CN101133074A - APOB的RNAi调节及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及调节载脂蛋白B表达的组合物和方法，尤其是涉及到利用化学修饰寡核苷酸而对载脂蛋白B的负调解作用。

Description

APOB的RNAi调节及其用途

技术领域

本发明涉及调节载脂蛋白B表达的组合物和方法，尤其是涉及到寡核苷酸例如化学修饰的寡核苷酸对载脂蛋白B的负调解作用。

背景技术

RNA干扰或“RNAi”一词最初是由Fire及其合作者在描述双链RNA(dsRNA)在被引入到线虫里时发现其能够阻遏基因表达而提出的(Fire et al.，Nature 391：806-811，1998)。短双链RNA在许多有机体包括脊椎动物体内引导基因特异性的转录后沉默，并为研究基因功能提供了一个新的工具。

脂蛋白由甘油酯和胆固醇酯构成，周围具有蛋白质、磷脂和胆固醇的双亲包被。脂蛋白的蛋白质成分众所周知为调节载脂蛋白，并且人类至少有九种调节载脂蛋白。调节载脂蛋白B(ApoB)发现于各类脂蛋白中：乳糜微粒、密度极低的脂蛋白(VLDL)、中密度脂蛋白(IDL)和低密度脂蛋白(LDL)。ApoB的功能为通过ApoB/E受体作为细胞结合和LDL颗粒的内陷的识别信号。含有载脂蛋白B的脂蛋白积聚和过多，会导致脂相关疾病的生成，如动脉粥样硬化。

研究降低ApoB的疗法对治疗脂相关疾病很有意义。一种以反义治疗的形式、以寡核苷酸为基础的治疗，已经显示能够降低小鼠体内ApoB水平，并且该治疗还能够减少血清胆固醇和甘油三酸酯的水平(U.S.公告号2003/0215943)。这些结果表明了一个适度的ApoB的负调解作用，以及作为治疗脂相关疾病的一个靶。本发明对现有技术的改进表现在提供了能够减少体内血清ApoB水平的IRNA试剂。

发明内容

本发明提供了能够减少受试者如哺乳动物(例如人)中载脂蛋白B(APoB)水平的组合物及其方法。所述方法包括对受试者施用能够使ApoB基因沉默的一种iRNA试剂。该iRNA试剂可以是在本文所描述的这样，或者是一种基于具有活性的序列之一的dsRNA，并且对哺乳动物ApoB基因如来自人或小鼠ApoB基因的相同区域定位。iRNA试剂包含每条链少于30个的寡核苷酸，例如21-23个核苷酸，构成、包括在此提供的试剂标号为1-74的试剂之一，或是来自在此提供的标号为1-74的试剂之一衍生物。这些优选的iRNA试剂含有对受试者所有非ApoB基因序列的四个或更多个的核苷酸错配。

本发明尤其是提供一种iRNA试剂，其包含一种有义链，该有义链具有至少15个有义链序列的连续的核苷酸，以及具有一种反义链，该反义链具有至少15个反义链序列的连续的核苷酸，这些序列为在此提供的试剂标号为1-74的iRNA试剂的序列，例如，1号试剂，有义链序列5’-cuuuacaagccuugguucagu-3’(SEQ.ID NO.153)，反义链序列5’-acugaaccaaggcuuguaaagug-3’(SEQ.ID NO.154)。

需要理解的是，在此提供的某些iRNA试剂包含特定的修饰核苷酸优选类型如54-74号试剂，同时试剂号为1-53的iRNA试剂则作为蓝图。它们是指包含这样的修饰，该修饰对本领域技术人员来说是明显的，且与试剂标号为1-53的iRNA试剂相当，如下面还要提到的，例如，2’-O-甲基修饰、碱基替代等，对于上述修饰，本领域技术人员不会认为这些试剂的特性会改变，尤其是不会改变两条链与它们的互补链在严格的条件下杂交的能力。

表1：靶向ApoB的示例性iRNA

SEQ.IDNo.	序列	SEQ.IDNo.	序列反义链	双链体描述符	试剂号
						153	cuuuacaagccuugguucagu	154	acugaaccaaggcuuguaaagua	AL-DUP 5097	1
155	ggaaucuuauauuugauccaa	156	uuggaucaaauauaagauucccu	AL-DUP 5098	2
						161	aagaagggaaucuuauauuug	162	caaauauaagauucccuucuauu	AL-DUP 5101	3
147	gccccaucacuuuacaagccu	148	aggcuuguaaagugauggggcug	AL-DUP 5094	4
						159	aaauagaagggaaucuuauau	160	auauaagauucccuucuauuuug	AL-DUP 5100	5
145	ucacauccuccaguggcugaa	146	uucagccacuggaggaugugagu	AL-DUP 5093	6
						49	agguguauggcuucaacccug	50	caggguugaagccauacaccucu	AL-DUP 5024	7
127	cugaacaucaagaggggcauc	128	gaugccccucuugauguucagga	AL-DUP 5084	8
						137	gaguuugugacaaauaugggc	138	gcccauauuugucacaaacucca	AL-DUP 5089	9
93	aucaagugucaucacacugaa	94	uucagugugaugacacuugauuu	AL-DUP 5046	10
						97	gucaucacacugaauaccaau	98	auugguauucagugugaugacac	AL-DUP 5048	11
95	ucaaguaucaucacacugaau	96	auucagugugaugacacuugauu	AL-DUP 5047	12
						99	cuguccauucaaaacuaccac	100	gugguaguuuugaauggacaggu	AL-DUP 5049	13
129	ugaacaucaagaggggcauca	130	ugaugccccucuugauguucagg	AL-DUP 5085	14
						135	agccccaucacuuuacaagcc	136	ggcuuguaaagugauggggcugg	AL-DUP 5088	15
131	guccagccccaucacuuuaca	132	uguaaagugauggggcuggacac	AL-DUP 5086	16
						27	gguguauggcuucaacccuga	28	ucaggguugaagccauacaccuc	AL-DUP 5013	17
107	gaccuguccauucaaaacuac	108	guaguuuugaauggacaggucaa	AL-DUP 5053	18
						143	auugggaagaagaggcagcuu	144	aagcugccucuucuucccaauua	AL-DUP 5092	19
123	uaacacuaagaaccagaagau	124	aucuucugguucuuaguguuagc	AL-DUP 5061	20
						57	gagguguauggcuucaacccu	58	aggguugaagccauacaccucuu	AL-DUP 5028	21
41	guguauggcuucaacccugag	42	cucaggguugaagccauacaccu	AL-DUP 5020	22
						157	gaagggaaucuuauauuugau	158	aucaaauauaagauucccuucua	AL-DUP 5099	23
59	uggcuucaacccugagggcaa	60	uugcccucaggguugaagccaua	AL-DUP 5029	24
						63	guauggcuucaacccugaggg	64	cccucaggguugaagccauacac	AL-DUP 5031	25
121	caagugucaucacacugaaua	122	uauucagugugaugacacuugau	AL-DUP 5060	26
						55	uaaaucaagugucaucacacu	56	agugugaugacacuugauuuaaa	AL-DUP 5027	27
39	gugacaaauaugggcaucauc	40	gaugaugcccauauuugucacaa	AL-DUP 5019	28
						71	caccaacuucuuccacgaguc	72	gacucguggaagaaguugguguu	AL-DUP 5033	29
73	gaugaacaccaacuucuucca	74	uggaagaaguugguguucaucug	AL-DUP 5036	30
						105	accuguccauucaaaacuacc	106	gguaguuuugaauggacagguca	AL-DUP 5052	31
61	gaacaccaacuucuuccacga	62	ucguggaagaaguugguguucau	AL-DUP 5030	32
						45	gauaccguguauggaaacugc	46	gcaguuuccauacacgguaucca	AL-DUP 5022	33
133	cagccccaucacuuuacaagc	134	gcuuguaaagugauggggcugga	AL-DUP 5087	34
						5	gauugauugaccuguccauuc	6	gaauggacaggucaaucaaucuu	AL-DUP 5002	35
77	agaugaacaccaacuucuucc	78	ggaagaaguugguguucaucugg	AL-DUP 5038	36
						1	aagccuugguucaguguggac	2	guccacacugaaccaaggcuugu	AL-DUP 5000	37
117	ucaucacacugaauaccaaug	118	cauugguauucagugugaugaca	AL-DUP 5058	38

SEQ.IDNo.	序列	SEQ.IDNo.	序列反义链	双链体描述符	试剂号
						3	ugaacaccaacuucuuccacg	4	cguggaagaaguugguguucauc	AL-DUP 5001	39
69	acaccaacuucuuccacgagu	70	acucguggaagaaguugguguuc	AL-DUP 5034	40
						25	ugauugaccuguccauucaaa	26	uuugaauggacaggucaaucaau	AL-DUP 5012	41
21	caaauggacucaucugcuaca	22	aguagcagaugaguccauuugga	AL-DUP 5010	42
						29	ucugugggauuccaucugcca	30	uggcagauggaaucccacagacu	AL-DUP 5014	43
109	caycacacygaayaccccugc	110	gcauugguauucagugugaugac	AL-DUP 5054	44
						23	gauugaccuguccauucaaaa	24	uuuugaauggacaggucaaucaa	AL-DUP 5011	45
33	acccuuugaucaguauauuaa	34	uuaauauacugaucaaauuguau	AL-DUP 5016	46
						83	acaagccuugguucagugugg	84	ccacacugaaccaaggcuuguaa	AL-DUP 5041	47
79	auuccaucugccaucucgaga	80	ucucgagauggcagauggaaucc	AL-DUP 5039	48
						43	uaccguguauggaaacugcuc	44	gagcaguuuccauacacgguauc	AL-DUP 5021	49
35	ggacucaucugcuacagcuua	36	uaagcuguagcagaugaguccau	AL-DUP 5017	50
						51	guuugugacaaauaugggcau	52	augcccauauuugucacaaacuc	AL-DUP 5025	51
65	auggcuucaacccugagggca	66	ugcccucaggguugaagccauac	AL-DUP 5032	52
						125	caauuugaucaguauauuaaa	126	uuuaauauacugaucaaauugua	AL-DUP 5062	53

^a参见图2对表示核苷酸的解释(例如，小写字母、黑体和斜体字母)。

如下面的实例3所示，表1中试剂号为1-53的iRNA试剂具有良好的和令人惊讶的减少存在于培养的人HepG2细胞中的ApoB mRNA量的能力，在HepG2细胞与这些iRNA试剂共同孵育后，与没有同iRNA试剂一起孵育的那些细胞相比，减少50％以上，并且/或减少分泌到细胞培养上清的ApoB蛋白质的量超过50％(参见表8)。

本发明还提供了一种iRNA试剂，其包含一个至少具有iRNA试剂有义序列的15个连续核苷酸的有义链，该试剂的试剂号为1-19，24-26，29，30和32-42，以及一个至少具有iRNA试剂反义序列15个连续核苷酸的反义链，该试剂的试剂号为1-19，24-26，29，30和32-42。如下面的实例3所示，表1中试剂号为1-19，24-26，29，30和32-42的iRNA试剂具有良好的和令人惊讶的减少存在于培养的人HepG2细胞中的ApoB mRNA量的能力，在HepG2细胞与这些iRNA试剂共同孵育后，与没有同iRNA试剂一起孵育的那些细胞相比，减少60％以上，并且/或减少分泌到细胞培养上清的ApoB蛋白质的量超过60％(参见表8)。

本发明还提供了一种iRNA试剂，其包含一个具有表1所提供的iRNA试剂有义序列中的至少15个连续核苷酸的有义链，该试剂的试剂号为1-12，15，17，24，29，30和32-35，以及一个具有表1所提供的iRNA试剂反义序列中的至少15个连续核苷酸的反义链，该试剂的试剂号为1-12，15，17，24，29，30和32-35。如下面的实例3所示，这些试剂具有良好的和令人惊讶的减少存在于培养的人HepG2细胞中的ApoB mRNA量的能力，在HepG2细胞与这些iRNA试剂共同孵育后，与没有同iRNA试剂一起孵育的那些细胞相比，减少70％以上，并且/或减少分泌到细胞培养上清的ApoB蛋白质的量超过70％(参见表8)  。

本发明还提供了一种iRNA试剂，其包含一个具有iRNA试剂有义序列中的至少15个连续核苷酸的有义链，该试剂的试剂号为1-5，7和11，以及一个具有iRNA试剂反义序列中的至少15个连续核苷酸的反义链，该试剂的试剂号1-5，7和11。如下面的实例3所示，这些试剂具有良好的和令人惊讶的减少存在于培养的人HepG2细胞中ApoBmRNA的量的能力，在HepG2细胞与这些iRNA试剂共同孵育后，与没有同iRNA试剂一起孵育的那些细胞相比，减少80％以上，并且/或减少分泌到细胞培养上清的ApoB蛋白质的量超过80％(参见表8)。

在一个尤其优选的实例中，iRNA试剂选白下面的iRNA试剂组：试剂号为54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73或74。

在另一项是实施例中，与那些没有同试剂共同孵育的人HepG2细胞相比，iRNA试剂减少存在于培养的人HepG2细胞中的ApoB mRNA的量超过50％，并且/或减少孵育的人HepG2分泌到细胞孵育上清的ApoB蛋白质的量超过50％，并且/或在50mg每kg体重或100mg每kg体重的施用后，减少存在于小鼠体内C57B1/6的小鼠肝细胞的apo-BmRNA的量至少达到20％。

本发明还提供iRNA试剂，其包含一条有义链和一条反义链，每一条链包括至少16，17或18个，如以下所限定的，与iRNA试剂序列之一基本相同的核苷酸，这些试剂的试剂号为1-74，除了那些每条链不超过1，2或3个核苷酸分别被其它的核苷酸(例如，腺苷被尿嘧啶替代)替代的链，其基本保留抑制ApoB在培养的人HepG2细胞中的表达的能力，如下面所限定。

在一项实施例中，iRNA试剂为至少15个核苷酸的长度，包括一条有义RNA链和一条反义RNA链，其中，反义RNA链为30个核苷酸或更短一些，iRNA试剂的双链区为15-30个核苷酸，优选为18-25个核苷酸对的长度。iRNA试剂还可以包括一个具有1-4，优选为2-3的未配对核苷酸的核苷酸单链突出端，并且未配对的核苷酸具有至少一个硫代磷酸酯二核苷酸的连接。核苷酸单链突出端可以为例如在iRNA试剂反义链的3’端。

在一项实施例中，iRNA试剂抑制人和小鼠ApoB在如人HepG2细胞和鼠NmuLi细胞中的表达。

在一项实施例中，如所描述，IRNA试剂可优选通过连接一个疏水结构例如含有胆固醇的结构而得到修饰，该连接优选为连接至iRNA试剂的有义链，更优选为连接至iRNA试剂有义链的3’端。

在另一项实施例中，如本文所描述，iRNA试剂优选被修饰来促进稳定性。优选的修饰包括引入硫代磷酸酯的连接和在2’位核糖单元的替代，例如，2’-脱氧，2’-脱氧-2’-氟，2’-氧-甲基，2’-氧-甲氧乙基(2’-O-MOE)，2’-氧-氨丙基(2’-O-AP)，2’-氧-二甲氨基乙基(2’-O-DMAOE)，2’-氧-二甲基氨丙基(2’-O-DMAP)，2’-氧-二甲基氧氨基乙基氧乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-氧-氮-甲基乙酰氨基(2’-O-NMA)替代。

优选地，这些2’-替代是针对iRNA试剂有义链上以及任选的反义链上的5’-UA-3’二核苷酸、5’-UG-3’二核苷酸，5’-CA-3’二核苷酸，5’-UU-3’二核苷酸或者5’-CC-3’二核苷酸的5’核苷酸，或者针对所有含嘧啶碱基的核苷酸。更优选的是出现于所有序列基序(sequence motif)5’-UA-3’、5’-CA-3’、5’-UU-3’和5’-UG-3’的5’端的大部分嘧啶是2’修饰的核苷酸。更优选地，所有出现于有义链的嘧啶为2’-修饰的核苷酸，并且出现于所有序列基序5’-UA-3’和5’-CA-3’中的5’端的大部分嘧啶。最优选地，所有位于有义链的嘧啶为2’-修饰的核苷酸，并且在反义链中，出现于所有序列基序5’-UA-3’、5’-CA-3’、5’-UU-3’和5’-UG-3’的5’端的大部分嘧啶是2’-修饰的核苷酸。

在另一项实施例中，如本文所描述，胆固醇结构(例如，位于有义链的3’端)、2’-修饰(例如，2’-氧-甲基或2’-脱氧-2’-氟修饰)和硫代磷酸酯(例如，位于有义链和反义链靠近3’端的一或两个核苷酸)存在于同一个iRNA试剂中。

在一项优选实施例中，施用一种iRNA试剂，例如一种在本文描述的试剂，用来治疗由于ApoB的表达而引起的受试者的疾患和病症。在另一项实施例中，施用iRNA试剂作为由ApoB介导的病症的预防性治疗。

一方面，本发明公开了制剂，包括基本上是纯的或药物上可接受的iRNA试剂的制剂，其调节例如抑制ApoB。该制剂可以包含靶向编码ApoB核苷酸的iRNA试剂和一种药物可接受的载体。在一项实施例中，iRNA试剂包含一条有义链，该有义链具有iRNA试剂有义链的至少15个连续的核苷酸，该试剂的试剂号为1-74，并且包含一条反义链，该反义链具有iRNA试剂反义链的至少15个连续的核苷酸，该试剂的试剂号为1-74。

另一方面，本发明提供了一种制备一种药物组合物的方法，包括：配制iRNA试剂的一条有义链，其具有至少15个iRNA试剂有义链的连续的核苷酸，该试剂的试剂号为1-74；配制一条反义链，其具有至少15个iRNA试剂反义链的连续的核苷酸，该试剂的试剂号为1-74；以及一种药物可接受的载体。

本发明的药物组合物可以一个足以减少ApoB信使RNA(mRNA)表达的量被施用。在一项实施例中，施用了足够量的iRNA试剂以减少ApoB蛋白质的表达(例如，减少了至少2％、4％、6％、10％、15％、20％或更多)。

本发明的药物组合物可以施用于受试者，其中，该受试者有患有如下疾病的风险或正在患有如下疾病，这些疾病的特征在于ApoB增加或不必要的ApoB的表达、胆固醇的增加或不需要的胆固醇的水平、脂介导的脉管病症和/或脂代谢紊乱。iRNA试剂可用于被诊断为患有疾病或有患该疾病风险的个体，以拖延疾病的发作或症状的出现。这些疾病包括HDL/LDL胆固醇失衡；异常脂血症，如家族性混合型高脂血症、获得性高脂血症；高胆固醇血症；抗斯达汀高胆固醇血症；冠状动脉疾病(CAD)；冠心病(CHD)；血栓症和动脉粥样硬化。在一项实施例中，靶向ApoB的iRNA被施用于患有抗斯达汀高胆固醇血症的受试者。

本发明的药物组合物还能够以足以减少血清LDL胆固醇和/或HDL胆固醇和/或总胆固醇水平的量施用于受试者。例如，iRNA以能够足以减少总胆固醇的量施用到受试者，使总胆固醇的水平减少了至少0.5％、1％、2.5％、5％、10％或更多。在一项实施例中，本发明的药物组合物以足以减少心肌梗塞发作的量施用于受试者。在一项优选实施例中，药物组合物被重复施用。

在一项实施例中，iRNA试剂可以被靶向到肝脏，在使用了ApoBiRNA试剂之后，肝脏中的ApoB的表达水平被降低。例如，iRNA试剂可以与能够靶向到肝脏的结构进行复合，例如一种抗体或配体，如与肝细胞上的受体结合的胆固醇。如以下的实例7G)所示，含有胆固醇结构的这种结合导致了siRNAs被肝组织有效的吸收，并且降低了ApoB mRNA在肝样品中的水平。这个结果表明这种与含有胆固醇结构的结合使iRNA试剂在体内靶向肝中的基因成为可能。

在一项实施例中，iRNA试剂能够被靶向到消化道，例如，靶向到肠如空肠，并且ApoB在消化道中的表达水平在施用ApoB iRNA试剂之后降低。意想不到的是，还发现结合到一个胆固醇结构上的iRNA试剂可以将IRNA试剂靶向到消化道。如下面的实例7G)所示，与含有胆固醇结构的结合导致肠组织对siRNA有效的吸收和将ApoB mRNA在肠组织样品里的水平降低。表明该修饰，例如与含有胆固醇结构的结合，使iRNA试剂在体内靶向到消化道组织的基因的使用成为可能。

在一项实施例中，iRNA试剂被修饰或是与一种运送试剂结合，如在本文所描述的运送试剂脂质体。在一项实施例中，该修饰介导与血清白蛋白(SA)的结合，例如，一种人血清白蛋白(HAS)，或是它的片段。

一种评估抑制ApoB-基因表达的iRNA试剂的方法，该方法包括：

a.提供一种iRNA试剂，其中，第一条链充分地与ApoB mRNA核苷酸序列互补，第二条链充分地与第一条链互补从而杂交到第一条链；

b.将iRNA试剂与含有ApoB基因的细胞接触；

c.将同iRNA试剂接触之前的细胞或未接触的对照细胞的ApoB基因表达与同iRNA试剂接触之后的细胞的APoB基因表达作一个对比；和

d.确定iRNA试剂是否对抑制ApoB基因表达起作用，其中，如果ApoB RNA在细胞中存在的量或细胞分泌的蛋白质的量少于细胞接触iRNA试剂之前的量，那么该iRNA是起作用的。

在一项实施例中，b.-d.步骤是在体外和非人类实验用动物体内进行。在另一项实施例中，该方法还包括确定iRNA试剂在激活外周血单核细胞刺激干扰素-α生成的活性。

本发明的方法和组合物，例如在本文所描述的治疗肝脏疾病和病症的方法和组合物，可以使用所描述的任一iRNA试剂。同时，本发明的方法和组合物可以治疗在本文所描述的任何一种疾病或病症，以及治疗任一受试者，如任何一种动物、任何一种哺乳类如任何一个人。

本发明的方法和组合物，例如治疗在本文所描述的脂代谢紊乱的方法和iRNA组合物，可以利用任何一种在本文所描述的剂量和/或配方，以及任何一种在本文所描述的施药途径。

本发明的一个或多个实施例的详情可用下面提供的附图来说明。本发明的其它特征、目的以及优势将通过本说明书、附图和权利要求书而得以充分的理解。该申请引入了所有具有相关目的的参考资料、专利和专利申请。

附图说明

图1为示意图，说明结合了胆固醇的RNA链的合成和结构。圆圈表示固相(可控孔径玻璃，CPG)。

图2表示细胞在经过增加siRNA和AL-DUP5024水平而治疗后的比例[ApoB mRNA]/[GAPDH对照mRNA]。在50％最大抑制作用(IC₅₀)处的抑制剂浓度的确定，通过曲线拟合来确定，同时利用计算机软件Xlfit的参数如下：单侧量效(Dose Response One Site)、4参数逻辑模型(4 Parameter Logistic Model)、

fit＝(A+((B-A)/(1+(((10^C)/x)^D))))，inv＝((10^C)/((((B-A)/(y-A))-1)^(1/D)))，res＝(y-fit)。

图3为聚丙烯酰胺凝胶板，表明小鼠血清核酸酶对下列siRNA复合物的降解：AL-DUP5024、AL-DUP5163、AL-DUP5164、AL-DUP5165、AL-DUP5166、AL-DUP5180和AL-DUP5181。siRNA复合物在小鼠血清中孵育0、1、3、6或24小时。标有“unb”的行代表未处理的对照。

图4为聚丙烯酰胺凝胶板，为聚丙烯酰胺凝胶板，表明小鼠血清核酸酶对siRNA复合物的降解：AL-DUP5167、AL-DUP5168、AL-DUP5048、AL-DUP5169、AL-DUP5170、AL-DUP5182和AL-DUP5183。siRNA复合物在小鼠血清中孵育0、1、3、6或24小时。标有“unb”的行代表未处理的对照。

图5A为培养的人HepG2细胞分泌到上清的ApoB蛋白质的量效图，培养的人HepG2细胞与含有100、33、11、3.7、1.2、0.4、0.14或0.05nM ApoB特异性的siRNA复合物AL-DUP5163介质一同孵育。该效应以经过ApoB特异性的siRNA复合物处理的细胞上清中ApoB蛋白质的浓度，与经过非特异性对照siRNA复合物(AL-DUP5129，菱形)处理或经过不含(AL-DUP HCV，方形)胆固醇结合物处理的细胞上清中ApoB浓度的比例来表示。

图5B为按照图5A描述的方法，ApoB蛋白质分泌的量效图。HepG2细胞与在图5A中描述的浓度范围内的siRNA复合物5164一同孵育。

图5C为按照图5A描述的方法，ApoB蛋白质分泌的量效图。HepG2细胞与在图5A中描述的浓度范围内的siRNA复合物5165一同孵育。

图5D为按照图5A描述的方法，ApoB蛋白质分泌的量效图。HepG2细胞与在图5A中描述的浓度范围内的siRNA复合物5166一同孵育。

图5E为按照图5A描述的方法，ApoB蛋白质分泌的量效图。HepG2细胞与在图5A中描述的浓度范围内的siRNA复合物5180一同孵育。

图5F为按照图5A描述的方法，ApoB蛋白质分泌的量效图。HepG2细胞与在图5A中描述的浓度范围内的siRNA复合物5181一同孵育。

图5G为按照图5A描述的方法，ApoB蛋白质分泌的量效图。HepG2细胞与在图5A中描述的浓度范围内的siRNA复合物5167一同孵育。

图5H为按照图5A描述的方法，ApoB蛋白质分泌的量效图。HepG2细胞与在图5A中描述的浓度范围内的siRNA复合物5168一同孵育。

图5I为按照图5A描述的方法，ApoB蛋白质分泌的量效图。HepG2细胞与在图5A中描述的浓度范围内的siRNA复合物5169一同孵育。

图5J为按照图5A描述的方法，ApoB蛋白质分泌的量效图。HepG2细胞与在图5A中描述的浓度范围内的siRNA复合物5170一同孵育。

图5K为按照图5A描述的方法，ApoB蛋白质分泌的量效图。HepG2细胞与在图5A中描述的浓度范围内的siRNA复合物5182一同孵育。

图5L为按照图5A描述的方法，ApoB蛋白质分泌的量效图。HepG2细胞与在图5A中描述的浓度范围内的siRNA复合物5183一同孵育。

图6A-D举例表示如下实例7，(H)，的实验结果。

图6A为用放射标记的且与siRNAs反义链互补的探针的S1-核酸酶保护测试。该测试用于检测收集的肝脏和空肠组织裂解物中的siRNA，这些裂解物来自注射了生理盐水(“-”)、AL-DUP5386(”A”)、AL-DUP5311(”B”)、AL-DUP5385(“C2“)和AL-DUP5167(”C1”)的动物。三种与胆固醇结合的siRNAs在肝脏和空肠中的比较水平上被检测到，但是未与胆固醇结合的siRNA AL-DUP5383在两种组织中仍然低于检测水平。用于内源miRNAs的S1-核酸酶保护测试作为空肠(miRNA 143，序列5’-UGAGAUGAAGCACUGUAGCUCA-3’，SEQ IDNO. 270)和肝脏(miRNA122，序列5’-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’，SEQ ID NO.269)的负载对照。

图6B显示分支DNA测定法测试检测经过siRNA处理之后，小鼠肝脏和空肠组织中的ApoB mRNA水平。组织裂解物用于定量检测ApoB和GAPDH mRNA以及计算ApoB和GAPDH mRNA的比例，并且用相对于生理盐水对照组的一组平均值来表达。棒代表组平均值，误差棒代表平均值的标准偏差。棒棒上方的*号表示与生理盐水对照组动物具有显著差异的组，p＜0.01。

图6C表示在经过siRNA处理之后所测定的血浆ApoB蛋白质水平的ELISA测试结果。利用抗小鼠ApoB-100的初级抗体LF3，测试来自每个动物体血浆样品的ApoB-100。ApoB蛋白质水平的组平均值用相对于生理盐水对照平均值来表示。棒代表组平均值，误差棒代表平均值的标准偏差。棒上方的*号表示与生理盐水对照组动物具有显著差异的组，p＜0.01。

图6D表示在经过siRNA处理之后总血浆ApoB蛋白质水平。用胆固醇测试试剂盒(Diasys)测定的总血浆胆固醇水平。棒代表组平均值，误差棒代表平均值的标准偏差。棒上方的*号表示与生理盐水对照组动物的具有显著差异的组，p＜0.01。

图7A为示意图，表示ApoB mRNA和连接到用于5’-RACE PCR的ApoB cDNA的连接物。该示意图显示对应的AL-DUP5167 siRNA和PCR引物的靶位，以及PCR反应产物的大小。

图7B为RACE-PCR扩增3的琼脂糖凝胶。该电泳分析显示了仅用ApoB特异性的AL-DUP5167处理的小鼠的肝脏和空肠的特定的剪切产物。凝胶上大写字母标记的泳道表示经过处理的组和对照组。该泳道的标记如下：A：PBS；B：AL-DUP5386；C：AL-DUP5167；D：AL-DUP5163；E：AL-DUP5385；F：AL-DUP5311；Fc：对照，仅使用来自C组cDNA的正向引物；RC：对照，仅使用来自C组cDNA的反向引物。

具体实施方式

为便于理解，术语“核苷酸”或“核糖核苷酸”在此有时是指RNA试剂的一或多个单体亚基。应该理解，如果是被修饰的RNA或核苷酸替代物，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”也指被修饰的核苷酸或者替代物置换结构(surrogate replacement moiety)，如同下面所述。

在此所使用的“RNA试剂”是未修饰的RNA、修饰的RNA或核苷替代物，它们在本文中均被描述。虽然描述了大量的修饰的RNAs和核苷替代物，但是优选实例是指那些与未修饰RNAs相比对核酸酶降解具有更大抵抗性的。优选的实例包括具有2’糖修饰、对单链突出端的修饰，优选的是3’单链突出端，或者尤其是如果为单链，则为包括一个或多个磷酸酸盐基团或一个或多个磷酸基团的类似物的5’修饰。

在此所使用的“iRNA试剂”(“干扰RNA试剂”的缩写)是指一种RNA试剂，其能够负调解作用靶基因的表达，如ApoB。不受理论的约束，iRNA试剂可以通过一个或多个机制而起作用，包括靶mRNA转录后剪切，有时在本领域指RNAi，或转录前或翻译前机制。iRNA试剂可以包括一个单链或多于一个链，例如双链(ds)RNA试剂。如果iRNA试剂为一个单链，那么尤其优选的是包括5’修饰，该修饰包括一个或多个磷酸酯基团或一个或多个磷酸酯基团的类似物。

在此所使用的“单链iRNA试剂”是指iRNA试剂由一个单个分子所组成。它可以包含双链区，由链内配对形成，如可以是或包括发夹或柄状结构。针对靶分子，单链iRNA试剂优选为反义。

在此所使用的“ds iRNA试剂”(“双链iRNA试剂”的缩写)是指iRNA试剂，其包括多于一条优选为两条链，其中链间杂交能够形成双链结构区域。

在哺乳类动物细胞中，虽然ds iRNA试剂能够诱导经常是有害的干扰反应，但是短的ds iRNA试剂不会启动这种干扰反应，至少不会使其达到对细胞和宿主有害的程度。本发明的iRNA试剂包括短到不会诱发哺乳动物细胞内干扰反应的分子。所以，将iRNA试剂(如在本文所描述的配方)组合物施用到哺乳类的细胞，可以用于沉默ApoB基因的表达从而避免干扰反应。那些短得不足以激动感染反应的分子在此被称为siRNA试剂或siRNAs。在此所使用的“siRNA试剂”或“siRNA”是指iRNA试剂，例如一种ds iRNA试剂或单链RNA试剂，其短到不足以诱导人细胞中有害的干扰反应，例如它有少于60但优选是少于50、40或30个核苷酸对的双链区。

另外，在一项实施例中，哺乳动物细胞经过一种破坏干扰反应成份的iRNA试剂的处理，例如dsRNA激活的蛋白质激酶PKR。

本文所描述的分离的iRNA试剂，其包括ds iRNA试剂和siRNA试剂，并能够介导ApoB基因的沉默，例如通过RNA降解。为方便起见，这种RNA在此也指被沉默的RNA。那么这种基因就是靶基因。优选是，被沉默的RNA为一种内源ApoB基因的基因产物。

如在此所使用，短句“介导RNAi”是指一种试剂以序列特异性方式，将靶基因沉默的能力。“使靶基因沉默”意为一种过程，由此细胞在没有接触试剂的时候，含有和/或分泌靶基因特定产物，而当与试剂接触后，与一种相似的未与试剂接触的细胞相比较，含有和/或分泌至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或少于90％这种基因产物。这种靶基因产物可以是例如信使RNA(mRNA)、一种蛋白质或一种调节元素。不受理论的束缚，可以认为由在本文所描述的试剂造成的沉默使用了RNAi机制或过程以及一种向导RNA，如具有15到30个核苷酸对的siRNA试剂。

如在此所使用的，术语“互补”是用于说明互补充分的程度，以便在本发明化合物和靶RNA分子如ApoB mRNA分子之间，形成稳定的和特性的结合。在特异性结合是必要的情况下，也就是说，在体内测试或治疗处理的生理条件下，或是在体外测试，测试被实施的条件下，特异性结合需要充分的互补以避免寡聚体化合物与非靶序列的非特异性结合。非靶序列一般至少有4个核苷酸是不相同的。

如在此所使用的，iRNA试剂是“充分地”与靶RNA“互补”，例如，靶mRNA(如靶ApoB mRNA)，如果iRNA试剂减少细胞中靶RNA编码的蛋白质产生的话。该iRNA试剂还可以”准确地”与靶RNA“互补”(不包括含有亚基(一个或多个)的SRMS)，如靶RNA和iRNA试剂退火，优选是在确切互补区用独有的Watson-Crick碱基配对，形成一个杂交体。“充分互补”iRNA试剂可以包含一个内在区域(如至少10个核苷酸)，该内在区域准确地与靶ApoB RNA互补。更进一步说，在一些实施例中，iRNA试剂特异性地辨别一个单个核苷酸的区别。在这种情形下，如果发现准确的互补在该区域(例如在7个核苷酸之内)有一个核苷酸的不同的话，iRNA试剂仅仅介导RNAi。优选的iRNA试剂基于或包含表1中所提供的有义和反义序列，或由表1中所提供的有义和反义序列组成。

如在本文所使用的，当指第一条核苷酸序列与第二条核苷酸序列相比较时，“基本相同”是除了最多一个、二个或三个核苷酸替代(例如，腺苷被尿嘧啶替代)之外，第一条核苷酸序列与第二条核苷酸序列相同。当指不同于表1所列的iRNA试剂之一，但通过核苷酸的缺失、添加或替代从表1所列的iRNA试剂之一而衍生的iRNA试剂时，“基本保留抑制ApoB在培养的人HepG2细胞中的表达的能力”，如在本文所使用，是指所述衍生的iRNA试剂具有比较低的抑制活性，与作为衍生物来源的表1中的iRNA试剂相比，低于不超过20％的抑制作用。例如，衍生于表1中iRNA试剂的一种iRNA试剂，该表中的iRNA试剂降低在培养的人HepG2细胞中ApoB mRNA的量到70％，而衍生的iRNA试剂降低在培养的人HepG2细胞中ApoB mRNA的量到50％，可以看作基本保留了抑制ApoB在培养的人HepG2细胞中表达的能力。可选的，本发明的iRNA试剂降低了ApoB mRNA在培养的人HepG2细胞中的量，或者是将分泌到细胞培养上清中的ApoB蛋白质量减少到至少50％。

在一项典型的实施例中，受试者为牛、马、小鼠、兔子、狗、猪、山羊或灵长类。在更优选的实施例中，受试者是人，例如，一名正常的个体或者是被诊断患有或预测患有疾病或有病症的个体。

因为在施用了iRNA试剂组合物之后，iRNA试剂介导沉默可以持续好几天，因而在多数情况下，可以将一天一次的施用组合物的频率降低，或在某些情况下，整个疗程仅一次给药。

与ApoB错误表达相关的病症

靶向ApoB的iRNA试剂，例如在本文所描述的iRNA试剂，可被用于治疗受试者，如患有或具有发展的疾病或病症风险的人，其中该疾病与病症与异常或不需要的ApoB基因表达相关，如ApoB的过表达。

例如，靶向ApoB mRNA的iRNA试剂可用于治疗一种脂相关疾病，例如高胆固醇血症，如伴有外周血病变的原发性高胆固醇血症。其它脂相关病症包括冠状动脉疾病(CAD)、心肌梗塞；HDL/LDL胆固醇失衡；异常脂血症(例如家族性混合型高脂血症(FCHL)和获得性高脂血症)；高胆固醇血症；抗斯达汀高胆固醇血症；冠心病(CHD)；血栓症和动脉粥样硬化。在一项实施例中，靶向ApoB mRNA的iRNA被施用于患有抗斯达汀病症，如抗斯达汀高胆固醇血症的受试者。该受试者当时正在接受斯达汀的治疗，或过去接受过斯达汀的治疗，或不适于接受斯达汀的治疗。

靶向ApoB mRNA的iRNA试剂可用于治疗携带ApoB基因或LDL受体的基因突变或多态性的人。例如，iRNA试剂可用来治疗被诊断为患有家族性载脂蛋白B-100缺陷症(FDB)的人，这是一种脂蛋白代谢显性遗传疾病，会导致高胆固醇血症和增加患CAD的倾向。由于缺陷性ApoB/E受体而削弱了的LDL颗粒的清除，血浆胆固醇水平在这类受试者中会显著提高。

iRNA试剂的设计和选择

以下的实例2解释了基于序列预测的基因步查用于评估81种潜在靶向人和小鼠ApoB mRNA的iRNA试剂。根据所提供的结果，表1列出了具有活性的iRNA试剂靶向ApoB。人们可以很方便地设计和产生出其它基于此的其它iRNA试剂，这些试剂包含在此所提供的具有活性的序列之一，或由在此所提供的具有活性的序列之一组成，以使活性序列的至少一部分被包含在iRNA试剂中。

以下实例2中所示的iRNA试剂由一条21个核苷酸长度的有义链和一条23个核苷酸长度的反义链构成。虽然，这些长度可能是潜在的比较理想的，并不是说iRNA试剂仅限于这些长度。本领域熟练的技术人员很清楚，较短或较长的iRNA试剂的效能是相似的，因为在某一个特定长度范围内，功效是指核苷酸序列的功能而不是指链的长度。例如，Yang，D.等在PNAS 2002，99：9942-9947中阐明了长度在21和30碱基对之间的iRNA试剂具有相似的功效。其它资料显示了碱基对长度减少到15个的iRNA试剂的有效的基因沉默(Byrom，W.M.等，InducingRNAi with siRNA Cocktails Generated by RNase III；Tech Notes 10(1)，Ambion，Inc.，Austin，TX，USA)。

所以，根据本发明从表1中提供的序列，选择长度在15到22的一部分核苷酸生成衍生自表1所列序列之一的iRNA试剂是可行和可以考虑的。或者说，可以向表1中所提供的序列之一添加一个或几个核苷酸，优选但不是必要的，以这样的方式加入的核苷酸分别与靶基因如ApoB的序列是互补的。所有这样衍生成的iRNA试剂都包括在本发明iRNA试剂的范围内，假设它们基本保留了抑制ApoB在培养的人HepG2细胞中表达的能力。

一般来说，本发明的iRNA试剂包括了一个与ApoB基因充分互补的区域，并且核苷酸的长度足够长，从而iRNA试剂或其一个片段可以介导ApoB基因的负调解作用。表1中iRNA试剂的反义链与小鼠(GenBank Accession number：XM_137955)的mRNA序列和人(GenBank Accession number：NM_000384)ApoB完全互补的，它们的有义链与反义链除了反义链上的两个3’端核苷酸外，完全互补。然而获得iRNA试剂与靶之间完全的互补不是必需的，但是该一致性必需充分得足以使iRNA试剂或其剪切产物进行序列特异性沉默，例如通过ApoB mRNA的RNAi剪切。

因此，如以下所述，本发明的iRNA试剂包括这样的试剂，其包括一条有义链和一条反义链，每一条链包括至少16、17或18个核苷酸序列，这些核苷酸基本与如下限定的表1中的序列之一基本相同，除了每条链上分别不超过1、2或3个核苷酸被其它核苷酸替代(如，腺苷被尿嘧啶置换)外，并且基本保留了抑制ApoB在培养的人HepG2细胞中的表达的能力。这些试剂因而具有至少15个核苷酸与表1中的序列之一相同，但是针对ApoB mRNA序列或在有义链和反义链之间有1、2或3个碱基错配被引入。对靶ApoB mRNA序列的错配，尤其是在反义链，终端是最耐受区域，并且如果出现错配，优选是在一个或多个终端区，如出现在5’和/或3’端的6、5、4或3个核苷酸之内，最优选是出现在有义链5’端或反义链3’端的6、5、4或3个核苷酸之内。有义链仅需要充分地与反义链互补以保持分子整体的双链特征。

iRNA试剂的反义链在长度上应该与14、15、16、17、18、19、25、29、40或50个核苷酸相同，或至少为14、15、16、17、18、19、25、29、40或50个核苷酸。其在长度上应该等于或小于60、50、40或30个长度的核苷酸。优选的范围是15-30、17-25、19-23和19-21个核苷酸的长度。

iRNA试剂的有义链在长度上应该等于或至少为14、15、16、17、18、19、25、29、40或50个核苷酸。其在长度上应该等于或小于60、50、40或30个核苷酸。优选的范围是15-30、17-25、19-23和19-21个核苷酸的长度。

iRNA试剂的双链部分在长度上应该等于或至少为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、29、40或50个核苷酸对。其在长度上应该等于或小于60、50、40或30个长度的核苷酸对。优选的范围是15-30、17-25、19-23和19-21个核苷酸对的长度。

优选是对有义链和反义链进行选择，使iRNA试剂在分子的一端或两端包含一个单链或未配对的区。如此，iRNA试剂就含有有义链和反义链，优选是配对地含有突出端，例如，在5’和3’两端或一端的突出端，但优选是3’端的2-3个核苷酸的突出端。大多数实施例具有3’端的突出端。优选的siRNA试剂具有1-4个单链突出端，优选为3’端的突出端，或每一端为优选为2或3个核苷酸的长度。突出端可以由于一条链长于另一条而形成，或者是由两条相同长度的链交错形成。5’端优选为被磷酸化。

双链区的优选的长度在15和30之间，最优选的为18、19、20、21、22和23个核苷酸的长度，例如以上所述的siRNA试剂的范围。siRNA试剂可以在长度和结构上与天然的Dicer处理的来自长的dsRNAs的产物相同。在实施例中，siRNA试剂的两条链相连，例如包括共价连接。能产生所需双链区和优选为3’端突出端的发夹或其它单链结构，都在本发明范围内。

以下的讨论多数是针对单链分子。在本发明的很多实施例中，需要或优选ds iRNA试剂，例如一种部分地ds iRNA试剂。所以，应该理解的是，由以下所描述的单链结构组成的双链结构(例如两条分开的分子相接触形成双链区或双链区是通过链内分子配对(例如发夹结构)形成的)属于本发明的范围之内。优选的长度在其它各处都有描述。

候选iRNA试剂的评估

候选iRNA试剂负调解靶基因表达的能力可以被评估。例如，提供一种候选iRNA试剂，使其与一种表达靶基因如ApoB基因的细胞如HepG2细胞相接触，该基因或者是内源性的或者是用一种能够表达ApoB表达的构造而被转染。靶基因在接触候选iRNA试剂之前和之后的表达水平可以进行比较，例如，在mRNA或蛋白质水平上的比较。如果确定靶基因的RNA或蛋白质表达的量在接触了iRNA试剂之后变低，则说明iRNA试剂负调解了靶基因的表达。靶ApoB RNA或ApoB蛋白质在细胞内的水平可以用任何所需方法来确定。例如，靶RNA的水平可以用RNA印迹法、逆转录-聚合酶链反应或核糖核酸酶保护分析进行测定。蛋白质水平可以通过例如蛋白质印迹法来测定。

稳定性测试、修饰和iRNA试剂的重测试

可以评估候选iRNA试剂的稳定性，例如，当例如把iRNA试剂引入进受试者身体时，它对核酸内切酶和核酸外切酶剪切的易感性。多种方法可以用来确定对修饰尤其是对剪切的易感性的位点，例如用受试者体内一种成分的剪切。

如果对剪切易感的位点被确定，还可对iRNA试剂进行设计和/或合成，其中，潜在的剪切位点被制成对剪切有耐性，例如引入在剪切位点2’的修饰，如2’-氧-甲基基团。该被修饰了的iRNA试剂可被重新测试其稳定性，并且这个过程可以反复进行，直到iRNA试剂表现出所需的稳定性。

体内测试

iRNA试剂被确认具有抑制ApoB基因表达的能力，可以利用动物模型(例如，哺乳类如小鼠或兔子)进行体内的功能性测试。例如，iRNA试剂施用到某个动物，然后根据它的生物分布、稳定性和它的抑制ApoB基因表达的能力进行评估。

iRNA试剂可以直接施用到靶组织，例如通过注射的方式，或者iRNA试剂以与施用到人同样的方式施用到动物模型。

还可以评估iRNA试剂的细胞内分布。该评估可以包括确定iRNA试剂是否被细胞所利用。该评估还可以包括确定iRNA试剂的稳定性(例如半衰期)。iRNA试剂的体内评估还可以通过将iRNA试剂连接到一种示踪性的标记物(例如一种荧光标记，如荧光素；同位素放射性标记，如³⁵S、³²P、³³P或³H；金颗粒；或者用于免疫组织化学的抗原颗粒)。

可用于监测生物分布的iRNA试剂，能够在体内缺少使基因沉默的活性。例如，iRNA试剂能靶向不存在于动物体内的基因(例如注射进小鼠体内的iRNA试剂可以靶向荧光素酶)，或者是iRNA试剂具有不能靶向任何基因(例如内源性基因)的无义序列。该iRNA的定位/生物分布能够被检测到，例如通过连接到iRNA试剂的示踪性标记，如以上所述的那些示踪剂。

还可以对iRNA试剂负调解ApoB基因表达的能力进行评估。可以测定到体内ApoB基因表达的水平，例如通过原位杂交，或者是通过暴露于iRNA试剂之前和之后RNA与组织的分离作用。当为获得该组织而需要处死动物时，另外未经过处理的对照动物用于比较。靶ApoBmRNA可以通过任何所需方法被检测到，包括但不局限于RT-PCR、RNA印迹法、分支DNA测定法测试或核糖核酸酶保护分析。或者，ApoB基因表达还可以通过实施蛋白质印迹分析对经过iRNA试剂处理的组织提取物进行检测。

iRNA化学

在本文所描述的为分离的iRNA试剂，例如RNA分子(双链；单链)，其能够介导RNAi抑制ApoB的表达。

在此所讨论的RNA试剂包括未修饰的RNA以及为提高功效而修饰的RNA，和核苷替代物的多聚体。未修饰RNA是指一种分子，其中核酸、所说的糖、碱基和磷酸酯结构成份与天然的成份一样或基本相同，优选为人体内的天然成份。现有技术将稀有的或不寻常但是天然发生的RNAs看作是修饰的RNAs，参见Limbach等，(1994)NucleicAcids Res.22：2183-2196。这样的稀有或不寻常的修饰的RNAs通常被称为修饰的RNAs(很显然是因为它们是转录后修饰的结果)，并在本文属于未修饰的RNA。在本文所使用的修饰的RNA是指一种分子，其中核酸的组分，即糖、碱基和磷酸酯结构的一或多个成份，与天然的成份不一样，优选为不同于产生自人体的天然成份。虽然它们被称为修饰的“RNAs”，但由于修饰作用，它们当然包含不是RNAs的分子。核苷替代物是这样一些分子，其中核糖磷酸酯主链被非核糖磷酸酯构造所替代，该构造使碱基处于正确的空间关系，以便杂交与所见到的与核糖磷酸酯主链的杂交基本相似，例如，非带电的核糖磷酸酯主链的类似物。以上所述的实例都在此讨论。

在本文所述的修饰可以并入到任何双链RNA和在本文所描述的RNA样分子如iRNA试剂中。可能需要对iRNA试剂的反义链和有义链的一条链或两条链进行修饰。由于核酸是亚基或单体的多聚体，许多如下所述的修饰发生于可以在核酸内重复的部位，例如碱基或磷酸酯结构，或磷酸酯结构的非连接氧的修饰。在某些情况下，该修饰会在核酸的所有涉及部位发生，但事实上在大多数情况下，并不是这样。作为实例，修饰可以仅发生于3’或5’末端，也可以仅发生于末端区域，例如在链的末端核苷酸或最后2、3、4、5或10个核苷酸的部位。修饰可发生于双链区、单链区或二者都有。例如，在非结合氧部位的硫代磷酸酯修饰仅在一个末端或两个末端发生，也可以在末端区域发生，例如在链的末端核苷酸或最后2、3、4、5或10个核苷酸的部位，或是发生于双链和单链区，尤其是在两个末端。类似地，修饰可以发生在有义链、反义链或两者都有。在某些情况下，有义链和反义链具有相同修饰或者同类修饰，但是在其它情形下，有义链和反义链具有不同的修饰，例如，在某些情况下，仅对一条链进行修饰，例如有义链。

对iRNA试剂进行修饰的两个主要目的是获得它们对生物环境降解的稳定性以及改进药理学性质，例如药效性质，这一点下面还将进行阐述。其它的对iRNA试剂的糖、碱基或骨架的适当的修饰在共有PCT申请No.PCT/US2004/01193中有所描述，该申请于2004年1月16日递交。iRNA试剂可以包含非天然存在的碱基，如在2004年4月16日提交的共有PCT申请No.PCT/US2004/011822中所描述的。iRNA试剂可以包含非天然存在的糖，如非碳水化合物环形载体分子。用于iRNA试剂的非天然存在的糖的典型特性，在共有PCT申请No.PCT/US2004/011829中有所描述，该申请于2003年4月16日递交。

iRNA试剂可以包括核苷酸之间的键(例如手性硫代磷酸酯键)，用于增加核酸酶抗性。iRNA试剂此外还可包含，或者可选择地包含，核糖类似物以增加核酸酶抗性。典型的用于增加核酸酶抗性的核苷酸间的键和核糖类似物在共有PCT申请No.PCT/US2004/07070中有所描述，该申请于2004年3月8日递交。

iRNA试剂可以包括用于寡核苷酸合成的与配体结合的单体亚基和单体。典型的单体在共有美国申请No.10/916,185中有所描述，该申请于2004年8月10日递交。

iRNA试剂可以具有ZXY结构，如在共有PCT申请No.PCT/US2004/07070中有所描述，该申请于2004年3月8日递交。

iRNA试剂可以与双亲结构结合。用于iRNA试剂典型的双亲结构在共有PCT申请No.PCT/US2004/07070中有所描述，该申请于2004年3月8日递交。

iRNA试剂的有义和反义序列可以是回文序列。回文iRNA试剂的典型特征在共有PCT申请No.PCT/US2004/07070中有所描述，该申请于2004年3月8日递交。

在另一项实施例中，iRNA试剂可以与输送试剂复合，使其特征为模块复合物(modular complex)。所述复合物可以包含载体试剂，该载体试剂连接到下述(a)、(b)和(c)中的一个或多个(优选是两个或多个，更优选是三个)：(a).凝聚剂(例如一种试剂，其可以通过离子或静电相互作用，具有吸引诸如结合核酸的能力)；(b).融合剂(例如一种能够融合和/或通过细胞膜被输送的试剂)；和(c).靶向基团，例如细胞或组织靶向试剂，诸如凝集素、糖蛋白、脂或蛋白质，例如一种能够结合到某一特定细胞类型的抗体。iRNA试剂与输送试剂的复合在共有PCT申请No.PCT/US2004/07070中有所描述，该申请于2004年3月8日递交。

iRNA试剂可以具有非规范的配对，比如在iRNA双链分子的有义序列和反义序列之间。非规范配对的iRNA试剂的典型特征在共有PCT申请No.PCT/US2004/07070中有所描述，该申请于2004年3月8日递交。

增强的核酸酶抗性

iRNA试剂，如靶向ApoB的iRNA试剂，对核酸酶具有增强的抗性。增加抗性的一个途径是确定剪切位点和将这些位点进行修饰以抑制剪切。例如，二核苷酸5’-UA-3’、5’-UG-3’、5’-CA-3’、5’-UU-3’或5’-CC-3’作为剪切点已经在审理中的共有申请U.S.60/574,744和共有PCT申请PCT/US2005/018931中有所描述。

为增加核酸酶抗性和/或增加与靶结合的亲和性，iRNA试剂，如具有有义链和/或反义链的iRNA试剂，可以包括诸如2’修饰的核糖单元和/或硫代磷酸酯键。例如，2’羟基基团(OH)可以被许多不同的“含氧”或“脱氧”取代基修饰或取代。

2’羟基基团的“含氧”修饰的实例包括烷氧基或芳氧基(OR，例如R＝H，烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂OR；“锁”核酸(LNA)，其中2’羟基通过诸如亚甲基桥连接到相同核糖的4’碳；O-AMINE(AMINE＝NH₂；烷基胺、二烷基胺、杂环基胺、芳基胺、二芳基胺、杂芳基胺或二杂芳基胺、乙二胺、多胺)和氨基烷氧基，O(CH₂)_nAMINE，(例如，AMINE＝NH₂；烷基胺、二烷基胺、杂环基胺、芳基胺、二芳基胺、杂芳基胺或二杂芳基胺、乙二胺、多胺)。值得注意的是，仅含有甲氧基乙基(MOE)(OCH₂CH₂OCH₃，PEG的衍生物)的寡核苷酸，与那些用强硫代磷酸酯修饰修饰的寡核苷酸相比，表现出相当的核酸酶稳定性。

“脱氧”修饰包括氢(即尤其针对部分ds RNA突出端部分的脱氧核糖)；卤素(例如氟)；氨基(如NH₂；烷基胺、二烷基胺、杂环基胺、芳基胺、二芳基胺、杂芳基胺、二杂芳基胺或氨基酸)；NH(CH₂CH₂NH)_nCH₂CH₂-AMINE(AMINE＝NH₂；烷基胺、二烷基胺、杂环基胺、芳基胺、二芳基胺、杂芳基胺，或二杂芳基胺)，-NHC(O)R(R＝烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)，氰基；巯基；烷基-硫代-烷基；硫代烷氧基；和烷基、环烷基、芳基、烯基、炔基，它们可以被诸如氨基官能团所取代。优选的取代基是2’-甲氧基乙基、2’-OCH₃、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基和2’-氟。

为最大化核酸酶抗性，2’-修饰可以与一个或多个磷酸键修饰(例如硫代磷酸酯)联合使用。“嵌合”寡核苷酸是指含有两个或多个不同修饰的寡核苷酸。

在某些实施例中，iRNA试剂的所有嘧啶都进行2’修饰，因而iRNA试剂促进了对核酸内切酶的抗性。核酸抗性也可通过5’修饰而得到促进，导致诸如至少一个5’-尿苷-腺嘌呤-3’(5’-UA-3’)二核苷酸，其中尿苷是2’-修饰的核苷酸；至少一个5’-尿苷-鸟嘌呤-3’(5’-UG-3’)二核苷酸，其中5’-尿苷是2’-修饰的核苷酸；至少一个5’-胞苷-腺嘌呤-3’(5’-CA-3’)二核苷酸，其中5’-胞苷是2’-修饰的核苷酸；至少一个5’-尿苷-尿苷-3’(5’-UU-3’)二核苷酸，其中5’-尿苷是2’-修饰的核苷酸；或者至少一个5’-胞苷-胞苷-3’(5’-CC-3’)二核苷酸，其中5’-胞苷是2’-修饰的核苷酸。iRNA试剂可以包括至少2个、至少3个、至少4个或至少5个这种二核苷酸。优选的是，出现于所有序列基序5’-UA-3’、5’-CA-3’、5’-UU-3’和5’-UG-3’的最5’端的嘧啶是2’修饰的核苷酸。更优选的是，所有出现于有义链的嘧啶为2’-修饰的核苷酸，并且是出现于所有基序列5’-UA-3’和5’-CA-3’的最5’端的嘧啶。最优选的是，所有位于有义链的嘧啶为2’-修饰的核苷酸，并且在反义链中出现于所有序列基序5’-UA-3’、5’-CA-3’、5’-UU-3’和5’-UG-3’的最5’端的嘧啶是2’-修饰的核苷酸。本发明人指出当使获得的理想稳定性所需的修饰总数最小化时，后一种修饰显示出核苷修饰在整个分子的抗核酸酶降解的稳定性中的贡献最大化，  参见审理中的共同申请的PCT申请PCT/US2005/018931中，在此作为参考。

寡核苷酸主链中包含的呋喃糖也可以降低核酸内切。iRNA试剂可以通过含有3’阳离子的基团进行进一步修饰，或是通过3’-3’键在3’末端将核苷反转(inverting)进行修饰。在另一种选择中，3’末端可以被氨基烷基封闭，例如3’C5-氨基烷基dT。其它的3’结合物能够抑制3’-5’核酸外切。不受理论的约束，3’结合物如甲氧萘丙酸和异丁苯丙酸，能够通过空间位阻阻止核酸外切酶结合到寡核苷酸的3’端而抑制核酸外切。甚至小的烷基链、芳香基团或者杂环结合物或修饰的糖(D-核糖、脱氧核糖、葡萄糖等)也能够阻滞3’-5’核酸外切酶。

相似地，5’结合物能够抑制5’-3’核酸外切。不受理论的约束，  5’结合物诸如甲氧萘丙酸或异丁苯丙酸，可以通过空间位阻阻止核酸外切酶结合到寡核苷酸的5’端而抑制核酸外切。甚至小的烷基链、芳香基团或者杂环结合物或修饰的糖(D-核糖、脱氧核糖、葡萄糖等)能够阻滞3’-5’核酸外切酶。

当双链iRNA试剂包括位于至少一端的单链核苷酸突出端时，该iRNA试剂具有增加的核酸酶抗性。在优选实施例中，核酸突出端包含1到4个，优选是2到3个的未配对核苷酸。在一项优选实施例中，直接与端部核苷酸对相邻的单链突出端未配对的核苷酸，包含有一个嘌呤碱基，而且端部核苷酸对是G-C对，或者最后四个互补核苷酸对中的至少两个为G-C对。进一步地，在有些实施例中，核苷酸突出端可以含有1个或2个未配对的核苷酸，并且在典型实施例中，核苷酸突出端为5’-GC-3’。在一项优选实施例中，iRNA试剂包括位于反义链3’端的基序5’-CGC-3’，从而形成2-nt突出端5’-GC-3’。

所以，iRNA试剂可以包含单体，该单体已经被修饰以抑制降解，例如抑制来自受试者体内的核酸酶如核酸内切酶或核酸外切酶的降解。这些单体在本文是指NRMs，即核酸酶抗性促进单体(NucleaseResistance promoting Monomers)或修饰物。在很多情形下，这些修饰也会调节iRNA试剂的其它特性，例如，与蛋白质相互作用的能力，如转移蛋白诸如血清白蛋白，或者RISC的成员，或者第一和第二序列互相形成双链或与其它序列如靶分子形成双链的能力。

不受理论的约束，认为iRNA试剂中的糖、碱基和/或磷酸酯主链的修饰能够提高核酸内切酶和核酸外切酶的抗性，并且能够促进与转移蛋白质和一个或多个RISC复合物的功能性成分的相互作用。优选的修饰是指增进了对核酸外切酶和核酸内切酶的抗性，从而在与RISC复合物相互作用之前延长iRNA试剂的半衰期，但同时不降低iRNA试剂作为靶向mRNA酶切导向试剂的活性。并且，不受理论的约束，相信将修饰定位于在或靠近反义链的3’和/或5’端，使iRNA试剂满足以上所述的优选的核酸酶抗性的标准。并且，仍旧不受理论的约束，相信将修饰定位在例如有义链的中部会使iRNA试剂显示出脱靶效应的可能性相对小。

用于产生满足于如上所述的优选核酸酶抗性标准的iRNA试剂的修饰，可以包含一个或多个的如下糖、碱基和/或磷酸酯主链的化学的和/或立体化学修饰。

(i)手性(Sp)硫代物。所以，优选的NRMs包括核苷酸二聚体，该核苷酸二聚体富含或全部都是特定手性形式的修饰的磷酸酯基，该修饰的磷酸酯基含有在非桥部位的杂原子，如在X位点的Sp或Rp，该位点一般被氧所占据。在X处的原子也可以是S、Se、Nr₂或Br₃。当X为S时，优选富含或全部都是手性(手性纯)Sp键。富含意为至少70％、80％、90％、95％或99％的优选形式。这种NRMs在下面将有更详细的描述；

(ii)一个或多个阳离子基团与糖、碱基和/或磷酸酯或修饰的磷酸酯主链结构的磷原子的结合。因此，优选的NRMs包括在末端衍生阳离子基团的单体。由于反义序列5’端应该具有端基-OH或磷酸酯基，该NRM优选不在反义序列的5’端使用。该基团应该在碱基上对H键形成和杂交的干扰最小的位点结合，例如，远离与另一条链的互补碱基相互作用的面，如5’位的嘧啶或7位的嘌呤。这些内容将在下面要详细讨论；

(iii)末端的非磷酸键。所以，优选的NRMs包括非磷酸键，如4个碳原子的键，其比磷酸键对酶切具有更大的抗性。实例包括3’CH₂-NCH₃-O-CH₂-5’和3’CH₂-NH-(O＝)-CH₂-5’；

(iv)3’-桥连硫代磷酸酯和5’-桥连硫代磷酸酯。所以，优选的NRMs包括这些结构；

(v)L-RNA、2’-5’键、反向键、a-核苷。所以，其它优选的NRMs包括：L核苷和来自L-核苷的二聚核苷酸；2’-5’磷酸酯键、非磷酸酯键和修饰的磷酸酯键(例如，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和硼磷酸酯(boronophosphate))；具有反向键的二聚体，例如3’-3’或5’-5’键；具有在糖1’位的α键的单体，例如在本文所描述的具有α键的结构；

(vi)结合基团。所以，优选的NRMs可以包含例如在本文所描述的例如通过糖、碱基或主链与单体结合的靶向结构或结合配体。

(vii)脱碱基键。所以，优选的NRMsk可以包含脱碱基单体，如在本文所描述的脱碱基单体(例如，无碱基单体)；如在本文所描述的芳香族单体或杂环单体或多杂环芳香族单体；和

(viii)5’-膦酸酯和5’-磷酸酯前药。所以NRMs包括单体，优选在末端位点，例如5’位，其中一个或多个磷酸酯基团原子用保护基团进行衍生，该一个或多个保护基团由于受试者体内的某种成分的作用而被去除，例如受试者体内的羧酸酯酶或某种酶。例如，一种磷酸酯前药，其中羧酸酯酶裂解受保护的分子，导致硫代阴离子的产生，该硫代阴离子攻击与磷酸酯的氧相邻的碳并导致脱保护的磷酸酯的产生。

一个或更多个不同的NRM修饰可以引入到iRNA试剂或iRNA试剂的序列中。可在一条序列或iRNA试剂中使用一次以上的NRM修饰。由于某些NRMs干扰杂交，所以其使用总数量应能保持可接受水平的iRNA试剂双链体的形成。

在某些实施例中，NRM修饰被引入到一条序列的端部酶切位点或酶切区域(有义链或序列)，其不会靶向受试者体内所需的序列或基因。如此，可以减少脱靶沉默(off-target silencing)。

核酸酶抗性修饰包括一些可以只在末端或其它任何可行的部位的修饰。一般来说，修饰能够抑制杂交，所以优选是仅在末端区域利用它们，并且优选是不在序列的酶切位点或酶切区域使用它们，所述序列靶向受试者的序列或基因。如果在iRNA试剂两条序列之间保持有充分的杂交，则它们可以用于有义序列的任何一个部位。在某些实施例中，需要将NRM置于序列的酶切位点或酶切区域，该序列不靶向受试者的序列或基因，因为它能够最小化脱靶沉默。

另外，在本文所描述的iRNA试剂可以具有一个突出端，该突出端不会与iRNA试剂的其它序列形成双链结构——它是一个突出端，但除了iRNA试剂的其它序列之外，其既与自身也与另一条核苷酸杂交。

在大多数情形下，核酸酶抗性促进修饰会随着序列是否靶向受试者的序列(通常是指反义序列)或不靶向受试者的序列(通常是指有义序列)而有所不同。如果序列靶向受试者序列，那么干扰或抑制核酸内切酶酶切的修饰就不插入受RISC介导的酶切区域，例如，酶切位点或酶切区域(参见Elbashir等，2001年，Genes and Dev.15：188)。该靶点的酶切大约位于20或21nt的向导RNA的中部，或者是第一条核苷酸上游的10或11个核苷酸的中间，该第一条核苷酸与向导核苷酸互补。如在此所述，酶切位点是指位于剪切位点任意一侧的核苷酸，在靶点上或在与之杂交的iRNA试剂链上。酶切区域是指任一方向上具有酶切位点的1、2或3个核苷酸的核苷酸。

这种修饰可以被引入到末端区域，例如，一条序列末端或距末端2、3、4或5个核苷酸的位置，该序列靶向或不靶向受试者的序列。

栓系配体

iRNA试剂的特性包括它的药理学特性，可以受到配体如栓系配体引入的影响和调整。

很多种实体物质如配体，能够被束缚到iRNA试剂上，例如，到结合配体的单体亚基的载体上。实例在下面有关结合配体的单体亚基的内容中有所描述，但只是优选部分，实体物质可在其它位点处与iRNA试剂结合。

优选结构是配体，它们能够通过介入束缚而直接或间接地连接到载体，优选是共价地连接。在优选实施例中，所述配体是通过介入束缚而结合到载体上的。当结合配体的单体被并入正在生长的链时，所述配体或束缚的配体可以出现在结合配体的单体上。在某些实施例中，在结合“前体”配体的单体亚基已经被并入生长中的链之后，该配体能够并入到结合“前体”配体的单体亚基中。例如，一个单体具有诸如氨基末端的束缚，如TAP(CH₂)_nNH₂，可以被并入进一个生长中的有义链或反义链。在之后的步骤中，即在前体单体亚基被并入链之后，具有亲电基团如五氟苯酯或醛基的配体，可通过将配体的亲电基团连接到结合前体配体的单体亚基束缚的末端亲核基团，从而连接到结合前体配体的单体上。

在优选实施例中，配体改变了与其结合的iRNA试剂的分布、靶向或寿命。在优选实施例中，与缺乏配体的种类相比较，配体增强了所选择的靶的亲和力，所选择的靶例如为分子、细胞或细胞类别和诸如细胞或器官腔隙的腔隙、组织、器官或身体的某个区域。

优选的配体能够促进运输、杂交和特异性的特性，并能够促进所获天然的或修饰的寡核糖核苷酸的核酸酶抗性，或者促进含有任一在本文所描述的单体和/或天然或修饰的核糖核苷酸的结合体的多聚体分子的核酸酶抗性。

一般来说，配体包括治疗性修饰物，如利于增进吸收；例如用于监测分布的诊断化合物或报告基团(reporter group)；交联剂；赋予核酸酶抗性的结构；和天然或不寻常的核苷碱基(nucleobase)。普通的实例包括亲脂类、脂类、类固醇(如，uvaol，hecigenin，diosgenin)、萜类(例如三萜，诸如萨洒皂草配基、Friedelin、衍生自表木栓醇的石胆酸)、维生素(例如叶酸、维生素A、生物素、维生素B6)、碳水化合物、蛋白质、蛋白质结合试剂、整合蛋白靶向分子、聚阳离子、肽、多胺和拟肽。

配体可包括自然生成的物质，(如人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)，或球蛋白)；碳水化合物(如右旋糖苷、普鲁兰多糖、几丁质、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸)；氨基酸，或脂类。配体还可以是重组体或合成分子，如合成聚合物，例如合成的聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括氨基酸为聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、poly(L-lactide-co-glycolied)copolymer、联乙烯醚-马来酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚膦嗪。多胺类的实例包括：聚氮丙啶(polyethylenimine)、聚赖氨酸、亚精胺、精胺、多胺、伪肽-多胺、拟肽多胺、树状聚合物多胺、精氨酸、脒、精蛋白、阳离子结构，例如，阳离子脂质、阳离子卟啉、多胺季铵盐或α螺旋肽。

配体还可以包括靶向基团，例如，细胞或组织靶向试剂，如凝集素、糖蛋白、脂或蛋白质，例如结合到某一个特定的细胞如肝细胞或空肠细胞的抗体。靶向基团可以为促甲状腺素、促黑细胞激素、凝集素、糖蛋白、表面活性剂蛋白A、粘液素碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、多价甘露糖、多价海藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、铁传递蛋白、二膦酸酯、聚谷氨酸酯、聚天冬氨酸酯、脂、胆固醇、类固醇、胆酸、叶酸、维生素B12、生物素、或RGD肽或RGD拟肽。

其它配体的实例包括染料、嵌入剂(如吖啶)、交联剂(如补骨脂灵、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、德卟啉、Sapphyrin)、多环芳香烃(如吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(如EDTA)、亲脂性分子，如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾丸激素(dihydrotestosterone)、甘油(如其酯及其醚，例如C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆、C₁₇、C₁₈、C₁₉或C₂₀烷基；例如，1，3-二-O(十六烷基)甘油、1，3-二-O(十八烷基)甘油)、geranyloxyhexyl、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)，以及肽结合物(如antennapedia肽、Tat肽)、烷基化试剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]₂、多胺、烷基、取代的烷基、放射性同位素标记物、酶、半抗原(例如生物素)、运输/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成的核糖核酸酶(例如咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑结合物、四氮杂大环的Eu3+复合物)、二硝基苯基、HRP或AP。

配体可以是蛋白质，如糖蛋白或肽，如针对共配体(co-ligand)具有特定亲和力的分子；或抗体，其能结合到特定细胞如癌细胞、内皮细胞或骨细胞上。配体还可以包括激素或激素受体。它们还包括非肽类，如脂、凝集素、碳水化合物、维生素、辅助因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、多价甘露糖、或多价海藻糖。配体可以为例如脂多糖，一种p38MAP激活剂或是NF-κB激活剂。

配体可以是一种物质，例如一种药，它能够通过破坏细胞的细胞骨架，如破坏细胞的微管、微丝和/或中间纤维来增强iRNA试剂被吸收进入细胞。所述药可以为例如taxon、长春新碱、长春碱、细胞松弛素、噻氨酯哒唑、japlakinolide、latrunculin A、羟基毒肽、swinholide A、indanocine或myoservin。

所述配体能够通过激活诸如炎性反应来增强细胞对iRNA试剂的吸收。示例性配体应具有这样的功效，包括肿瘤坏死因子α(TNFalpha)、白细胞介素-1β或γ干扰素。

一方面，所述配体为脂或脂类分子。这种脂或脂类分子优选为能够结合一种血清蛋白，例如，人血清白蛋白(HSA)。一种HSA结合配体可以使这种结合物分布到靶组织上，如肝组织，包括肝的实质细胞。其它能够结合HAS的分子也可用作配体，例如neproxin或阿司匹林。脂或脂类配体能够(a)增强对这种结合物降解的抗性，(b)促进靶向或运输到靶细胞或细胞膜，和/或(c)能够用于调节与血清蛋白的结合，例如HSA。

脂类配体可用于调节，如控制所述结合物与靶组织的结合。例如，与HSA结合的脂或脂类配体更加不太可能靶向到肾脏，因而被排出体外的可能性很小。与HSA结合的脂或脂类配体很少被用于将结合物靶向到肾脏。

在一项优选实施例中，脂类配体结合HSA。优选地，它有足够的亲和力与HSA结合，从而该结合物将优选地分配到非肾脏组织。但优选地，该亲和力并不会太强以致这种HSA-配体的结合不能逆转。

另一方面，所述配体是一种结构，如一种维生素，它被靶细胞如增生性细胞吸收。这些特性尤其对治疗不需要的细胞增生性病症有益，例如，恶性或非恶性类型细胞如癌细胞。示例的维生素包括维生素A、E和K。其它的实例维生素包括维生素B，例如叶酸、B12、核黄素、生物素、维生素B6或其它被癌细胞吸收的维生素或营养。还包括HSA和低密度脂蛋白(LDL)。

另一方面，所述配体为细胞渗透试剂，优选为螺旋状细胞渗透试剂。优选地，该试剂为两性分子。示例的试剂是一种肽，诸如tat或antennopedia。如果所述试剂是一种肽，它可以是被修饰的肽，其包括拟肽、逆转体(invertomers)、非肽或伪肽的键，以及D-氨基酸的应用。螺旋状试剂优选为α-螺旋试剂，其具有亲脂和疏脂相。

可以使用靶向增生细胞内富含的标记物的肽。例如，含有RGD的肽和拟肽能够靶向癌细胞，尤其是表达α_vβ₃整合蛋白的细胞。所以可以使用RGD肽、含有RGD的环肽、包括D-氨基酸的RGD肽，以及合成的RGD模拟物。除了RGD之外，还可以使用其它靶向α_vβ₃整合蛋白配体的结构。一般来说，这样的配体能够用来控制增殖细胞和血管生成。这种类型的优选结合物包括能靶向PECAM-1、VEGF或其它癌基因，如在本文所描述的癌基因的iRNA试剂。

与糖如半乳糖和/或其类似物结合的靶向试剂尤其有用。这些试剂尤其是靶向肝脏的实质细胞。例如靶向结构可以包含超过一个优选为2个或3个的半乳糖结构，相互之间的间隔大约为15埃左右。靶向结构也可以是乳糖(例如三个乳糖结构)，其由葡萄糖与半乳糖结合而成。靶向结构还可以为N-乙酰基-半乳糖胺和N-乙酰-葡糖胺。甘露糖或甘露糖-6-磷酸酯靶向结构可用于靶向巨噬细胞。

所述配体可以为肽或拟肽。拟肽(在此也指寡拟肽)是一种能够折叠成与天然肽类似的所限定的三维结构的分子。肽和拟肽与iRNA试剂的结合通过如增强细胞识别和吸收，而影响iRNA药代动力学的分布。肽或拟肽结构大约为5-50个氨基酸的长度，例如大约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸的长度。

iRNA结合物

iRNA试剂可以通过诸如共价结合而与第二种试剂结合。例如，用于治疗一种特定疾病如脂类紊乱的iRNA试剂，能够与除了iRNA试剂的第二种治疗试剂结合。所述第二种治疗试剂可为治疗同一种病症的试剂。

5’-磷酸酯修饰

在优选实施例中，iRNA试剂为5’磷酰化或包括5’起始端磷酰基类似物。反义链5’-磷酸酯修饰包括那些与RISC介导的基因沉默相容的修饰。适合的修饰包括：5’-单磷酸酯((HO)₂(O)P-O-5’)；5’-二磷酸酯((HO)₂(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-三磷酸酯((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-鸟苷帽(7-甲基化或非甲基化)(7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’；5’-腺苷帽(Appp)，和任一修饰的或未修饰的核苷酸帽结构(N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-单硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)2(S)P-O-5’)；5’-单二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5’)，5’-硫代磷酸酯(HO)2(O)P-S-5’)；如下任一其它的组合，氧/硫取代的单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯(如5’-α-硫代三磷酸酯、5’-γ-硫代三磷酸酯，等)、5’-氨基磷酸酯((HO)2(O)P-NH-5’，(HO)(NH2)(O)P-O-5’)，5’-烷基磷酸酯(R＝烷基＝甲基、乙基、异丙基、丙基等，例如RP(OH)(O)-O-5’，(OH)2(O)P-5’-CH2-)，5’-烷基醚膦酸酯(R＝烷基醚＝甲氧基甲基(MeOCH2-)，乙氧基甲基等，例如RP(OH)(O)-O-5’-)。

有义链被修饰以使有义链失活和防止活性RISC的形成，从而减少可能的脱靶效应。可以通过用于阻止有义链5’-磷酰化的修饰来完成，例如通过5’-O-甲基核糖核苷酸修饰(参见Nyknen等，(2001)ATPrequirements and small interfering RNA structure in the RNA interferencepathway.Cell 107，309-321)。其它阻止磷酰化作用的修饰都可以使用，例如，用H而不是O-Me来替代5’-OH。或者，将大体积的基团加到5’-磷酸酯，使其成为磷酸二酯键。

iRNA试剂到组织和细胞的运输

靶向肝脏

靶向ApoB的iRNA试剂可以通过例如将iRNA试剂与亲脂性结构如脂、油酰基、视黄基或胆固醇基结合等的结合作用使iRNA试剂被靶向到肝脏。优选为与胆固醇结合。其它能够与诸如iRNA试剂结合的亲脂性结构，包括胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、双氢睾酮、1，3-双-O(十六烷基)甘油、geranyloxyhexyl基团、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪。或者，iRNA试剂可以通过例如将iRNA试剂结合到低密度脂蛋白(LDL)，例如乳糖化的LDL等的结合被靶向到肝脏，或iRNA试剂可以通过例如将iRNA试剂结合到具有糖残基的多聚体载体复合物上等的结合被靶向到肝脏。

iRNA试剂可以通过如结合作用被靶向到肝脏，如将iRNA试剂与脂质体结合，该脂质体与糖残基复合。与例如半乳糖和/或其类似物的糖结合的靶向试剂是尤其有用的。这些试剂尤其靶向肝脏的实质细胞。优选地，靶向结构包括多于一个半乳糖结构，更优选为两个或三个。再优选地，靶向结构包括三个半乳糖结构，例如相互之间相隔大约15埃。靶向结构可以是乳糖，乳糖为葡萄糖与半乳糖的结合。优选地，靶向结构包括三个乳糖。靶向结构还可以为N-乙酰基-半乳糖胺和N-乙酰基-葡萄糖胺。甘露糖或甘露糖-6-磷酸酯靶向结构可用于靶向巨噬细胞。

iRNA试剂还可以通过与低密度脂蛋白(LDL)例如乳糖化的LDL结合而被靶向到肝脏。与糖残基复合的聚合载体也具有将iRNA试剂靶向到肝脏的功能。

靶向试剂可以经共价或非共价直接连接到iRNA试剂，或连接到另一种运送或配方形式，如脂质体。例如，具有或不具有靶向结构的iRNA试剂能够与一种具有或不具有靶向结构的运送形式相结合，例如脂质体。

靶向ApoB的iRNA试剂能够被靶向到肝脏，例如通过结合的方式，如将iRNA试剂结合到血清白蛋白(SA)分子，例如，人血清白蛋白(HSA)分子或其片段。iRNA试剂或其组合物对SA例如HSA具有亲和力，在SA如HSA存在的情况下，该亲和力水平在肝脏中足够高，达到至少为10％、20％、30％、50％或100％，或者外源性SA的加入将增加对肝脏的输送。通过例如测试在加入或缺乏外援小鼠或人SA情况下的分布，可以对这些指标进行测定。

SA，如HSA，和靶向试剂可以通过诸如共价或非共价直接连接到iRNS试剂或到另一种运送或配方形式，例如脂质体。例如，具有或不具有靶向结构的iRNA试剂能够与一种具有或不具有靶向结构的运送形式相结合，例如脂质体。

iRNA试剂运送进细胞

不受任何理论的约束，结合胆固醇的iRNA试剂和某些脂蛋白成分(如胆固醇、胆固醇酯、磷脂)之间的化学相似性会导致血液中iRNA试剂与脂蛋白(如LDL、HDL)的结合，和/或者导致iRNA试剂与对胆固醇，如胆固醇运输途径中的成分具有亲和力的细胞成分的相互作用。脂蛋白以及它们的组成成分通过各种主动或被动运输机制被细胞吸收或加工，不受限制地，例如LDL-受体结合的LDL的内吞作用、氧化的或其它修饰的LDL的内吞作用，该LDL的修饰通过与Scavenger受体A的相互作用、Scavenger受体B1-介导的HDL胆固醇在肝脏的吸收，和胞饮作用或经过诸如ABC-A1、ABC-G1或ABC-G4的ABC(ATP结合性盒型)转运蛋白的胆固醇跨膜运输。所以，结合胆固醇的iRNA有利于具有这些运输机制的细胞如肝细胞对对它的吸收。如此，本发明提供了证据和通用的方法将iRNA试剂靶向到表达特定细胞表面成分如受体的细胞，其是通过将所述成分(如胆固醇)的天然配体结合到iRNA试剂，或通过将一种化学结构(如胆固醇)结合到结合有所述成分(例如LDL、HDL)的天然配体的iRNA试剂。

其它实施例

一种RNA，如iRNA试剂，能够在体内细胞产生，例如通过将外源DNA模板运送入细胞。例如，DNA模板能被插入到载体作为基因治疗载体。基因治疗载体可以通过静脉注射、局部给药(U.S.专利No.5,328,470)或立体定向注射(参见Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：3054-3057，1994)被输送到某个受试者。基因治疗载体的药物制备包括可以接受的稀释剂中的基因治疗载体或包含一种缓释基质，基因输送载体被被埋入该缓释基质中。例如，DNA模板包含两个转录单位，一个产生包括iRNA试剂上链(top strand)的转录物，另一个产生包括iRNA试剂下链(bottom strand)的转录物。当模板被转录时，iRNA试剂生成并且被加工进siRNA试剂片段中，该片段介导基因沉默。

生理效应

通过iRNA试剂与人和非人类的动物序列的互补性，将在本文所描述的iRNA试剂设计成使测定治疗毒性更容易完成。用这些方法，iRNA试剂可以由一条与人的核酸序列完全互补的序列和来自至少一种非人类动物如非人类哺乳类诸如啮齿动物、反刍动物或灵长类的核酸序列组成。例如，非人类哺乳动物可以是小鼠、大鼠、狗、猪、山羊、绵羊、牛、猴子、倭黑猩猩、黑猩猩、猕猴或食蟹猴。iRNA试剂序列能够与同源基因范围内的序列互补，例如，非人类哺乳动物和人的致癌基因或肿瘤抑制基因。通过测定iRNA试剂在非人类哺乳动物的毒性，可以推断出iRNA试剂在人体内的毒性。对更严格的毒性测试，iRNA试剂能够与人和多于一种如二、三种或更多种非人类动物互补。

在本文所描述的方法能够被用来与iRNA试剂作用于人的任何一种生理效应相关联，例如任何不需要的功效，如毒性作用，或任何有益的或需要的效果。

iRNA的生产

iRNA试剂可以用各种方法进行批量生产。典型的方法包括：有机合成和RNA酶切，例如进行体外酶切。

有机合成iRNA试剂可以通过分别合成双链RNA分子的每一条链制备向成。然后使构成链(component strands)退火。

大的生物反应器如OligoPilot II from Pharmacia Biotec AB(UppsalaSweden)可用于生产大量的用于既定iRNA的特定RNA链。OligoPilot II反应器仅用过量1.5摩尔的亚磷酰胺核苷酸就能有效地结合核苷酸。要制备RNA链，可以使用核糖核苷酸酰胺(amidites)。单体加成的标准循环可用于合成iRNA寡聚核苷酸链。一般来说，两条互补链分别合成然后退火，例如，从固体支撑物释放和脱保护之后。

有机合成可用于生产不连续的iRNA种类。对ApoB基因的互补的类型可以被精确地规定。例如，该种类与某个区域互补，该区域包含多态性，例如单核苷酸多态性。同时，多态性的部位可以被准确地确定。在某些实施例中，该多态性位于内部区域，例如单个或两个末端的至少4、5、7或9核苷酸。

dsRNA酶切iRNA可以通过酶切一个比较大的ds iRNA来制备。该酶切可以体外或体内被介导。例如，体外酶切生产iRNA可以通过以下的方法进行：

体外转录：dsRNA通过从两个方向转录核酸(DNA)片段而生成。例如，HiScribe^TM RNAi转录试剂盒(New England Biolabs)提供从核酸片段生产dsRNA的载体和方法，，该片段通过T7启动子在任意一侧的某一部位被克隆进载体。产生了用于T7转录dsRNA两条互补链的单独模板。通过加入T7RNA聚合酶，模板进行体外转录，从而生成dsRNA。使用PCR和/或其它的RNA聚合酶(例如，T3或SP6聚合酶)的类似的方法也都可以使用。在一项实施例中，用该方法产生的RNA经过仔细的纯化去除会污染重组酶制品的内毒素。

体外酶切：dsRNA经体外切割成iRNAs，例如使用Dicer或相容的RNAse III-based活性。例如，将dsRNA在果蝇的体外提取物中孵育，或者利用纯化的组分如纯化的RNAse或RISC复合物。参见Ketting等，Genes Dev 2001 Oct 15；15(20)：2654-9以及Hammond的Science 2001Aug 10；293(5532)：1146-50。

dsRNA切割通常产生多个iRNA种类，每一种为源dsRNA分子(source dsRNA molecule)的某个特定的21到23nt片段。例如，可能存在包含与源dsRNA分子的重叠区域和相邻区域互补的序列的iRNAs。

不管合成方法如何，iRNA制备可在适于形成配方的溶液(例如，水溶液和/或有机溶液)中进行。例如，iRNA制备物被沉淀并重新溶解于纯双重蒸馏水中，然后被冻干。然后经干燥的iRNA重悬于适于进行配方加工的溶液中。

修饰的和核苷酸替代品iRNA试剂的合成在下面进行探讨。

配制

在本文所描述的iRNA试剂可以配制成可用于受试者。

为了便于理解，这一章节的配方、组合物和方法主要针对未修饰的iRNA试剂进行讨论。但需要明白的是，这些配方、组合物和方法也可以与其它iRNA试剂一同作用，如修饰的iRNA试剂，并且这种使用属于本发明的范围。

所配制的iRNA组合物可以设定为多种状态。在一些实例中，所述组合物至少为部分晶体、全部晶体，和/或无水(例如，少于80％、50％、30％、20％，或10％的水)。在其它实例中，iRNA为含水状态，例如在含水的溶液中。

水相或晶体组合物能够与诸如运输载体如脂质体(尤其针对水相)或颗粒(如适于晶体组合物的微粒)结合。一般情况下，iRNA组合物以这样的方式配制成，即与所施用的方法相容的方式。

在特定的实施例中，所述组合物用以下至少一个方法制备：喷雾干燥、冻干法、真空干燥、蒸发、流化床干燥，或这些技术的组合；或者使用脂的超声处理、冷冻干燥、冷凝和其它的组合方式。

iRNA可以与其它的试剂结合配制而成，例如，另一种治疗性试剂或稳定iRNA的试剂，如与iRNA复合形成iRNP的蛋白质。其它的试剂还包括螯合剂如EDTA(例如为了去除二价阳离子如Mg²⁺)、盐、RANse抑制剂(例如广谱RNAse抑制剂诸如RNAsin)，等等。

在一项实施例中，iRNA制剂包括另一种iRNA试剂，例如能够介导针对第二基因或者同一基因RNAi的第二iRNA试剂。其它制剂还包括至少三个、五个、十个、二十、五十或一百或更多个不同的iRNA种类。这样的iRNAs能够针对相似数量的不同基因介导RNAi。

在一项实施例中，iRNA制剂包含至少一种第二种治疗性试剂(如一种试剂，其不是RNA或DNA)。

在某些实施例中，iRNA试剂，如双链iRNA试剂或siRNA试剂(例如，一种前体，如一种较大的能被加工成siRNA试剂的iRNA试剂，或者是一种编码iRNA试剂如双链iRNA试剂或siRNA试剂或其前体的DNA)，被配制成靶向特定的细胞。例如，包含iRNA的脂质体或颗粒或其它结构也可以包含一种靶向结构，该结构能够识别靶细胞上的特异性分子。靶向结构可以包括抗靶细胞表面蛋白质的抗体，或者是针对靶细胞表面某个分子的配体或配体的受体结合部分。

在一项实施例中，所述靶向结构与脂质体结合。例如，美国专利6,245,427公开了一种利用蛋白质或肽靶向脂质体的方法。在另一项实施例中，脂质体中阳离子的脂组分衍生为具有靶向作用的结构。例如，WO96/37194描述了转换戊二酰基二油酰基磷脂酰基乙醇胺(N-glutaryldioleoylphosphatidyl ethanolamine)成为N-羟基丁二酰亚胺激活的酯。该产物然后连接到RGD肽。其它的靶向方法在本发明仍有描述。

治疗方法和输送途径

包含iRNA试剂如靶向ApoB的iRNA试剂的组合物，可以通过很多途径输送到受试者。典型的途径包括鞘内、薄壁组织、静脉、鼻部、口腔和眼部的输送。iRNA试剂可以结合进适于施药的药物组合物。例如，组合物可以包含一种或多种iRNA试剂和药物可接受的载体。在此所述的“药物可接受的载体”包括与药物施用相容的任何一种或所有的溶剂、扩散媒介、涂覆物、抗细菌和抗真菌试剂、等渗和吸收延迟试剂等。这种针对具有药物活性物质的载体和试剂的用途在本领域是已知的。除非任何现有技术的载体或试剂与活性化合物不相容，其在组合物中的使用是可以预期的。添加的活性化合物也可以结合进组合物。

本发明的药物组合物可以根据是否为局部治疗或系统治疗以及根据所需治疗的区域，以各种方式来给药。给药可以是局部的(包括眼部、鼻内部、皮肤)、口腔或肠外给药。肠外给药包括静脉内滴注、皮下、腹膜内或肌内注射，或鞘内或心室内给药。

输送途径依据病人的症状而定。

一般来说，iRNA试剂可以以任何一种适合的方法给药。如在此所述，局部输送是指直接将iRNA试剂施用到身体的任何一个表面，包括眼、粘液膜、体腔表面，或任何的内表面。局部施药制品包括皮肤贴剂、药膏、洗液、乳液、胶、滴剂、喷雾以及液体。传统的药学载体、水溶液、粉剂或油剂、增稠剂等也都是必需或所需的。局部用药还可以作为一种途径，选择性地将iRNA试剂输送到病人的表皮、真皮，或它们的特异性的层，或基底组织。

用于鞘内或心室给药的组合物包括无菌水溶液，其含有缓冲液、稀释剂和其它适合的添加剂。

用于肠外给药的配制品包括无菌水溶液，其含有缓冲液、稀释剂和其它适合的添加剂。心室内注射可以通过例如连接到一种储器的心室导管来进行。对心室内注射，需要控制溶质的浓度以保证制剂的等渗。

iRNA试剂还可以经肺部输送被施用到病人身上。肺部输送组合物可以被病人吸入并被扩散，使该组合物，优选为iRNA，在扩散过程中能够到达肺，在此，组合物通过肺泡吸收直接进入血液循环。肺部输送能够有效地通过系统输送和局部输送来治疗肺部疾病。

肺部输送可以通过不同的途径来获得，包括使用喷雾、烟雾、毛细管和干粉剂型。输送可以通过使用液体喷雾器、烟雾吸入器和干粉扩散器来完成。优选为定量吸入器。使用喷雾器或吸入器的优点之一是可以将潜在的污染降到最低，因为这些设备是自含式的。以干粉扩散器来说，输送药物已经被配制成干粉。iRNA组合物自身可以稳定地贮存为冻干或喷雾干燥粉或者与适合的粉载体组合。在用烟雾给药治疗时，用于吸入的组合物的输送可以通过剂量定时设备来完成，该设备包括定时器、剂量器、时间测量器或时间显示器，当该显示器与所述设备结合在一起时，可以测量剂量、疗程监测，和/或诱导至病人的剂量。

iRNA试剂被修饰使其能够通过血脑屏障。例如，将iRNA试剂与一种可以使该试剂穿过屏障的分子结合。这种修饰的iRNA试剂可以通过任何一种所需的方法进行给药，如通过心室注射或肌内注射或通过肺部输送。

iRNA试剂可以经眼部给药，来治疗视网膜疾病如视网膜病变。例如，该药物组合物可以被施用到眼表面或附近的组织，例如眼睑的内面。它们还可以局部施用，如通过喷雾、滴注象眼药水一样，或者眼药膏。药膏或滴液可以通过本领域所熟知的眼部输送系统被输送，如敷药器或眼滴管。这种组合物包括mucomimetics如透明质酸、硫酸软骨素、羟丙基甲基纤维素或聚(乙烯醇)、防腐剂如山梨酸、EDTA或benzylchronium chloride，以及普通量的稀释剂和/或载体。药物组合物还可以被施用到眼内部，并且用针或其它能够将该药物组合物引入到所选择部位或结构的输送装置进行输送。含有iRNA试剂的组合物还可以通过眼贴剂被施用。

iRNA试剂经口腔或鼻输送被施用。例如，经过这些膜施用的药物的药力可以很快地发作，从而提供了治疗血浆水平，避免肝代谢的首过效应，以及避免将药物暴露于不利的胃肠(GI)环境中。其余的优点还包括容易接近膜部位，使药物能被施用、局域化并且易清除。

药物施用可以由受试者或其它人提供，如护理人员。护理人员指参与提高人类健康的单位，如医院、收容所、医生办公室、门诊；保健工作者如医生、护士或其它从医人员；或是配偶或监护人如父母。以一定剂量或输送定量药剂的分配器的形式提供药物治疗。

还可以监测受试者以观察疾病症状的改进或稳定。

术语“治疗有效量”是指存在于组合物中用于提供接受治疗的受试者体内所需药物水平的量，以期产生所希望的生理反应。

术语“生理有效量”是指输送到受试者以产生所期望的缓和效果或医疗效果的量。

术语“药物可接受载体”是指能够进入肺而对肺没有明显的不利的毒物学效果的载体。

适于作载体的药物赋形剂的类别包括稳定剂如人血清白蛋白(HSA)、填充剂如碳水化合物、氨基酸和多肽；pH调节剂或缓冲液；盐如氯化钠；等等。这些载体是晶体形式或无定形的形式或是二者的混合。

尤其有价值的填充剂包括相容碳水化合物、多肽、氨基酸或其组合物。适合的碳水化合物包括单糖如半乳糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖如乳糖、海藻糖等；环糊精如2-羟基丙基-β-环糊精；和多糖如棉子糖、麦芽糊精、右旋糖苷等；醛醇如甘露醇、木糖醇等。碳水化合物的优选基团包括乳糖、海藻糖、棉子糖麦芽糊精和甘露醇。适合的多肽包括天冬酰苯丙氨酸甲酯。氨基酸包括丙氨酸和甘氨酸，优选为甘氨酸。

适合的pH调节剂或缓冲液包括从有机酸和碱如柠檬酸钠、抗坏血酸钠等制备的有机盐；优选为柠檬酸钠。

在一项实施例中，包含iRNA组合物的单位剂量或测定的剂量由输入的装置来分配。该装置包括一个监测受试者体内参数的感应器。例如，该装置可以包括一个泵如渗透泵和，可选择地，连接电极。

iRNA试剂可以包裹在病毒天然的外壳中或包裹在用化学或酶解方法产生的人工外壳中或衍生自它们的结构中。

剂量：iRNA试剂以每kg体重少于大约75mg的单位剂量给药，或少于大约70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.0005mg，以及少于200nmole的RNA试剂(例如，大约4.4×1016copies)按每kg体重，或少于1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075、0.00015nmole的RNA试剂每kg体重。单位剂量可以通过诸如注射(例如静脉或肌肉、鞘内或直接注射进器官)、吸入或局部施用来给药。

iRNA试剂直接输送到器官(例如直接到肝脏)以每个器官从大约0.00001mg到3mg的顺序输送药剂，或者优选为每个器官大约0.0001-0.001mg，大约每个器官0.03-3.0mg，大约每个眼睛0.1-3.0mg或者大约每个器官0.3-3.0mg。

药剂的施用剂量以能有效地治疗或防止疾病或病症的发展和发生为准。

在一项实施例中，单位剂量的施用频率少于一天一次，例如少于每2、4、8或30天一次。在另一项实施例中，单位剂量不是以一定的频率(例如不规则的频率)进行给药。例如单位剂量只给药一次。

在一项实施例中，有效剂量是与其它传统的治疗方式一同给药。

在一项实施例中，受试者先以起始剂量给药，然后是iRNA试剂的维持剂量或更多剂量，如双链iRNA试剂、siRNA试剂，(例如前体，如一种大的能够被加工成siRNA试剂的iRNA试剂，或者是编码iRNA试剂诸如双链iRNA试剂或siRNA试剂的DNA或其前体)。该维持剂量一般来说低于起始剂量，例如少于起始剂量的一半。维持剂量方案包括用一个或多个剂量治疗受试者，所述剂量的范围为从根据体重的0.01μg到75mg/kg例如70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.0005mg每kg体重每天。维持剂量给药优选为不超过每5、10或是30天一次。更进一步说，该治疗方案可以维持一段时间，这要根据特定的疾病的性质、严重程度和病人的整体健康情况而定。在优选实施例中，给药剂量不超过一天一次，例如不超过每24、36、48或更多个小时一次，例如不超过每5或8天一次。随着治疗，监测病人的身体状况的改变和疾病症状的减缓。如果病人对当前使用的剂量水平反应不明显的话，化合物的剂量可以增加，如果疾病的症状减缓或消失或者如有非预想的副作用出现，则要减少化合物的剂量。

根据特定情形按照需要来给与有效的剂量，以单剂量或二个或更多的剂量给药。如果需要方便地重复或频繁的给药，建议使用输送工具，如泵、半永久支架(如静脉内、腹膜内、脑池、囊内)或储库。

在一项实施例中，iRNA试剂药物组合物包括多种iRNA试剂。针对天然形成的靶序列如ApoB基因的靶序列，iRNA试剂具有非重叠和非相邻的序列。在另一项实施例中，多种iRNA试剂对不同天然形成的靶基因是特异性的。例如，靶向ApoB的iRNA试剂可以出现在相同的药物组合物中作为靶向不同基因的iRNA试剂。在另一项实施例中，iRNA试剂对不同的等位基因是特异性的。

随着成功的治疗，接下来需要考虑的是对病人进行维持治疗以防止病患复发，其中本发明的化合物将以维持剂量给药，给药范围从0.01μg到100g每kg体重(参见美国6,107,094)。

iRNA试剂化合物的浓度以能足以有效地治疗或防止人类的病患或调节生理机能为准。

iRNA试剂的给药浓度或用药量根据测定试剂的参数和给药方法而定，例如鼻内、口腔或肺部给药。例如，鼻部的配方需要成分的浓度更低一些，以避免对鼻道的刺激和烧伤感。有时需要将口部服用的配方的浓度稀释到10-100倍，然后用于鼻部的配方。

某些因素会影响有效治疗受试者所需的剂量，这些因素包括但不限于疾病或病症的的严重程度、以前的治疗、整体健康状态和/或受试者的年龄，以及存在其它的疾病。同时，以iRNA试剂如双链iRNA试剂或siRNA试剂(如前体，如一种大的能够被加工成siRNA试剂的iRNA试剂，或者是编码iRNA试剂诸如双链iRNA试剂或siRNA试剂的DNA或其前体)的有效治疗剂量对受试者的治疗，可以包括单一治疗或优选为可以包括一系列的治疗。同样重要的是，用于治疗的iRNA试剂如siRNA试剂的有效剂量在一个特定的治疗过程中可以增减。从在本文所描述的诊断方法的结果来看，剂量的改变会引起明显的变化。例如，在iRNA试剂组合物给药后，受试者可以被监控。根据监测的信息，可以施用额外剂量的iRNA试剂组合物。

服药剂量是依据被治疗的疾病的严重性和反应来确定的，疗程可以从几天延续到几个月，或直到治疗有效果或者疾病症状减轻。理想的服用剂量方案可以从测量药物在病人体内积累的时候计算。本领域的熟练技术人员可以很容易地测定最理想的剂量和服用方法以及重复频率。最佳剂量可以随着每一种化合物的相对药力而改变，并且一般基于在体内和体外动物模型中有效的EC50来确定的。在某些实施例中，动物模型包括表达人类基因的转基因动物，例如产生靶ApoB RNA的基因。转基因动物可以缺乏相应的内源RNA。在另一项实施例中，测试组合物包括iRNA试剂，该iRNA试剂至少在内部区域与在动物模型的靶ApoB RNA和人的靶ApoB RNA之间的保守序列互补。

本发明利用下面的实例来做进一步的说明，但不能解释为是作进一步的限制。

实施例

实施例1.经过固相合成制备siRNAs

试剂的来源

在此试剂的来源没有专门给出，这种试剂可以获白任何一个在质量/纯度上达到分子生物学应用标准的分子生物学试剂供应商。

siRNA合成

单链RNAs使用Expedite 8909合成器(Applied Biosystems，AppleraDeutschland GmbH，Darmstadt，Germany)在1μmole的规模上固相合成，可控孔径玻璃(CPG，500，Glen Research，Sterling VA)作为固体支持物。RNA和含有2’-O-甲基核苷酸的RNA分别使用相应的亚磷酰胺和2’-O-甲基亚磷酰胺通过固相合成产生(Proligo BiochemieGmbH，Hamburg，Germany)。这些building blocks在寡核苷酸链序列范围内所选择的位点上引入，其利用标准核苷亚磷酰胺化学，如在书《Current protocols in nucleic acid chemistry》，Beaucage，S.L.等(Edrs.)，John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY，USA中所描述。硫代磷酸键通过将碘氧化剂溶液替代为在乙腈(1％)的Beaucage试剂(ChruachemLtd，Glasgow，UK)溶液而引入。辅助试剂获自Mallinckrodt Baker(Griesheim，Germany)。

通过对寡核苷酸粗品进行阴离子交换HPLC，根据现有的方法进行脱保护和纯化作用。利用分光光度计(DU640B，Beckman Coulter GmbH，Unterschleiβheim，Germany)，产率和浓度通过各自RNA溶液在260nm波长处的UV吸收值来确定。双链RNA经过与一种等摩尔的退火缓冲液(20mM磷酸钠，pH6.8；100mM氯化钠)中的互补链溶液相混合而形成，并在85-90℃水浴中加热3分钟，然后经过3-4个小时冷却到室温。纯化的RNA溶液在-20℃贮存备用。

胆固醇如图1所示与siRNA结合。为合成这些3’-结合胆固醇的siRNAs，一种适当修饰的固体支持物用于RNA合成。该修饰的固体支持物按照下列方法制备：

二乙基-2-氮杂丁烷-1，4-二羧酸酯AA

将4.7M的氢氧化钠(50mL)水溶液加入搅拌和冰冷却的甘氨酸乙酯盐酸盐(32.19g，0.23mole)水溶液(50mL)中。然后加入丙烯酸乙酯(23.1g，0.23mole)，在室温下搅拌混合物直到用TLC确定反应完成(19h)。19个小时后，用二氯甲烷(3×100mL)分离。有机层用无水硫酸钠干燥、过滤和蒸发。残留物被蒸馏得到AA(28.8g，61％)。

3-{乙氧基羰基甲基-[6-(9H-芴-9-基-甲氧羰基-氨基)-己酰基]-氨基}-丙酸乙酯AB

芴甲氧羰基-6-氨基-己酸(Fmoc-6-amino-hexanoicacid)(9.12g，25.83mmol)溶解于二氯甲烷(50mL)并用冰冷却。二异丙基碳二亚胺(Diisopropylcarbodiimde)(3.25g，3.99mL，25.83mmol)在0℃下加入该溶液。然后加入二乙基-氮杂丁烷-1，4-二羧酸酯(5g，24.6mmol)和二甲氨基吡啶(0.305g，2.5mmol)。将该溶液置于室温下，并进一步搅拌6个小时，用TLC确定反应完成。该反应混合物在真空下浓缩，并且加入乙酸乙酯使二异丙基脲(diisopropyl urea)沉淀。将该悬浮液过滤。用5％盐酸水溶液、5％碳酸氢钠和水冲洗过滤物。合并的有机层用硫酸钠干燥并浓缩得到粗产品，该粗产品用柱层析(50％EtOAC/Hexanes)纯化以获得11.87g(88％)的AB。

3-[(6-氨基-己酰基)-乙氧基羰基甲基-氨基]-丙酸乙酯AC

将3-{乙氧基羰基甲基-[6-(9H-芴-9-基-甲氧羰基-氨基)-己酰基-氨基}-丙酸乙酯AB(11.5g，21.3mml)在0℃下溶解于20％的二甲基甲酰胺中的哌啶溶液。将该溶液连续搅拌1个小时。反应混合物在真空下浓缩并向残留物加入水，产物用乙酸乙酯提取。粗产物通过转变成盐酸盐被纯化。

3-({6-[17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氢-1H-环戊并[a]-菲-3-基-氧羰基氨基]-己酰基}乙氧基羰基甲基-氨基)-丙酸乙酯AD

将3-[(6-氨基-己酰基)-乙氧基羰基甲基-氨基]-丙酸乙酯AC的盐酸盐(4.7g，14.8mmol)加入二氯甲烷中。并将该悬浮液在冰上冷却到0℃。在悬浮液中加入二异丙基乙胺(3.87g，5.2mL，30mmol)。在所得溶液中加入胆甾醇氯甲酸酯(6.675g，14.8mmol)。将反应混合物搅拌过夜。该反应混合物用二氯甲烷稀释并用10％的盐酸洗涤。产物经过快速分离色谱(闪柱)纯化(10.3g，92％)。

1-{6-[17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氢-1H-环戊并[a]-菲-3-基-氧羰基氨基]-己酰基}-4-氧代-吡咯烷-3-羧酸乙酯AE

叔丁醇钾(1.1g，9.8mmol)在30mL的干甲苯中搅拌。将该混合物在冰上冷却到0℃，并在20分钟内边搅拌慢慢加入5g(6.6mmol)的二酯AD。在加入过程中，温度保持在低于5℃。在0℃下持续搅拌30分钟，并加入1mL的冰乙酸，之后立即加入下述溶液，即40mL水中溶解4gNaH₂PO₄·H₂O。将所获得的混合物用100mL的二氯甲烷提取两次，然后用10mL的磷酸缓冲液洗涤合并的有机提取液两次，干燥、蒸发至干。残留物溶解于60mL的甲苯中，冷却至0℃，用50mL、pH9.5的冷碳酸盐缓冲液洗涤三次。用磷酸将水提物调节到pH3，并用40mL氯仿提取5次，合并氯仿液、干燥、蒸发得到残留物。用25％乙酸乙酯/己烷进行柱层析，将该残留物纯化而获得1.9g的b-酮酯(39％)。

[6-(3-羟基-4-羟甲基-吡咯烷-1-基)-6-氧代-己基]-氨甲酸17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氢-1H-环戊并[a]菲-3-基酯AF

将甲醇(2mL)在1小时期间逐滴加入四氢呋喃(10mL)中的b-酮酯AE(1.5g，2.2mmol)与氢硼化钠(0.226g，6mmol)的回流混合物中。在回流温度下持续搅拌1小时。在冷却到室温后，加入1N HCl(12.5mL)，用乙酸乙酯(3×40mL)提取混合物。合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥并真空浓缩生成产物，该产物再经过柱层析(10％MeOH/CHCl₃)纯化(89％)。

(6-{3-[双-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-4-羟基-吡咯烷-1-基}-6-氧代-己基)-氨基甲酸17-(1，5-二甲基-己基)-10，1 3-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氢-1H-环戊并[a]菲-3-基酯AG

将二醇AF(1.25gm，1.994mmol)在真空下与吡啶(2×5mL)蒸发进行干燥。搅拌中加入无水吡啶(10mL)和4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(0.724g，2.13mmol)。在室温下反应过夜。加入甲醇使反应中止。在真空下浓缩反应混合物，并向残留物加入二氯甲烷(50mL)。用1M碳酸氢钠水溶液洗涤有机层，并用无水硫酸钠干燥、过滤并浓缩。残留吡啶通过与甲苯蒸发而被去除。粗产物经过柱层析(2％MeOH/CHCl₃，在5％MeOH/氯仿中的Rf＝0.5)纯化(1.75g，95％)。

琥珀酸单-(4-[双-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-1-{6-[17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氢-1H-环戊并[a]菲-3-基氧羰基氨基]-己酰}-吡咯烷-3-基)酯AH

将化合物AG(1.0g，1.05mmol)与琥珀酸酐(0.150g，1.5mmol)和DMAP(0.073g，0.6mmol)混合，然后在真空下40℃干燥过夜。将该混合物溶解在无水二氯乙烷(3mL)中，然后加入三乙胺(0.318g，0.440mL，3.15mmol)，在氩气环境中、室温下搅拌该溶液16个小时。然后用二氯甲烷(40mL)稀释该溶液，用冰冷却的柠檬酸水溶液(5wt％，30mL)和水(2×20mL)洗涤。用无水硫酸钠干燥有机相并浓缩至干。残留物留作下一个步骤使用。

胆固醇衍生的CPG AI

将琥珀酸酯AH(0.254g，0.242mmol)溶解于二氯甲烷/乙腈(3∶2，3mL)的混合物中。然后在该溶液中先后加入乙腈(1.25mL)中的DMAP(0.0296g，0.242mmol)、乙腈/二氯乙烷(3∶1，1.25mL)中的2，2’-二硫-二(5-硝基吡啶)(0.075g，0.242mmol)。在所得溶液中加入乙腈(0.6mL)中的三苯基膦(0.064g，0.242mmol)。反应混合物颜色转变成亮橙色。用手动摇动器简单搅拌该溶液(5分钟)。加入长链烷基胺-CPG(LCAA-CPG)(1.5g，61mm/g)。搅拌该悬浮液2个小时。用烧结的漏斗过滤CPG，并用乙腈、二氯甲烷和醚先后洗涤。未参加反应的氨基用乙酸酐/嘧啶掩盖。用UV测量来测定CPG的负载容量(37mM/g)。

结合胆固醇的RNA链的合成与结构示于图1中。

实例2：设计siRNA以靶向人与小鼠ApoB基因中的区域

核酸序列如以下所示，采用标准命名法命名，具体为表2中的缩写。

表2：用于所列核苷酸序列的核苷酸单体缩写。要明白的是，当这些单体出现在寡核苷酸的时候，相互由5’-3’磷酸二酯键相连接。

缩写a	核苷酸
		A，a	2’-脱氧-腺苷-5’-磷酸，腺苷-5’-磷酸
C，c	2’-脱氧-胞苷-5’-磷酸，胞苷-5’-磷酸
		G，g	2’-脱氧-鸟苷-5’-磷酸，鸟苷-5’-磷酸
T，t	2’-脱氧-胸苷-5’-磷酸，胸苷-5’-磷酸
		U，u	2’-脱氧-尿苷-5’-磷酸，尿苷-5’-磷酸
Y，y	嘧啶(C或T，c或u)
		R，r	嘌呤(A或G，a或g)
N，n	任一个(G，A，C或T，g，a，c或u)
		am	2’-氧-甲基腺苷-5’-磷酸
cm	2’-氧-甲基胞苷-5’-磷酸
		gm	2’-氧-甲基鸟苷-5’-磷酸
tm	2’-氧-甲基胸苷-5’-磷酸
		um	2’-氧-甲基尿苷-5’-磷酸
af	2’-氟-脱氧-腺苷-5’-磷酸
		cf	2’-氟-脱氧-胞苷-5’-磷酸
gf	2’-氟-脱氧-鸟苷-5’-磷酸
		tf	2’-氟-脱氧-胸苷-5’-磷酸

uf	2’-氟-脱氧-尿苷-5’-磷酸
		A，C，G，T，U，a，c，g，t，u	划线：核苷-5’-硫代磷酸
am，cm，gm，tm，um	划线：2-氧-甲基-核苷-5’-硫代磷酸
		A，C，G，T，U，a，c，g，t，u	黑斜体：2’-脱氧-腺苷，2’-脱氧-胞苷，2’-脱氧-鸟苷，2’-脱氧-胸苷，2’-脱氧-尿苷，腺苷，胞苷，鸟苷，胸苷，尿苷
am，cm，gm，tm，um	黑斜体：2-氧-甲基-腺苷，2-氧-甲基-胞苷，2-氧-甲基-鸟苷，2-氧-甲基-胸苷，2-氧-甲基-尿苷(5’-羟基)

^a大写字母代表2’-脱氧核糖核酸(DNA)，小写字母代表核糖核酸(RNA)

在此描述的某些寡核苷酸被修饰为包含连接于它们的3’末端的胆固醇结构(参见图1)。这些被表示为5’-(n)_n(Chol)-3’。

当在本文中涉及在所给定核苷酸序列内的“位置n”(n为整数)时，其意为在核苷酸序列的第n个核苷酸，其中最5’的核苷酸计数为第一个核苷酸，然后朝向3’方向向后数。

由于用于人的治疗一般先用动物来做试验，所以我们设计的siRNAs能够对动物模型系统和人都具有潜在的功效。所选择的动物模型系统为小家鼠，mus musculus。所以，选择siRNA靶向作用的序列的第一个标准就是小鼠和人ApoB之间的交叉反应。

为了选择能够潜在抑制ApoB基因在小鼠和人表达的siRNA，编码小鼠(GenBank Accession No.：XM_137955)和人(GenBank AccessionNo.：NM_000384)ApoB阅读框的序列，用序列对比(pair wise BLASTalgorithm)进行排列比较。有关BLAST程序运用的数学运算在Altschul等(Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997)中有说明。具有23或更多的连续的核苷酸(小鼠阅读框的核苷酸：463-494，622-647，658-680，701-725，1216-1240，1282-1320，1299-1328，1339-1362，2124-2155，2807-2830，2809-2837，2860-2901，3035-3057，3103-3125，3444-3467，3608-3635，4130-4167，4374-4402，4503-4525，5962-5985，6696-6724，9232-9257，9349-9372，10177-10213，10477-10505，10791-10814，11020-11045，12227-12251，13539-13572)相同的区域被识别。

所有可能的23个核苷酸长度的序列都被确定。这一组代表了170个潜在的siRNA靶向区域。根据BLAST检索(word size 7，mismatchpenalty-1，expect value 1000)将这些序列与人和小鼠的基因组和mRNA数据库进行比较。所有具有3个或少于3个的与任何小鼠mRNA和小鼠基因组数据库错配的序列的潜在的23个核苷酸靶区域，从最初的组中排除。剩下的84个潜在的靶区域作为模板衍生出siRNA的有义链和反义链。每个siRNA的有义链与来自潜在靶区域的3到23(从5’到3’)个核苷酸相同。反义链被限定为对整个23个核苷酸靶区域的反向互补。所获得的siRNAs在反义链的3’端有2个核苷酸突出端以及一个21个核苷酸的碱基对区域。84个潜在的siRNAs中有81个被合成并且确定具有抑制ApoB在孵育的人HepG2细胞中表达的功效。与那些未处理的对照细胞相比较，抑制ApoB mRNA表达少于50％的siRNAs在人和/或小鼠血清中的稳定性也被确定。

84个合成的siRNA双链分子的有义和反义链序列如表3所示。有义链代表所有23个核苷酸区域的3-23位核苷酸，所述23个核苷酸区域是：(a)在小鼠(GenBank Accession No.：XM_137955)和人(GenBankAccession No.：NM_000384)ApoB的阅读框(ORF)之间是同源的；和(b)当与所有其它的人和小鼠基因组和mRNA数据库的序列比较时发现具有4个或更多个错配。表3所列的反义链与23个有义链核苷酸区域的1-23位核苷酸互补。并给出相应的小鼠ApoB的ORF中对应的23核苷酸区域的最5’端的核苷酸位置。

表3：未修饰的siRNA双链分子核酸序列

SEQ.IDNo.	序列有义链	SEQ.IDNo.	序列反义链	双链体描述符	起始位点b
						1	aagccuugguucaguguggac	2	guccacacugaaccaaggcuugu	AL-DUP 5000	1302
3	ugaacaccaacuucuuccacg	4	cguggaagaaguugguguucauc	AL-DUP 5001	2865
						5	gauugauugaccuguccauuc	6	gaauggacaggucaaucaaucuu	AL-DUP 5002	13539
7	aauggacucaucugcuacagc	8	gcuguagcagaugaguccauuug	AL-DUP 5003	3610
						9	auugaccuguccauucaaaac	10	guuuugaauggacaggucaauca	AL-DUP 5004	13544
11	uuugugacaaauaugggcauc	12	gaugcccauauuugucacaaacu	AL-DUP 5005	2810
						13	cuugguucaguguggacagcc	14	ggcuguccacacugaaccaaggc	AL-DUP 5006	1306
15	uggacucaucugcuacagcuu	16	aagcuguagcagaugaguccauu	AL-DUP 5007	3612
						17	auugauugaccuguccauuca	18	ugaauggacaggucaaucaaucu	AL-DUP 5008	13540
19	uugauugaccuguccauucaa	20	uugaauggacaggucaaucaauc	AL-DUP 5009	13541
						21	caaauggacucaucugcuaca	22	uguagcagaugaguccauuugga	AL-DUP 5010	3608
23	gauugaccuguccauucaaaa	24	uuuugaauggacaggucaaucaa	AL-DUP 5011	13543
						25	ugauugaccuguccauucaaa	26	uuugaauggacaggucaaucaau	AL-DUP 5012	13542
27	gguguauggcuucaacccuga	28	ucaggguugaagccauacaccuc	AL-DUP 5013	466
						29	ucugugggauuccaucugcca	30	uggcagauggaaucccacagacu	AL-DUP 5014	4136
31	agacuuccugaauaacuaugc	32	gcauaguuauucaggaagucuau	AL-DUP 5015	9349
						33	acaauuugaucaguauauuaa	34	uuaauauacugaucaaauuguau	AL-DUP 5016	6697
35	ggacucaucugcuacagcuua	36	uaagcuguagcagaugaguccau	AL-DUP 5017	3613
						37	uuacuccaacgccagcuccac	38	guggagcuggcguuggaguaagc	AL-DUP 5018	3103
39	gugacaaauaugggcaucauc	40	gaugaugcccauauuugucacaa	AL-DUP 5019	2813
						41	guguauggcuucaacccugag	42	cucaggguugaagccauacaccu	AL-DUP 5020	467
43	uaccguguauggaaacugcuc	44	gagcaguuuccauacacgguauc	AL-DUP 5021	703
						45	gauaccguguauggaaacugc	46	gcaguuuccauacacgguaucca	AL-DUP 5022	701
47	aaaucaagugucaucacacug	48	cagugugaugacacuugauuuaa	AL-DUP 5023	10178
						49	agguguauggcuucaacccug	50	caggguugaagccauacaccucu	AL-DUP 5024	465
51	guuugugacaaauaugggcau	52	augcccauauuugucacaaacuc	AL-DUP 5025	2809
						53	auaccguguauggaaacugcu	54	agcaguuuccauacacgguaucc	AL-DUP 5026	702
55	uaaaucaagugucaucacacu	56	agugugaugacacuugauuuaaa	AL-DUP 5027	10177
						57	gagguguauggcuucaacccu	58	aggguugaagccauacaccucuu	AL-DUP 5028	464
59	uggcuucaacccugagggcaa	60	uugcccucaggguugaagccaua	AL-DUP 5029	472
						61	gaacaccaacuucuuccacga	62	ucguggaagaaguugguguucau	AL-DUP 5030	2866
63	guauggcuucaacccugaggg	64	cccucaggguugaagccauacac	AL-DUP 5031	469
						65	auggcuucaacccugagggca	66	ugcccucaggguugaagccauac	AL-DUP 5032	471
67	aacaccaacuucuuccacgag	68	cucguggaagaaguugguguuca	AL-DUP 5033	2867
						69	acaccaacuucuuccacgagu	70	acucguggaagaaguugguguuc	AL-DUP 5034	2868
71	caccaacuucuuccacgaguc	72	gacucguggaagaaguugguguu	AL-DUP 5035	2869
						73	gaugaacaccaacuucuucca	74	uggaagaaguugguguucaucug	AL-DUP 5036	2863
75	augaacaccaacuucuuccac	76	guggaagaaguugguguucaucu	AL-DUP 5037	2864
						77	Agaugaacaccaacuucuucc	78	ggaagaaguugguguucaucugg	AL-DUP 5038	2862
79	auuccaucugccaucucgaga	80	ucucgagauggcagauggaaucc	AL-DUP 5039	4144
						81	uuccaucugccaucucgagag	82	cucucgagauggcagauggaauc	AL-DUP 5040	4145
83	acaagccuugguucagugugg	84	ccacacugaaccaaggcuuguaa	AL-DUP 5041	1300
						85	uucaagucugugggauuccau	86	auggaaucccacagacuugaagu	AL-DUP 5042	4130
87	aaucaagugucaucacacuga	88	ucagugugaugacacuugauuua	AL-DUP 5043	10179
						89	uauggcuucaacccugagggc	90	gcccucaggguugaagccauaca	AL-DUP 5044	470

SEQ.IDNo.	序列有义链	SEQ.IDNo.	序列反义链	双链体描述符	起始位点b
						91	uugaccuguccauucaaaacu	92	aguuuugaauggacaggucaauc	AL-DUP 5045	13545
93	aucaagugucaucacacugaa	94	uucagugugaugacacuugauuu	AL-DUP 5046	10180
						95	ucaagugucaucacacugaau	96	auucagugugaugacacuugauu	AL-DUP 5047	10181
97	gucaucacacugaauaccaau	98	auugguauucagugugaugacac	AL-DUP 5048	10187
						99	cuguccauucaaaacuaccac	100	gugguaguuuugaauggacaggu	AL-DUP 5049	13550
101	ccuguccauucaaaacuacca	102	ugguaguuuugaauggacagguc	AL-DUP 5050	13549
						103	aucacacugaauaccaaugcu	104	agcauugguauucagugugauga	AL-DUP 5051	10190
105	accuguccauucaaaacuacc	106	gguaguuuugaauggacagguca	AL-DUP 5052	13548
						107	gaccuguccauucaaaacuac	108	guaguuuugaauggacaggucaa	AL-DUP 5053	13547
109	caucacacugaauaccaaugc	110	gcauugguauucagugugaugac	AL-DUP 5054	10189
						111	uacaagccuugguucagugug	112	cacacugaaccaaggcuuguaaa	AL-DUP 5055	1299
113	uguauggcuucaacccugagg	114	ccucaggguugaagccauacacc	AL-DUP 5056	468
						115	ugaccuguccauucaaaacua	116	uaguuuugaauggacaggucaau	AL-DUP 5057	13546
117	ucaucacacugaauaccaaug	118	cauugguauucagugugaugaca	AL-DUP 5058	10188
						119	uugugacaaauaugggcauca	120	ugaugcccauauuugucacaaac	AL-DUP 5059	2811
121	caagugucaucacacugaaua	122	uauucagugugaugacacuugau	AL-DUP 5060	10182
						123	uaacacuaagaaccagaagau	124	aucuucugguucuuaguguuagc	AL-DUP 5061	11020
125	caauuugaucaguauauuaaa	126	uuuaauauacugaucaaauugua	AL-DUP 5062	6698
						127	cugaacaucaagaggggcauc	128	gaugccccucuugauguucagga	AL-DUP 5084	623
129	ugaacaucaagaggggcauca	130	ugaugccccucuugauguucagg	AL-DUP 5085	624
						131	guccagccccaucacuuuaca	132	uguaaagugauggggcuggacac	AL-DUP 5086	1282
133	cagccccaucacuuuacaagc	134	gcuuguaaagugauggggcugga	AL-DUP 5087	1285
						135	agccccaucacuuuacaagcc	136	ggcuuguaaagugauggggcugg	AL-DUP 5088	1286
137	gaguuugugacaaauaugggc	138	gcccauauuugucacaaacucca	AL-DUP 5089	2807
						139	agggaaucuuauauuugaucc	140	ggaucaaauauaagauucccuuc	AL-DUP 5090	2131
141	uuacugagcugagaggccuca	142	ugaggccucucagcucaguaacc	AL-DUP 5091	1218
						143	auugggaagaagaggcagcuu	144	aagcugccucuucuucccaauua	AL-DUP 5092	12228
145	ucacauccuccaguggcugaa	146	uucagccacuggaggaugugagu	AL-DUP 5093	1339
						147	gccccaucacuuuacaagccu	148	aggcuuguaaagugauggggcug	AL-DUP 5094	1287
149	ccagccccaucacuuuacaag	150	cuuguaaagugauggggcuggac	AL-DUP 5095	1284
						151	aagggaaucuuauauuugauc	152	gaucaaauauaagauucccuucu	AL-DUP 5096	2130
153	cuuuacaagccuugguucagu	154	acugaaccaaggcuuguaaagug	AL-DUP 5097	1296
						155	ggaaucuuauauuugauccaa	156	uuggaucaaauauaagauucccu	AL-DUP 5098	2133
157	gaagggaaucuuauauuugau	158	aucaaauauaagauucccuucua	AL-DUP 5099	2129
						159	aaauagaagggaaucuuauau	160	auauaagauuccauucuauuuug	AL-DUP 5100	2124
161	uagaagggaaucuuauauuug	162	caaauauaagauucccuucuauu	AL-DUP 5101	2127
						163	gacuuccugaauaacuaugca	164	ugcauaguuauucaggaagucua		9350
165	gcaaggaucuggagaaacaac	166	guuguuucuccagauccuugcac		4375
						167	caaggaucuggagaaacaaca	168	uguuguuucuccagauccuugca		4376

^a解说符指退火的双链siRNA

^b在小鼠ApoB的ORF中的相应的23核苷酸区域的最5’端核苷酸位置

或者，对于84个潜在靶区域的同一个组，siRNA可以产生19个碱基对和2个核苷酸dTdT突出端。有义链于是与靶区域的1到19、2到20、3到21、4到22，或5到23的核苷酸相同，并且两个dT核苷酸被加到寡核苷酸的3’末端。如此选择的有义链的反向互补作为反义链的模板，并且两个dT核苷酸被加到3’末端。

实例3.在细胞培养时，siRNA在mRNA以及蛋白质水平上抑制ApoB表达

以上所述的siRNA的活性是在HepG2细胞中测试的。

用分支DNA测定法测定培养的HepG2细胞中总mRNA的ApoBmRNA，所述总mRNA分离自与ApoB特异性的siRNA一同孵育的细胞，以及用酶连免疫吸附测定法(ELISA)测定与ApoB特异性的siRNA一同孵育的细胞上清中的ApoB 100蛋白质。HepG2细胞获自AmericanType Culture Collection(Rockville，MD，cat.No.HB-8065)并培养在MEM(Gibco Invitrogen，Invitrogen GmbH，Karlsruhe，Germany，cat.No.21090-022)，并补充有10％小牛血清(FCS)(Biochrom AG，Berlin，Germany，cat.No.S0115)，2mM L-Glutamin(Biochrom AG，Berlin，Germany，cat.No.K0238)，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml(Biochrom AG，Berlin，Germany，cat.No.A2213)，1x非必需氨基酸(NEA)(Biochrom AG，Berlin，Germany，cat.No.K0293)以及1mM丙酮酸钠(Biochrom AG，Berlin，Germany，cat.No.L0473)，且培养是在37℃下5％CO₂氛围内的增湿孵育箱中(Heraeus HERAcell，KendroLaboratory Products，Langenselbold，Germany)进行。

为转染siRNA，HepG2细胞以1.5×10⁴每孔细胞的密度置于96微孔板上，孵育24小时。用说明书所描述的oligofectamine(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，Germany，cat.No.12252-011)进行siRNA转染。siRNA以100nM的浓度转染，以用于筛选siRNA双链分子，以100、33、11、3.7、1.2、0.4、0.14和0.05nM的浓度用于测定剂量反应/在50％最大抑制作用(IC₅₀)时的抑制浓度。转染24小时之后，更换培养基再将细胞孵育24小时。用酶连免疫吸附测定法测定ApoB 100蛋白质浓度，如以下所述，收集上清后贮存在-80℃下直至分析之用。用分支DNA测定法测定ApoB mRNA，如下所述，，除了将2μl的50μg/μlProteinase K(Epicentre，Madison，WI，USA，cat.No.MPRK092)贮备液添加到600μl的Tissue and Cell Lysis Solution(Epicentre，Madison，WI，USA，cat.No.MTC096H)之外，按照Quantigene Explore试剂盒(Genospectra，Fremont，CA，USA，cat.No.QG-000-02)说明书的说明收集细胞然后将细胞裂解，用于bDNA的mRNA测定。在-80℃贮存裂解物直至用于分支DNA测定法分析。

利用培养的NmuLi细胞，根据分支DNA测定法(bDNA测定法)定量测定鼠科动物ApoB mRNA。NmuLi细胞(普通肝脏，ATCC No.：CRL-1638)在DMEM(Biochrom AG，Berlin，Germany，cat.No.F0435)中孵育，添加10％小牛血清(FCS)(Biochrom AG，Berlin，Germany，cat.No.S0115)和2mM L-Glutamin(Biochrom AG，Berlin，Germany，cat.No.K0238)，在37℃、5％CO₂大气氛围下的增湿孵育箱中(HeraeusHERAcell，Kendro Laboratory Products，Langenselbold，Germany)。

在转染的前一天，将细胞以4×10³细胞每孔的密度置于在96微孔板上。按照明书的方法(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，Germany，cat.No.12252-011)，用oligofectamine进行三遍siRNA细胞转染。在转染过程中siRNA在培养基中的浓度为200nM，用于筛选15个未修饰或修饰的siRNA双链分子。在转染之后，将细胞孵育24个小时，之后生长培养基用不含siRNA的新鲜培养基更换。收集细胞裂解物并用以上所描述的贮存HipG2细胞的方法贮存。

以下所示为未结合胆固醇的对照siRNA双链分子的序列：

AL-DUP HCV

Sense：5′-acggcuagcugugaaaggucc-3′SEQ.ID No.169

Antisense：5′-ggaccuuucacagcuagccguga-3′SEQ.ID No.170

AL-DUP HCV的有义链相应于肝炎C病毒(Accession No.：D89815)3’-未翻译区域的9472-9493位置。以下所示为结合胆固醇的对照siRNA双链分子的序列：

AL-DUP 5129

Sense：5′-ccacaugaagcagcacgacuu(Chol)-3′

                                         SEQ.ID No.171

Antisense：5′-aagucgugcugcuucaugug-3′  SEQ.ID No.172

有义链的1-21核苷酸相应于具有增强的绿色荧光蛋白(GenBankAccession No.：U57607)的克隆载体pEGFP-C3的843-864位置。

细胞上清中的ApoB 100蛋白质水平用ELISA法进行测定。用ClearFlat Bottom Polystyrene High Bind Microplates(Corning B.V.LifeSciences，Schiphol-Rijk，The Netherlands，cat.No.9018)进行测定。多克隆抗体山羊抗人载脂蛋白B(Chemicon International GmbH，Hofheim，Germany，cat.No.AB742)以1∶1000在磷酸缓冲生理盐水(PBS)(PBSDulbecco w/o Ca2⁺⁺，Mg2⁺⁺，Biochrom AG，Berlin，Germany，cat.No.L182-05)中被稀释，将100μl这种稀释液覆盖在96微孔板上，4℃下过夜。用300μl在PBS中的1％牛血清白蛋白(BSA)(Carl Roth GmbH&Co KG，Karlsruhe，Germany，cat.No.8076.2)封闭后，微孔板用PBS洗三遍。

解冻细胞培养上清并且以1∶1用含有0.1％Tween 20(Carl RothGmbH&Co KG，Karlsruhe，Germany，cat.No.9127.1)和0.1％BSA的PBS稀释。取100μl这种稀释液加到每一个孔。在室温下经过2小时的孵育后，用含有0.1％Tween 20的PBS将微孔板洗涤五遍，之后用PBS洗三遍。取100μl以1∶1000经过含有0.1％Tween 20和3％BSA的PBS稀释的结合辣根过氧化物酶的山羊抗人载脂蛋白B多克隆抗体(Academy Bio-Medical Company，Houston，TX，USA，cat.No.20H-G1-b)加入到每一个孔。将微孔板在室温下孵育2个小时。经过用含有0.1％Tween 20的PBS将微孔板洗涤五遍并用PBS洗涤三遍后，孔在0.9mg/ml OPD(ophenylendiamine dihydrochloride，MerckBiosciences GmbH，Bad Soden，Germany cat.No.523121)中孵育，该OPD在24mmol/L柠檬酸缓冲液中(Sigma-Aldrich，Taufkirchen，Germany，cat.No.C1909-1KG)，pH5.0，含有0.03％过氧化氢(MerckBiosciencesGmbH，Bad Soden，Germany cat.No.386790)。加入0.5mol/L H₂SO₄(Merck KgaA，Darmstadt，Germany，cat.No.100731)中断酶反应，并用分光光度计(Perkin Elmer Wallac Victor3 1420 multilabel reader，PerkinElmer LAS GmbH，Rodgau，Germany)测定490nm处的吸收。与任何小鼠基因无关联的siRNA双链分子用做对照，并且给定的ApoB特异性的siRNA双链分子的活性以经过处理的细胞上清中的ApoB蛋白质浓度相对于经过对照siRNA双链分子处理的细胞上清中的ApoB蛋白质浓度的百分比表示。胆固醇结构与siRNA双链分子有义链的结合增进了培养的HepG2细胞中ApoB分泌诱导效果。所以，一个siRNA双链分子对照包含了结合的胆固醇结构(AL-DUP 5129)。

利用分支DNA测定法(bDNA)测定ApoB mRNA的水平。该测试利用Quantigene Explore试剂盒(Genospectra，Fremont，CA，USA，cat.No.QG-000-02)进行。冷冻裂解物在室温下溶化，然后按照QuantigeneExplore试剂盒说明书的说明定量测定ApoB和GAPDH mRNA。用于捕获延伸物(Capture Extender，CE)，标记延伸物(Label Extender，LE)的核酸序列以及封闭(BL)探针，在借助QuantiGene ProbeDesignerSoftware 2.0(Genospectra，Fremont，CA，USA，cat.No.QG-002-02)下，选自ApoB和GAPDH的核酸序列。用于定量测定鼠类和人ApoB的探针核苷酸序列分别在表4和表5列出。用于定量测定鼠类和人GAPDH的探针核苷酸序列分别在表6和表7列出。

表4：用于分支DNA测定法的鼠ApoB的DNA探针

Probetypea	Nucleotide sequence	SEQ.ID. No.
			CECECECECECELELELELELELELELELELELELELEBLBLBLBLBLBLBLBL	CTCATTCTCCAGCAGCAGGGTTTTTCTCTTGGAAAGAAAGTGAAGCGGCCGTTTGTTGATATTTTTCTCTTGGAAAGAAAGTGTTTTTGCTGTCTGCACCCATTTTTCTCTTGGAAAGAAAGTTAAATATTGTCCATTTTTGAGAAGAAGTTTTTCTCTTGGAAGAAAGTCATTCAGCTTCAGTGGCTCCATTTTTCTCTTGGAAAGAAAGTAATGTCTGCATTTAGCCTATGGCTTTTTTCTCTTGGAAAGAAAGTAGCCCAAGCTCTGCATTCAATTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTATTTCATGGATGCCCCAGAGTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTACTGAATTTTGCATGGTGTTCTTTTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTGGGCAGCTCTCCCATCAAGTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTGAATCATGGCCTGGTAAATGCTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTCAGCATAGGAGCCCATCAAATCATTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTGACTGTGTGTGTGGTCAAGTTTCATCTTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTATAGGGCTGTAGCTGTAAGTTAAAATTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTGTCAAATCTAGAGCACCATATCTCAGTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTGCCGAAACCTTCCATTGTTGTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTAGATATGTTTCAGCTCATTATTTTGATAGTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTCTACTACCAGGTCAGTATAAGATATGGTATTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTGAATTCGACACCCTGAACCTTAGTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTTCCCCAGTGACACCTCTGTGATCGGCTGAGTTTGAAGTTGAAGATTGGACAGCCTCAGCCCTTCTCCAGTGAGAGACCTGCAATGTTCATCTGCTTATAGAACTTGTCTCCACTGGTCGTTGCTTAAAGTAGTTATGAAAGAGTTCCTTTAAAGTTGCCACCCACCACAGTGTCTGCTCTGTAACTTG	173174175176177178179180181182183184185186187188189190191192193194195196197198199

^aCE＝捕获延伸物  探针；LE＝标记延伸物  探针；BL＝封闭探针

表5：用于分支DNA测定法的鼠ApoB的DNA探针

Probe typea	Nucleotide sequence	SEQ.ID.No
			CECECECECECECELELELELELEBLBLBLBLBL	GATTGGATTTTCAGAATACTGTATAGCTTTTTTCTCTTGGAAAGAAAGTCCTGCTTCGTTTGCTGAGGTTTTTTCTCTTGGAAAGAAAGTGCAGTGATGGAAGCTGCGATATTTTTCTCTTGGAAAGAAAGTGAACTTCTAATTTGGACTCTCCTTTGTTTTTCTCTTGGAAAGAAAGTACTCCTTCAGAGCCAGCGGTTTTTCTCTTGGAAAGAAAGTACTCCCATGCTCCGTTCTCATTTTTCTCTTGGAAAGAAAGTAGGGTAAGCTGATTGTTTATCTTGATTTTTCTCTTGGAAAGAAAGTGGTTCCATTCCCTATGTCAGCATTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTATTAATCTTAGGGTTTGAGAGTTGTGTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTCACTGTGTTTGATTTTCCCTCAATATTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTTGTATTTTTTTCTGTGTGTAAACTTGCTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTCAATCACTCCATTACTAAGCTCCAGTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTTGCCAAAAGTAGGTACTTCAATTGTTTGCATCTAATGTGAAAAGAGGACATTTGCTTGAAAATCAAAATTGAGGTACTTGCTGGAGAACTTCACTGGCATTTCCAAAAAACAGCATTTC	200201202203204205206207208209210211212213214215216

^aCE＝捕获延伸物探针；LE＝标记延伸物探针；BL＝封闭探针

表6：用于分支DNA测定法的鼠GAPDH的DNA探针

Probetypea	Nucleotide sequence	SEQ.ID.No.
			CECECECELELELELELEBLBLBLBL	CAAATGGCAGCCCTGGTGATTTTTCTCTTGGAAAGAAAGTCCTTGACTGTGCCGTTGAATTTTTTTTCTCTTGGAAAGAAAGTGTCTCGCTCCTGGAAGATGGTTTTTCTCTTGGAAAGAAAGTCCCGGCCTTCTCCATGGTTTTTTCTCTTGGAAAGAAAGTAACAATCTCCACTTTGCCACTGTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTCATGTAGACCATGTAGTTGAGGTCAATTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTGACAAGCTTCCCATTCTCGGTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTTGATGGGCTTCCCGTTGATTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTGACATACTCAGCACCGGCCTTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTTGAAGGGGTCGTTGATGGCCCGTGAGTGGAGTCATACTGGAACACCCCATTTGATGTTAGTGGGGGTGAAGACACCAGTAGACTCCAC	217218219220221222223224225226227228229

^aCE＝捕获延伸物  探针；LE＝标记延伸物  探针；BL＝封闭探针

表7：用于分支DNA测定法的人GAPDH的DNA探针

Probetypea	Nucleotide sequence	SEQ.ID.No.
			CECECECELELELELELELEBL	GAATTTGCCATGGGTGGAATTTTTTCTCTTGGAAAGAAAGTGGAGGGATCTCGCTCCTGGATTTTTCTCTTGGAAAGAAAGTCCCCAGCCTTCTCCATGGTTTTTTCTCTTGGAAAGAAAGTGCTCCCCCCTGCAAATGAGTTTTTCTCTTGGAAAGAAAGTAGCCTTGACGGTGCCATGTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTGATGACAAGCTTCCCGTTCTCTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTAGATGGTGATGGGATTTCCATTTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTGCATCGCCCCACTTGATTTTTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTCACGACGTACTCAGCGCCATTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTGGCAGAGATGATGACCCTTTTGTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTGGTGAAGACGCCAGTGGACTC	230231232233234235236237238239240

^aCE＝捕获延伸物  探针；LE＝标记延伸物  探针；BL＝封闭探针

通过比较样品中ApoB mRNA与GAPDH mRNA的比例，将不同样品的ApoB mRNA水平标准化。不靶向任何鼠基因的AL-DUP HCV以及结合胆固醇的AL-DUP 5129用作对照。所给定的ApoB特异性siRNA双链分子的活性以经过处理的细胞中的ApoB mRNA(ApoBmRNA/GAPDH mRNA)相对于经过对照siRNA处理的细胞的百分比表不。

表8显示筛选81个siRNA双链分子在减少HepG2细胞培养中的ApoB mRNA水平和NmuLi细胞培养的上清液中ApoB蛋白质水平的活性的结果。

表8：经过siRNA处理之后ApoB mRNA和蛋白质的百分比

双链体描述符	相对对照，HEPG2培养的细胞中的(ApoBmRNA/GAPDHmRNA)	相对对照，HEPG2细胞培养物上清中的ApoB蛋白
			AL-DUP 5000	204	35
AL-DUP 5001	141	37
			AL-DUP 5002	68	29
AL-DUP 5003	121	119
			AL-DUP 5004	55	55
AL-DUP 5005	250	129
			AL-DUP 5006	174	99
AL-DUP 5007	96	72
			AL-DUP 5008	93	67
AL-DUP 5009	68	92
			AL-DUP 5010	79	41
AL-DUP 5011	98	44
			AL-DUP 5012	111	40
AL-DUP 5013	37	24
			AL-DUP 5014	112	43
AL-DUP 5015	165	54
			AL-DUP 5016	108	44
AL-DUP 5017	117	46
			AL-DUP 5018	414	93
AL-DUP 5019	46	56
			AL-DUP 5020	43	43
AL-DUP 5021	103	45
			AL-DUP 5022	86	26
AL-DUP 5023	218	74
			AL-DUP 5024	25	19
AL-DUP 5025	64	47
			AL-DUP 5026	84	70
AL-DUP 5027	45	51
			AL-DUP 5028	41	31
AL-DUP 5029	44	29
			AL-DUP 5030	49	27
AL-DUP 5031	45	36

双链体描述符	相对对照，HEPG2培养的细胞中的(ApoBmRNA/GAPDHmRNA)	相对对照，HEPG2细胞培养物上清中的ApoB蛋白
			AL-DUP 5032	82	47
AL-DUP 5033	115	87
			AL-DUP 5034	58	38
AL-DUP 5035	46	26
			AL-DUP 5036	47	24
AL-DUP 5037	120	53
			AL-DUP 5038	62	33
AL-DUP 5039	56	45
			AL-DUP 5040	78	70
AL-DUP 5041	387	45
			AL-DUP 5042	232	52
AL-DUP 5043	65	54
			AL-DUP 5044	95	55
AL-DUP 5045	65	57
			AL-DUP 5046	28	37
AL-DUP 5047	29	56
			AL-DUP 5048	28	16
AL-DUP 5049	31	36
			AL-DUP 5050	55	54
AL-DUP 5051	65	55
			AL-DUP 5052	49	49
AL-DUP 5053	37	46
			AL-DUP 5054	54	43
AL-DUP 5055	205	101
			AL-DUP 5056	67	72
AL-DUP 5057	77	66
			AL-DUP 5058	85	37
AL-DUP 5059	116	61
			AL-DUP 5060	45	35
AL-DUP 5061	40	43
			AL-DUP 5062	63	47
AL-DUP 5084	26	52
			AL-DUP 5085	35	57

双链体描述符号	相对对照，HEPG2培养的细胞中的(ApoBmRNA/GAPDHmRNA)	相对对照，HEPG2细胞培养物上清中的ApoB蛋白
			AL-DUP 5086	36	69
AL-DUP 5087	71	27
			AL-DUP 5088	35	28
AL-DUP 5089	26	33
			AL-DUP 5090	64	51
AL-DUP 5091	76	90
			AL-DUP 5092	37	81
AL-DUP 5093	21	64
			AL-DUP 5094	15	29
AL-DUP 5095	54	57
			AL-DUP 5096	55	62
AL-DUP 5097	8	29
			AL-DUP 5098	11	24
AL-DUP 5099	43	48
			AL-DUP 5100	17	57
AL-DUP 5101	15	39

表8中最具活性的27个siRNA双链分子被确定为具有＜对照的31％的残余ApoB mRNA/GAPDH mRNA，或者是ApoB蛋白质残基水平＜对照的35％。这些siRNA双链分子被选择作进一步的分析和建立IC50值。这27个siRNA双链分子为：AL-DUP5000，AL-DUP5002，AL-DUP5013，AL-DUP5022，AL-DUP5024，AL-DUP5028，AL-DUP5029，AL-DUP5030，AL-DUP5035，AL-DUP5036，AL-DUP5038，AL-DUP5046，AL-DUP5047，AL-DUP5048，AL-DUP5049，AL-DUP5060，AL-DUP5083，AL-DUP5084，AL-DUP5087，AL-DUP5088，AL-DUP5089，AL-DUP5093，AL-DUP5094，AL-DUP5097，AL-DUP5098，AL-DUP5100，AL-DUP5101。

用以上所述的27个siRNA双链分子研究增加剂量，其中，在经过分别与100、33、11、3.7、1.2、0.4、0.14或0.05nM的siRNA双链分子溶液一同孵育之后，利用NmuLi细胞作ApoB mRNA的定量分析，而利用HepG2细胞的细胞培养上清作ApoB蛋白质的定量分析。最低ApoB mRNA和ApoB蛋白质残留水平被测定。对27个siRNA当中15个显示出均最少量的ApoB mRNA和最低的蛋白质残留水平，重复三次增加剂量，所得数据用来计算50％最大抑制作用(IC50)时的抑制浓度，然后计算出三次测定的平均值。通过应用剂量增加试验的数据对计算机软件Xlfit 4(ID Business Solutions Ltd.，Guildford，UK)上实施的程序做曲线拟合取得IC50值。运用以下参数从曲线拟合所得的参数化公式，计算IC50值，所述参数为：单侧量效(Dose ResponseOne Site)、4参数逻辑模型、fit＝(A+((B-A)/(1+(((10^C)/x)^D))))，inv＝((10^C)/((((B-A)/(y-A))-1)^(1/D)))，res＝(y-fit)(以实例的方式，参见图2)。

表9表示五个减少NmuLi细胞中mRNA和蛋白质水平＞70％的ApoB siRNAs的IC50的平均值。对照实验测定了培养的NmuLi细胞中最少的ApoB mRNA/GAPDH残留，以未处理对照的百分比表示；以及测定了HepG2细胞上清中最少的ApoB蛋白质残留，也以未测试对照的百分比表示。

表9：选择的siRNA的IC50

双链体名称	IC50(ApoB蛋白浓度)	最小的残余的ApoBmRNA/GAPDHmRNA(与对照的百分比)	细胞的上清夜中，最小的残余的ApoB蛋白(与对照的百分比)
				AL-DUP 5097	0.3nM	15％	18％
AL-DUP 5098	0.7nM	9％	20％
				AL-DUP 5094	0.7nM	14％	7％
AL-DUP 5048	0.9nM	11％	6％
				AL-DUP 5024	2.8nM	12％	21％

选择AL-DUP5024和AL-DUP5048用于进一步的实验。

实例6.siRNA双链体被修饰并表现出对核酸酶提高的抗性

siRNA双链体AL-DUP 5024和AL-DUP 5048被各种化学修饰所改变，以试图增强寡聚核苷酸链对在诸如如血清和胞内介质的生物液中存在的核酸酶引起的降解的抗性。具体的，在反义链的位点21和22之间，以及位点22和23之间，或者在有义链的位点20和21之间引入硫代磷酸酯键(参见表10)，这样提高了siRNA对核酸外切降解的稳定性。

表10  用于稳定性检验的siRNA

双链体描述符	SEQ.IDNo.	有义链序列	SEQ.IDNo.	反义链序列
					衍生自AL-DUP 5024的siRNA双链体
AL-DUP 5163	241	agguguauggcuucaacccug(chol)	242	caggguugaagccauacaccumcmu
					AL-DUP 5164	243	aggumgumaumggcumucmaacccumg(chol)	244	cmagggumumgaagccmaumacmaccucu
AL-DUP 5165	245	agguguauggcuucaacccug(chol)	246	cmagggumumgaagccmaumacmaccucu
					AL-DUP 5156	247	aggumgumaumggcumucmaacccumg(chol)	248	caggguugaagccauacaccumcmu
AL-DUP 5180	249	aggumgumaumggcumucmaacccumg	250	caggguugaagccauacaccumcmu
					AL-DUP 5181	251	aggumgumaumggcumucmaacccumg	252	cmagggumumgaagccmaumacmaccucu
衍生自AL-DUP 5048的siRNA双链体
					AL-DUP 5167	253	gucaucacacugaauaccaau(chol)	254	auugguauucagugugaugacmamc
AL-DUP 5168	255	gucmaucmacmacumgaaumaccmaau(chol)	256	aumumggumaumucmagumgumgaumgacmac
					AL-DUP 5169	257	gucaucacacugaauaccaau(chol)	258	aumumggumaumucmagumgumgaumgacmac
AL-DUP 5170	259	gucmaucmacmacumgaaumaccmaau(chol)	260	auugguauucagugugaugacmamc
					AL-DUP 5182	261	gucmaucmacmacumgaaumaccmaau	262	auugguauucagugugaugacmamc
AL-DUP 5183	263	gucmaucmacmacumgaaumaccmaau	264	aumumggumaumucmagumgumgaumgacmac

m＝2’O-甲基修饰；“(chol)”表示通过包含硫代磷酸酯的吡咯烷连接物偶联到3’-末端的胆固醇。

之前，该实验室鉴定了siRNA双链体中的某些序列基序，其特别易于于被内切核酸酶进行降解性攻击(参见共有和同时处于申请中的申请US 60/574,744)。具体的，这些基序是5’-UA-3’、5’-UG-3’、5’-CA-3’、5’-UU-3’和5’-CC-3’。含有这些序列基序的siRNA具有针对内切核酸酶的降解性攻击的稳定性，其通过将这些双核苷酸基序中最5’端核苷酸的核糖亚基的2’-OH替代为2’-O-CH₃(这里也被称作2’-O-甲基或者2’-O-Me)。因此，这些siRNA被合成，其中，在有义链上、反义链上或者上述两链上，除了5’-CC-3’外，所有这些双核苷酸基序都具有2’-O-Me基。

所测试的进一步修饰是将胆固醇部分结合到这些siRNA的有义链的3’-末端(参见图1)。这种修饰被认为促进RNA被吸收入细胞内(Manoharan，M.等人，Antisense and Nucleic Acid Drug Development2002，12：103～128)。

合成在表10中所列的siRNA双链体，并检测它们在血清孵育检验中对核裂解性降解的稳定性，以及它们在降低由培养的NmuLi细胞分泌到上清的ApoB蛋白量中的活性。

除了下面列出的外，siRNA AL-DUP 5024、AL-DUP 5163、AL-DUP5164、AL-DUP 5165、AL-DUP 5166、AL-DUP 5180和AL-DUP 5181的核苷酸序列是完全相同的：

AL-DUP 5024完全由未修饰的核苷酸构成；

AL-DUP 5163在反义链的位点21和22具有2’-O-Me基，在反义链的位点21和22之间以及位点22和23之间具有硫代磷酸酯键，并且AL-DUP 5163具有偶联到其有义链的3’-末端的胆固醇部分；

AL-DUP 5164在其有义链的位点4、6、8、12、14和20以及其反义链的位点1、6、7、13、15和17具有2’-O-Me基，并在其反义链的位点21和22之间以及位点22和23之间具有硫代磷酸酯键，并且AL-DUP 5164具有偶联到其有义链的3’-末端的胆固醇部分；

AL-DUP 5165在其反义链的位点1、6、7、13、15和17具有2’-O-Me基，在其反义链的位点21和22之间以及22和23之间具有硫代磷酸酯键，并且AL-DUP 5165具有偶联到其有义链的3’-末端的胆固醇部分；

AL-DUP 5166在其有义链的位点4、6、8、12、14和20具有2’-O-Me修饰，在其反义链的位点21和22之间以及22和23之间具有硫代磷酸酯键，并且AL-DUP 5166具有偶联到其有义链的3’-末端的胆固醇部分；

AL-DUP 5180在其有义链的位点4、6、8、12、14和20以及其反义链的位点21和22具有2’-O-Me修饰，在其反义链的位点21和22之间以及22和23之间，以及在其有义链的位点20和21之间具有硫代磷酸酯键；以及

AL-DUP 5181在其有义链的位点4、6、8、12、14和20以及其反义链的位点1、6、7、13、15和17具有2’-O-Me修饰，在其反义链的位点21和22之间以及22和23之间，以及在其有义链的位点20和21之间具有硫代磷酸酯键。

siRNA AL-DUP 5048、AL-DUP 5167、AL-DUP 5168、AL-DUP5169、AL-DUP 5170、AL-DUP 5182和AL-DUP 5183的核苷酸序列是完全相同的，除了：

AL-DUP 5048完全由未修饰的核苷酸构成；

AL-DUP 5167在反义链的位点21和22具有2’-O-Me基，在反义链的位点21和22之间以及位点22和23之间具有硫代磷酸酯键，并且AL-DUP 5167具有偶联到其有义链的3’-末端的胆固醇部分；

AL-DUP 5168在其有义链的位点3、6、8、11、15和18以及其反义链的位点2、3、6、8、10、13、15、18和21具有2’-O-Me基，并在其反义链的位点21和22之间以及位点22和23之间具有硫代磷酸酯键，并且AL-DUP 5168具有偶联到其有义链的3’-末端的胆固醇部分；

AL-DUP 5169在其反义链的位点2、3、6、8、10、13、15、18和21具有2’-O-Me基，在其反义链的位点21和22之间以及22和23之间具有硫代磷酸酯键，并且AL-DUP 5169具有偶联到其有义链的3’-末端的胆固醇部分；

AL-DUP 5170在其有义链的位点3、6、8、11、15和18以及其反义链的位点21和22具有2’-O-Me修饰，在其反义链的位点21和22之间以及22和23之间具有硫代磷酸酯键，并且AL-DUP 5170具有偶联到其有义链的3’-末端的胆固醇部分；

AL-DUP 5182在其有义链的位点3、6、8、11、15和18以及其反义链的位点21和22具有2’-O-Me修饰，在其反义链的位点21和22之间以及22和23之间，以及在其有义链的位点20和21之间具有硫代磷酸酯键；以及

AL-DUP 5183在其有义链的位点3、6、8、11、15和18以及其反义链的位点2、3、6、8、10、13、15、18和21具有2’-O-Me修饰，在其反义链的位点21和22之间以及22和23之间，以及在其有义链的位点20和21之间具有硫代磷酸酯键。

在小鼠和95％人血清中检测表10中所列举的siRNA的稳定性。小鼠血清是从Sigma  (Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，Germany，cat.No.M5905)或者Charles River  (Charles RiverLaboratories，Sulzfeld，Germany，cat.No.MASER)得到的。这里所报道的检验结果在所检测的不同血清来源中是一致的。为了检测所述被修饰的siRNA在人血清中的稳定性，收集了来自8位人类志愿者的血(270mL)，并将其在室温下保持3小时。将血池在20℃和3000rcf下使用Megafuge 1.0(Heraeus Instruments，Kendro Laboratory ProductsGmbH，Langenselbold)离心以从细胞部分(cellular fraction)分离血清。将上清等份保存在-20℃，并在需要时使用。从Sigma(Sigma-AldrichChemie GmbH，Taufkirchen，Germany，cat.No.Hl 513)获得的人血清被用于对照检验中。

向溶解在6μl PBS中的双链RNA(300pmol，大约4.2μg)中加入60μl人血清，并将该混合物在37℃孵育不同的时间例如0、15或者30分钟，或者1、2、4、8、16或者24小时。接着，将含有RNA/血清溶液的整个管在液氮中进行冷冻，并保存在-80℃。

为了分析未偶联胆固醇的siRNA，将冷冻的样品置于冰上，冰加入450μl 0.5M的NaCl。完全熔化后，将该溶液转入Phase-Lock Gel管(Eppendorf，Hamburg，Germany；cat.No.0032 005.152)中，与500μl50％苯酚、48％氯仿、2％异戊醇(Carl Roth GmbH&Co KG，Karlsruhe，Germany，cat.No.Al 56.2)进行混合，并加入额外的300μl氯仿。将这些管剧烈漩涡30秒，接着在4℃以16,200rcf离心15分钟。将含水的上清转入到新管中，并与40μl 3M乙酸钠pH5.2、1μl GlycoBlue(Ambion，TX，USA；cat.No.9516)和1ml 95％乙醇进行混合。在-20℃使RNA沉淀过夜。

在存在SDS(十二烷基硫酸钠)的情况下通过热苯酚提取对偶联胆固醇的siRNA进行分离。将血清样品(66μl)与200μl RNA缓冲液(0.5％SDS、10mM EDTA、10mM Tris pH7.5)和200μl水饱和的苯酚(Carl Roth GmbH&Co KG Karlsruhe，Germany；cat.No.A980.1)进行混合。将反应管在65℃孵育20分钟。为了达到相分离，将这些管置于冰上5分钟，并接着在4℃以16,200 rcf离心10分钟。将水相转入到新管中。利用150μl RNA potion和剧烈漩涡10秒钟对剩余的苯酚相进行又一次提取。将这些管置于冰上2分钟，并接着在4℃以16,200rcf离心10分钟。将第二次提取的水相转移并与第一次提取的上清结合。通过加入2μl GlycoBlue(Ambion，Austin，TX，USA；Cat.No.9516)和1ml95％乙醇将RNA进行沉淀。在-20℃过夜将RNA的沉淀进行完全。

通过变性凝胶电泳对所分离的RNA进行分析。将含有沉淀的RNA的管在4℃以16,200rcf离心10分钟。将上清移弃。使用400μl 70％乙醇将RNA沉淀进行清洗，并通过在4℃以16,200rcf离心5分钟进行再沉淀。去除所有的液体，并将沉淀溶解在20μl STOP缓冲液(95％甲酰胺、5％EDTA 0.5M、0.02％二甲苯蓝)中。将这些样品在92℃煮沸3分钟，并在冰上快速冷却。将10μl上样到14％聚丙烯酰胺变性胶(6M尿素、20％甲酰胺，Carl Roth GmbH & Co KG Karlsruhe，Germany)上。在45mA下对RNA进行分离大约2小时。通过使用“全染色(stains-all)”试剂(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Steinheim，Germany，cat.no.E9379)根据用户说明书进行的染色将RNA带进行显示。

在与小鼠和人血清孵育1小时后未修饰的AL-DUP 5024几乎完全被降解，而被修饰的siRNA对降解则更有抗性(参见图3)。在电泳分离后，使用全染色试剂对全长RNA进行染色达到3小时以显示AL-DUP 5163，孵育达到6小时以显示AL-DUP 5164、AL-DUP 5165、AL-DUP 5166、AL-DUP 5180和AL-DUP 5181。AL-DUP 5164、AL-DUP5166和AL-DUP 5181中观察到了最强的稳定作用，这说明易于降解的有义链中这些位点的修饰是非常有效的。反义链的额外的修饰仅仅提供了较少的额外稳定作用。(参见图3)

类似的，在与小鼠血清孵育1小时后，未修饰的AL-DUP 5048几乎完全被降解，而被修饰的dsRNA则对于降解有较少的敏感。在电泳分离之后，使用全染色试剂对全长RNA进行染色达到3小时以显示AL-DUP 5167、AL-DUP 5170和AL-DUP 5182，孵育达到6小时以显示AL-DUP 5169，达到24小时以显示AL-DUP 5168和AL-DUP 5183。(参见图3)

对表10中所列的siRNA双链进行检测它们在降低培养的HepG2细胞分泌ApoB蛋白到上清中的效率，以选择最有活性的双链以进行体内的进一步测试。

ApoB特异性的胆固醇修饰的siRNA在HepG2细胞的体外检验中的沉默活性与未修饰的ApoB-特异性siRNA的沉默活性相当。两种未偶联的siRNA AL-DUP 5024和AL-DUP 5048以200nM的浓度分别降低了鼠ApoB mRNA水平的84±9％和72±9％，而相应的偶联的和被修饰的siRNA AL-DUP 5167和AL-DUP 5163分别具有61±8％和68±9％的抑制活性。

图5A～图5L表示ApoB蛋白分泌到培养的人HepG2细胞的上清中的剂量应答曲线，其中人HepG2细胞被与含有100、33、11、3.7、1.2、0.4、0.14或者0.05nM的ApoB特异性siRNA双链体进行孵育。所述应答被表达为在使用ApoB特异性siRNA双链体处理的细胞上清中ApoB蛋白浓度与在使用非特异性对照siRNA双链体处理的细胞上清中ApoB浓度的比例。在这些结果的基础上，选择AL-DUP 5163、AL-DUP 5165、AL-DUP 5166和AL-DUP 5167进行在小鼠中的检测(参见下面的结果)。

实例7被修饰的siRNA双链体降低肝脏和空肠的组织切片中ApoB mRNA的量，并降低C57B1/6雄性小鼠血清中ApoB蛋白的胆固醇水平

使用27G注射针通过尾部静脉注射进行在小鼠中的推注给药(bolus dosing)siRNA。以能够释放8μl/g体重的计划剂量的浓度，将siRNA溶解在PBS中。在给药之前，将小鼠置于红外线灯下大约3分钟以便于注射。

在给药之前几天，通过收集来自尾部静脉的4～7滴血收集预处理血样。在通过CO₂窒息进行处死后，通过心脏穿刺收集大约0.7ml血液，并将20～40mg的组织等份在液氮中进行冷冻并保存在-80℃直到进行分析。

通过上述的分支DNA测定法对ApoB 100 mRNA水平进行检测。将每份大约10～30mg的三份冷冻组织切片样品(肝脏或者空肠)通过在含有84μg/ml蛋白酶K(Epicentre，Madison，WI，USA，cat.No.MPRK092)的1ml组织和细胞裂解溶液(Epicentre，Madison，WI，USA，cat.No.MTC096H)的超声降解进行匀浆，其使用每次为0.9秒的3～9次脉冲，其振幅为大约150μm。在分析之前，将裂解物保存在-80℃至少12小时(过夜)。

将冷冻的裂解物在室温下融化，并根据用户说明书使用QuantigeneExplore试剂盒对ApoB和GAPDH mRNA进行定量。借助QuantiGeneProbeDesigner软件2.0(Genospectra，Fremont，CA，USA，cat.No.QG-002-02)从ApoB和GAPDH的核酸序列选择捕获延伸物(CE)、标记延伸物(LE)以及封闭(BL)探针的核酸序列。表4中示出了在ApoB定量中所使用的探针核苷酸序列。表6中示出了在GAPDH定量中所使用的探针核苷酸序列。

对每个处理组的组织样品中ApoB mRNA和GAPDH mRNA的比例进行平均，并与未处理的对照组或者使用不相关siRNA双链体处理的对照组进行比较。

进行ELISA检验以对小鼠血清中的ApoB 100蛋白的量进行定量。为了进行该检验，将96孔板覆盖100μl小鼠ApoB-100-特异性单克隆抗体LF3(25μg/ml；Zlot，CH.等人，J.Lipid Res.1999，40：76-84)，并将该板在37℃孵育2小时。使用磷酸酯缓冲生理盐水(PBS)  (PSDulbecco不含Ca²⁺、Mg²⁺，Biochrom AG，Berlin，Germany，cat.No.Ll82-05)将该板清洗3次，接着通过向每个孔中加入含有3％牛血清白蛋白(BSA)(Carl Roth GmbH&Co KG，Karlsruhe，Germany，cat.no.8076.2)的300μl PBS将剩余的结合位点封闭。在室温下将这些板孵育1小时。接着使用PBS将板清洗5次。将溶解在100μl含有0.1％Tween(Carl Roth GmbH & Co KG，Karlsruhe，Germany，cat.No.9127.1)和3％BSA的PBS中的0.2μl小鼠血清加入到每个孔中。在37℃孵育2小时后，使用PBS将板清洗5次。将100μl 1∶500稀释的多克隆兔抗小鼠载脂蛋白B48/100抗体(Acris Antibodies GmbH，Hiddenheim，Geπnany，cat.no.BP2050)加入到这些孔中，并在37℃孵育2小时。使用PBS将板清洗5次后，加入100μl偶联辣根过氧化物酶的驴抗兔IgG(SantaCruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA，cat.no.sc2004)，并在37℃孵育1小时。使用PBS将板清洗5次，并将这些孔与在24 mmol/L pH5.0含有0.03％过氧化氢(Merck Biosciences GmbH，Bad Soden，Germany，cat.No.386790)柠檬酸缓冲液中的0.9mg/ml OPD(邻苯二胺盐酸盐，Merck Biosciences GmbH，Bad Soden，Germany cat.No.523121)孵育。通过加入0.5mol/L H₂SO₄(Merck KgaA，Darmstadt，Germany，cat.No.100731)终止该酶反应，并在分光光度计(Perkin Elmer Wallac Victor31420多标记阅读仪器，PerkinElmer LAS GmbH，Rodgau，Germany)上检测490nm处的吸光度。

使用Cholesterol FS试剂盒(DiaSys Diagnostic Systems GmbH，Holzheim，Germany)根据用户说明书检测小鼠血清中的总血清胆固醇。在分光光度计(DU 640B，Beckman Coulter GmbH，Unterschleiβheim，Germany)上进行这些检测。

在注射之后，S1-核酸酶保护检验被用于检测肝脏和空肠组织中的siRNA。按照上面为进行分支DNA测定法所描述的，对一些小块动物组织(10～30mg)进行匀浆。立即对这些裂解物进行处理，或者将其保存在-80℃，并在进行检验操作之前在室温下将其融化。将100μl裂解物转到新管，并与200μl STE(氯化钠-TPJS-EDTA缓冲液；500mM NaCl，9mM Tris pH7.5，0.9mM EDTA)以及200μl苯酚(TRIS-EDTA饱和的苯酚，Roti-phenol，Carl 5 Roth GmbH & Co KG，Karlsruhe，Germany，cat.no.0038.1)进行混合。将这些管在Vortex Genie 2(Scientific Industries，Inc.，Bohemia，NY，USA，cat.no.SI-0256)上以最大速度剧烈混合30秒，接着在4℃以16,200rcf离心10分钟。将大约310μl含水的上清小心地抽吸并转到新的反应管，与50μg大肠杆菌(E.coli)tRNA(RocheDiagnostics，Penzberg，Germany；cat.No.109 541)和900μl95％乙醇进行混合。在-20℃将RNA的乙醇沉淀持续过夜。

将用于S1-核酸酶保护检验的DNA探针进行放射性标记。长度为25～27个核苷酸的探针对应于siRNA分子的21个核苷酸有义链序列，但在其3’-末端包含额外的4～6个核苷酸作为非互补延伸(extension)。使用γ-³²P ATP将这些DNA寡聚核苷酸探针进行磷酸化，以在其5’-末端引入有放射性的磷酸基团。将15皮摩尔的每种探针与50μCi的γ-³²P ATP(Amersham GE-Healthcare，Freiburg，Germany，cat.no.AAOO18)以及10U多聚核苷酸激酶(New England Biolabs，Frankfurt，Germany，M0201 S)在总体积50μl的多聚核苷酸激酶缓冲液(New EnglandBiolabs，Frankfurt，Germany，cat.no.M0201S)中进行混合。将该溶液在37℃孵育1小时。根据用户说明书通过将该反应混合物流经MicrospinG-25脱盐柱(Amersham GE-Healthcare，Freiburg，Germany，cat.no.27-5325-01)使该标记反应终止。在1～3天内使用所得到的探针溶液。

为了检测来自小鼠组织裂解物的siRNA，将从裂解物沉淀的总RNA在4℃以16,200rcf离心10分钟。小心地将上清移弃，而保留核酸沉淀。首先将该沉淀重悬浮在50μl S1-杂交缓冲液(300mM NaCl，1mM EDTA，38mM HEPES pH7.0，0.1％Triton X-100)中，接着加入1μl有放射性的DNA探针溶液。将该杂交反应混合物加热到92℃保持2分钟。立即将这些反应管转到保持在37℃的加热块上，并进一步孵育30分钟。在室温下继续杂交额外的2小时。

为了确定血清中siRNA的浓度，将1μl血清与50μlS1-杂交缓冲液以及1μl有放射性的DNA探针进行混合，并如上继续该杂交。

使用了下面的探针：

为检测AL-DUP 3001和AL-DUP 5386：

5’-GAACTGTGTGTGAGAGGTCCTTCTT-3’SEQ.ID NO.265；

为检测AL-DUP 5311

5’-GTGATCAGACTCAATACGAATTCTTCTT-3’SEQ.ID NO.266；

为检测衍生自AL-DUP 5048的siRNA(AL-DUP 5048、AL-DUP5167、AL-DUP 5168、AL-DUP 5169、AL-DUP 5170、AL-DUP 5182、AL-DUP 5183、AL-DUP 5385和AL-DUP 5546)

5’-GTCATCACACTGAATACCAATTCTTCT-3’SEQ.ID NO.267；

为检测衍生自AL-DUP 5024的siRNA(AL-DUP 5024、AL-DUP5163、AL-DUP 5164、AL-DUP 5165、AL-DUP 5166、AL-DUP 5180和AL-DUP 5181)

5’-AGGTGTATGGCTTCAACCCTGTCTTCT-3’SEQ.ID NO.268；

为检测衍生自AL-DUP 5002的siRNA(AL-DUP 5536和AL-DUP5537)

5’-GATTGATTGACCTGTCCATTCTCTTCTT-3’SEQ.ID NO.307；

为检测衍生自AL-DUP 5035的siRNA(AL-DUP 5538和AL-DUP5539)

5’-CACCAACTTCTTCCACGAGTCTCTTCTT-3’SEQ.ID NO.308；

为检测衍生自AL-DUP 5089的siRNA(AL-DUP 5540和AL-DUP5541)

5’-GAGTTTGTGACAAATATGGGCTCTTCTT-3’SEQ.ID NO.309；

为检测衍生自AL-DUP 5097的siRNA(AL-DUP 5542和AL-DUP5543)

5’-CTTTACAAGCCTTGGTTCAGTTCTTCTT-3’SEQ.ID NO.310；

为检测衍生自AL-DUP 5098的siRNA(AL-DUP 5544和AL-DUP5545)

5’-GGAATCTTATATTTGATCCAATCTTCTT-3’SEQ.ID NO.311。

另外，与肝脏(miRNA122)和空肠(miRNA143)中内源表达的微RNA杂交的两个探针被用作上样参照。

为检测miRNA 122：

5’-AAACACCATTGTCACACTCCATCTTCTT-3’SEQ.ID NO.269；

为检测miRNA143：

5’-GAGCTACAGTGCTTCATCTCATCTTCTT-3’SEQ.ID NO.270。

杂交之后，将450μl S1-核酸酶消化混合物加入到每个管中(450μlS1-反应混合物：333mM NaCl，2.2mM醋酸锌。66.7mM醋酸钠pH 4.5，0.02％Triton X-100和100 U S1-核酸酶；Amersham GE-Healthcare，Freiburg，Germany；cat.no.E2410Y)以降解全部未杂交的探针。将该消化反映混合物在37℃下孵育30分钟。通过加入在7μl 500mM EDTA pH8.0和900μl 95％乙醇中的30μg tRNA(Roche Diagnostics，Penzberg，Germany；109 541)终止该反应消化。在-20℃将得到保护的探针沉淀过夜，或者在-80℃沉淀90分钟。

沉淀后，通过变性凝胶电泳对得到保护的探针进行分析。将所沉淀的双链体RNA在4℃以16,200rcf离心10分钟。小心地将上清移弃。将沉淀溶解在12μlSTOP缓冲液(95％甲酰胺、5％EDTA 0.5M和0.02％二甲苯蓝中。将管加热到92℃2分钟，接着立即在冰上冷却。在变性测序凝胶(12.5％丙烯酰氨、1x标准TBE缓冲液、19cm×20cm×0.4mm长×宽×深；Rotiphorese DNA测序系统，Carl Roth GmbH & Co KG，Karlsruhe，5 Germany，cat.no.A431.1)上样4μl/泳道的该溶液。对该凝胶进行电泳45分钟，其在对应于大约30V/cm的电压梯度的600V下(EPS 3501XL，Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden；cat.no.18-1130-05)。在纸上将该凝胶干燥，并曝光到通用磷光板显像仪过夜(Amersham GE-Healthcare，Freiburg，Germany；cat.no.63-0034-88)。第二天，在Typhoon 9200高性能显像仪使有放射性的带显现。使用配有Typhoon 9200显像仪的2003.01版ImageQuant TL软件通过比较上样到凝胶上的每种有放射性探针的60、20、6.6和2.2fmol的梯度稀释进行比较进行对有放射性带的定量。

除了下面描述的涉及转基因动物以表达人ApoB的动物实验外，所有的动物实验都是遵守保护用于实验和其他科学用途的脊椎动物欧洲公约进行的。C57B1/6雄性小鼠是从Charles River Laboratories，Sulzfeld，Germany获得的，并在使用前适应至少5天。将这些动物饲养在22±2℃和55±10％rel.湿度下。昼/夜节奏为12小时，在上午6:00(亮)和下午6:00(黑)变化。除非下面有特别的说明，这些动物都被随意喂养Ssniff R/M-H食物(Ssniff Spezialdiaten GmbH，Soest，Germany，cat.No.Vl 531)。

进行下面的实验方案。

A.)3组，每组中7只年龄3.5个月的动物在连续的三天接受每日50mg/kg剂量的AL-DUP 5163、AL-DUP 5166(序列参见表10)或者等量的载体，并在第四天将其处死。确定总血清胆固醇、血清ApoB 100浓度和肝脏和空肠ApoB mRNA水平。

与其它方面完全相同的AL-DUP 5163相比，AL-DUP 5166有义链上位点4、6、8、12、14和20核苷酸的2’-O-甲基修饰为AL-DUP 5166提供了针对在血清中的降解的更高的稳定性(参见图3)。该实验被设计为测试小鼠ApoB特异siRNA下调ApoB基因在小鼠的肝脏和空肠中表达的能力，以及降低血清中ApoB蛋白水平和胆固醇水平的能力。该实验还测试了是否具有提高其在生物血清中稳定性的2’-O-Me修饰的siRNA在下调ApoB表达中比缺少2’OMe有义链修饰的siRNA更有效。

通过分支DNA测定法对肝脏和空肠组织中ApoB mRNA的水平进行检验。发现AL-DUP 5163将肝脏组织样品中ApoB mRNA的水平降低到对照动物的肝脏组织中存在的水平的50±13％。空肠中ApoBmRNA的水平被降低到对照动物中水平的40±6％。

发现AL-DUP 5166将肝脏组织中ApoB mRNA的水平降低到降低到对照动物的组织中的mRNA水平的59±9％。空肠中ApoB mRNA的水平被降低到对照动物中水平的14±3％。

B.)2组，每组中7只年龄3.5个月的动物连续三天接受每日50mg/kg剂量的AL-DUP 5167(序列参见表10)或者等量的载体的处理。在第四天将小鼠处死。确定总血清胆固醇、血清ApoB 100浓度和肝脏和空肠ApoB mRNA水平。

通过分支DNA测定法对ApoB mRNA水平进行检验。发现AL-DUP5167将来自经过处理的小鼠的肝脏组织样品中存在的ApoB mRNA水平降低到对照动物的肝脏组织中存在的mRNA水平的41±6％。空肠中ApoB mRNA的水平被降低到对照动物中水平的29±9％。小鼠血清中血清ApoB蛋白浓度为对照水平的101±9％，基本上没有变化。血清胆固醇被降低到载体对照的60±22％。

C.)3组，每组中7只年龄2.5个月的动物连续三天接受每日50mg/kg剂量的AL-DUP 5165或者等量的载体，并在第四天被处死。确定总血清胆固醇、血清ApoB 100浓度和肝脏ApoB mRNA水平。

与其它方面完全相同的AL-DUP 5163(序列参见表10)相比，AL-DUP 5165反义链上位点1、6、7、13、15和17核苷酸的2’-O-甲基修饰为AL-DUP 5 165提供了针对在血清中的降解的更高的稳定性(参见图3)，但这种稳定作用不如在AL-DUP 5166中所观察到的强。该实验被比较了具有提高其在生物血清中稳定性的反义链上2’-O-Me修饰的小鼠ApoB特异siRNA下调ApoB基因在小鼠的肝脏和空肠中表达的能力，以及降低血清ApoB蛋白水平和胆固醇水平的能力。该实验还测试了是否被修饰为具有在血清中提高的稳定性的siRNA在下调ApoB表达方面更有效。

分支DNA被用于检测ApoB mRNA的水平。发现AL-DUP 5165将来自经过处理的小鼠的肝脏组织样品中ApoB mRNA的水平降低到仅仅接受载体的对照动物的肝脏组织中存在的mRNA水平的68±12％。血清ApoB蛋白的浓度被降低到对照水平的63±6％。发现血清胆固醇为载体对照水平的99±26％，基本上没有变化。

D.)4组，每组6只年龄2.5个月的动物连续三天接受每日50mg/kg剂量的AL-DUP 5167、AL-DUP 3001、AL-DUP5311或者等量的载体，并在第四天被处死。确定总血清胆固醇、血清ApoB 100浓度，和肝脏与空肠ApoB mRNA水平。

AL-DUP 5167的核苷酸序列被表示在表10中。AL-DUP 5311和AL-DUP 3001的序列如下：

AL-DUP 5311

有义链：5′-gugaucagacugaauacgaau(Chol)-3

SEQ.ID No.271

反义链：5-auucguauugagucugaucacmamc-3′

SEQ.ID No.272

AL-DUP 3001

有义链：5′-gaacugugugugagagguccu(Chol)-3′

(SEQ.ID No.273)

反义链：5′-aggaccucucacacacaguuc_gmcm-3′

(SEQ.ID No.274)

AL-DUP 5311表示AL-DUP 5167的小鼠ApoB mRNA错配siRNA，其中在位点4、10、14和19制造了四个G/C转化。这种siRNA被用作与AL-DUP 5167进行比较的阴性对照。

AL-DUP 3001表示无关的对照siRNA。AL-DUP 3001有义链的位点1～20的序列相应于克隆载体pGL3-Basic(Promega GmbH，Mannheim，Germany，cat.no.El 751)(登记号：U47295)的1252～1272位核苷酸，并且其是编码萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶的序列的一部分。AL-DUP 3001用于作为AL-DUP 5167的另一个阴性对照。

本实验是为了确认使用AL-DUP 5167所得到的前面的发现，以进一步表示使用AL-DUP 5167所观察到的作用是序列特异性的。

通过分支DNA测定法确定ApoB mRNA水平。发现AL-DUP 5167将来自经过处理的小鼠的肝脏组织中ApoB mRNA的水平降低到对照动物的肝脏组织中存在的水平的36±11％。空肠中ApoB mRNA的水平被降低到对照动物中水平的27±8％。小鼠血清中血清ApoB蛋白被降低到大约载体对照水平的29±16％。血清胆固醇水平为73±35％，基本上没有变化。

发现AL-DUP 5311使来自经过处理的小鼠的肝脏组织中ApoBmRNA的水平为注射载体的对照动物的肝脏组织中存在的水平的95±16％，基本上没有变化。发现空肠中ApoB mRNA的水平基本在对照动物中水平的120±19％不变。血清ApoB蛋白浓度为载体对照水平的109±76％，基本上没有变化。发现血清胆固醇水平为载体对照的77±43％，基本上没有变化。

发现AL-DUP 3001使来自经过处理的小鼠的肝脏组织中ApoBmRNA的水平为注射载体的对照动物的肝脏组织中存在的水平的79±22％，基本上没有变化。发现空肠中ApoB mRNA的水平为对照动物中水平的130±33％，基本上没有变化。发现血清ApoB蛋白浓度为载体对照水平的104±55％，基本上没有变化。发现血清胆固醇水平为载体对照的108±46％，基本上没有变化。

E.)4组6只年龄2.5个月的动物连续三天接受每日50mg/kg剂量的AL-DUP 5167、AL-DUP 3001、AL-DUP5311或者等量的载体，或者连续三天接受每日10mg/kg剂量的AL-DUP 5167，或者连续三天接受每日2mg/kg剂量的AL-DUP 5167，或者仅仅在第一天接受一次剂量的50mg/kg。在第4天将小鼠处死。另外一组的6只动物在第一天，在它们背部肩胛骨稍后处接受了皮下渗透压泵移植(Alzet 1007D，ALZETOsmotic Pumps DURECT Corporation，Cupertino，CA，USA)。该泵被设置为释放0.5μl/hr的0.33mg/μlAL-DUP 5167溶液持续7天，其量达到每天的剂量为每只动物每天大约4mg/kg体重。在第8天将该组动物处死。确定总血清胆固醇、血清ApoB 100浓度，和肝脏与空肠ApoB mRNA水平。

前面给出了AL-DUP 5167、AL-DUP 5311和AL-DUP 3001的核苷酸序列。

该实验是为了确认前面利用AL-DUP 5167，且以载体、错配的siRNA(AL-DUP 5311)以及无关的siRNA(AL-DUP 3001)作为对照所得到的发现，以进一步确定是否推注静脉内连续3天2或10mg/kg体重的剂量，或者在第1天一次50mg/kg体重的剂量能够足以得到在上面(C)和(D)中连续3天静脉内50mg/kg体重的剂量时所观察到的作用。而且，该实验设计将这些给药方案与通过渗透压泵持续释放每天低剂量的4mg/kg体重持续7天进行比较。

根据分支DNA测定法所确定的，以50mg/kg体重的剂量静脉内给药连续3天，接着在第4天处死时，发现AL-DUP 5167将来自经过处理的小鼠的肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA水平降低到仅接受载体的动物的肝脏组织中存在的ApoB mRNA水平的69±17％，空肠中ApoB mRNA水平被降低到对照动物中水平的24±8％。小鼠血清中的血清ApoB蛋白浓度被降低到载体对照水平的69±9％。发现血清胆固醇为载体对照水平的95±29％，基本上没有变化。

根据分支DNA测定法所确定的，以10mg/kg体重的剂量静脉内给药连续3天，接着在第4天处死时，发现AL-DUP 5167使来自经过处理的小鼠的肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA水平为仅接受载体的动物的肝脏组织中存在的ApoB mRNA水平的81±32％，基本上没有变化，空肠中ApoB mRNA水平变为对照动物中水平的62±13％。小鼠血清中的血清ApoB蛋白浓度为载体对照水平的101±19％，基本上没有变化。发现血清胆固醇为载体对照水平的101±29％，基本上没有变化。

根据分支DNA测定法所确定的，以2mg/kg体重的剂量静脉内给药连续3天，接着在第4天处死时，发现AL-DUP 5167使来自经过处理的小鼠的肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA水平为仅接受载体的动物的肝脏组织中存在的ApoB mRNA水平的109±38％，基本上没有变化，空肠中ApoB mRNA水平变为对照动物中水平的97±21％。小鼠血清中的血清ApoB蛋白浓度为载体对照水平的115±13％，基本上没有变化。发现血清胆固醇为载体对照水平的114±26％，基本上没有变化。

根据分支DNA测定法所确定的，在第一天以50mg/kg体重的剂量静脉内给药一次，接着在第4天处死时，发现AL-DUP 5167将来自经过处理的小鼠的肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA水平降低到仅接受载体的动物的肝脏组织中存在的ApoB mRNA水平的41±20％，空肠中ApoB mRNA水平被降低到对照动物中水平的62±23％。小鼠血清中的血清ApoB蛋白浓度被降低到载体对照水平的52±11％。发现血清胆固醇为载体对照水平的95±25％，基本上没有变化。

根据分支DNA测定法所确定的，以50mg/kg体重的剂量静脉内给药连续3天，接着在第4天处死时，发现AL-DUP 5311使来自经过处理的小鼠的肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA水平为仅接受载体的动物的肝脏组织中存在的ApoB mRNA水平的100±16％，基本上没有变化，空肠中ApoB mRNA水平变为对照动物中水平的100±20％。小鼠血清中的血清ApoB蛋白浓度为载体对照水平的97±11％，基本上没有变化。发现血清胆固醇为载体对照水平的129±37％，基本上没有变化。

根据分支DNA测定法所确定的，以50mg/kg体重的剂量静脉内给药连续3天，接着在第4天处死时，发现AL-DUP 3001使来自经过处理的小鼠的肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA水平为仅接受载体的动物的肝脏组织中存在的ApoB mRNA水平的97±28％，基本上没有变化，空肠中ApoB mRNA水平变为对照动物中水平的101±16％。小鼠血清中的血清ApoB蛋白浓度被降低到载体对照水平的106±6％。发现血清胆固醇为载体对照水平的129±43％，基本上没有变化。

根据分支DNA测定法所确定的，以从渗透压泵释放每天4mg/kg体重的剂量持续7天，接着在第8天处死时，发现AL-DUP 5167使来自经过处理的小鼠的肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA水平为仅接受载体的动物的肝脏组织中存在的ApoB mRNA水平的79±24％，基本上没有变化，空肠中ApoB mRNA水平变为对照动物中水平的70±19％。小鼠血清中的血清ApoB蛋白浓度被降低到载体对照水平的106±6％。发现血清胆固醇为载体对照水平的129±43％，基本上没有变化。

F.)七组，每组中6只年龄为2.5个月的动物在第一天接受了一次推注给药50mg/kg的AL-DUP 5167。6只动物的一个对照组接受了等量的载体。在给药后12、24、36、60、84和108小时，将接受siRNA的多组动物处死。在给药后84小时，将接受载体的对照组处死。确定肝脏和空肠ApoB mRNA的水平。

上面提供了AL-DUP 5167的核苷酸序列。

设计本实验是为了获得AL-DUP 5167对肝脏和空肠中ApoBmRNA水平影响，以及对血清ApoB和胆固醇浓度影响的时间进程。

在静脉内给药50mg/kg AL-DUP 5167后12小时处死的动物中，在肝脏中发现了仅接受载体的动物肝脏组织中存在的ApoB mRNA水平的100±32％的ApoB mRNA水平，以及在空肠中发现了仅接受载体的动物的空肠组织中存在的ApoB mRNA水平的145±78％的ApoBmRNA水平。在小鼠血清中，血清ApoB蛋白浓度被确定为载体对照水平的124±14％。

在静脉内给药50mg/kg AL-DUP 5167后24小时处死的动物中，在肝脏中发现了仅接受载体的动物肝脏组织中存在的ApoB mRNA水平的85±21％的ApoB mRNA水平，以及在空肠中发现了仅接受载体的动物的空肠组织中存在的ApoB mRNA水平的84±32％的ApoB mRNA水平。在小鼠血清中，血清ApoB蛋白浓度被确定为载体对照水平的92±52％。

在静脉内给药50mg/kg AL-DUP 5167后36小时处死的动物中，在肝脏中发现了仅接受载体的动物肝脏组织中存在的ApoB mRNA水平的64±20％的ApoB mRNA水平，以及在空肠中发现了仅接受载体的动物的空肠组织中存在的ApoB mRNA水平的88±19％的ApoB mRNA水平。在小鼠血清中，血清ApoB蛋白浓度被确定为载体对照水平的55±12％。

在静脉内给药50mg/kg AL-DUP 5167后60小时处死的动物中，在肝脏中发现了仅接受载体的动物肝脏组织中存在的ApoB mRNA水平的73±10％的ApoB mRNA水平，以及在空肠中发现了仅接受载体的动物的空肠组织中存在的ApoB mRNA水平的41±13％的ApoB mRNA水平。在小鼠血清中，血清ApoB蛋白浓度被确定为载体对照水平的43±16％。

在静脉内给药50mg/kg AL-DUP 5167后84小时处死的动物中，在肝脏中发现了仅接受载体的动物肝脏组织中存在的ApoB mRNA水平的73±13％的ApoB mRNA水平，以及在空肠中发现了仅接受载体的动物的空肠组织中存在的ApoB mRNA水平的68±22％的ApoB mRNA水平。在小鼠血清中，血清ApoB蛋白浓度被确定为载体对照水平的54±15％。

在静脉内给药50mg/kg AL-DUP 5167后108小时处死的动物中，在肝脏中发现了仅接受载体的动物肝脏组织中存在的ApoB mRNA水平的68±15％的ApoB mRNA水平，以及在空肠中发现了仅接受载体的动物的空肠组织中存在的ApoB mRNA水平的85±15％的ApoB mRNA水平。在小鼠血清中，血清ApoB蛋白浓度被确定为载体对照水平的51±8％。

G.)五组，每组中1 只年龄为2.5个月的动物，连续三天每日静脉内接受50mg/kg体重剂量的AL-DUP 5167、AL-DUP 5385、AL-DUP5311、AL-DUP 5386或者等量的载体，一组7只动物根据相同的给药方案接受AL-DUP 5163，在第4天处死所有的动物。确定总血清胆固醇、血清ApoB 100浓度以及肝脏和空肠ApoB mRNA水平。另外，根据S1-核酸酶保护检验估计肝脏样品中存在的siRNA的量(参见图6)。

上面提供了AL-DUP 5167、AL-DUP 5163和AL-DUP 5311的核苷酸序列。AL-DUP 5385和AL-DUP 5386的核苷酸序列为：

AL-DUP 5385

有义链：5-gucaucacacugaauaccaau-3′

SEQ.ID NO.275

反义链：5′-auugguauucagugugaugacmamc-3′

SEQ.ID NO.276

AL-DUP 5386

有义链：5′-gaacugugugugagagguccu(Chol)-3′

SEQ.ID NO.277

反义链：5 ′-aggaccucucacacacaguucmgmc-3′

SEQ.ID NO.278

AL-DUP 5385与AL-DUP 5167完全相同，除了AL-DUP 5385在其有义链的3’-末端不具有胆固醇部分，并且在其有义链的位点20和21之间具有硫代磷酸酯键。后面的硫代磷酸酯键是为了提供与具有硫代磷酸酯键的胆固醇修饰相似的对核酸外切降解的保护。(参见图1)

AL-DUP 5386与AL-DUP 3001完全相同，除了反义链的位点23的2’-O-甲基修饰被去除，并在位点21加入了2’-O-甲基修饰。这被认为AL-DUP 5386提供了比AL-DUP 3001优越的对降解的稳定作用。

设计本实验是为了确认在上面(E)中所得到的结果，以进一步将偶联胆固醇的AL-DUP 5167的活性与在其他方面完全相同只是缺少胆固醇的AL-DUP 5385的活性进行比较，以确认利用AL-DUP观察到的抑制ApoB mRNA表达活性的缺失不是由于经过处理的小鼠的血液中AL-DUP 3001的快速降解。

根据分支DNA测定法所确定的，发现AL-DUP 5167将在来自经过处理的小鼠的肝脏组织中存在的ApoB mRNA水平降低到在仅接受载体的动物的肝脏组织中存在的mRNA水平的43±6％，空肠中ApoBmRNA的水平被降低到对照动物水平的27±10％。小鼠血清中血清ApoB蛋白浓度被降低到载体对照水平的32±14％。小鼠血清中血清胆固醇浓度被降低到载体对照水平的63±11％。通过S1-核酸酶保护检验，在肝脏和空肠组织样品中检测到大约100-200ng/g组织的AL-DUP 5167(图6A)。

根据分支DNA测定法所确定的，发现AL-DUP 5163将在来自经过处理的小鼠的肝脏组织中存在的ApoB mRNA水平降低到在仅接受载体的动物的肝脏组织中存在的mRNA水平的64±8％，空肠中ApoBmRNA的水平被降低到对照动物水平的49±13％。小鼠血清中血清ApoB蛋白浓度被降低到载体对照水平的66±20％。小鼠血清中血清胆固醇浓度为载体对照水平的94±10％，基本上没有变化。通过S1-核酸酶保护检验，在肝脏和空肠组织样品中检测到大约50-150ng/g组织的AL-DUP5163。

根据分支DNA测定法所确定的，发现AL-DUP 5385使在来自经过处理的小鼠的肝脏组织中存在的ApoB mRNA水平为仅接受载体的动物的肝脏组织中存在的mRNA水平的84±12％，基本上没有变化，空肠中ApoB mRNA的水平变为对照动物水平的115±25％。发现小鼠血清中血清ApoB蛋白浓度为载体对照水平的101±24％，没有变化。小鼠血清中血清胆固醇浓度为载体对照水平的97±10％，基本上没有变化。在S1-核酸酶保护检验中，在肝脏和空肠组织样品中没有能够检测到的残余AL-DUP 5385(图6A)。

根据分支DNA测定法所确定的，发现AL-DUP 5311使在来自经过处理的小鼠的肝脏组织中存在的ApoB mRNA水平为仅接受载体的动物的肝脏组织中存在的mRNA水平的96±16％，基本上没有变化，空肠中ApoB mRNA的水平变为对照动物水平的96±28％。发现小鼠血清中血清ApoB蛋白浓度为载体对照水平的102±32％，没有变化。小鼠血清中血清胆固醇浓度为载体对照水平的104±10％，基本上没有变化。通过S1-核酸酶保护检验，在肝脏和空肠组织样品中检测到大约50-200ng/g组织的AL-DUP 5311(图6A)。

根据分支DNA测定法所确定的，发现AL-DUP 5386使在来自经过处理的小鼠的肝脏组织中存在的ApoB mRNA水平为仅接受载体的动物的肝脏组织中存在的mRNA水平的89±11％，基本上没有变化，空肠中ApoB mRNA的水平变为对照动物水平的85±14％。发现小鼠血清中血清ApoB蛋白浓度为载体对照水平的94±31％，没有变化。小鼠血清中血清胆固醇浓度为载体对照水平的104±10％，基本上没有变化。通过S1-核酸酶保护检验，在肝脏和空肠组织样品中检测到大约50-200ng/g组织的AL-DUP 5386(图6A)。

H.)：六组，每组中年龄为2.5个月的6只动物接受了单次静脉内推注给药100、50、25或者12.5mg/kg体重的AL-DUP 5167，或者等量的载体。在给药72小时候将这些动物处死。确定总血清胆固醇、血清ApoB 100浓度以及肝脏和空肠ApoB mRNA水平。

前面在表10中提供了AL-DUP 5167的核苷酸序列。

进行本实验是为了评估AL-DUP 5167的剂量响应。

根据分支DNA测定法所确定的，以100mg/kg体重的剂量，发现AL-DUP 5167将来自经过处理的小鼠的肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA水平降低到仅接受载体的动物的肝脏组织中存在的ApoBmRNA水平的48±13％，空肠中ApoB mRNA水平被降低到对照动物中水平的37±3％。小鼠血清中的血清ApoB蛋白浓度被降低到载体对照水平的57±14％。血清胆固醇被降低为载体对照水平的71±14％。

根据分支DNA测定法所确定的，以50mg/kg体重的剂量，发现AL-DUP 5167将来自经过处理的小鼠的肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA水平降低到仅接受载体的动物的肝脏组织中存在的ApoBmRNA水平的79±13％，空肠中ApoB mRNA水平被降低到对照动物中水平的67±15％。小鼠血清中的血清ApoB蛋白浓度被降低到载体对照水平的69±17％。血清胆固醇被降低为载体对照水平的90±28％，基本上没有变化。

根据分支DNA测定法所确定的，以25mg/kg体重的剂量，发现AL-DUP 5167使来自经过处理的小鼠的肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA水平为仅接受载体的动物的肝脏组织中存在的ApoBmRNA水平的96±7％，基本上没有变化，空肠中ApoB mRNA水平被降低到对照动物中水平的56±11％。小鼠血清中的血清ApoB蛋白浓度被确定为载体对照水平的68±26％。发现血清胆固醇为载体对照水平的93±8％，基本上没有变化。

根据分支DNA测定法所确定的，以12.5mg/kg体重的剂量，发现AL-DUP 5167使来自经过处理的小鼠的肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA水平为仅接受载体的动物的肝脏组织中存在的ApoBmRNA水平的90±14％，基本上没有变化，空肠中ApoB mRNA水平为对照动物中水平的77±22％，没有变化。小鼠血清中的血清ApoB蛋白浓度被确定为载体对照水平的95±5％。发现血清胆固醇为载体对照水平的91±14％，基本上没有变化。

I)：八组，每组中6只年龄为2.5个月的动物接受了一次静脉内推注100mg/kg体重的AL-DUP 5167(序列，参见表10)剂量，或者等量的载体。在给药后18小时、66小时、96小时、168小时和336小时将使用AL-DUP 5167处理的这些组动物处死，在给药后18小时、66小时和240小时，将使用载体处理的这些组动物处死。将240小时后处死的组用作对照，所有的数值都表达为这组中所得到的平均值的百分数。确定总血清胆固醇、血清ApoB 100浓度以及肝脏和空肠ApoBmRNA水平。S1-核酸酶保护检验被用于确定肝脏组织中存在的AL-DUP-5167的量。

设计该实验是为了确认AL-DUP 5167对肝脏和空肠中ApoBmRNA水平影响，以及对血清ApoB以及胆固醇浓度的时间进程，以延长观察的时间。

给药18小时后，在肝脏样品中回收了3.3μg/g组织的AL-DUP5167，其在66小时后下降到22ng/g组织，在其之后低于能够检测的极限。

在静脉内注射100mg/kg AL-DUP 5167之后18个小时被处死的动物中，在其肝脏中发现240小时载体对照组的肝脏组织中所存在的ApoB mRNA的37±16％的ApoB mRNA，在空肠中发现240小时载体对照组的空肠组织中所存在的ApoB mRNA的87±29％的ApoB mRNA。小鼠血清中的血清ApoB蛋白浓度被降低到载体对照水平的XX±X％。

在静脉内注射100mg/kg AL-DUP 5167之后66个小时被处死的动物中，在其肝脏中发现240小时载体对照组的肝脏组织中所存在的ApoB mRNA的47±7％的ApoB mRNA，在空肠中发现240小时载体对照组的空肠组织中所存在的ApoB mRNA的43±8％的ApoB mRNA。小鼠血清中的血清ApoB蛋白浓度被降低到载体对照水平的XX±X％

在静脉内注射100mg/kg AL-DUP 5167之后96个小时被处死的动物中，在其肝脏中发现240小时载体对照组的肝脏组织中所存在的ApoB mRNA的38±9％的ApoB mRNA，在空肠中发现240小时载体对照组的空肠组织中所存在的ApoB mRNA的78±14％的ApoB mRNA。小鼠血清中的血清ApoB蛋白浓度被降低到载体对照水平的XX±X％。

在静脉内注射100mg/kg AL-DUP 5167之后168个小时被处死的动物中，在其肝脏中发现240小时载体对照组的肝脏组织中所存在的ApoB mRNA的57±5％的ApoB mRNA，在空肠中发现240小时载体对照组的空肠组织中所存在的ApoB mRNA的87±27％的ApoB mRNA。小鼠血清中的血清ApoB蛋白浓度被降低到载体对照水平的XX±X％。

在静脉内注射100mg/kg AL-DUP 5167之后336个小时被处死的动物中，在其肝脏中发现240小时载体对照组的肝脏组织中所存在的ApoB mRNA的94±10％的ApoB mRNA，在空肠中发现240小时载体对照组的空肠组织中所存在的ApoB mRNA的109±12％的ApoBmRNA。小鼠血清中的血清ApoB蛋白浓度被降低到载体对照水平的XX±X％。

在静脉内注射100mg/kg盐水对照AL-DUP 5167之后18个小时被处死的动物中，在其肝脏中发现240小时载体对照组的肝脏组织中所存在的ApoB mRNA的83±21％的ApoB mRNA，在空肠中发现240小时载体对照组的空肠组织中所存在的ApoB mRNA的109±26％的ApoBmRNA。小鼠血清中的血清ApoB蛋白浓度被降低到载体对照水平的51±8％。

在静脉内注射100mg/kg AL-DUP 5167之后18个小时被处死的动物中，在其肝脏中发现240小时载体对照组的肝脏组织中所存在的ApoB mRNA的104±19％的ApoB mRNA，在空肠中发现240小时载体对照组的空肠组织中所存在的ApoB mRNA的97±21％的ApoB mRNA。小鼠血清中的血清ApoB蛋白浓度被降低到载体对照水平的51±8％。

本实验表明偶联胆固醇的siRNA的功能可以在肝脏中持续7天或者更长，在肠中持续3天或者更长。后者与肠内的肠细胞的平均寿命一致。

从实验A)～I)得出的结论：基于siRNA的抑制基因表达的重要考虑是是否所观察到的影响是特异的，而且不是由于“脱靶”效应以及已经在体外和其他基于寡聚核苷酸的方法利用siRNA所报道的可能干扰反应。在我们的实验中利用多种独立的针对ApoB mRNA不同序列区域的siRNA观察到了偶联胆固醇的siRNA的ApoB特异性效应。而且，ApoB的体内沉默是特异性的，因为非特异的siRNA和错配对照siRNA都不能介导ApoBmRNA、血浆ApoB蛋白水平或者总胆固醇水平的显著降低。偶联胆固醇的ApoB特异性siRNA而不是未偶联的ApoB特异性siRNA表现出了生物活性，这说明胆固醇偶联在达到系统性体内活性的重要作用，并暗示通过化学偶联策略进一步优化基于系统给药的活性的可能。

实例8.胆固醇稳定siRNA活性

在体内探索合成的siRNA沉默内源靶基因的能力中，我们已经发现化学稳定的和偶联胆固醇的siRNA在体外和体内具有显著提高的药理学性能。在有义链和反义链上具有部分硫代磷酸酯骨架和2’-O-甲基修饰的化学稳定的siRNA表现出对血清和组织匀浆中的核酸外切酶和核酸内切酶的显著提高的抗性。在siRNA有义链的3’-末端通过吡咯烷连接物偶联胆固醇(进而产生胆固醇偶联的siRNA)不会导致细胞培养中基因沉默活性的显著丧失。在瞬时从转染的质粒表达荧光酶的HeLa细胞中，在不存在转染试剂或者电转的情况下，只有偶联胆固醇的siRNA会抑制荧光酶的表达(IC₅₀ 200nM)，而不偶联的siRNA则没有活性。通过表面电浆共振测定确定偶联胆固醇的siRNA与人血清白蛋白(HSA)的结合；未偶联的siRNA没有表现出与HAS的任何结合，而发现偶联胆固醇的siRNA结合到HAS，其估计的K_D＝1μM。由于增强的与血清蛋白的结合，通过静脉注射为大鼠注射的偶联胆固醇的siRNA与未偶联的siRNA相比表现出改进的药物动力学性能。在以50mg/kg在大鼠中静脉注射后，放射标记偶联胆固醇的siRNA在血浆中具有t_1/2＝95+/-13分钟，这是通过曲线拟合确定的，其假设了二室模型(two compartment model)，一级消除率，并利用WinNonLin 4.1(Pharsight Corporation，Mountain View，CA，USA)。在小鼠中静脉推注注射一次50mg/kg后24小时，根据RNA酶保护检验，偶联胆固醇的siRNA表现出广泛的组织生物分布。然而，在组织样品中没有观察到可以检测量的偶联siRNA，在肝脏、心脏、肾和肺样品中检测到了大约200ng/g的显著水平的偶联胆固醇的siRNA。共同的，这些研究说明胆固醇偶联显著改进siRNA的体内药物动力学性能。

实例9.人ApoB-100转基因小鼠中ApoB的表达被人和小鼠ApoB特异性的siRNA降低

试验程序是由Alnylam机构动物管理与使用委员会许可的，并且根据Massachusetts州Cambridge城关于动物福利的规章进行。

从Taconic(Taconic，Germantown，NY，USA，cat.no.1004-T)获得半合子雄性人ApoB-100转基因小鼠(动物株名称：B6.SSJL-Tg(APOB100)N20)，并将其在恒定的温度和湿度下在12小时光亮/黑暗循环(上午6:30/下午6:30)的条件下进行饲养，并喂养经过照射的标准啮齿动物食物(PicoLabRodent Diet 20，Purina Mills，LLC，St.Louis，MO，USA，cat.no.5053)。

将年龄为30～32的动物分成3组，每组8只进行处理。一组接收三天的每日尾部静脉注射(给药间隔24小时)磷酸缓冲液(10μl/g体重)。另一组，接受三天的每日尾部静脉注射(给药间隔24小时)50mgsiRNA AL-DUP 5167/kg体重，其给药体积为10μl/g体重。第三组接受三天的每日尾部静脉注射(给药间隔24小时)50mg siRNA AL-DUP5311/kg体重，其给药体积为10μl/g体重。将siRNA双链体配制在磷酸酯缓冲液中。

在最后的注射24小时后，将这些动物通过CO₂窒息处死。从每只动物收获整个肝脏以及对应空肠的小肠片段，并在液氮中进行快速冷冻。使用研钵和碾槌将冷冻的组织研磨成细粉。

将大约10mg的每种组织粉末加入到冰冷的1.5mlEppendorf管中，并加入含有3.3μl(10μl/3ml)50μg/μl蛋白酶K(Epicentre，Madison，WI，USA，cat.No.MPRK092)贮液的细胞裂解溶液(Epicentre，Madison，WI，USA，cat.No.MTC096H)。将这些管旋涡并在65℃下孵育15分钟；每5分钟漩涡一次。在室温下以5000rcf10分钟将细胞碎片沉淀，并将800μl上清转到新管中。立即将裂解物用于分支DNA测定法(上面所描述的)，以确定ApoB和GAPDH mRNA的相对水平，或保存在-80℃以后使用。

发现ApoB特异性的siRNA AL-DUP 5167降低了小鼠ApoB mRNA的水平(显著差异为p＜0.01)；在被AL-DUP 5167处理的动物中发现了载体处理小鼠中小鼠ApoB mRNA水平43±10％的肝脏中ApoBmRNA水平，以及58±12％的空肠中ApoB mRNA水平。人的肝脏中ApoB mRNA被降低到对照动物的肝脏中水平的40±10％。发现错配对照siRNA AL-DUP 5311使ApoB mRNA水平基本上没有变化；在被AL-DUP 5167处理的动物中发现了载体处理小鼠中小鼠ApoB mRNA水平93±20％的肝脏中ApoB mRNA水平，以及104±13％的空肠中ApoBmRNA水平。肝脏中的人ApoB mRNA被确定为对照动物肝脏中水平的92±24％。

实例10：特异性的ApoB切割位点可以被5’-RACE PCR所鉴定

引物是从Operon Biotechnologies，Inc.(Alameda，CA，USA)购买的。

通过5’-RACE(如在Llave等人，Science 2002，297：2053-6；和Yekta等人，Science 2004，304：594-6中所描述的)，使用下面的修饰和下面提供的引物，对来自上面实验(实例7)处理组(G.)每一只动物的汇集的肝脏和空肠的ApoB mRNA的特异性诱导切割产物进行鉴定。在这种实验中，接头与RNA样品中存在的具有5’-磷酸的RNA发生反应，例如联合siRNA的RISC对mRNA的3’切割产物。大部分(如果不是全部的话)由核酸酶催化的核酸水解反应的产物不含有5’-磷酸，因此不会与该接头反应。在后续的PCR反应中，只有含有这些接头序列以及目标基因序列的分子类型被通过选择适当的引物扩增。

在连接RACE接头(″GeneRacer″接头，Invitrogen)之后，使用基因特异型引物5167GSP对cDNA合成进行引导，以产生“5167”cDNA。使用下面的引物对，在连续PCR反应中进行对相应于ApoB的序列进行扩增：

PCR反应1：GR5‘-Xbal(正向)+5167 ApoB Rev2-Sall(反向)

PCR反应2：GS5‘Nest F-Xbal(正向)+5167 ApoB Rev3-SalI(反向)

将50倍稀释的PCR反应1用于PCR反应2中。通过琼脂糖凝胶电泳对每次PCR反映的产物进行分析，并通过溴化乙啶染色进行显现。在接受AL-DUP 5167动物的肝脏和接受AL-DUP 5167动物的空肠中发现了对应于的siRNA引导切割的预计特异性条带，并且达到比AL-DUP5385低的程度(参见图7)。

从PCR反应1切出特异性条带，并进行测序(测序引物：5167 ApoBRev3-Sall)以确认在RACE接头和小鼠ApoB的核苷酸1026(登记号：XMl 37955)之间存在的连接。

为了特异性地扩增对应预计的siRNA切割位点的片段，将PCR反应1稀释50倍，并使用下面的引物对进行扩增：

PCR反应3：iApoB 5167-XbaI(正向)+5167 ApoB Rev3-Sall(反向)

如果并且只有如果在PCR反应1中出现结合RACE接头和ApoBmRNA的RISC切割产物反应产物的话，其中所述ApoB mRNA的切割是通过AL-DUP 5167所介导的RNA干扰而预计的，在PCR反应3中才形成PCR产物。如上所述，使该PCR反应的产物显现(图7)。如上对所扩增的条带进行确认性测序。

引物序列：

GR5’-XbaI

5′-CTCTAGAGCGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3′SEQ.ID NO.279GS5’Nest F-XbaI

5′-CTCTAGAGGGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3′SEQ.ID NO.2805167GSP

5′-CTCCTGTTGCAGTAGAGTGCAGCT-3′SEQ.ID NO.2815167ApoB Rev2-SalI

5′-ACGCGTCGACGTGGGAGCATGGAGGTTGGCAGTTGTTC-3′SEQ.ID NO.2825167 ApoB Rev3-SalI

5′-ACGCGTCGACGTAATGGTGCTGTCATGACTGCCCTT-3′SEQ.ID NO.283iApoB 5167-XbaI

5′-CTCTAGAGCATGGACTGAAGGAGTAGAAAGAA-3′SEQ.ID NO.284

实例11：对修饰的siRNA进一步的测试

设计进一步修饰的siRNA

测试AL-DUP 5002、AL-DUP 5035、AL-DUP 5048、AL-DUP 5089、AL-DUP 5097和AL-DUP 5098的进一步的siRNA修饰版本的稳定性，以及抑制ApoB表达的活性。合成AL-DUP 5048的修饰版本，其具有通过吡咯烷连接物偶联到有义链3’-末端的胆固醇。对于未修饰iRNA试剂AL-DUP 5002、AL-DUP 5035、AL-DUP 5089、AL-DUP 5097和AL-DUP 5098的每一种，iRNA试剂是使用21个核苷酸的有义链、形成2个核苷酸的3’突出端的23个核苷酸的反义链进行合成的，在其有义链3’-末端具有通过含有硫代磷酸酯的连接物连接的胆固醇部分，在其反义链的位点21和22具有2’-O-甲基核苷酸，在其反义链的位点21和22之间以及位点22和23之间具有硫代磷酸酯键。这种结构对应于在AL-DUP 5167中已经使用的修饰模式，并且用于保护iRNA试剂免于核酸外切酶的降解活性。

另外，合成了另一种iRNA试剂，其代表了AL-DUP 5002、AL-DUP5035、AL-DUP 5089、AL-DUP 5097和AL-DUP 5098的修饰版本，在其有义链3’-末端具有通过含有硫代磷酸酯的连接物连接的胆固醇部分，在其反义链所有序列基序5’-UA-3’、5’-CA-3’、5’-UU-3’和5’-UG-3’的位点具有2’-O-甲基核苷酸，以及在其反义链的位点21和22之间以及位点22和23之间具有硫代磷酸酯键。制造这些额外的修饰以保护这些siRNA免于核酸内切酶的降解活性。表11中列出了相应的序列。

表11：用于稳定性和活性检验的被修饰的iRNA试剂

双链体描述符	SEQ.IDNo.	正义链序列	SEQ.IDNo.	反义链序列
					AL-DUP 5546	285	gucaucacacugaaua ccaau(chol)	286	caggguugaagccauacaccumcmu
AL-DUP 5536	287	gaumumgaumumgaccumguccmaumuc(chol)	288	gaaumggacmaggucaaucmaaucmumu
					AL-DUP 5537	289	gauugauugaccuguccauuc(chol)	290	gaauggacaggucaaucaaucmumu
AL-DUP 5538	291	cmaccmaacumucumuccmacgaguc(chol)	292	gacucgumggaagaagumumggumgmumu
					AL-DUP 5539	293	caccaacuucuuccacgaguc(chol)	294	gacucguggaagaaguuggugmumu
AL-DUP 5540	295	gagumumumgumgacm aaaumaumgggc(chol)	296	gcccmaumaumumumgucmacmaaacucmcma
					AL-DUP 5541	297	gaguuugugacaaauaugggc(chol)	298	gcccauauuugucacaaacucmcma
AL-DUP 5542	299	cumumumacmaagccumumggumucmagu(chol)	300	acumgaaccmaaggcumumgumaaagmumg
					AL-DUP 5543	301	cuuuacaagccuugguucagu(chol)	302	acugaaccaaggcuuguaaagmumg
AL-DUP 5544	303	ggaaucumumaumaum umumgauccmaa(chol)	304	umumggaucmaaaumaumaagaumuccmcmu
					AL-DUP 5545	305	ggaaucuuauauuugau ccaa(chol)	306	uuggaucaaauauaagauuccmcmu

m＝2’O-甲基修饰；“(chol)”表示通过包含硫代磷酸酯的吡咯烷连接物偶联到3’-末端的胆固醇；“(chol)”表示通过缺少硫代磷酸酯的吡咯烷连接物偶联到3’-末端的胆固醇。

siRNA稳定性测试

测试了siRNA(表11中表示了它们的序列)的稳定性，其通过在人血清中进行孵育(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，Germany，cat.No.Hl 513)接着通过HPLC进行片断的分离。将50μM的每种siRNA的磷酸酯缓冲液(PBS，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，Germany)溶液与血清以10∶1(血清：siRNA)的比例孵育30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、16小时和24小时，并按照下面所描述的对样品进行分析。

通过HPLC在对血清样品进行蛋白酶K处理后确定siRNA降解的时间进程。

蛋白酶K(20mg/ml)是从peQLab(Erlangen，Germany；Cat-No.04-1075)获得的，并将其与去离子水1∶1稀释到终浓度10mg/ml的蛋白酶K。新制备蛋白酶K缓冲液(4.0ml TRIS-HCl、1M pH7.5、1.0mlEDTA 0.5M、1.2ml NaCl 5M和4.0ml SDS 10％)，并将其保存在50℃直到使用以避免沉淀。

40个核苷酸的多聚(L-dT)((L-dT)₄₀)是从Noxxon Pharma AG(Berlin，Germany)获得的，并被用作内部标准。与由R-对映异构体构成的天然核酸相比，L-对映异构体的聚合物表现出了对核酸水解降解的特别的稳定性，而在其它方面也具有非常相似的性能。

在完成每一个孵育时期后，为了终止siRNA降解，立刻将25μl蛋白质酶K缓冲液加入到血清孵育样品中，以最高速度将该混合物漩涡5秒(Vortex Genie 2，Scientific Industries，Inc.，Bohemia，NY，USA，cat.no.SI 0256)，在漩涡5秒之后，加入8μl蛋白酶K(10mg/ml)，最后将该混合物在恒温混合仪在42℃和1050rpm下孵育20分钟。

向每个孔中，加入5μl 50μM(L-dT)₄₀溶液(250pmol)作为内部标准，将该溶液漩涡5秒，在桌面离心机上将该管离心1分钟以在底部收集所有附着到孔壁上的液滴。将该溶液转到96孔Captiva 0.2μm过滤板(Varian，Germany，Cat.No.A5960002)，并通过21900rcf离心45分钟进行过滤。

使用47.5μl去离子水(18，2mΩ)对孵育孔进行清洗，将该清洗液利用21900rcf 15分钟过滤通过Captiva Filter Unit，接着重复该清洗步骤。在第二次清洗步骤之后，回收平均大约180μl的总体积(理论总体积为200μl)。

从降解产物中利用离子交换色谱对siRNA单连进行互相分离：

在变形条件下使用Dionex BioLC HPLC系统，其配有内部脱气装置、自动取样器、柱式加热炉以及固定波长UV-检测器(Dionex GmbH，Idstein，Germany)。标准的运行参数如下：

柱：Dionex DNA-PaclOO；4×250mm

温度：75℃

洗脱液A：10mM NaClO₄，20mM TRIS-HCl，1mM EDTA；10％乙腈，pH＝8.0

洗脱液B：800mM NaClO₄，20mM TRIS-HCl，1mM EDTA；10％乙腈，pH＝8.0

检测：在260nm处

梯度：0～1分钟：10％B

      1-11分钟：10％-＞35％B

      11-12分钟：35％B-＞100％B

      12-14分钟：100％B-＞10％B

      14-16分钟：10％B达到柱的重新平衡

注射体积：20μl

如果siRNA的两条链之间的分离不满意，或者降解片断与一条链共同洗脱，则通过改变温度、pH、用NaBr替代NaClO₄、乙腈的浓度以及/或者调解洗脱梯度的斜率，直到对来自有义链与反义链的波峰进行单独定量。

通过使用由工具厂商所提供的软件(Chromeleon 6.6；Dionex GmbH，Idstein，Germany)对UV检测器信号的整合，得到了全长链的波峰。

数据分析：

从所有的样品和标准化的对照获得了积分的有义链、反义链以及内部标准的峰面积。

通过计算实验峰面积与理论内部标准峰面积的比例来确定每种样品的校正因子CF，其代表在过滤步骤和清洗步骤中的液体损失。理论内部标准峰面积是从例如内部标准的校准曲线和使用关系式相应于计算25pmol(L-dT)₄₀的理论峰面积得到的，其中所述内部标准的校准曲线是通过将50μl的50μM(L-dT)₄₀的每种系列稀释注射到HPLC柱上得到的，  所述的理论峰面积是从稀释系列通过峰面积的线性最小二乘拟合得到的。用于有义链和反义链的峰面积的校正因子CF是从如下得到的：

CF＝峰面积_内部标准(理论)/峰面积_内部标准(样品)

这种处理假设，通过两次清洗过滤器，在组合的过滤物中大打了实际上完全的回收，并校正残余在过滤器上的不同体积的清洗水，这样可以对来自不同样品的峰面积进行比较。

接着将在每个时间点得到的有义链和反义链的峰面积与校正因子CF相乘以得到标准化的峰面积(NPA_{有义链，t}，NPA_{反义链，t})：

NPA_{有义链或反义链，t}＝(峰面积_{有义链或反义链，t})XCF

为了获得在时间t，有义链和反义链的残余全长产物的相对量(％FLP)，将每种链在t＝0分钟经过标准化的峰面积(NPA_{有义链，t＝0}，NPA_{反义链，t＝0})设定为100％，将在其他时间点的NPA除以这些数值。

从对照样品(将siRNA仅与退火缓冲液孵育时)获得的数值，可以作为该方法精确度的对照。两种链的％FLP都应该在100％附近，包括了误差富余，而不论孵育的时间。

接着可以计算每种链的降解半衰期t_1/2，假设来自对ln(％FLP)图的线性最小二乘拟合的斜率的一级动力学为：

t_1/2＝ln(0，5)/斜率

表11的序列所描述的siRNA的血清半衰期

表12种提供了表11的序列所描述的siRNA全长产物的降解半衰期。从AL-DUP 5546反义链的半衰期与其有义链或者AL-DUP 5547的反义链的半衰期的差别明显的是，通过2’-O-甲基和3’-倒数第二个核苷酸的硫代磷酸酯对3’-末端的保护提供了在降解半衰期方面大约6～7倍的提高。在其倾向于核酸内切降解的位点进行取代2’-O-甲基修饰的核苷酸，会进一步提高半衰期大约3～4倍，除了平均提高倍数为20倍的AL-DUP 5543。

表12：具有不同稳定修饰的siRNA的血清半衰期

双链体描述符	t1/2(有义链)[h]	t1/2(反义链)[h]	平均提高倍数1
				AL-DUP 5167	8.7	6.5	4
AL-DUP 5546	6.8	0.9
				AL-DUP 5536	22.7	16.6	3
AL-DUP 5537	7.4	7.7
				AL-DUP 5538	21.1	18.4	4
AL-DUP 5539	6.3	3.7
				AL-DUP 5540	27.3	24.7	3
AL-DUP 5541	8.2	9.0
				AL-DUP 5542	40.3	15.9	20
AL-DUP 5543	1.5	1.2
				AL-DUP 5544	17.5	14.9	3
AL-DUP 5545	5.7	6.8

¹[(t_1/2(修饰的有义链)/t_1/2(未修饰的有义链))+(t_1/2(修饰的有义链))/t_1/2(未修饰的有义链)))/2]

被修饰的siRNA抵抗核酸内切降解的体外活性

表11的体内活性按照上面的实例3被进行检测。结果表示在表13中

表13被修饰的siRNA抵抗核酸内切降解的体外活性比较

双链体描述符	IC50修饰的[nM]	双链体描述符	IC50未修饰的[nM]
				AL-DUP 5167	0.4	AL-DUP 5546	0.5
AL-DUP 5536	0.6	AL-DUP 5537	0.6
				AL-DUP 5538	21	AL-DUP 5539	1
AL-DUP 5540	7	AL-DUP 5541	7
				AL-DUP 5542	3	AL-DUP 5543	6
AL-DUP 5544	7	AL-DUP 5545	4

从表13中AL-DUP 5167和AL-DUP 5546的IC₅₀之间的比较看，明显的是在AL-DUP 5167的反义链位点21和22之间，位点22和23之间引入硫代磷酸酯键，在反义链的位点21和22引入2’-O-甲基不会负面影响该siRNA的活性。而且，从AL DUP 5536与AL-DUP 5537、AL DUP 5538与AL DUP 5539、AL DUP 5540与AL-DUP 5541、AL DUP5542与AL-DUP 5543，以及AL DUP 5544与AL DUP 5545的IC₅₀之间的比较能够看出，在大部分情况下在所有出现序列基序5’-UA-3’、5’-CA-3’、5’-UU-3’和5’-UG-3’的最5’端嘧啶的位置引入2’-O-甲基修饰的核苷酸对于这些分子也不会有不利的影响。

被修饰的siRNA抵抗核酸内切降解的体内活性

使用上面实例7中所描述的路线和程序进行下面的实验

13组5只年龄为2.5个月的动物接受了一次静脉内推注给药剂量为100mg/kg体重的AL-DUP 5167、AL DUP 5536、AL-DUP 5537、ALDUP 5538、AL DUP 5539、AL DUP 5540、AL-DUP 5541、AL DUP 5542、AL-DUP 5543、AL DUP 5544、AL DUP 5545，或者等量的载体。在给药72小时后将这些动物处死。确定总血清胆固醇、血清ApoB 100浓度，和肝脏与空肠ApoB mRNA水平。另外，通过实例7中所描述的S1-核酸酶保护检验对每组中的3只动物的肝脏、空肠以及血清样品中的siRNA浓度进行确定；然而，通过视觉比较条带与系列稀释进行对放射性条带强度的定量，而且没有计算标准偏差。

AL-DUP 5167的核苷酸序列在表10中被提供。AL DUP 5536、AL-DUP 5537、AL DUP 5538、AL DUP 5539、AL DUP 5540、AL-DUP5541、AL DUP 5542、AL-DUP 5543、AL DUP 5544和AL DUP 5545的核苷酸序列在上面表11中被提供。

进行本实验以评定引入到siRNA的修饰对提高它们在生物介质中的稳定性，以及对体内它们的基因表达抑制活性的影响。

根据通过分支DNA测定法所确定的，发现AL-DUP 5167以100mg/kg体重的剂量，将来在来自经过处理的小鼠肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA的水平降低到在仅接受载体的动物肝脏组织中存在的mRNA水平的42±12％，空肠中的ApoB mRNA的水平被降低到对照动物中水平的45±8％。小鼠血清中血清ApoB蛋白浓度被降低为载体对照水平的44±23％。血清胆固醇为载体对照水平的75±20％，基本上没有变化。发现3种动物的平均iRNA浓度为大约：肝脏70ng/g，空肠14ng/g，血清14ng/g。

根据通过分支DNA测定法所确定的，发现AL-DUP 5546以100mg/kg体重的剂量，使在来自经过处理的小鼠肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA的水平为在仅接受载体的动物肝脏组织中存在的mRNA水平的95±9％，基本上没有变化；空肠中的ApoB mRNA的水平为对照动物中水平的102±16％。小鼠血清中血清ApoB蛋白浓度为载体对照水平的113±39％，基本上没有变化。血清胆固醇被提高到为载体对照水平的132±10％。发现3种动物的平均iRNA浓度为大约：肝脏1ng/g，空肠无法检测到，血清无法检测到。

根据通过分支DNA测定法所确定的，发现AL-DUP 5536以100mg/kg体重的剂量，将来在来自经过处理的小鼠肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA的水平降低到在仅接受载体的动物肝脏组织中存在的mRNA水平的56±8％，空肠中的ApoB mRNA的水平被降低到对照动物中水平的28±8％。小鼠血清中血清ApoB蛋白浓度被降低为载体对照水平的46±6％。血清胆固醇被降低到载体对照水平的74±33％，基本上没有变化。发现3种动物的平均iRNA浓度为大约：肝脏2ng/g，空肠6ng/g，血清6ng/g。

根据通过分支DNA测定法所确定的，发现AL-DUP 5537以100mg/kg体重的剂量，将来在来自经过处理的小鼠肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA的水平降低到在仅接受载体的动物肝脏组织中存在的mRNA水平的72±11％，空肠中的ApoB mRNA的水平被降低到对照动物中水平的94±9％，基本上没有变化。小鼠血清中血清ApoB蛋白浓度为载体对照水平的75±25％，基本上没有变化。血清胆固醇为载体对照水平的118±9％，基本上没有变化。发现3种动物的平均iRNA浓度为大约：肝脏无法检测到，空肠无法检测到，血清1ng/g。

根据通过分支DNA测定法所确定的，发现AL-DUP 5538以100mg/kg体重的剂量，将来在来自经过处理的小鼠肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA的水平降低到在仅接受载体的动物肝脏组织中存在的mRNA水平的56±16％，空肠中的ApoB mRNA的水平被降低到对照动物中水平的75±1％。小鼠血清中血清ApoB蛋白浓度为载体对照水平的102±27％，基本上没有变化。血清胆固醇为载体对照水平的117±18％，基本上没有变化。发现3种动物的平均iRNA浓度为大约：肝脏35ng/g，空肠7ng/g，血清1ng/g。

根据通过分支DNA测定法所确定的，发现AL-DUP 5539以100mg/kg体重的剂量，在来自经过处理的小鼠肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA的水平为在仅接受载体的动物肝脏组织中存在的mRNA水平的76±18％，基本上没有变化；空肠中的ApoB mRNA的水平被降低到对照动物中水平的62±12％，基本上没有变化。小鼠血清中血清ApoB蛋白浓度为载体对照水平的108±23％，基本上没有变化。血清胆固醇为载体对照水平的102±18％，基本上没有变化。发现3种动物的平均iRNA浓度为大约：肝脏7ng/g，空肠4ng/g，血清2ng/g。

根据通过分支DNA测定法所确定的，发现AL-DUP 5540以100mg/kg体重的剂量，将来在来自经过处理的小鼠肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA的水平降低到在仅接受载体的动物肝脏组织中存在的mRNA水平的54±12％，空肠中的ApoB mRNA的水平被降低到对照动物中水平的54±12％。小鼠血清中血清ApoB蛋白浓度为载体对照水平的72±30％，基本上没有变化。血清胆固醇为载体对照水平的117±18％，基本上没有变化。发现3种动物的平均iRNA浓度为大约：肝脏35ng/g，空肠7ng/g，血清1ng/g。

根据通过分支DNA测定法所确定的，发现AL-DUP 5541以100mg/kg体重的剂量，将来在来自经过处理的小鼠肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA的水平降低到在仅接受载体的动物肝脏组织中存在的mRNA水平的73±10％，空肠中的ApoB mRNA的水平被降低到对照动物中水平的68±5％。小鼠血清中血清ApoB蛋白浓度为载体对照水平的90±8％，基本上没有变化。血清胆固醇为载体对照水平的99±8％，基本上没有变化。发现3种动物的平均iRNA浓度为大约：肝脏72ng/g，空肠10ng/g，血清7ng/g。

根据通过分支DNA测定法所确定的，发现AL-DUP 5542以100mg/kg体重的剂量，将来在来自经过处理的小鼠肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA的水平降低到在仅接受载体的动物肝脏组织中存在的mRNA水平的58±9％，空肠中的ApoB mRNA的水平被降低到对照动物中水平的28±4％。小鼠血清中血清ApoB蛋白浓度被降低到载体对照水平的55±9％。血清胆固醇为载体对照水平的61±27％，基本上没有变化。发现3种动物的平均iRNA浓度为大约：肝脏8ng/g，空肠17ng/g，血清22ng/g。

根据通过分支DNA测定法所确定的，发现AL-DUP 5543以100mg/kg体重的剂量，将来在来自经过处理的小鼠肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA的水平降低到在仅接受载体的动物肝脏组织中存在的mRNA水平的77±5％，空肠中的ApoB mRNA的水平为低对照动物中水平的91±14％，基本上没有变化。小鼠血清中血清ApoB蛋白浓度为载体对照水平的97±16％，基本上没有变化。血清胆固醇为载体对照水平的128±24％，基本上没有变化。发现3种动物的平均iRNA浓度为大约：肝脏无法检测到，空肠无法检测到，血清无法检测到。

根据通过分支DNA测定法所确定的，发现AL-DUP 5544以100mg/kg体重的剂量，将来在来自经过处理的小鼠肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA的水平降低到在仅接受载体的动物肝脏组织中存在的mRNA水平的63±6％，空肠中的ApoB mRNA的水平被降低到对照动物中水平的20±3％。小鼠血清中血清ApoB蛋白浓度被降低到载体对照水平的46±5％。血清胆固醇被降低到载体对照水平的55±5％。发现3种动物的平均iRNA浓度为大约：肝脏＞900ng/g，空肠60ng/g，血清40ng/g。

根据通过分支DNA测定法所确定的，发现AL-DUP 5545以100mg/kg体重的剂量，将来在来自经过处理的小鼠肝脏组织的样品中存在的ApoB mRNA的水平降低到在仅接受载体的动物肝脏组织中存在的mRNA水平的58±11％，空肠中的ApoB mRNA的水平被降低到对照动物中水平的37±11％。小鼠血清中血清ApoB蛋白浓度被降低到载体对照水平的50±6％。血清胆固醇为载体对照水平的75±28％，基本上没有变化。发现3种动物的平均iRNA浓度为大约：肝脏70ng/g，空肠7ng/g，血清无法检测到。

实例12：测试siRNA产生免疫的能力

最近，一些已经公开的报道主张了siRNA试剂有具有可能不利的产生免疫反应的能力(参见例如Hornung等人，Nature Med 2005，11：263-270)。关于例如潜在地由siRNA引起的人中暂时干扰素-α(IFN-α)提高的某些生物结果几乎没有了解。为了避免不必要的危险副作用，期望得到有效的抗病毒siRNA，其几乎没有或者没有刻意检测到的刺激免疫的活性。虽然，在人中刺激的具体过程是不能的，但我们认为所描述的试验作为预测寡聚核苷酸和siRNA刺激免疫能力的方法是适当的。

我们通过检测外周血单核细胞(PMBC)中siRNA AL-DUP 5167、AL-DUP 5536、AL-DUP 5537、AL DUP 5538、AL DUP 5539、AL DUP5542、AL-DUP 5543、AL DUP 5544和AL DUP 5545诱导的IFN-α，检测了表11中所列出的siRNA的产生免疫的能力。包括AL-DUP 5311作为无关的序列对照。ODN2216(一种IFN-α的强诱导剂)(Hornung等人，Nature Med 2005，11：263-270)被用作阳性对照，PBS作为阴性对照。ODN2216的核苷酸序列为：

5’-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3’SEO.ID NO.306

通过在Chang，H.S.，和Sack，D.A.，Clin.Diag.Lab.Immunology2001，8：482-488中所描述的Ficoll梯度离心分离PBMC，除了采用来自从Institute for Transfusion Medicine gGmbH，Suhl，Germany获得的单个供体的未过滤的耗尽红细胞的白细胞浓缩物(使用PBS 1∶1稀释)(Buffy Coat)作为起始材料，将在RPMI完全培养基(RPMI 1640完全；10％FCS；1％L-Glu)中的最终悬浮液调整到1×10⁶个细胞/ml。

将细胞与在Opti-MEM或者Opti-MEM+转染试剂GenPorter 2(GP2；Peqlab B iotechnologie GmbH，Erlangen，Germany)中的ODN2216或者siRNA进行孵育。将每孔100μl细胞悬浮液(100.000个细胞)的96孔板结合50μl的1.5μMOpti-MEM中的寡聚核苷酸(寡聚核苷酸的最终浓度为500nM)，或者50μl a)6μl GP2试剂与119μlOpti-MEM的混合物与b)1μl100μMPBS中的寡聚核苷酸溶液以及来自GP2试剂盒的124μl洗脱液B的1∶1混合物(寡聚核苷酸的最终浓度为133nM)。在37℃下进行孵育24小时，从孔的顶部小心去除50μl的上清。将这些用于使用huIFN-α快速ELISA(BenderMed Systems，Vienna，Austria，catalogue no.BMS216INST)的确定IFN-α。表14总结了这些结果。

表14：与siRNA或者ODN2216孵育的外周血单核细胞所产生的IFN-α

双链体描述符	IFN-α[pg/ml上清]
		盐水	0±3
ODN 2216	383±62
		AL-DUP 5311	77±4
AL-DUP 5167	193±9
		AL-DUP 5546	159±33
AL-DUP 5536	0±1
		AL-DUP 5537	2±1
AL-DUP 5538	-5±0
		AL-DUP 5539	-10±1
AL-DUP 5542	-3±1
		AL-DUP 5543	-2±0
AL-DUP 5544	-2±0
		AL-DUP 5545	-10±0

得自实例11和12的结论：

a)在某些位点(特别是倾向降解的位点)具有被修饰的核苷酸的寡聚核苷酸在它们在生物介质中的体外半衰期方面受益，而它们体外或者体内的抑制基因表达的能力则大部分没有受到影响

b)根据它们的序列，siRNA能够但不是普遍地是刺激免疫的试剂。

c)AL-DUP 5536、AL-DUP 5540和AL-DUP 5542是作为抑制apoB表达的特别有希望的候选，因此可以用于治疗包括apoB异常表达的紊乱。

表15列举了这里可以使用的试剂数目以指定上面所描述的iRNA试剂

表15：与siRNA或者ODN2216孵育的外周血单核细胞所产生的IFN-α

双链体描述符	试剂序号
		AL-DUP 5163	54
AL-DUP 5164	55
		AL-DUP 5165	56
AL-DUP 5166	57
		AL-DUP 5167	58
AL-DUP 5168	59
		AL-DUP 5169	60
AL-DUP 5170	61
		AL-DUP 5180	62
AL-DUP 5181	63
		AL-DUP 5182	64
AL-DUP 5183	65
		AL-DUP 5536	66
AL-DUP 5537	67
		AL-DUP 5538	68
AL-DUP 5539	69
		AL-DUP 5542	70
AL-DUP 5543	71
		AL-DUP 5544	72
AL-DUP 5545	73
		AL-DUP 5545	74

其他实施方式

已经描述了一些本发明的实施方式。然而，需要理解的是，可以进行多种修饰，而不离开本发明的主旨和范围。

序列表

<110>阿尔尼拉姆医药有限公司(ALNYLAM PHARMACEUTICALS，INC.)

<120>APOB的RNAi调节及其用途(RNAI MODULATION OF APOB AND USESTHEREOF)

<130>14174-087001

<140>US 11/235,385

<141>2005-09-26

<150>US 60/613,141

<151>2004-09-24

<160>297

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>1

aagccuuggu ucagugugga c                                  21

<210>2

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>2

guccacacug aaccaaggcu ugu                                 23

<210>3

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>3

ugaacaccaa  cuucuuccac g                              21

<210>4

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>4

cguggaagaa guugguguuc auc                             23

<210>5

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>5

gauugauuga ccuguccauu c                               21

<210>6

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>6

gaauggacag gucaaucaau cuu                             23

<210>7

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>7

aauggacuca ucugcuacag c                               21

<210>8

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>8

gcuguagcag augaguccau uug                                      23

<210>9

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>9

auugaccugu ccauucaaaa c                                        21

<210>10

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>10

guuuugaaug gacaggucaa uca                                      23

<210>11

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>11

uuugugacaa auaugggcau c                                        21

<210>12

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>12

gaugcccaua uuugucacaa acu                                      23

<210>13

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>13

cuugguucag uguggacagc c                                   21

<210>14

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>14

ggcuguccac acugaaccaa ggc                                 23

<210>15

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>15

uggacucauc ugcuacagcu u                                   21

<210>16

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>16

aagcuguagc agaugagucc auu                                 23

<210>17

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>17

auugauugac cuguccauuc a                                   21

<210>18

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>18

ugaauggaca ggucaaucaa ucu                              23

<210>19

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>19

uugauugacc uguccauuca a                                21

<210>20

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>20

uugaauggac aggucaauca auc                              23

<210>21

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>21

caaauggacu caucugcuac a                                21

<210>22

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>22

uguagcagau gaguccauuu gga                              23

<210>23

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>23

gauugaccug uccauucaaa a                                   21

<210>24

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>24

uuuugaaugg acaggucaau caa                                 23

<210>25

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>25

ugauugaccu guccauucaa a                                   21

<210>26

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>26

uuugaaugga caggucaauc aau                                 23

<210>27

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>27

gguguauggc uucaacccug a                                   21

<210>28

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>28

ucaggguuga agccauacac cuc                                    23

<210>29

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>29

ucugugggau uccaucugcc a                                      21

<210>30

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>3

uggcagaugg aaucccacag acu                                    23

<210>31

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>31

agacuuccug aauaacuaug c                                      21

<210>32

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>32

gcauaguuau ucaggaaguc uau                                    23

<210>33

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>33

acaauuugau caguauauua a                                     21

<210>34

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>34

uuaauauacu gaucaaauug uau                                   23

<210>35

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>35

ggacucaucu gcuacagcuu a                                     21

<210>36

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>36

uaagcuguag cagaugaguc cau                                   23

<210>37

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>37

uuacuccaac gccagcucca c                                     21

<210>38

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>38

guggagcugg cguuggagua agc                       23

<210>39

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>39

gugacaaaua ugggcaucau c                         21

<210>40

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>40

gaugaugccc auauuuguca caa                       23

<210>41

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>41

guguauggcu ucaacccuga g                         21

<210>42

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>42

cucaggguug aagccauaca ccu                      23

<210>43

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>43

uaccguguau ggaaacugcu c                      21

<210>44

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>44

gagcaguuuc cauacacggu auc                    23

<210>45

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>45

gauaccgugu auggaaacug c                      21

<210>46

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>46

gcaguuucca uacacgguau cca                    23

<210>47

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>47

aaaucaagug ucaucacacu g                      21

<210>48

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>48

cagugugaug acacuugauu uaa                         23

<210>49

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>49

agguguaugg cuucaacccu g                           21

<210>50

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>50

caggguugaa gccauacacc ucu                         23

<210>51

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>51

guuugugaca aauaugggca u                           21

<210>52

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>52

augcccauau uugucacaaa cuc                         23

<210>53

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>53

auaccgugua uggaaacugc u                                  21

<210>54

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>54

agcaguuucc auacacggua ucc                                23

<210>55

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>55

uaaaucaagu gucaucacac u                                  21

<210>56

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>56

agugugauga cacuugauuu aaa                                23

<210>57

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>57

gagguguaug gcuucaaccc u                                  21

<210>58

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>58

aggguugaag ccauacaccu cuu                              23

<210>59

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>59

uggcuucaac ccugagggca a                                21

<210>60

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>60

uugcccucag gguugaagcc aua                              23

<210>61

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>61

gaacaccaac uucuuccacg a                                21

<210>62

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>62

ucguggaaga aguugguguu cau                              23

<210>63

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>63

guauggcuuc aacccugagg g                              21

<210>64

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>64

cccucagggu ugaagccaua cac                            23

<210>65

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>65

auggcuucaa cccugagggc a                              21

<210>66

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>66

ugcccucagg guugaagcca uac                            23

<210>67

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>67

aacaccaacu ucuuccacga g                              21

<210>68

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>68

cucguggaag aaguuggugu uca                                     23

<210>69

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>69

acaccaacuu cuuccacgag u                                       21

<210>70

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>70

acucguggaa gaaguuggug uuc                                     23

<210>71

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>71

caccaacuuc uuccacgagu c                                       21

<210>72

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>72

gacucgugga agaaguuggu guu                                     23

<210>73

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>73

gaugaacacc aacuucuucc a                               21

<210>74

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>74

uggaagaagu ugguguucau cug                             23

<210>75

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>75

augaacacca acuucuucca c                               21

<210>76

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>76

guggaagaag uugguguuca ucu                             23

<210>77

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>77

agaugaacac caacuucuuc c                               21

<210>78

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>78

ggaagaaguu gguguucauc ugg                             23

<210>79

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>79

auuccaucug ccaucucgag a                               21

<210>80

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>80

ucucgagaug gcagauggaa ucc                             23

<210>81

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>81

uuccaucugc caucucgaga g                               21

<210>82

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>82

cucucgagau ggcagaugga auc                             23

<210>83

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>83

acaagccuug guucagugug g                               21

<210>84

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>84

ccacacugaa ccaaggcuug uaa                             23

<210>85

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>85

uucaagucug ugggauucca u                               21

<210>86

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>86

auggaauccc acagacuuga agu                            23

<210>87

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>87

aaucaagugu caucacacug a                              21

<210>88

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>88

ucagugugau gacacuugau uua                               23

<210>89

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>89

uauggcuuca acccugaggg c                                 21

<210>90

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>90

gcccucaggg uugaagccau aca                               23

<210>91

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>91

uugaccuguc cauucaaaac u                                 21

<210>92

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>92

aguuuugaau ggacagguca auc                               23

<210>93

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>93

aucaaguguc aucacacuga a                                    21

<210>94

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>94

uucaguguga ugacacuuga uuu                                  23

<210>95

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>95

ucaaguguca ucacacugaa u                                    21

<210>96

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>96

auucagugug augacacuug auu                                  23

<210>97

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>97

gucaucacac ugaauaccaa u                                    21

<210>98

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>98

auugguauuc agugugauga cac                                23

<210>99

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>99

cuguccauuc aaaacuacca c                                  21

<210>100

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>100

gugguaguuu ugaauggaca ggu                                23

<210>101

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>101

ccuguccauu caaaacuacc a                                  21

<210>102

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>102

ugguaguuuu gaauggacag guc                                23

<210>103

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>103

aucacacuga auaccaaugc u                                21

<210>104

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>104

agcauuggua uucaguguga uga                              23

<210>105

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>105

accuguccau ucaaaacuac c                                21

<210>106

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>106

gguaguuuug aauggacagg uca                              23

<210>107

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>107

gaccugucca uucaaaacua c                                21

<210>108

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>108

guaguuuuga auggacaggu caa                         23

<210>109

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>109

caucacacug aauaccaaug c                           21

<210>  110

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>110

gcauugguau ucagugugau gac                         23

<210>111

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>111

uacaagccuu gguucagugu g                           21

<210>112

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>112

cacacugaac caaggcuugu aaa                         23

<210>113

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>113

uguauggcuu caacccugag g                            21

<210>114

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>114

ccucaggguu gaagccauac acc                          23

<210>115

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>115

ugaccugucc auucaaaacu a                            21

<210>116

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>116

uaguuuugaa uggacagguc aau                          23

<210>117

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>117

ucaucacacu gaauaccaau g                            21

<210>118

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>118

cauugguauu cagugugaug aca                              23

<210>119

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>119

uugugacaaa uaugggcauc a                                21

<210>120

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>120

ugaugcccau auuugucaca aac                              23

<210>121

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>121

caagugucau cacacugaau a                                21

<210>122

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>122

uauucagugu gaugacacuu gau                              23

<210>123

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>123

uaacacuaag aaccagaaga u                              21

<210>124

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>124

aucuucuggu ucuuaguguu agc                            23

<210>125

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>125

caauuugauc aguauauuaa a                              21

<210>126

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>126

uuuaauauac ugaucaaauu gua                            23

<210>127

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>127

cugaacauca agaggggcau c                              21

<210>128

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>128

gaugccccuc uugauguuca gga                           23

<210>129

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>129

ugaacaucaa gaggggcauc a                             21

<210>130

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>130

ugaugccccu cuugauguuc agg                           23

<210>131

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>131

guccagcccc aucacuuuac a                             21

<210>132

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>132

uguaaaguga uggggcugga cac                           23

<210>133

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>133

cagccccauc acuuuacaag c                                   21

<210>134

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>134

gcuuguaaag ugauggggcu gga                                 23

<210>135

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>135

agccccauca cuuuacaagc c                                   21

<210>136

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>136

ggcuuguaaa gugauggggc ugg                                 23

<210>137

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>137

gaguuuguga caaauauggg c                                   21

<210>138

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>138

gcccauauuu gucacaaacu cca                                 23

<210>139

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>139

agggaaucuu auauuugauc c                                   21

<210>140

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>140

ggaucaaaua uaagauuccc uuc                                 23

<210>141

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>141

uuacugagcu gagaggccuc a                                   21

<210>142

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>142

ugaggccucu cagcucagua acc                                 23

<210>143

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>143

auugggaaga agaggcagcu u                                    21

<210>144

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>144

aagcugccuc uucuucccaa uua                                  23

<210>145

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>145

ucacauccuc caguggcuga a                                    21

<210>146

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>146

uucagccacu ggaggaugug agu                                  23

<210>147

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>147

gccccaucac uuuacaagcc u                                    21

<210>148

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>148

aggcuuguaa agugaugggg cug                                 23

<210>149

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>149

ccagccccau cacuuuacaa g                                   21

<210>150

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>150

cuuguaaagu gauggggcug gac                                 23

<210>151

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>151

aagggaaucu uauauuugau c                                   21

<210>152

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>152

gaucaaauau aagauucccu ucu                                 23

<210>153

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>153

cuuuacaagc cuugguucag u                                  21

<210>154

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>154

acugaaccaa ggcuuguaaa gug                                23

<210>155

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>155

ggaaucuuau auuugaucca a                                  21

<210>156

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>156

uuggaucaaa uauaagauuc ccu                                23

<210>157

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>157

gaagggaauc uuauauuuga u                                  21

<210>158

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>158

aucaaauaua agauucccuu cua                                   23

<210>159

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>159

aaauagaagg gaaucuuaua u                                     21

<210>160

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>160

auauaagauu cccuucuauu uug                                   23

<210>161

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>161

uagaagggaa ucuuauauuu g                                     21

<210>162

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>162

caaauauaag auucccuucu auu                                   23

<210>163

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>163

gacuuccuga auaacuaugc a                                       21

<210>164

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>164

ugcauaguua uucaggaagu cua                                     23

<210>165

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>165

gcaaggaucu ggagaaacaa c                                       21

<210>166

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>166

guuguuucuc cagauccuug cac                                     23

<210>167

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>167

caaggaucug gagaaacaac a                                       21

<210>168

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>168

uguuguuucu ccagauccuu gca                                     23

<210>169

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>169

acggcuagcu gugaaagguc c                                       21

<210>170

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>170

ggaccuuuca cagcuagccg uga                                     23

<210>171

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<220>

<221>misc feature

<222>21

<223>(n＝结合尿苷的胆同醇)(n＝uridine conjugated cholesterol)

<400>171

ccacaugaag cagcacgacu n                                       21

<210>172

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<400>172

aagucgugcu gcuucaugug                                         20

<210>173

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>173

ctcattctcc agcagcaggg tttttctctt ggaaagaaag t               41

<210>174

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>174

gaagcggccg tttgttgata tttttctctt ggaaagaaag t               41

<210>175

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>175

gtttttgctg tctgcaccca tttttctctt ggaaagaaag t               41

<210>176

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>176

taaatattgt ccatttttga gaagaagttt ttctcttgga aagaaagt        48

<210>177

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>177

cattcagctt cagtggctcc atttttctct tggaaagaaa gt              42

<210>178

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>178

aatgtctgca tttagcctat ggcttttttc tcttggaaag aaagt         45

<210>179

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>179

agcccaagct ctgcattcaa tttttaggca taggacccgt gtct          44

<210>180

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>180

atttcatgga tgccccagag tttttaggca taggacccgt gtct          44

<210>181

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>181

actgaatttt gcatggtgtt ctttttttta ggcataggac ccgtgtct       48

<210>182

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>182

gggcagctct cccatcaagt ttttaggcat aggacccgtg tct            43

<210>183

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>183

gaatcatggc ctggtaaatg ctttttaggc ataggacccg tgtct          45

<210>184

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>184

cagcatagga gcccatcaaa tcatttttta ggcataggac ccgtgtct       48

<210>185

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>185

gactgtgtgt gtggtcaagt ttcatctttt ttaggcatag gacccgtgtc t   51

<210>186

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>186

atagggctgt agctgtaagt taaaattttt taggcatagg acccgtgtct     50

<210>187

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>187

gtcaaatcta gagcaccata tctcagtttt taggcatagg acccgtgtct     50

<210>188

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>188

gccgaaacct tccattgttg tttttaggca taggacccgt gtct              44

<210>189

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>189

agatatgttt cagctcatta ttttgatagt ttttaggcat aggacccgtg tct    53

<210>190

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>190

ctactaccag gtcagtataa gatatggtat tttttaggca taggacccgt gtct   54

<210>191

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>191

gaattcgaca ccctgaacct tagtttttag gcataggacc cgtgtct           47

<210>192

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>192

tccccagtga cacctctgtg a                                       21

<210>193

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>193

tcggctgagt ttgaagttga agat                                    24

<210>194

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>194

tggacagcct cagcccttc                                          19

<210>195

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>195

tccagtgaga gacctgcaat gttca                                   25

<210>196

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>196

tctgcttata gaacttgtct ccactg                                  26

<210>197

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>197

gtcgttgctt aaagtagtta tgaaaga                                 27

<210>198

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>198

gttcctttaa agttgccacc ca                                       22

<210>199

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠ApoB的探针序列(Probe sequence for murine ApoB)

<400>199

ccacagtgtc tgctctgtaa cttg                                     24

<210>200

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人ApoB的探针序列(Probe sequence  for human ApoB)

<400>200

gattggattt tcagaatact gtatagcttt tttctcttgg aaagaaagt          49

<210>201

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人ApoB的探针序列(Probe sequence for human ApoB)

<400>201

cctgcttcgt ttgctgaggt tttttctctt ggaaagaaag t                  41

<210>202

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人ApoB的探针序列(Probe sequence for human ApoB)

<400>202

gcagtgatgg aagctgcgat atttttctct tggaaagaaa gt                  42

<210>203

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人ApoB的探针序列(Probe sequence for human ApoB)

<400>203

gaacttctaa tttggactct cctttgtttt tctcttggaa agaaagt           47

<210>204

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人ApoB的探针序列(Probe sequence for human ApoB)

<400>204

actccttcag agccagcggt ttttctcttg gaaagaaagt                   40

<210>205

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人ApoB的探针序列(Probe sequence for human ApoB)

<400>205

actcccatgc tccgttctca tttttctctt ggaaagaaag t                 41

<210>206

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人ApoB的探针序列(Probe sequence for human ApoB)

<400>206

agggtaagct gattgtttat cttgattttt ctcttggaaa gaaagt            46

<210>207

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人ApoB的探针序列(Probe sequence for human ApoB)

<400>207

ggttccattc cctatgtcag catttttagg cataggaccc gtgtct            46

<210>208

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人ApoB的探针序列(Probe sequence for human ApoB)

<400>208

attaatctta gggtttgaga gttgtgtttt taggcatagg acccgtgtct         50

<210>209

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人ApoB的探针序列(Probe sequence for human ApoB)

<400>209

cactgtgttt gattttccct caatattttt aggcatagga cccgtgtct          49

<210>210

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人ApoB的探针序列(Probe sequence for human ApoB)

<400>210

tgtatttttt tctgtgtgta aacttgcttt ttaggcatag gacccgtgtc t       51

<210>211

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人ApoB的探针序列(Probe sequence for human ApoB)

<400>211

caatcactcc attactaagc tccagttttt aggcatagga cccgtgtct          49

<210>212

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人ApoB的探针序列(Probe sequence for human ApoB)

<400>212

tgccaaaagt aggtacttca attg                                     24

<210>213

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人ApoB的探针序列(Probe sequence for human ApoB)

<400>213

tttgcatcta atgtgaaaag agga                                  24

<210>214

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人ApoB的探针序列(Probe sequence for human ApoB)

<400>214

catttgcttg aaaatcaaaa ttga                                  24

<210>215

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人ApoB的探针序列(Probe sequence for human ApoB)

<400>215

ggtacttgct ggagaacttc actg                                  24

<210>216

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人ApoB的探针序列(Probe sequence for human ApoB)

<400>216

gcatttccaa aaaacagcat ttc                                   23

<210>217

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠GAPDH的探针序列

<400>217

caaatggcag ccctggtgat ttttctcttg gaaagaaagt                 40

<210>218

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠GAPDH的探针序列

<400>218

ccttgactgt gccgttgaat tttttttctc ttggaaagaa agt                 43

<210>219

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠GAPDH的探针序列

<400>219

gtctcgctcc tggaagatgg tttttctctt ggaaagaaag t                   41

<210>220

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠GAPDH的探针序列

<400>220

cccggccttc tccatggttt tttctcttgg aaagaaagt                      39

<210>221

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠GAPDH的探针序列

<400>221

aacaatctcc actttgccac tgtttttagg cataggaccc gtgtct              46

<210>222

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠GAPDH的探针序列

<400>222

catgtagacc atgtagttga ggtcaatttt taggcatagg acccgtgtct          50

<210>223

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠GAPDH的探针序列

<400>223

gacaagcttc ccattctcgg tttttaggca taggacccgt gtct                 44

<210>224

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠GAPDH的探针序列

<400>224

tgatgggctt cccgttgatt ttttaggcat aggacccgtg tct                  43

<210>225

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠GAPDH的探针序列

<400>225

gacatactca gcaccggcct tttttaggca taggacccgt gtct                 44

<210>226

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠GAPDH的探针序列

<400>226

tgaaggggtc gttgatggc                                             19

<210>227

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠GAPDH的探针序列

<400>227

ccgtgagtgg agtcatactg gaa                                        23

<210>228

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠GAPDH的探针序列

<400>228

caccccattt gatgttagtg gg                                       22

<210>229

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鼠GAPDH的探针序列

<400>229

ggtgaagaca ccagtagact ccac                                     24

<210>230

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人GAPDH的探针序列

<400>230

gaatttgcca tgggtggaat tttttctctt ggaaagaaag t                  41

<210>231

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人GAPDH的探针序列

<400>231

ggagggatct cgctcctgga tttttctctt ggaaagaaag t                 41

<210>232

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人GAPDH的探针序列

<400>232

ccccagcctt ctccatggtt ttttctcttg gaaagaaagt                   40

<210>233

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人GAPDH的探针序列

<400>233

gctcccccct gcaaatgagt ttttctcttg gaaagaaagt                 40

<210>234

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人GAPDH的探针序列

<400>234

agccttgacg gtgccatgtt tttaggcata ggacccgtgt ct              42

<210>235

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人GAPDH的探针序列

<400>235

gatgacaagc ttcccgttct ctttttaggc ataggacccg tgtct           45

<210>236

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人GAPDH的探针序列

<400>236

agatggtgat gggatttcca tttttttagg cataggaccc gtgtct          46

<210>237

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人GAPDH的探针序列

<400>237

gcatcgcccc acttgatttt tttttaggca taggacccgt gtct            44

<210>238

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人GAPDH的探针序列

<400>238

cacgacgtac tcagcgccat ttttaggcat aggacccgtg tct            43

<210>239

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人GAPDH的探针序列

<400>239

ggcagagatg atgacccttt tgtttttagg cataggaccc gtgt ct        46

<210>240

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人GAPDH的探针序列

<400>240

ggtgaagacg ccagtggact c                                    21

<210>241

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的siRNA

<220>

<221>misc_feature

<222>21

<223>n＝通过包含硫代磷酸酯的吡咯烷连接于3′端的鸟嘌呤胆固醇

     (guanine cholesterol conjugated to the 3′-end

     via a pyrrolidine linker comprising a

     phosphorothioate)

<400>241

agguguaugg cuucaacccu n                                    21

<210>242

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的siRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>21

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>22

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

     硫代磷酸酯键

<220>

<221>misc_feature

<222>23

<223>n＝尿苷硫代磷酸酯键(uridine phosphorothioate linkage)

<400>242

caggguugaa gccauacacc ucn                                  23

<210>243

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的siRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>4，6，8，12，20

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>14

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

<220>

<221>misc_feature

<222>21

<223>n＝通过包含硫代磷酸酯的吡咯烷连接于3′端的鸟嘌呤胆固醇

     (guanine cholesterol conjugated to the3′-eRd

     via a pyrrolidine linker comprising a

     phosphorothioate)

<400>243

agguguaugg cuucaacccu n                                        21

<210>244

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的siRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>1，13，17

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>6，7，15

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰

<220>

<221>misc_feature

<222>22

<223>n＝胞苷硫代磷酸酯键

<220>

<221>misc_feature

<222>23

<223>n＝尿苷硫代磷酸酯键

<400>244

caggguugaa gccauacacc unn                                 23

<210>245

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针序列

<400>245

gattgattga cctgtccatt ctcttctt                            28

<210>246

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针序列

<400>246

caccaacttc ttccacgagt ctcttctt                            28

<210>247

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针序列

<400>247

gagtttgtga caaatatggg ctcttctt                            28

<210>248

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针序列

<400>248

ctttacaagc cttggttcag ttcttctt                            28

<210>249

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的siRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>4，6，8，12，20

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>14

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

<220>

<221>misc_feature

<222>21

<223>n＝鸟嘌呤硫代磷酸酯键(guanine phosphorothioate linkage)

<400>249

agguguaugg cuucaacccu n                                        21

<210>250

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针序列

<400>250

ggaatcttat atttgatcca atcttctt                                 28

<210>251

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的siRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>21

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>22

<223>um＝2′O-甲基胞苷修饰

硫代磷酸酯键

<220>

<221>misc_feature

<222>23

<223>n＝尿苷硫代磷酸酯键

<400>251

uuggaucaaa uauaagauuc ccn                                  23

<210>252

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的siRNA

<220>

<221>misc_feature

<222>21

<223>n＝通过包含硫代磷酸酯的吡咯烷连接于3′端的腺嘌呤胆固醇(adenine cholesterol

     conjugated to the 3′-end

     via a pyrrolidine linker comprising a

     phosphorothioate)

<400>252

ggaaucuuau auuugaucca n                                    21

<210>253

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的siRNA

<220>

<221>misc_feature

<222>21

<223>n＝通过包含硫代磷酸酯的吡咯烷连接于3′端的尿苷胆固醇(uridine cholesterol

     conjugated to the  3′-end

     via a pyrrolidine linker comprising a

     phosphorothioate)

<400>253

gucaucacac ugaauaccaa n                                        21

<210>254

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的siRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>21

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>22

<223>am＝2′O-甲基腺嘌呤修饰

<220>

<221>misc_feature

<222>23

<223>n＝胞苷硫代磷酸酯键

<400>254

auugguauuc agugugauga can                                      23

<210>255

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的siRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>3，6，8，18

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>11，15

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰

<220>

<221>misc_feature

<222>21

<223>n＝通过包含硫代磷酸酯的吡咯烷连接于3′端的尿苷胆同醇

     (uridine cholesterol conjugated to the 3′-end

     via a pyrrolidine linker comprising a

     phosphorothioate)

<400>255

gucaucacac ugaauaccaa n                                    21

<210>256

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的siRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>2，3，6，8，13，15，18

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>10，21

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

<220>

<221>misc_feature

<222>22

<223>n＝腺嘌呤硫代磷酸酯键

<220>

<221>misc_feature

<222>23

<223>n＝胞苷硫代磷酸酯键

<400>256

auugguauuc agugugauga cnn                                     23

<210>257

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的siRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>1，2，11，13，18

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰(methyl uridine modification)

<220>

<221>修饰的碱基

<222>7，21

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰(methyl cytidine modification)

<220>

<221>修饰的碱基

<222>22

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

硫代磷酸酯键

<220>

<221>misc_feature

<222>23

<223>n＝尿苷硫代磷酸酯键

<400>257

uuggaucaaa uauaagauuc ccn                              23

<210>258

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的siRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>7，8，10，12，13，14，

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>19

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

<220>

<221>misc_feature

<222>21

<223>n＝通过包含硫代磷酸酯的吡咯烷连接于3′端的腺嘌呤胆固醇

     (adenine cholesterol conjugated to the 3′-end

     via a pyrrolidine linker comprising a

     phosphorothioate)

<400>258

ggaaucuuau auuugaucca n                                21

<210>259

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的siRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>21

<223>gm＝2′O-甲基鸟苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>22

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰

硫代磷酸酯键

<220>

<221>misc_feature

<222>23

<223>n＝鸟苷硫代磷酸酯键

<400>259

acugaaccaa ggcuuguaaa gun                                  23

<210>260

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的siRNA

<220>

<221>misc_feature

<222>21

<223>n＝通过包含硫代磷酸酯的吡咯烷连接于3′端的尿苷胆固醇

       (uridine cholesterol conjugated to the 3′-end

       via a pyrrolidine linker comprising a

       phosphorothioate)

<400>260

cuuuacaagc cuugguucag n                                    21

<210>261

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的siRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>3，6，8，18

<223>cm＝  2′O-甲基胞苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>11，15

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰

<220>

<221>misc_feature

<222>21

<223>n＝尿苷硫代磷酸酯键

<400>261

gucaucacac ugaauaccaa n                                      21

<210>262

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的siRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>2，3，4，12，13，16

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>6，18

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

<220>

<221>misc_feature

<222>21

<223>n＝尿苷硫代磷酸酯键

<400>262

cuuuacaagc cuugguucag n                                      21

<210>263

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的siRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>3，14，15，17

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>8

<223>cm＝2 ′O-甲基胞苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>21

<223>gm＝2′O-甲基鸟苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>22

<223>um2′O-甲基尿苷修饰

硫代磷酸酯键

<220>

<221>misc_feature

<222>23

<223>n＝鸟苷硫代磷酸酯键

<400>263

acugaaccaa ggcuuguaaa gun                             23

<210>264

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的siRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>21

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>22

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

     硫代磷酸酯键

<220>

<221>misc_feature

<222>23

<223>n＝腺嘌呤硫代磷酸酯键

<400>264

gcccauauuu gucacaaacu ccn                             23

<210>265

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针序列

<400>265

gaactgtgtg tgagaggtcc ttctt                           25

<210>266

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针序列

<400>266

gtgatcagac tcaatacgaa ttcttctt                             28

<210>267

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针序列

<400>267

gtcatcacac tgaataccaa ttcttct                              27

<210>268

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针序列

<400>268

aggtgtatgg cttcaaccct gtcttct                              27

<210>269

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针序列

<400>269

aaacaccatt gtcacactcc atcttctt                             28

<210>270

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针序列

<400>270

gagctacagt gcttcatctc atcttctt                             28

<210>271

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>21

<223>n＝连接尿苷胆固醇的(uridine cholesterol conjugated)

<400>271

gugaucagac ugaauacgaa n                                  21

<210>272

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<220>

<221>修饰的碱基

<222>21

<223>cm＝2 ′O-甲基胞苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>22

<223>am＝2′O-甲基腺嘌呤修饰

     硫代磷酸酯键

<220>

<221>misc_feature

<222>23

<223>n＝胞苷硫代磷酸酯键

<400>272

auucguauug agucugauca can                                23

<210>273

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>21

<223>n＝尿苷硫代磷酸酯键

<400>273

gaacugugug ugagaggucc n                                  21

<210>274

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<220>

<221>修饰的碱基

<222>22

<223>gm＝2′O-甲基鸟苷修饰

    硫代磷酸酯键

<220>

<221>修饰的碱基

<222>23

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

     硫代磷酸酯键

<400>274

aggaccucuc acacacaguu cgc                                       23

<210>275

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>21

<223>n＝尿苷硫代磷酸酯键

<400>275

gucaucacac ugaauaccaa  n                                        21

<210>276

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<220>

<221>修饰的碱基

<222>21

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>22

<223>am＝2′O-甲基腺嘌呤修饰(methyl adenine modification)

<220>

<221>misc_feature

<222>23

<223>n＝胞苷硫代磷酸酯键

<400>276

auugguauuc agugugauga can                                      23

<210>277

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>21

<223>n＝通过吡咯烷连接子连接于3′端的尿苷胆固醇

    (uridine cholesterol conjugated to the3′-end

    via a pyrrolidine linker)

<400>277

gaacugugug ugagaggucc n                                        21

<210>278

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的寡核苷酸

<220>

<221>修饰的碱基

<222>21

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>22

<223>gm＝2′O-甲基鸟苷修饰

<220>

<221>misc_feature

<222>23

<223>n＝胞苷硫代磷酸酯键

<400>278

aggaccucuc acacacaguu cgn                                     23

<210>279

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>279

ctctagagcg actggagcac gaggacactg a                            31

<210>280

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>280

ctctagaggg acactgacat ggactgaagg agta                         34

<210>281

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>281

ctcctgttgc agtagagtgc agct                                    24

<210>282

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>282

acgcgtcgac gtgggagcat ggaggttggc agttgttc                     38

<210>283

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>283

acgcgtcgac gtaatggtgc tgtcatgact gccctt                    36

<210>284

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>284

ctctagagca tggactgaag gagtagaaag aa                        32

<210>285

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的iRNA

<220>

<221>misc_feature

<222>21

<223>n＝通过包含硫代磷酸酯的吡咯烷连接于3′端的尿苷胆固醇

<400>285

gucaucacac ugaauaccaa n                                    21

<210>286

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的iRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>21

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>22

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

<400>286

caggguugaa gccauacacc ucu                                  23

<210>287

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的iRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>3，4，7，8，13，19

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>17

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

<220>

<221>misc_feature

<222>21

<223>n＝通过包含硫代磷酸酯的吡咯烷连接于3′端的胞苷胆固醇

<400>287

gauugauuga ccuguccauu n                                   21

<210>288

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的iRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>4

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>8，17，21

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>22

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰

     硫代磷酸酯键

<220>

<221>misc_feature

<222>23

<223>n＝尿苷硫代磷酸酯键(uridine phosphorothioate linkage)

<400>288

gaauggacag gucaaucaau cun                                    23

<210>289

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的iRNA

<220>

<221>misc_feature

<222>21

<223>n＝通过包含硫代磷酸酯的吡咯烷连接于3′端的胞苷胆固醇

<400>289

gauugauuga ccuguccauu n                                21

<210>290

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的iRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>21

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>22

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰

    硫代磷酸酯键

<220>

<221>misc_feature

<222>23

<223>n＝尿苷硫代磷酸酯键

<400>290

gaauggacag gucaaucaau cun                              23

<210>291

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的iRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>1，4，14

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>8，11

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰

<220>

<221>misc_feature

<222>21

<223>n＝通过包含硫代磷酸酯的吡咯烷连接于3′端的胞苷胆固醇

<400>291

caccaacuuc uuccacgagu n                                         21

<210>292

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的iRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>7，16，17，20

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>21

<223>gm＝2′O-甲基尿苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>22

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰

    硫代磷酸酯键

<220>

<221>misc_feature

<222>23

<223>n＝尿苷硫代磷酸酯键(uridine phosphorothioate linkage)

<400>292

gacucgugga agaaguuggu gun                                      23

<210>293

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的iRNA

<220>

<221>misc_feature

<222>21

<223>n＝通过包含硫代磷酸酯的吡咯烷连接于3′端的胞苷胆固醇

<400>293

caccaacuuc uuccacgagu n                                        21

<210>294

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的iRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>21

<223>gm＝2′O-甲基鸟苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>22

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰

    硫代磷酸酯键

<220>

<221>misc_feature

<222>23

<223>n＝尿苷硫代磷酸酯键

<400>294

gacucgugga agaaguuggu gun                                      23

<210>295

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的iRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>4，5，6，8，15，17

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>11

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

<220>

<221>misc_feature

<222>21

<223>n＝胞苷硫代磷酸酯键

<400>295

gaguuuguga caaauauggg n                                         21

<210>296

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的iRNA

<220>

<221>修饰的碱基

<222>4，13，15，21

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>6，8，9，10，

<223>um＝2′O-甲基尿苷修饰

<220>

<221>修饰的碱基

<222>22

<223>cm＝2′O-甲基胞苷修饰

    硫代磷酸酯键

<220>

<221>misc_feature

<222>23

<223>n＝腺嘌呤硫代磷酸酯键

    (adenine phosphorothioate linkage)

<400>296

gcccauauuu gucacaaacu ccn                                       23

<210>297

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过合成产生的iRNA

<220>

<221>misc_feature

<222>21

<223>n＝胞苷硫代磷酸酯键

<400>297

gaguuuguga caaauauggg n                                         21

Claims (37)

1.一种iRNA试剂，其包括有义链和反义链，其中所述的有义链具有试剂序号1～74的iRNA试剂的有义链序列中的至少15个连续核苷酸，所述的反义链具有试剂序号1～74的iRNA试剂的反义链序列中的至少15个连续核苷酸。

2.一种iRNA试剂，其包括有义链和反义链，其中所述的有义链具有试剂序号1～19、24～26、29、30和32～42的iRNA试剂的有义链序列中的至少15个连续核苷酸，其中所述的反义链具有试剂序号1～19、24～26、29、30和32～42的iRNA试剂的反义链序列中的至少15个连续核苷酸，其中所述iRNA试剂使与这些试剂孵育后培养的人HepG2细胞中存在的ApoB mRNA的量与没有与该试剂孵育的细胞相比降低了60％以上，和/或使分泌到细胞培养上清中的Apo蛋白的量降低了60％以上。

3.一种iRNA试剂，其包括有义链和反义链，其中所述的有义链具有试剂序号1～12、15、17、24、29、30和32～35的iRNA试剂的有义链序列中的至少15个连续核苷酸，其中所述的反义链具有试剂序号1～12、15、17、24、29、30和32～35的iRNA试剂的反义链序列中的至少15个连续核苷酸，其中所述iRNA试剂使与这些试剂孵育后培养的人HepG2细胞中存在的ApoB mRNA的量与没有与该试剂孵育的细胞相比降低了70％以上，和/或使分泌到细胞培养上清中的Apo蛋白的量降低了70％以上。

4.一种iRNA试剂，其包括有义链和反义链，其中所述的有义链具有试剂序号1～5、7和11的iRNA试剂的有义链序列中的至少15个连续核苷酸，其中所述的反义链具有试剂序号1～5、7和11的iRNA试剂的反义链序列中的至少15个连续核苷酸，其中iRNA试剂使与这些试剂孵育后培养的人HepG2细胞中存在的ApoB mRNA的量与没有与该试剂孵育的细胞相比降低了80％以上，和/或使分泌到细胞培养上清中的Apo蛋白的量降低了80％以上。

5.一种iRNA试剂，其包括有义链和反义链，其中每条链都包括至少有16、17或18个核苷酸的序列，该序列与试剂序号1～74的iRN试剂的序列之一基本上完全相同，除了每条链上分别有不超过1、2或3个核苷酸被其它核苷酸替代(例如腺苷被尿嘧啶替代)外，同时基本保持了抑制培养的人HepG2细胞中ApoB表达的能力，或者保持了在将该iRNA试剂以50mg/kg体重或者100mg/kg体重为动物给药后，将C57B1/6小鼠的鼠肝脏细胞中所存在的apo-B mRNA的量在体内降低至少20％的能力。

6.一种iRNA试剂，其选自试剂序号54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74的iRNA试剂组。

7.根据权利要求1所述的iRNA试剂，其中，所述iRNA试剂使与这些试剂孵育后培养的人HepG2细胞中存在的ApoB mRNA的量与没有与该试剂孵育的细胞相比降低了50％以上，和/或使分泌到人HepG2细胞培养上清中的Apo蛋白的量降低了50％以上，和/或使该iRNA试剂以50mg/kg体重或者100mg/kg体重给药后，将C57B 1/6小鼠的鼠肝脏细胞中所存在的apo-B mRNA的量在体内降低至少20％。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的iRNA试剂，其中所述的反义RNA链长度为30个或者更少的核苷酸，所述iRNA试剂的双链体区长度为15～30个核苷酸对。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的iRNA试剂，其中所述的iRNA试剂还额外降低了培养的肝源鼠细胞中所存在的ApoB mRNA的量。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的iRNA试剂，其包括使所述iRNA试剂在生物样品中稳定性得到提高的修饰。

11.根据权利要求1～10中任一项所述的iRNA试剂，其包括硫代磷酸酯或者2’-修饰的核苷酸。

12.根据权利要求11所述的iRNA试剂，其包括：

至少一个5’-尿苷-腺嘌呤-3’(5’-UA-3’)二核苷酸，其中所述的尿苷是2’-修饰的核苷酸；

至少一个5’-尿苷-鸟嘌呤-3’(5’-UG-3’)二核苷酸，其中所述的5’-尿苷是2’-修饰的核苷酸；

至少一个5’-胞苷-腺嘌呤-3’(5’-CA-3’)二核苷酸，其中所述的5’-胞苷是2’-修饰的核苷酸；

或者至少一个5’-尿苷-尿苷-3’(5’-UU-3’)二核苷酸，其中所述的5’-尿苷是2’-修饰的核苷酸。

13.根据权利要求12所述的iRNA试剂，其中在所有出现的序列基序5’-UA-3’、5’-CA-3’、5’-UU-3’和5’-UG-3’二核苷酸中的最5’端嘧啶都是2’-修饰的核苷酸，

或者在有义链中的所有嘧啶以及在所有出现的5’-UA-3’和5’-CA-3’的最5’端嘧啶都是2’-修饰的核苷酸，

或者其中在有义链中的所有嘧啶都是2’-修饰的核苷酸，以及在反义链中所有出现的序列基序5’-UA-3’、5’-CA-3’、5’-UU-3’和5’-UG-3’中的最5’端嘧啶都是2’-修饰的核苷酸。

14.根据权利要求11～13中任一项所述的iRNA试剂，其中所述的2’-修饰选自2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氟、2’-O-甲基、2’-O-甲氧乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)和2’-O-N-甲基乙酰氨基(2’-O-NMA)的组。

15.根据权利要求1～14中任一项所述的iRNA试剂，其包含具有1～4个不配对核苷酸的核苷酸突出。

16.根据权利要求15所述的iRNA试剂，其中所述的核苷酸突出具有2或3个不配对核苷酸。

17.根据权利要求15或16所述的iRNA试剂，其中所述的核苷酸突出是在所述iRNA试剂反义链的3’-末端。

18.根据前面任一项权利要求所述的iRNA试剂，其含有胆固醇部分。

19.根据权利要求18所述的iRNA试剂，其中所述的胆固醇部分连接到所述iRNA试剂有义链的3’-末端。

20.根据前面任一项权利要求所述的iRNA试剂，其中所述的iRNA试剂靶向为被肝细胞吸收。

21.根据前面任一项权利要求所述的iRNA试剂，其中所述的iRNA试剂靶向为被肠细胞吸收。

22.一种用于治疗人受试者的方法，其中所述受试者具有脂类紊乱或者有产生脂类紊乱的风险，所述方法包括给药iRNA试剂，其中所述的iRNA试剂包括有义链和反义链，其中所述的有义链具有试剂序号1～74的iRNA试剂的有义链序列中的至少15个连续核苷酸，所述的反义链具有试剂序号1～74的iRNA试剂的反义链序列中的至少15个连续核苷酸。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述的脂类紊乱是高胆固醇血症、高脂血症、冠状动脉病、冠心病、血栓或动脉粥样硬化。

24.根据权利要求22或23所述的方法，其中以足以降低受试者细胞或者组织中ApoB表达的量进行iRNA给药。

25.一种药物组合物，其包含：

a.权利要求1～21任一项所述的iRNA试剂，和

b.药物上可以接受的载体。

26.一种制备药物组合物的方法，其包括使用药物上可以接受的载体配制权利要求1～21任一项所述的iRNA试剂。

27.一种降低细胞中ApoB RNA量的方法，其包括：

将细胞与权利要求1～21任一项所述的iRNA试剂接触。

28.根据权利要求27所述的方法，其中将所述细胞在体外与所述的iRNA试剂接触。

29.根据权利要求27所述的方法，其中在受试者体内将所述细胞与iRNA试剂接触。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述受试者被诊断为患有高胆固醇血症、高脂血症、冠状动脉病(CAD)、冠心病、血栓或动脉粥样硬化。

31.一种制备权利要求1～21任一项所述的iRNA试剂的方法，其中所述方法包括合成所述iRNA试剂，其中所述的有义链和反义链包括至少一种能够使iRNA试剂对核苷酸水解降解稳定的修饰。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述受试者被诊断为患有脂类紊乱。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述受试者被诊断为患有高胆固醇血症、高脂血症、冠状动脉病、冠心病、血栓或动脉粥样硬化。

34.根据权利要求31～33中任一项所述的方法，其中所述受试者为人。

35.一种评估被认为抑制ApoB基因表达的iRNA试剂的方法，其中所述方法包括：

a.提供iRNA试剂，其中第一链与ApoB mRNA的核苷酸序列充分互补，另一条链与所述第一链充分互补以与第一链杂交；

b.将所述iRNA试剂与含有ApoB基因的细胞接触；

c.在所述iRNA试剂与细胞接触之前，将ApoB基因表达或者未接触的对照细胞的ApoB基因表达与所述iRNA试剂接触细胞之后的ApoB基因表达进行比较；以及

d.确定是否所述iRNA试剂能够用于抑制ApoB基因的表达，其中如果细胞中存在的ApoB RNA的量或者细胞所分泌的蛋白质的量比iRNA试剂接触细胞之前的量小，则所述iRNA能够用于抑制ApoB基因的表达。

36.根据权利要求35所述的方法，其中在体外和非人的实验室动物体内进行步骤b.～d.。

37.根据权利要求35或36所述的方法，其还包括确定iRNA试剂在激活外周血单核细胞产生干扰素-α中的活性。

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