JP7463410B2 - アポリポタンパク質ｂアンタゴニスト - Google Patents

アポリポタンパク質ｂアンタゴニスト Download PDF

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Description

本開示は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡ分子を含み、分子のセンスまたはアンチセンスのいずれかのＲＮＡ部分の３’末端に共有結合した一本鎖ＤＮＡ分子をさらに含む核酸であって、二本鎖阻害性ＲＮＡがアポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）を標的とする、核酸、当該核酸分子を含む医薬組成物、ならびにＡｐｏＢのレベルの増加と関連する疾患、例えば高コレステロール血症の治療のための方法に関する。
高コレステロール血症と関連する心血管疾患は、一般的な状態であり、心疾患ならびに高い死亡頻度および罹病率をもたらし、貧弱な食事、肥満、または遺伝性機能障害性遺伝子の帰結であり得る。例えば、家族性高コレステロール血症におけるような低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ受容体）またはアポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）における変異。コレステロールは、動物細胞における膜新生のために必須である。水溶性を欠くことは、コレステロールがリポタンパク質に付随して身体の至るところに輸送されることを意味する。アポリポタンパク質は、リン脂質、コレステロールおよび脂質と一緒に形成され、これは、血流を介した身体の様々な部分へのコレステロールなどの脂質の輸送を促進する。リポタンパク質はサイズに従って分類され、ＨＤＬ（高密度リポタンパク質）、ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）、ＩＤＬ（中間密度リポタンパク質）、ＶＬＤＬ（超低密度リポタンパク質）、およびＵＬＤＬ（超低比重リポタンパク質）リポタンパク質を形成し得る。
リポタンパク質はその循環を通して組成を変化させ、様々な比率のアポリポタンパク質Ａ（ＡｐｏＡ）、Ｂ（ＡｐｏＢ）、Ｃ（ＡｐｏＣ）、Ｄ（ＡｐｏＤ）またはＥ（ＡｐｏＥ）、トリグリセリド、コレステロールおよびリン脂質を含む。ＡｐｏＢは、ＵＬＤＬおよびＬＤＬの主要なアポリポタンパク質であり、２つのアイソフォーム、ａｐｏＢ－４８およびａｐｏＢ－１００を有する。両方のＡｐｏＢアイソフォームは、１つの単一遺伝子によってコードされ、短い方のＡｐｏＢ－４８遺伝子は、終止コドンの作製をもたらす残基２１８０でのＡｐｏＢ－１００転写物のＲＮＡ編集の後に生成される。ＡｐｏＢ－１００は、ＬＤＬの主要な構造タンパク質であり、細胞受容体のリガンドとして作用し、これは、例えばコレステロールの細胞中への輸送を可能にする。
家族性高コレステロール血症は、希少疾患であり、血中のＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）のレベルの上昇から生じる。この疾患は、常染色体優性障害であり、ヘテロ接合状態（３５０～５５０ｍｇ／ｄＬ ＬＤＬ－Ｃ）およびホモ接合状態（６５０～１０００ｍｇ／ｄＬ ＬＤＬ－Ｃ）の両方がＬＤＬ－Ｃの上昇をもたらす。家族性高コレステロール血症のヘテロ接合型は、人口のおよそ１：５００である。ホモ接合状態はずっと稀であり、約１：１，０００，０００である。ＬＤＬ－Ｃの正常レベルは、１３０ｍｇ／ｄＬの領域にある。
高コレステロール血症は、小児患者において特に急性であり、これは、早期に診断されない場合、冠動脈心疾患の加速および早死をもたらし得る。早期に診断および治療される場合、小児は正常な平均余命を有し得る。成人では、高いＬＤＬ－Ｃ（変異または他の要因のいずれかによる）は、アテローム性動脈硬化症のリスクの増加と直接的に関連し、これは、冠動脈疾患、卒中または腎臓の問題を導き得る。ＬＤＬ－Ｃのレベルを低下させることは、アテローム性動脈硬化症および関連する状態のリスクを低下させることが知られている。ＬＤＬ－Ｃレベルは、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼを阻害することによってコレステロールのデノボ合成をブロックするスタチンの投与によって最初に低下され得る。いくらかの対象は、スタチンをエゼチミブ、コレスチポールまたはニコチン酸などの他の治療剤と組み合わせる併用療法の恩恵を受け得る。しかしながら、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの発現および合成は、スタチン阻害に応答して順応し、経時的に増加し、従って、有益な効果は、スタチン抵抗性が確立された後は、一時的または限定的に過ぎない。
それゆえ、ＬＤＬ－Ｃの上昇による心血管疾患を制御するために、単独で、または既存の治療アプローチとの組み合わせで使用することができる代替療法を特定することが所望されている。
遺伝子機能を特異的に除去する技術は、低分子阻害性または干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とも呼ばれる二本鎖阻害性ＲＮＡの細胞中への導入を介するものであり、これは、ｓｉＲＮＡ分子に含まれる配列に相補的なｍＲＮＡの破壊をもたらす。ｓｉＲＮＡ分子は、互いにアニーリングして、二本鎖ＲＮＡ分子を形成する、ＲＮＡの２つの相補鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）を含む。ｓｉＲＮＡ分子は、典型的には（排他的にではないが）、除去しようとする遺伝子のエキソンに由来する。多くの生物は、ｓｉＲＮＡの形成を導くカスケードを活性化することによって、二本鎖ＲＮＡの存在に応答する。二本鎖ＲＮＡの存在は、二本鎖ＲＮＡを、リボヌクレオタンパク質複合体の部分になるより小さなフラグメント（ｓｉＲＮＡ、約２１～２９ヌクレオチド長）にプロセシングするＲＮａｓｅＩＩＩを含むタンパク質複合体を活性化する。ｓｉＲＮＡは、ＲＮａｓｅ複合体が、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に相補的なｍＲＮＡを切断し、それによりｍＲＮＡの破壊をもたらすためのガイドとして作用する。
ＡｐｏＢは、ＬＤＬ－Ｃの調節における治療的介入のための既知の標的である。例えば、アンチセンスＲＮＡを使用することによってＡｐｏＢ合成をサイレンシングする試みが当技術分野で知られている。国際公開２００６／０５３４３０、国際公開２００８／１０９３５７、国際公開２０１４／０７６１９６、国際公開２０１０／０７６２４８、国際公開２０１５／０７１３８８、国際公開２０１１／０００１０８および国際公開２００８／１１８８８３を参照されたい。ＲＮＡｉまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与に関する問題は、ＲＮＡｉ分子の長さまたは修飾非天然ヌクレオチドによって引き起こされる毒性である。さらに、アンチセンス技術は必ずしも安定な形質転換を生じないので、ＲＮＡｉなどのアンチセンス構築物の安定性は変動し得る。
本開示は、センスまたはアンチセンスのいずれかの阻害性ＲＮＡの３’末端に結合された短いＤＮＡ部分を含めることによって改変され、ヘアピン構造を形成し、ＡｐｏＢをコードするヌクレオチド配列を参照して設計される二本鎖阻害性ＲＮＡを含む核酸分子に関する。参照によりその全体が組み込まれるＵＳ８，０６７，５７２は、当該核酸分子の例を開示している。二本鎖阻害性ＲＮＡは、専らまたは主に天然ヌクレオチドを使用し、従来技術の二本鎖ＲＮＡ分子が薬力学および薬物動態を向上させるために典型的に利用する修飾されたヌクレオチドまたは糖を必要としない。開示される二本鎖阻害性ＲＮＡは、潜在的により少ない副作用でＡｐｏＢをサイレンシングする活性を有する。
国際公開２００６／０５３４３０ 国際公開２００８／１０９３５７ 国際公開２０１４／０７６１９６ 国際公開２０１０／０７６２４８ 国際公開２０１５／０７１３８８ 国際公開２０１１／０００１０８ 国際公開２００８／１１８８８３
発明の陳述
本発明の一態様によれば、核酸分子であって、
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖阻害性リボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む第１の部分と、
一本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含む第２の部分であって、当該一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端は、二本鎖阻害性ＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端に共有結合しているか、または一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端は、二本鎖阻害性ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の３’に共有結合しており、二本鎖阻害性ＲＮＡは、ヒトアポリポタンパク質Ｂタンパク質の部分をコードするセンスヌクレオチド配列を含むことを特徴とし、当該一本鎖ＤＮＡ分子は、その長さの少なくとも一部にわたって、当該一本鎖ＤＮＡの一部への相補的塩基対形成によってアニーリングして、二本鎖ＤＮＡ構造を形成するように適合されたヌクレオチド配列を含む、第２の部分と、を含む、核酸分子が提供される。
本発明の一態様によれば、核酸分子であって、
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖阻害性リボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む第１の部分と、
一本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含む第２の部分であって、当該一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端は、二本鎖阻害性ＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端に共有結合しているか、または一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端は、二本鎖阻害性ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の３’に共有結合しており、二本鎖阻害性ＲＮＡは、ヒトアポリポタンパク質Ｂタンパク質、またはその多型配列変異体の部分をコードするセンスヌクレオチド配列を含むことを特徴とし、当該一本鎖ＤＮＡ分子は、その長さの少なくとも一部にわたって、当該一本鎖ＤＮＡの一部への相補的塩基対形成によってアニーリングして、二本鎖ＤＮＡ構造を形成するように適合されたヌクレオチド配列を含む、第２の部分と、を含む、核酸分子が提供される。
「多型配列変異体」は、１個、２個、３個以上のヌクレオチドによって異なる配列である。アポＢ多型は当技術分野で知られており、そのいくつかは高コレステロール血症と関連する。
本発明の好ましい実施形態では、当該一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端は、二本鎖阻害性ＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端に共有結合している。
本発明の好ましい実施形態では、当該一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端は、二本鎖阻害性ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の３’末端に共有結合している。
本発明の好ましい実施形態では、当該一本鎖ＤＮＡ分子は、ヌクレオチド配列ＴＣＡＣＣＴＣＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＧＣ（配列番号１）を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、１０～４０ヌクレオチド長である。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、１８～２９塩基対長である。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、２１塩基対長である。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を参照して設計される。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含む。
本発明の別の実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７からなる群から選択されるセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の別の実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９および１１０からなる群から選択されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号２７に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号４７に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の別の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号８０に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１００に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の別の実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３および１２５からなる群から選択されるセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の別の実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、および１２６からなる群から選択されるセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号１１１に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１１２に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号１１３に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１１４に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号１１５に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１１６に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号１１７に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１１８に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号１１９に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１２０に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号１２１に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１２２に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号１２３に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１２４に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号１２５に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１２６に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の別の実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号７、配列番号３６、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５および配列番号１１９からなる群から選択されるセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号６０、配列番号７２、配列番号８９、配列番号１００、配列番号１０８、配列番号１１４および配列番号１１８からなる群から選択されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号７に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号６０に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号１１１に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１１２に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号１１７に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１１８に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号５５に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１０８に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号４７に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１００に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号３６に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号８９に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号１９に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号７２に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号１１５に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１１６に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号１１３に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１１４に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号１１９に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１２０に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号１１３に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１１４に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、修飾された塩基、糖、ヌクレオチド間結合、またはその組み合わせを含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該核酸分子は、当該核酸分子を細胞または組織に送達するように適合された担体分子に共有結合している。
本発明の好ましい実施形態では、当該核酸分子は、Ｎ－アセチルガラクトサミンに共有結合している。好ましくは、Ｎ－アセチルガラクトサミンは三分岐である。
本発明の別の好ましい実施形態では、当該核酸分子は、オリゴマンノース、オリゴフコース、またはＮ－アセチルガラクトサミン４－サルフェートに共有結合している。
本発明のさらなる態様によれば、少なくとも１つの本発明による核酸分子を含む医薬組成物が提供される。
本発明の好ましい実施形態では、当該組成物は、医薬担体および／または賦形剤をさらに含む。
投与されるときに、本発明の組成物は、薬学的に許容される調製物で投与される。そのような調製物は、通常、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合性担体、および任意選択でコレステロール低下剤などの他の治療剤を含み得、これは、本発明による核酸分子と別々に、または組み合わせが適合性である場合は併用調製物で投与され得る。
本発明による核酸と他の異なる治療剤との組み合わせは、同時の、連続的な、または時間的に分離した投薬量として投与される。
本発明の治療薬は、注射を含む任意の従来の経路によって、または経時的な漸進的注入によって投与され得る。投与は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、経皮または経上皮であり得る。
本発明の組成物は、有効量で投与される。「有効量」は、単独で、またはさらなる用量と一緒に、所望の応答をもたらす組成物の量である。心血管疾患などの疾患を治療する場合、所望の応答は、疾患の進行の阻害または逆転である。これは、一時的に疾患の進行を遅延させることのみを含み得るが、より好ましくは、持続的に疾患の進行を停止することを含む。これは、通常の方法によってモニターされ得る。
そのような量は、もちろん、治療される特定の状態、状態の重症度、年齢、健康状態、サイズおよび体重を含む個々の患者のパラメーター、治療の期間、同時治療の性質（ある場合）、特定の投与経路、および医療従事者の知識および専門知識内の同様の要因に依存する。これらの要因は当業者によく知られており、日常的な実験だけで対処され得る。一般に、個々の成分またはその組み合わせの最大用量、すなわち、健全な医学的判断に従った最も高い安全な用量を使用することが好ましい。しかしながら、患者が、医学的理由、心理的理由または実質的に任意の他の理由で、より低い用量または許容用量を主張し得ることが当業者によって理解される。
前述の方法において使用される医薬組成物は、好ましくは無菌であり、患者への投与のために適切な重量または容量の単位で所望の応答をもたらすために有効な量の本発明による核酸分子を含む。応答は、例えば、心血管疾患の退行および疾患症状の減少などを決定することによって測定され得る。
対象に投与される本発明による核酸分子の用量は、様々なパラメーターに従って、特に使用される投与様式および対象の状態に従って選択され得る。他の要因には、所望される治療期間が含まれる。対象における応答が、適用される最初の用量で不十分である場合、より高い用量（または異なるより局所化された送達経路による有効により高い用量）が、患者の許容性が許す程度まで用いられ得る。本発明による核酸の検出方法が、治療を必要とする対象のために適切な投薬量の決定を容易にすることは明らかである。
一般に、１ｎＭ～１μＭの本明細書に開示される核酸分子の用量が、標準的な手順に従って一般に処方および投与される。好ましくは、用量は、１ｎＭ～５００ｎＭ、５ｎＭ～２００ｎＭ、１０ｎＭ～１００ｎＭの範囲であり得る。組成物の投与のための他のプロトコルは当業者に知られており、ここで、用量、注射スケジュール、注射部位、投与様式などは前述から変動する。ヒト以外の哺乳動物への組成物の投与（例えば、試験目的または獣医治療目的のため）は、上記と実質的に同じ条件下で実施される。本明細書で使用される場合、対象は、哺乳動物、好ましくはヒトであり、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたは齧歯動物を含む。
投与されるときに、本発明の医薬調製物は、薬学的に許容される量で、薬学的に許容される組成物で適用される。「薬学的に許容される」という用語は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨げない非毒性材料を意味する。そのような調製物は、通常、塩、緩衝剤、防腐剤、適合性担体、および任意選択で他の治療剤、例えばスタチンを含み得る。医薬において使用されるときに、塩は薬学的に許容されるものであるべきであるが、薬学的に許容されない塩は、その薬学的に許容される塩を調製するために好都合に使用され得、本発明の範囲から除外されない。そのような薬理学的および薬学的に許容される塩には以下の酸、塩酸、臭化水素酸塩、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸などから調製されるものが含まれるが、これらに限定されない。また、薬学的に許容される塩は、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩などのアルカリ金属またはアルカリ土類塩として調製され得る。
組成物は、所望であれば、薬学的に許容される担体と組み合わされ得る。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、ヒトへの投与のために適切な１つ以上の適合性の固体または液体の充填剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。この文脈での「薬学的に許容される担体」という用語は、例えば、溶解性および／または安定性を促進するために、それとともに活性成分が組み合わされる、天然または合成の、有機または無機の成分を示す。医薬組成物の成分はまた、所望の薬学的有効性を実質的に損なう相互作用が存在しないような方法で、本発明の分子と、そして互いに、混合されることができる。
医薬組成物は、塩の酢酸、塩のクエン酸、塩のホウ酸、塩のリン酸を含む適切な緩衝剤を含み得る。医薬組成物はまた、任意選択で、適切な防腐剤を含み得る。
医薬組成物は、単位剤形で好都合に提供され得、薬学の技術分野でよく知られている方法のいずれかによって調製され得る。すべての方法は、活性剤を、１つ以上の副成分を構成する担体と合わせるステップを含む。一般に、組成物は、活性化合物を、液体担体、微細に分割された固体担体、またはその両方と均一かつ密接に合わせ、次に、必要であれば、生成物を成形することによって調製される。経口投与のために適切な組成物は、各々が所定量の活性化合物を含む、カプセル、錠剤、トローチなどの個別の単位として提供され得る。
非経口投与のために適切な組成物は、核酸の無菌の水性または非水性の調製物を好都合に含み、これは、好ましくは、レシピエントの血液と等張である。この調製物は、適切な分散または湿潤剤および懸濁剤を使用する既知の方法に従って処方され得る。無菌の注射用調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌の注射用の溶液または懸濁液（例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液として）であり得る。用いられ得る許容される溶媒には、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の固定油は、溶媒または懸濁媒質として従来用いられている。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の刺激の少ない固定油が用いられ得る。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製において使用され得る。経口、皮下、静脈内、筋肉内などの投与のために適切な担体製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにおいて見出され得る。
本発明のさらなる好ましい実施形態では、当該医薬組成物は、少なくとも１つのさらなる異なる治療剤を含む。
本発明の好ましい実施形態では、当該さらなる治療剤は、スタチンである。
スタチンは、ＬＤＬ－Ｃの上昇を有する対象におけるコレステロールレベルを制御するために一般的に使用されている。スタチンは、罹患しやすい対象および心血管疾患を有する対象の予防および治療において有効である。スタチンの典型的な投薬量は５～８０ｍｇの領域にあるが、これは、高ＬＤＬ－Ｃを患う対象のために必要とされる所望されるＬＤＬ－Ｃ低下のレベルおよびスタチンに依存する。しかしながら、スタチンの標的であるＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの発現および合成は、スタチン投与に応答して順応し、したがって、スタチン療法の有益な効果は、スタチン抵抗性が確立された後は、一時的または限定的に過ぎない。
好ましくは、当該スタチンは、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピトバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンからなる群から選択される。
本発明の好ましい実施形態では、当該さらなる治療剤は、エゼチミブである。任意選択で、エゼチミブは、少なくとも１つのスタチン、例えばシンバスタチンと組み合わされる。
本発明の別の好ましい実施形態では、当該さらなる治療剤は、フィブラート、ニコチン酸、コレスチラミンからなる群から選択される。
本発明のさらなる別の好ましい実施形態では、当該さらなる治療剤は、治療抗体、例えば、エボロクマブ、ボコシズマブまたはアリロクマブである。
本発明のさらなる態様によれば、高コレステロール血症を有するかまたはその素因がある対象の治療または予防における使用のための、本発明による核酸分子または医薬組成物が提供される。
本発明の好ましい実施形態では、当該使用は、高コレステロール血症と関連する疾患の治療または予防である。
本発明の好ましい実施形態では、高コレステロール血症と関連する当該疾患は、卒中予防、高脂血症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、大動脈狭窄、脳血管疾患、末梢動脈疾患、高血圧、代謝症候群、ＩＩ型糖尿病、非アルコール性脂肪酸肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、バージャー病、腎動脈狭窄、高アポベータリポタンパク血症、脳血管アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患および静脈血栓症からなる群から選択される。
本発明の好ましい実施形態では、当該対象は、小児対象である。
小児対象には、新生児（０～２８日齢）、乳児（１～２４月齢）、幼児（２～６歳）および思春期前（７～１４歳）小児が含まれる。
本発明の別の好ましい実施形態では、当該対象は、成人対象である。
本発明の好ましい実施形態では、高コレステロール血症は、家族性高コレステロール血症である。
本発明の好ましい実施形態では、家族性高コレステロール血症は、アポリポタンパク質Ｂ発現のレベルの上昇と関連する。
本発明の好ましい実施形態では、当該対象は、スタチン療法に対して抵抗性である。
本発明のさらなる態様によれば、高コレステロール血症を有するかまたはその素因がある対象を治療する方法であって、有効用量の本発明による核酸または医薬組成物を投与し、それにより高コレステロール血症を治療または予防することを含む、方法が提供される。
本発明の好ましい方法では、当該対象は、小児対象である。
本発明の別の好ましい方法では、当該対象は、成人対象である。
本発明の好ましい方法では、高コレステロール血症は、家族性高コレステロール血症である。
本発明の好ましい方法では、家族性高コレステロール血症は、ＡｐｏＢ発現のレベルの上昇と関連する。
本発明の好ましい方法では、当該対象は、スタチン療法に対して抵抗性である。
本発明のさらなる態様によれば、ＡｐｏＢの上昇と関連する高コレステロール血症の診断および治療のための治療レジメンであって、
ｉ）高コレステロール血症を有することの疑いがあるかまたは高コレステロール血症を有している疑いのある対象から生物学的サンプルを取得することと、
ｉｉ）サンプルを、アポリポタンパク質ポリペプチドに特異的な抗体または抗体フラグメントと接触させることと、
ｉｉｉ）当該生物学的サンプルにおける当該アポリポタンパク質ＢポリペプチドおよびＬＤＬ－Ｃの濃度を決定することと、
ｉｖ）ＬＤＬ－Ｃ濃度が３５０ｍｇ／ｄＬ超である場合に、本発明による核酸分子または医薬組成物を投与することと、を含む、治療レジメンが提供される。
典型的には、家族性高コレステロール血症疾患において、ＬＤＬ－Ｃのレベルは、アポリポタンパク質Ｂにおける選択された変異についてヘテロ接合性である対象において３５０～５５０ｍｇ／ｄＬであり、アポリポタンパク質Ｂにおけるホモ接合変異を保有する対象において６５０～１０００ｍｇ／ｄＬである。ＬＤＬ－Ｃの正常レベルは、１３０ｍｇ／ｄＬの領域にある。
本明細書の説明および特許請求の範囲の全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」という単語、ならびにこれらの単語の変形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むがこれらに限定されない」ことを意味し、他の部分、添加物、成分、整数またはステップを除外することを意図しない（除外しない）。
本明細書の説明および特許請求の範囲の全体を通して、別段文脈上の必要がない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、別段文脈上の必要がない限り、明細書は、単数形だけでなく複数形も考慮していると理解すべきである。
本発明の態様、実施形態または例と関連して記載される特徴、整数、特性、化合物、化学部分または基は、それと非適合性でない限り、本明細書に記載される任意の他の態様、実施形態または例に適用可能であると理解すべきである。
本発明の実施形態をここで以下の図を参照して例としてのみで説明する。
対照ｓｉＲＮＡ構築物と比較した、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＣｒｏｏｋ抗マウスＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡのインビボ活性を示すグラフ。（ａ）５匹の成体雄性野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの血漿ＡｐｏＢレベル（マイクログラム／ｍｌ）を、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡｐｏＢ Ｃｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡの投与（１つの処置群）の９６時間後に測定し、生理食塩水を投与した対照処置群と比較した。統計分析を、両側の対応のあるＴ検定アルゴリズムを使用して適用した。結果は、対照と比較して、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＣｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡを用いて処置したマウスにおける平均血漿ＡｐｏＢレベルの実質的な低下を示す。しかしながら、おそらく小さなサンプルサイズ、および対照動物の間のＡｐｏＢレベルの変動に起因して、有意性には至らない（ｐ＝０．１１）。 対照ｓｉＲＮＡ構築物と比較した、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＣｒｏｏｋ抗マウスＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡのインビボ活性を示すグラフ。（ｂ）５匹の成体雄性野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの血漿ＡｐｏＢレベル（マイクログラム／ｍｌ）を、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡｐｏＢ Ｃｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡの投与（１つの処置群）の９６時間後に測定し、ｓｉＲＮＡ構築物非コンジュゲート（ＧａｌＮＡｃなし）ＡｐｏＢ Ｃｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡを投与した対照処置群と比較した。統計分析を、両側の対応のあるＴ検定アルゴリズムを使用して適用した。結果は、Ｃｒｏｏｋを有する対照非コンジュゲートｓｉＲＮＡと比較して、このＧａｌＮＡｃコンジュゲートＣｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡ処置群における血漿ＡｐｏＢレベルの高度に有意な低下を示す（Ｐ＝０．００４３５８３２）。 表２に列挙する４０個のカスタムデュプレックスＣｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡ（Ｃ１～Ｃ４０）のインビトロスクリーニング。グラフは、４０個のｃｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡの各々によるＨｅｐＧ２細胞におけるＡｐｏＢ ｍＲＮＡ発現の相対的ノックダウンを示す。個々のグラフは、表２に示す各々のｓｉＲＮＡセンスおよびアンチセンスペア、Ｃ１～Ｃ２０（センス鎖）、Ｃ２１～４０（アンチセンス鎖）からのデータを示す。４０個のｃｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡ分子の各々を、アッセイ開発段階において特定した条件を使用して、５つの用量（１００ｎＭ、２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１．５６ｎＭおよび０．３９ｎＭ）でＨｅｐＧ２細胞中に（４連で）リバーストランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、細胞を溶解し、ＡｐｏＢ ｍＲＮＡレベルをデュプレックスＲＴ－ｑＰＣＲによって決定した。各濃度の各ｓｉＲＮＡについてのＡｐｏＢの相対的ノックダウンを計算するために、発現をまずハウスキーピング参照遺伝子ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現に対して正規化し、次に対応するＮＥＧ対照（センスまたはアンチセンス）の５つの用量にわたる平均ＡｐｏＢ発現に対して正規化した。しかしながら、ＡｐｏＢ発現の低下がＮＥＧセンス対照について観察され、それでｓｉＲＮＡ Ｃ１～Ｃ２０についてのＡｐｏＢのノックダウンは過小評価されている可能性があることに留意すべきである。４０個すべてのｓｉＲＮＡのＡｐｏＢノックダウン効率を表３に示す。Ｃ１３およびＣ２３のｓｉＲＮＡは、８５％超のノックダウン効率を示す（２５ｎＭで）。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
表３は、インビトロＡｐｏＢ ｍＲＮＡ発現データ（図２（ａ～ｄ））から編集したものであり、最も高いノックダウンパフォーマーを表の最上部にして、Ｃｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡ（Ｃ１～Ｃ４０）の順位を示す。Ｃ１３およびＣ２３のｓｉＲＮＡは、８５％超のノックダウン効率を示す（２５ｎＭで）。
材料および方法
ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＣｒｏｏｋ抗マウスＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡのインビボ活性
肝臓への選択的ｓｉＲＮＡ送達を向上させるために、三分岐ＧａｌＮＡｃコンジュゲートを、ホスホロアミダート結合を介してＣｒｏｏｋ－ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖に付着させた。
以下に記載するＡｐｏＢ Ｃｒｏｏｋ－ｓｉＲＮＡの非コンジュゲート（ＧａｌＮＡｃなし）およびコンジュゲート（ＧａｌＮＡｃ）バージョンを、それぞれ静脈内（ＩＶ）および皮下（ＳＣ）経路によって成体雄性野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与して、相対的な血漿および組織曝露を調査した。さらに、対照ＧａｌＮＡｃコンジュゲート非修飾ｓｉＲＮＡ（Ｃｒｏｏｋなし）構築物を比較した。
インビボＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡ構築物
マウスにおけるＡｐｏＢのインビボサイレンシングのために、以下の配列を使用した（以下の表２におけるＣ１０に対応する。類似の配列が以前にインビボで成功していたので、これを選択した（Ｓｏｕｔｓｈｅｋ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ２００４；４３２：１７３－１７８）。
Ｃｒｏｏｋ－ｓｉＲＮＡ ２１ｍｅｒ－ｄｓＲＮＡ構築物（１）：抗マウスＡｐｏＢ－ＧａｌＮＡｃ
センス鎖：
５’－ＧＵＣＡＵＣＡＣＡＣＵＧＡＡＵＡＣＣＡＡＵ－ｄ（ｔｃａｃｃｔｃａｔｃｃｃｇｃｇａａｇｃ）－３’－［Ｔｒｉ－ＧａｌＮＡｃ］
アンチセンス鎖：
５’－ＡＵＵＧＧＵＡＵＵＣＡＧＵＧＵＧＡＵＧＡＣ－３’
最終的なＧａｌＮＡｃコンジュゲートの構造：
Ｃｒｏｏｋ－ｓｉＲＮＡ ２１ｍｅｒ ｄｓＲＮＡ構築物（２）：非コンジュゲート抗マウスＡｐｏＢ
センス鎖（パッセンジャー）
５’－ＧＵＣＡＵＣＡＣＡＣＵＧＡＡＵＡＣＣＡＡＵ－ｄ（ｔｃａｃｃｔｃａｔｃｃｃｇｃｇａａｇｃ）－３
アンチセンス鎖（ガイド）
５’－ＡＵＵＧＧＵＡＵＵＣＡＧＵＧＵＧＡＵＧＡＣ－３
用量選択のための理論的根拠は、科学文献において公開された以下の情報に基づいた。
ＧａｌＮＡｃコンジュゲートｓｉＲＮＡを、５ｍｇ／ｋｇで皮下投与し、これは、遺伝子サイレンシングの必要とされるレベルをもたらすことが予想され、ここで、構造的に関連するｓｉＲＮＡのＥＤ８０は、２．５ｍｇ／ｋｇであると報告されている（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００４）。これらの構造的に関連するｓｉＲＮＡは、マウスにおいて２５ｍｇ／ｋｇ（単回投与）まで許容された（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
スポンサーのｓｉＲＮＡの非コンジュゲートバージョンを、５０ｍｇ／ｋｇ ＩＶで投与する。ＳＣ用量と比較して１０倍のＩＶでのこの増加は、非コンジュゲートｓｉＲＮＡの肝臓の標的化における有効性がより低いことに起因する。さらに、ＳＣ投与と比較して、ＩＶの後に肝臓においてより低いレベルのＲＮＡが測定されることが、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ（２００４）によって報告されている。ＳＣデポからのｓｉＲＮＡのより遅い放出は、受容体－リガンド相互作用の可能性を増加させる曝露の延長、および組織中へのより大きな取り込みを導くと記述されている。類似の関連するｓｉＲＮＡは、連続する３日間のＩＶ投与で５０ｍｇ／ｋｇまでマウスによってよく許容されている（Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．２０１４）。予防措置として、残りの動物に投薬する前に、１５分の観察期間を第１の動物のＩＶ投薬の間に置いて、試験物質が何らかの有害作用を引き起こすかどうかを決定する。
マウスが、選択する種である。なぜなら、それは試験物質の安全性試験における毒物学の種の１つとして使用されているからである。マウスはまた、Ｃｒｏｏｋ－ｓｉＲＮＡ調製物の治療標的（ＡｐｏＢ）に関してヒトと非常に類似した代謝生理を持っている。この種において生成されたデータのヒトに対する意義を評価のために規制当局に許容される利用可能なかなりの量の公開されたデータが存在する。
動物
２０匹の健康な雄性動物（処置群当たり５匹のマウス）を提供するために十分なＣ５７ＢＬ／６マウスを、承認された供給元から取得した。動物は、投薬時に２０～３０ｇの目標体重範囲にある。マウスに、尾部マーキングによって一意的に番号付けする。番号をランダムに割り当てる。ケージを、研究番号および動物番号を含む情報を与えるカードによってコード化する。研究部屋を、部屋番号および研究番号を含む情報を与えるカードによって特定する。受け取り時に、すべての動物を、不健康の外部兆候について検査した。不健康な動物を研究から除外した。動物を最低５日の期間気候順化させた。実行可能な場合、研究の科学的完全性を損なうことなしに、動物をできるだけ取り扱った。投薬開始前に福祉監査を実行して、研究のためのそれらの適合性を確実にした。
マウスを、４５～６５％の相対湿度で、２０～２４℃の温度に恒温維持された部屋の中に維持し、毎日蛍光灯（名目上１２時間）に曝露した。温度および相対湿度を毎日記録する。施設は、最低１５回の空気交換／時間を与えるように設計されている。代謝ケージ中または手術からの回復時を除いて、マウスを、適切な寝床を含む適切な固体床ケージ中に、性別に従ってケージ当たり５匹まで収容した。
ケージは、’Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｏｕｓｉｎｇ ａｎｄ Ｃａｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ Ｂｒｅｄ，Ｓｕｐｐｌｉｅｄ ｏｒ Ｕｓｅｄ ｆｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ’（Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，２０１４）に従っている。動物の環境および福祉の両方を高めるために、それらに木製Ａｓｐｅｎチューブロックおよびポリカーボネートトンネルを与えた。サプライヤーは、使用したブロックの各バッチについて分析証明書を提供した。すべての動物は、５ＬＦ２ ＥＵ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ １４％への自由接近を許可される。食餌のサプライヤーは、使用した各バッチについて特定の混入物およびいくつかの栄養素の濃度の分析を提供した。すべての動物は、ケージに取り付けられたボトルからの水道水への自由接近を許可された。水道水供給の定期的な分析を行う。
本研究の一部として生きた動物に対して実施されるすべての手順は、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｗ，ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ １９８６の規定に従う。
すべての動物を、それらが健康であることを確実にするために、作業日の開始時と終了時に検査した。不健康の顕著な兆候を示すすべての動物を隔離した。瀕死の動物または関連する内務省認可によって課せられた重症度限界を超える危険にある動物を屠殺した。
インビボ実験のための材料および方法
製剤の調製
試験物質を０．９％生理食塩水中で希釈して、それぞれ、ＡｐｏＢ Ｃｒｏｏｋ－ｓｉＲＮＡ ＧａｌＮＡｃ非コンジュゲートおよびコンジュゲートのＩＶおよびＳＣ用量のための２５ｍｇ／ｍＬおよび０．６ｍｇ／ｍＬの濃度を提供した。試験物質が完全に溶解するまで、製剤を適切に穏やかにボルテックスした。得られた製剤（複数可）を目視検査のみによって評価し、それに従って分類した。
（１）清澄溶液
（２）濁った懸濁液、可視粒子なし
（３）可視粒子
使用後、製剤を名目上２～８℃で冷蔵保存した。
投薬の詳細
各動物に、ＡｐｏＢ Ｃｒｏｏｋ－ｓｉＲＮＡ非コンジュゲートの単回ＩＶ用量、またはＡｐｏＢ Ｃｒｏｏｋ－ｓｉＲＮＡ ＧａｌＮＡｃコンジュゲートの単回ＳＣ用量のいずれかを与えた。ＩＶ用量を、２ｍＬ／ｋｇの容量で外側尾静脈中にボーラスとして投与した。ＳＣ用量を、５ｍＬ／ｋｇの容量で皮下空間中に投与した。
群１：ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡｐｏＢ Ｃｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡ ５ｍｇ／ｋｇ用量
群２：非コンジュゲート（ＧａｌＮＡｃなし）ＡｐｏＢ Ｃｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡ ５０ｍｇ／ｋｇ用量
群３：生理食塩水対照群
体重
最低限でも、体重を、到着の翌日および用量投与の前日に記録した。必要であれば、追加の決定を行った。
サンプル保存
適切な場合、サンプルに、以下を含む情報で一意的にラベルを付した：研究番号、サンプルタイプ、用量群、動物番号／Ｄｅｂｒａコード、（名目上）サンプリング時間、保存条件。サンプルを＜－５０℃で保存した。
薬物動態調査
用量群の指定
動物を以下のように用量群に割り当てた。
血液サンプリング
一連の血液サンプル（名目上１００μＬ、体重に依存）を、以下の時点、投薬後０、４８、および９６時間で、尾部切り込みによって収集した。動物を、ペントバルビタールナトリウムを使用して終末的に麻酔し、最終サンプル（名目上０．５ｍＬ）を心臓穿刺によって収集した。
血液サンプルをＫ２ＥＤＴＡマイクロキャピラリーチューブ（尾部切り込み）またはＫ２ＥＤＴＡ血液チューブ（心臓穿刺）に収集し、処理するまで氷上に置いた。血液を遠心分離して（１５００ｇ、１０分、４℃）、分析のための血漿を得た。バルク血漿を、等容量の２つのアリコートに分けた。残存血液細胞を廃棄した。
予定した収集時間が許容される範囲外である場合、実際の血液収集時間を、任意のその後のＰＫ分析において含めるために報告した。
動物の運命
動物を、終末血液サンプリングの前にペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射を介して麻酔し、灌流および放血によって屠殺した。
全身灌流を実行し、すべての動物をヘパリン処理生理食塩水溶液で４ｍｌ／分の速度で５分間フラッシュした（約２０ｍＬの総フラッシュ）。死亡を、呼吸、心拍および血流の不在によって確認した。動物の死骸を組織収集のために保持した。
組織収集
肝臓を、すべての動物（群Ａ～Ｄ）から取り出し、事前秤量したチューブ中に入れた。組織サンプルを、ＵｌｔｒａＴｕｒｒａｘホモジナイゼーションプローブを使用して、１部の組織に対して５部のＲＮＡｌａｔｅｒを用いてホモジナイズした。以下の組織を、ＡｐｏＢ処置群（群ＡおよびＣ）の動物から切除し、事前秤量したポット中に入れた。
・脾臓
・脳
・心臓
・肺葉
・皮膚（鼠径部、約２５ｍｍ２）
収集後、組織の外表面をＰＢＳでリンスし、ティッシュを使用してそっと軽くたたいて乾燥させた。組織を、秤量するまで最初に湿潤氷上に置き、次に組織を保存前にドライアイス上で瞬間凍結させた。組織を＜－５０℃（名目上－８０℃）で保存する。
ＡＰＯＢについてのイムノアッセイ
血漿ＡｐｏＢレベルを、Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．の市販のマウスＡｐｏＢ検出キット（カタログ番号Ｅ－ＥＬ－Ｍ０１３２）を使用する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を介して測定した。血漿サンプルを分析前に－８０℃で保存し、氷上で解凍し、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、アリコートをアッセイバッファー中で希釈し、ＥＬＩＳＡプレートにアプライした。ＡｐｏＢアッセイキットは、ＯＤ４５０で測定される比色測定読み出しをもたらすサンドイッチＥＬＩＳＡを使用する。特定の時点（０時間および９６時間）での各動物からのサンプルを２連でアッセイし、測定値を、キットとともに供給される標準曲線試薬に基づいて、血漿１ｍｌ当たりのＡｐｏＢのマイクログラムとして記録した。すべてのデータポイントは、変動係数＜２０％で測定された。
ＡｐｏＢ Ｃｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡのインビトロスクリーニング
ＨｅｐＧ２リバーストランスフェクション
本研究において評価したカスタムライブラリの説明を表２に示す。Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙによって合成されたカスタムデュプレックスｓｉＲＮＡを、ＵｌｔｒａＰｕｒｅ ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ不含水中に再懸濁して、１０μＭのストック溶液を生成した。
・ストックｓｉＲＮＡを、４×３８４ウェルアッセイプレート中に分注した。各アッセイプレート上に、１０個のカスタムｓｉＲＮＡと３個の対照（ＰＯＳ ＡｐｏＢ、ＮＥＧセンスおよびＮＥＧアンチセンス）を分注して、１００ｎＭのアッセイプレートにおける最高最終濃度からの５点４倍希釈系列を生成した。ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ非標的化およびＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡ対照を分注して、２５ｎＭの最終濃度とした。
・Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃１３７７８０７５）をＯｐｔｉＭＥＭ培地中で希釈した後、ウェル当たり１０μＬのＬｉｐｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ：ＯｐｔｉＭＥＭ溶液をアッセイプレートに添加した。ウェル当たりのＲＮＡｉＭＡＸの最終容量は０．０８μＬであった。
・脂質－ｓｉＲＮＡミックスを室温で３０分間インキュベートした後、細胞に添加した。
・ＨｅｐＧ２細胞をアッセイ培地（ＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧＩＢＣＯ）１０％ＦＢＳ １％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中で希釈した後、４，０００個のＨｅｐＧ２細胞を４０μＬの容量でアッセイプレートの各ウェル中に播種した。４連の技術的複製物をアッセイ条件ごとに播種した。
・細胞の評価の前に、プレートを加湿雰囲気中、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。
ＡｐｏＢ／ＧＡＰＤＨデュプレックスＲＴ－ｑＰＣＲ
・トランスフェクションの７２時間後に、細胞を、Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴ １－ｓｔｅｐ ＴａｑＭａｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、４３９１８５１Ｃ）を使用して、ＲＴ－ｑＰＣＲ読み出しのために処理した。簡単に説明すると、細胞を５０μｌの冷ＰＢＳで洗浄し、次にＤＮａｓｅＩを含む２０μｌの溶解溶液中で溶解した。５分後に、溶解を、２μｌのＳＴＯＰ溶液を２分間添加することによって停止した。
・ＲＴ－ｑＰＣＲ分析のために、ウェル当たり３μｌの溶解物を、３８４ウェルＰＣＲプレート中にテンプレートとして１１μｌのＲＴ－ｑＰＣＲ反応容量中で分注した。
・ＲＴ－ｑＰＣＲを、ＧＡＰＤＨ（ＶＩＣ ＃４４４８４８６）およびＡｐｏＢ（ＦＡＭ ＃４３５１３６８）用のＴａｑＭａｎプローブとともにＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｖｉｒｕｓ１－Ｓｔｅｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（＃４４４４４３４）を使用して実行した。
・ＲＴ－ｑＰＣＲを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６サーモサイクリング装置（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して実行した。
・相対的定量（ＲＱ）をΔΔＣＴ法を使用して決定し、ここで、ＧＡＰＤＨを内部標準として使用し、発現の変化を参照サンプル（ＮＥＧセンスまたはＮＥＧアンチセンスのいずれかのｓｉＲＮＡ処理細胞）に対して正規化した。
統計
・このプロジェクトにおけるすべてのアッセイについて、４つの技術的複製物を各データポイントについて取得した。
・平均および標準誤差（ＳＥＭ）を、ＥｘｃｅｌまたはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して計算した。
・すべてのグラフを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して生成した。
表１：ＡｐｏＢ ｃｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡの配列および対応する配列番号
表２．４０個のデュプレックスｓｉＲＮＡのライブラリーがＨｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙによって合成された。この表は、各ｓｉＲＮＡについてのＲＮＡの両方の鎖の配列を示す。以下のＤＮＡ配列（ｄＴｄＣｄＡｄＣｄＣｄＴｄＣｄＡｄＴｄＣｄＣｄＣｄＧｄＣｄＧｄＡｄＡｄＧｄＣ）を、センス鎖（ｓｉＲＮＡ Ｃ１～Ｃ２０、以下、センスｓｉＲＮＡと呼ぶ）またはアンチセンス鎖（ｓｉＲＮＡ Ｃ２１～Ｃ４０、以下、アンチセンスｓｉＲＮＡと呼ぶ）のいずれかの３’末端に付加した。
実施例１
パイロットインビボマウス実験を実施して、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＣｒｏｏｋ抗マウスＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡの活性を、対照ｓｉＲＮＡ構築物と比較して評価した。ＡｐｏＢ Ｃｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡ（表２における配列Ｃ１０；Ｃｏｖａｎｃｅ）のコンジュゲート（ＧａｌＮＡｃ）および非コンジュゲート（ＧａｌＮＡｃなし）バージョンを、それぞれ材料および方法の節において先に記載した皮下（ＳＣ）および静脈内（ＩＶ）経路によって成体雄性野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与した。
血漿ＡｐｏＢを、投薬の詳細の下で上記で詳述した、４つの処置群（群当たり５匹のマウス）において示すように、時間０（ｓｉＲＮＡ構築物の投与前）およびｓｉＲＮＡ構築物投与の９６時間後にＥＬＩＳＡ（上記）によって測定した。
各処置群の５匹のマウスからの血漿ＡｐｏＢレベル（マイクログラム／ｍｌ）を使用して、平均ＡｐｏＢ値＋／－標準誤差（ＳＥＭ）を計算した。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＣｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡのＳＣ投与の９６時間後の血漿ＡｐｏＢレベルの変化を、対照の（ｉ）ビヒクル生理食塩水、または（ｉｉ）Ｃｒｏｏｋを有する非コンジュゲートｓｉＲＮＡのいずれかを与えたマウスにおけるレベルと比較した。統計分析を、両側の対応のあるＴ検定アルゴリズムを使用して適用した。
図１（ａ）を参照して、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡｐｏＢ Ｃｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡでの処置の９６時間後のマウスの血漿ＡｐｏＢレベル（マイクログラム／ｍｌ）を、生理食塩水を投与した対照処置群と比較した。統計分析を、両側の対応のあるＴ検定アルゴリズムを使用して適用した。結果は、対照と比較して、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＣｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡで処置したマウスにおける平均血漿ＡｐｏＢレベルの実質的な低下を示す。しかしながら、おそらく小さなサンプルサイズ、および対照動物の間のＡｐｏＢレベルの変動に起因して、有意性には至らない（ｐ＝０．１１）。
図１（ｂ）を参照して、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡｐｏＢ Ｃｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡの投与の９６時間後に測定した血漿ＡｐｏＢレベル（マイクログラム／ｍｌ）を、ｓｉＲＮＡ構築物非コンジュゲート（ＧａｌＮＡｃなし）ＡｐｏＢ Ｃｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡで処置した対照群と比較した。統計分析を、両側の対応のあるＴ検定アルゴリズムを使用して適用した。
結果は、Ｃｒｏｏｋを有する対照非コンジュゲートｓｉＲＮＡと比較して、このＧａｌＮＡｃコンジュゲートＣｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡ処置群における血漿ＡｐｏＢレベルの高度に有意な低下を示す（Ｐ＝０．００４３５８３２）。
重要なことに、このパイロットインビボ実験において使用した、選択したＡｐｏＢ Ｃｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡ配列（表２におけるＣ１０；Ｃｏｖａｎｃｅ）は、インビトロＡｐｏＢ Ｃｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡスクリーニングの前に実行された。本発明者らのその後のインビトロデータ（実施例２）は、より高いＡｐｏＢ ｍＲＮＡノックダウン（ＫＤ）効率を有する他のｓｉＲＮＡ配列が存在することを示しており（表３）、例えば、Ｃ２３は、Ｃ１０（７４％）と比較して、２５ｎＭで８９％のＫＤを与える。
実施例２
図２（ａ～ｄ）を参照して、ＨｅｐＧ２細胞におけるアレイＲＮＡｉスクリーニングを実行して、ヒトＡｐｏＢ遺伝子を標的とする４０個の「ｃｒｏｏｋ」ｓｉＲＮＡのカスタムライブラリー（表２）を評価した。このライブラリー中のすべてのｓｉＲＮＡは、センスＲＮＡ鎖（センスｓｉＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡ鎖（アンチセンスｓｉＲＮＡ）に付加されたＤＮＡ伸長（または「ｃｒｏｏｋ」）を持っている。
スクリーニングを実行する前に、ＨｅｐＧ２リバーストランスフェクションのために適切な条件を特定した。まず、必須遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを使用して、いくつかのトランスフェクション条件を評価した後、選択した条件を、ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ｓｉＲＮＡを使用したＡｐｏＢの発現のノックダウン、ならびにＡｐｏＢの遺伝子およびタンパク質の発現の分析のための分子検出ツールの評価に進めた。ホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）およびデュプレックスリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）アッセイを、それぞれタンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルでのＡｐｏＢ発現の変化を定量化するために開発した。スクリーニング段階において、４０個のカスタムｃｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡを、５点用量範囲にわたって評価した。トランスフェクションの７２時間後に、ＡｐｏＢ発現をデュプレックスＲＴ－ｑＰＣＲによって評価した。データをその関連する陰性対照（センスｓｉＲＮＡについてはＮＥＧセンス、アンチセンスｓｉＲＮＡについてはＮＥＧアンチセンス）に対して正規化した場合、少しの注目すべきものを例外として、ＡｐｏＢ発現のノックダウンは、同じＲＮＡ配列を共有するセンスｓｉＲＮＡとアンチセンスｓｉＲＮＡとの間で類似していた。しかしながら、ＡｐｏＢ発現の低下がＮＥＧセンス対照について観察され、それでｓｉＲＮＡ Ｃ１～Ｃ２０についてのＡｐｏＢのノックダウンは過小評価されている可能性があることに留意すべきである。
ＨｅｐＧ２細胞を、アッセイ開発段階において特定した条件を使用して、ｓｉＲＮＡ対照と一緒に４０個のカスタムｃｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡ（２０個のセンスｓｉＲＮＡおよび２０個のアンチセンスｓｉＲＮＡ）のライブラリーを用いてリバーストランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、トランスフェクトした細胞におけるＡｐｏＢ ｍＲＮＡレベルをデュプレックスＲＴ－ｑＰＣＲによって定量化し、ＡｐｏＢ ｍＲＮＡレベルをハウスキーピング参照遺伝子ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのレベルに対して正規化した（図２（ａ～ｄ））。
４０個のカスタムｃｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡ分子の評価はいくつかのアッセイプレートをカバーしたので、アッセイＱＣステップを実行できるように、各プレートにいくつかの対照を含めた。これらには、２５ｎＭで評価したＡｐｏＢを標的とするＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ（ＯＴ＋）ｓｉＲＮＡおよび対応非標的化対照、ならびにセンスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡのための陰性対照（それぞれＮＥＧセンスおよびＮＥＧアンチセンス）およびアルゴノート対照ＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡ（ＰＯＳ ＡｐｏＢ）が含まれた。
図２（ａ～ｄ）を参照して、ｓｉＲＮＡ濃度の増加に伴うＡｐｏＢ発現の用量依存的な減少が、試験したｓｉＲＮＡの大部分について観察されたが、しかしながら、観察されたノックダウンのレベルは、予想どおり、ｓｉＲＮＡ間で異なった。標的化ｓｉＲＮＡによるＡｐｏＢのノックダウンは、限定的なノックダウンが観察されたｓｉＲＮＡ Ｃ２８およびＣ２９を例外として、試験したすべてのｓｉＲＮＡについてＮＥＧ対照よりも大きかった。
表３を参照して、同じＲＮＡ配列を標的とするセンスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡを比較した場合、ノックダウンは類似していた。４つのｓｉＲＮＡペアは、センスｓｉＲＮＡとアンチセンスｓｉＲＮＡとの間でノックダウン効率の相違を示すようであった。これらは、Ｃ３－Ｃ２３、Ｃ８－Ｃ２８、Ｃ９－Ｃ２９、およびＣ１３－Ｃ３３であった。Ｃ３－Ｃ２３を除いたこれらすべてについて、センスｓｉＲＮＡはアンチセンスｓｉＲＮＡよりも効率的であるようであったが、しかしながら、Ｃ８－Ｃ２８およびＣ９－Ｃ２９については、アンチセンスｓｉＲＮＡはＡｐｏＢ発現をノックダウンしないようであった。
２５ｎＭのｓｉＲＮＡでの処理後のＡｐｏＢ ｍＲＮＡレベルに基づいて全体に、以下のｓｉＲＮＡ、センスｃｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡ Ｃ３およびＣ１３ならびにアンチセンスｃｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡ Ｃ２３、Ｃ２４、Ｃ３０およびＣ３６が最高のノックダウン効率を示す。Ｃ１３およびＣ２３は、この用量で８５％超のノックダウン効率を示す唯一の２つのｓｉＲＮＡである（表３を参照されたい）。
表３ ＨｅｐＧ２細胞におけるＡｐｏＢ Ｃｒｏｏｋ ｓｉＲＮＡ（Ｃ１～Ｃ４０）のインビトロ活性。各ｓｉＲＮＡを、ＡｐｏＢ ｍＲＮＡノックダウン（ＫＤ）のパフォーマンスに従って順位付けし、最も高いＫＤを表の最上部にしている。
参考文献
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Claims (27)

  1. 核酸分子であって、
    センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖阻害性リボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む第１の部分と、
    ヌクレオチド配列５’ＴＣＡＣＣＴＣＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＧＣ３’（配列番号１）からなる一本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含む第２の部分とを含み、
    前記一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端は、前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子の前記センス鎖の３’末端に共有結合しているか、または前記一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端は、前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子の前記アンチセンス鎖の３’末端に共有結合しており、前記二本鎖阻害性ＲＮＡは、配列番号２に示されるセンスヌクレオチド配列を含み、１８～２９ヌクレオチド長であることを特徴とし、前記二本鎖阻害性ＲＮＡは天然ヌクレオチドからなる、核酸分子。
  2. 核酸分子であって、
    センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖阻害性リボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む第１の部分と、
    ヌクレオチド配列５’ＴＣＡＣＣＴＣＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＧＣ３’（配列番号１）からなる一本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含む第２の部分とを含み、
    前記一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端は、前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子の前記センス鎖の３’末端に共有結合しているか、または前記一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端は、前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子の前記アンチセンス鎖の３’末端に共有結合しており、前記二本鎖阻害性ＲＮＡは、配列番号２に示されるセンスヌクレオチド配列またはその多型配列変異体を含み、１８～２９ヌクレオチド長であることを特徴とし、前記二本鎖阻害性ＲＮＡは天然ヌクレオチドからなる、核酸分子。
  3. 前記一本鎖ＤＮＡ分子の前記５’末端が、前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子の前記センス鎖の前記３’末端に共有結合している、請求項１または２に記載の核酸分子。
  4. 前記一本鎖ＤＮＡ分子の前記５’末端が、前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子の前記アンチセンス鎖の前記３’末端に共有結合している、請求項１または２に記載の核酸分子。
  5. 前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子が、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７からなる群から選択されるセンスヌクレオチド配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  6. 前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子が、配列番号５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９および１１０からなる群から選択されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  7. 前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子が、配列番号１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３および１２５からなる群から選択されるセンスヌクレオチド配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  8. 前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子が、配列番号１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４および１２６からなる群から選択されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  9. 前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子が、配列番号７、配列番号３６、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５および配列番号１１９からなる群から選択されるセンスヌクレオチド配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  10. 前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子が、配列番号６０、配列番号７２、配列番号８９、配列番号１００、配列番号１０８、配列番号１１４および配列番号１１８からなる群から選択されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  11. 前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子が、配列番号７に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号６０に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  12. 前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子が、配列番号１１１に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１１２に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  13. 前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子が、配列番号１１７に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１１８に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  14. 前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子が、配列番号５５に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１０８に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  15. 前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子が、配列番号４７に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１００に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  16. 前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子が、配列番号３６に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号８９に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  17. 前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子が、配列番号１９に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号７２に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  18. 前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子が、配列番号１１５に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１１６に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  19. 前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子が、配列番号１１３に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１１４に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  20. 前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子が、配列番号１１９に示されるセンスヌクレオチド配列および配列番号１２０に示されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  21. 前記核酸分子が、Ｎ－アセチルガラクトサミンに共有結合している、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸分子。
  22. 前記Ｎ－アセチルガラクトサミンが、前記核酸分子の前記一本鎖ＤＮＡ部分に結合している、請求項２１に記載の核酸分子。
  23. 前記Ｎ－アセチルガラクトサミンが、前記核酸分子の前記一本鎖ＤＮＡ部分の３’末端に結合している、請求項２２に記載の核酸分子。
  24. 少なくとも１つの、請求項１～２３のいずれか一項に記載の核酸分子を含む医薬組成物。
  25. 高コレステロール血症を有するかまたはその素因がある対象の治療または予防における使用のための、請求項１～２４のいずれか一項に記載の核酸分子または医薬組成物。
  26. 高コレステロール血症と関連する疾患の治療または予防における請求項２５に記載の使用のための核酸または医薬組成物。
  27. 高コレステロール血症と関連する前記疾患が、家族性高コレステロール血症、卒中予防、高脂血症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、大動脈狭窄、脳血管疾患、末梢動脈疾患、高血圧、代謝症候群、ＩＩ型糖尿病、非アルコール性脂肪酸肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、バージャー病、腎動脈狭窄、高アポベータリポタンパク血症、脳血管アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患および静脈血栓症からなる群から選択される、請求項２６に記載の使用のための核酸または医薬組成物。
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