplea respectivamente una misma sustancia especifica del analito y un mismo anal ita de ensayo en diferentes cantidades. Para elaborar un gráfico de calibración se llevan a cabo reacciones individuales, utilizando preferiblemente 5 hasta 50 cantidades distintas del analito de ensayo, con mayor preferencia 10 hasta 40, sobre todo 10 hasta 25, correspondientes a muchas asignaciones de cantidades del analito de ensayo a parámetros descriptores de la señal por cada tiempo de reacción prefijado.

Antes de elaborar los gráficos de calibración, los valores hallados experimentalmente también se pueden someter a un método cinético de evaluación y entonces para elaborar el grafico de calibración también se pueden utilizar los valores determinados mediante el método de evaluación

El analito de ensayo y el analito objeto de detección cuantitativa son preferiblemente idénticos

En el método de la presente invención se comprueba mediante los graficos de calibración elaborados si al medir la señal resultante de la reacción de la sustancia especifica del analito con el analito de la muestra se consigue una determinación cuantitativa del analito con la exactitud deseada. Para verificar la exactitud se pueden usar cualquier método de evaluación conocido en la especialidad que tenga en cuenta el recorrido de la señalo precisión

En una forma de ejecución preferida de la presente invención la señal medida tras un tiempo prefijado de reacción entre el analito y la sustancia especifica del analito se compara con el grafico de calibración correspondiente al respectivo tiempo de reacción prefijado. La exactitud deseada de la cantidad de analito objeto de la determinación se alcanza cuando el gráfico de calibración observado presenta la mayor pendiente de todas las curvas de calibración elaboradas respecto a la correspondiente cantidad de analito de ensayo.

Los dos, como mínimo, tiempos de reacción prefijados para la determinación de los graficos de calibración se eligen de manera que se logre tanto la detección de mayores concentraciones de analito en la muestra, como la necesaria sensibilidad del ensayo. Para conseguir la sensibilidad que requiere el ensayo se necesita un tiempo de reacción lo mas largo posible. Si los tiempos de reacción son cortos se forman menos complejos entre la sustancia específica del analito y el analito, preferiblemente inmunocomplejos. Por tanto se detecta una señal de menor intensidad. En cambio si las concentraciones de analito son bajas se forma una cantidad insuficiente de complejos, preferiblemente inmunocomplejos, y se pierde la sensibilidad del ensayo. Sin embargo en caso de concentraciones elevadas hay mas complejos disponibles y por lo tanto, aunque los tiempos de reacción sean cortos, se pueden detectar señales claras o intensidades de señal altas. Mediante la combinación de un tiempo de reacción largo, para asegurar la sensibilidad necesaria, y un tiempo de reacción corto, que sirve para detectar una concentración mas elevada, se incrementa notablemente el rango de medición cuantitativa de la reacción entre el analito y la sustancia especifica del anal ita .

Por esta razón, uno de los tiempos de reacción prefijados se elige preferiblemente de larga duración respecto a la reacción entre el analito y la sustancia especifica del anal ita, de tal manera que tras este tiempo dicha reacción se encuentre en un intervalo de saturación o en un estado estacionario. Otros tiempos de reacción prefijados se eligen preferiblemente más cortos, para que en estos breves periodos prefijados la reacción entre el analito y la sustancia específica del analito no llegue a un intervalo de saturación o a un estado estacionario. Al menos un tiempo de reacción corto se elige preferiblemente de manera que su duración aproximada sea la mitad del tiempo de reacción largo.

La sustancia especifica del analito se prepara sobre una tira de ensayo o tira de ensayo rápido.

Las sustancias especificas del analito o los reactivos empleados para la determinación del analito están dispuestos en forma sólida -y soluble tras el contacto con la muestra -sobre una o varias zonas de la tira de ensayo, de modo que la señal detectable se registre en una zona de detección, preferiblemente en un segmento separado de la zona de detección. Con el método de la presente invención son utilizables en particular todas las tiras de ensayo que se pueden adquirir en el comercio y que son adecuadas para la determinación cuantitativa de un analito tras un tiempo de espera prefijado

El método segun la presente invención permite ampliar por un factor de 2 hasta 5 y preferiblemente superior a 3 los limites del rango de medición de la tira de ensayo empleada

Segun otro aspecto de la presente invención, además de los analitos analizados cuantitativamente se determinan cualitativa y/o cuantitativamente otros analitos sobre el mismo soporte. Entonces, por tanto, hay varias sustancias específicas del analito sobre el soporte. Además, para ello, puede ser conveniente emplear reactivos de detección, acoplados a sustancias especificas del analito, que permitan determinar cualitativa o cuantitativamente todos los analitos mediante un solo formato de tira, por ejemplo un ensayo enzimático, un ensayo de electroluminiscencia, un ensayo de fluorescencia o de adsorción o un ensayo turbidimetrico. Evidentemente también puede haber varios reactivos de detección acoplados a las distintas sustancias especificas del analito sobre una sola tira de ensayo

En una forma de ejecución especialmente preferida se usa la tira de ensayo CARDIAC-proBNP de Roche

Así, el metodo de la presente invención permite ampliar el rango de medición de la tira de ensayo Roche-CARDIACproBNP, que es de 60-3000 pglml, hasta 60-10000 pg/ml. Por tanto una forma de ejecución preferida de la presente invención se refiere a la determinación cuantitativa de una concentración de un analito elegido preferiblemente de nuevo entre troponina T, mioglobina, dímero D y NT-proBNP. En el caso del NTproBNP la determinación se realiza por ejemplo en el rango de 3000-10000 pg/ml, para un tiempo corto de reacción entre la sustancia especifica del analito y el analito de 3-9 minutos, preferiblemente de 8 minutos La determinación del NTproBNP en el intervalo de concentración de 60-3000 pg/ml tiene lugar preferiblemente para un tiempo largo de reacción de 10-15 minutos, preferiblemente de 12 minutos

La determinación cuantitativa de la señal detectable resultante de la reacción entre el anal ita y la sustancia

5 específica del analito tiene lugar preferiblemente por medios ópticos, sobre todo por detección renectofotométrica o fluorimétrica o por electroquimioluminiscencia. Otros métodos preferidos de determinación cuantitativa comprenden medidas para variar las constantes dieléctricas, las mediciones de conductividad, los campos magnéticos o el ángulo de rotación óptica de la luz pola rizada.

10 En otra forma de ejecución preferida de la presente invención el método se lleva a cabo de forma automatizada, por ejemplo en un analizador automatico

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un dispositivo para efectuar el método de la presente invención. Este dispositivo comprende un elemento de memoria en el cual se almacenan los graficos de calibración elaborados

15 para un analito. Como ejemplo de elemento de memoria cabe mencionar todos los soportes de datos conocidos, por ejemplo llaves de plástico con un chip ROM, discos duros fijos, CD, disquetes, DVD, memorias USB, etc. Luego los graficos de calibración almacenados se pueden usar para la determinación sucesiva de varias muestras de analito

El método de la presente invención se puede usar concretamente para identificar pacientes con síndrome coronario 20 agudo, sobre todo para mejorar la detección temprana de sucesos coronarios agudos, por ejemplo para mejorar la detección temprana del infarto de miocardio agudo

La presente invención se explica a continuación mediante el siguiente ejemplo.

25 Grilficos

Figura 1·

Cinética de remisión de la CARDIAC-proBNP al cabo de 6 minutos, 8 minutos y 12 minutos. La remisión [%] 30 esta representada en función de la concentración de proBNP [pg/ml] determinada mediante el ensayo de referencia Elecsys-proBNP.

Figura 2·

35 ComparaCión de métodos entre el de la presente invención con el uso de una tira de ensayo CARDIACproBNP y el ensayo Elecsys-proBNP

Ejemplos:

40 Se elaboraron graficos de calibración con el uso de una tira de ensayo CARDIAC-proBNP para 6, 8 Y 12 minutos de tiempo de reacción. Las respectivas cantidades de proBNP se determinaron por el método de referencia ElecsysproBNP (figura 1). De los gráficos de calibración se desprende que su pendiente disminuye al disminuir el tiempo de reacción. Como consecuencia, a concentraciones superiores a 3000 pg/ml aumenta el recorrido de la señal y por tanto la sensibilidad

45 Valorando los rangos de concentración de 60-2800 pg/ml después de 12 minutos y las concentraciones superiores a 2800 pgfml (correspondientes a valores de remisión determinados empíricamente o definidos) después de 8 minutos se obtiene una comparación de métodos entre el ensayo CARDIAC-proBNP empleado según la presente invención y el ensayo Elecsys-proBNP (figura 2)

50 Comparando las mediciones respecto al método de referencia Elecsys-proBNP, el ensayo CARDIAC-proBNP realizado con dos tiempos de reacción distintos según la presente invención tiene un rango de medición cuantitativo de 60 -aprox. 10000 pglml. Por consiguiente el límite superior de medición se ha incrementado más de tres veces en comparación con la valoración después de 12 minutos, cuyo límite superior de medición es de 3000 pglml

Claims

REIVINDICACIONES

Método de determinación cuantitativa de un analito en una muestra, que comprende

(a)

preparación de una sustancia específica del analito que al entrar en contacto con él es capaz de reaccionar con el mismo produciendo una señal detectable, de manera que para proporcionar la sustancia especifica del analito se usa una tira de ensayo;

(b)

elaboración de, al menos, dos gráficos de calibración obtenidos respectivamente por reacción de la misma sustancia especifica del analito con diferentes cantidades de un mismo analito, para unos tiempos de reacción prefijados respectivamente;

(c)

puesta en contacto de la sustancia especifica del analito con una muestra que contiene el anal ita buscado;

(d)

medición de la señal correspondiente a un primer tiempo de reacción prefijado, para el cual existe un primer gráfico de calibración según (b);

(e)

comprobación de que la señal medida en (d) permite una determinación cuantitativa del analito con una exactitud deseada, que para el analito buscado se logra cuando el gráfico de calibración considerado presenta la mayor pendiente de todas las curvas de calibración elaboradas respecto a la correspondiente cantidad del analito buscado;

(~

(i)

determinación cuantitativa del analito basada en la señal medida en (d) cuando se alcanza la exactitud deseada, de modo que para determinar cuantitativamente el analito, la señal medida según (d) se compara con el primer gráfico de calibración elaborado para el primer tiempo de reacción prefijado, o

(ii)

medición de la señal correspondiente a un segundo tiempo de reacción prefijado, para el cual existe un segundo gráfico de calibración según (b);

(g)

comprobación de que la señal medida en (f) (ii) permita una determinación cuantitativa del analito con una exactitud deseada, que para el analito buscado se logra cuando el gráfico de calibración considerado presenta la mayor pendiente de todas las curvas de calibración elaboradas respecto a la correspondiente cantidad del analito buscado; y

(h)

(i)

determinación cuantitativa del analito basada en la señal medida en (f) (ii) cuando se alcanza la exactitud deseada, de modo que para determinar cuantitativamente el analito, la señal medida según (f) (ii) se compara con el segundo grafico de calibración elaborado para el segundo tiempo de reacción prefijado, o

(ii)

continuación de la determinación para al menos otro tiempo de reacción prefijado correspondiente a (f) (ii), (g), (h)

(i)
2. Método de determinación cuantitativa de un analito en una muestra, que comprende

(a)

preparación de una sustancia específica del analito que al entrar en contacto con él es capaz de reaccionar con el mismo produciendo una señal detectable, de manera que para proporcionar la sustancia especifica del analito se usa una tira de ensayo;

(b)

elaboración de, al menos, dos gráficos de calibración obtenidos respectivamente por reacción de la misma sustancia especifica del analito con diferentes cantidades de un mismo analito, para unos tiempos de reacción prefijados respectivamente;

(c)

puesta en contacto de la sustancia especifica del analito con una muestra que contiene el anal ita buscado;

(d)

medición de una primera señal correspondiente a un primer tiempo de reacción prefijado, para el cual existe un primer gráfico de calibración según (b);

(e)

medición de una segunda señal correspondiente a un segundo tiempo de reacción prefijado, para el cual existe un segundo gráfico de calibración según (b);

(f)

medición opcional de otra señal;

(g)

comprobación de cuál de las señales medidas según (d), (e) o (f) permite determinar cuantitativamente el analito con suficiente exactitud, de modo que la exactitud deseada para el analito buscado se logra cuando el gráfico de calibración considerado presenta la mayor pendiente de todas las curvas de calibración elaboradas respecto a la correspondiente cantidad del analito buscado, y

(h)

determinación cuantitativa del analito basada en la señal que permite una exactitud suficiente, de modo que para determinar cuantitativamente el analito se compara esta señal con el gráfico de calibración elaborado para el tiempo de reacción correspondiente a dicha señal.

Método según la reivindicaciÓn 1 o 2, caracterizado porque la exactitud de la determinación cuantitativa del analito se comprueba mediante la pendiente de los gráficos de calibración.
4.

Método según la reivindicación 1 o 3, caracterizado porque el analito de ensayo y el analito objeto de la determinación cuantitativa son idénticos
5.

Método según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se elaboran dos o tres gráficos de calibración
6.

Método según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los limites del rango de medición del analito objeto de la determinación se amplían por un factor de 2 hasta 5, preferiblemente superior a tres.

7 Método según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se usa una muestra procedente de liquido corporal, preferiblemente una muestra de sangre, plasma, suero, saliva u orina
8. Método según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque simultáneamente con el analito objeto 5 de la determinación cuantitativa se determinan cualitativa yfo cuantitativamente otros analitos
9. Método según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el analito se elige entre ácidos nucleicos, lipidos, hidratos de carbono, proteinas, y en particular entre ADN, ARN, anticuerpos, antígenos, productos metabólicos, hormonas, Virus, microorganismos, células, marcadores cardioespecificos, marcadores neuro

10 hormonales, marcadores isquémicos y marcadores musculares especificos.
10. Método según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque al menos un marcador cardioespecífico se elige entre troponina r, mioglobina, dimero O y NT-proBNP.

15 11. Método según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la sustancia específica del analito se elige entre anticuerpos, receptores capaces de fijar el anal ita, antígenos, lectinas, ácidos nucleicos y análogos de ácidos nucleicos, de manera que la sustancia especifica del analito está preferiblemente acoplada a un reactivo de detección.

20 12. Método según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la reacción entre el analito y la sustancia especifica del analito es una reacción inmunológica
13. Método según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la determinación cuantitativa se

efectúa por medios ópticos, en particular por detección renectofotométrica o nuorimétrica o por electroquimio25 luminiscencia.

14 Método según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque está automatizado