CN101130755A - 崂山食用牛肝菌液体菌种的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种崂山食用牛肝菌液体菌种的培养方法，其特征是使用马铃薯、葡萄糖、松根细粉、维生素B1、琼脂、蒸馏水等原料按照一定配比配制菌种制备培养基和液体培养基，使用菌种制备培养基培养崂山食用牛肝菌离体部分子实体制备菌种，使用液体培养基按照液体培养方法进行菌丝体的发酵培养。本发明中，所提供培养基特别适合崂山牛肝菌的菌种制备与菌丝体的液体发酵培养，利用该培养基和培养方法，可快速进行崂山牛肝菌菌丝体的液体发酵培养。
Description
技术领域
本发明涉及食用菌液体菌种的培养方法，特别涉及其中的产自于山东青岛崂山的崂山食用牛肝菌液体菌种的培养方法。
背景技术
美味牛肝菌属于担子菌纲散菌目、牛肝菌科牛肝菌属，据报道，美味牛肝菌含有二十种多氨基酸，多种矿物质、维生素和多糖，具有协调内分泌、提高人体免疫机能和显著的抗肿瘤活性。液体培养是微生物产品大规模生产的基本方法，它可在短时间内获得大量生物产品，该法具有不受环境与气候条件的限制，重复性好，工艺易于放大，而且安全性不用怀疑的优点。由于美味牛肝菌是菌根菌，目前不能人工栽培，野生资源不能满足人们的需要，液体发酵培养取代子实体的体外培养是解决这一问题的有效办法。目前，研究人员分离了一牛肝菌菌株，研究了PDA培养基中的葡萄糖、培养基的pH、培养温度对该菌株液体培养的影响，结果表明，该菌株在培养基中添加60mg/ml葡萄糖、pH5.5-6.0培养温度为26℃时，该菌生长良好，多糖产量为6.7mg/ml；还采用响应曲面法对影响牛肝菌(Boletus sp.)ACCC50328产糖与生长的工艺参数，发酵温度、发酵时间和装液量的最佳水平范围进行了研究和探讨，确定了马铃薯培养基中添加5g/L葡萄糖、22g/L的麦芽糖、14g/L的酵母膏、0.5g/L KH2PO4、2.7g/L(NH4)2SO4、0.067g/LFeSO4、100μg/L CuSO4适于该菌生长，最适生长温度为26.77℃，最佳培养时间为10.9天，装液量为64.90ml。还有研究人员对美味牛肝菌(Boletus edulis)深层发酵条件及菌丝体的主要营养成分进行了研究，结果表明，最适培养基配方为：葡萄糖30.0g，玉米粉20.0g，酵母膏7.0g，KH2PO4 2.0g，MgSO4.7H2O 1.0g，VB10.01g，CaCO3 2.0g，最优发酵条件的初始pH5.2-5.8，振荡速度180r/min，培养温度27℃，三角瓶装液量为60ml。此外，适合食用菌培养的培养基和培养工艺还有很多种，中国专利00123385.8公开了一种利用酒精废糟液添加了淀粉、蔗糖、酵母粉配置的培养基，通过深层发酵生产食用药用菌种的制备方法；中国专利01114001.1公开了一种食用菌液体菌种的培养基和培养方法。该培养基含有土豆汁、红塘、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锌、VB1、琼脂等，培养方式为含有空气提升管的罐体发酵培养；中国专利200410001084.7还公开一种食用菌液体菌种深层发酵工艺，该工艺涉及母种培养基、一级发酵培养基和深层发酵培养基，主要成分有葡萄糖、酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸镁、棉子皮粉、玉米粉、蛋白胨、麸皮、阔叶木屑、琼脂等成分。
产自于山东青岛崂山的崂山食用牛肝菌子实体饱满，味道鲜美，营养丰富，但受气候季节条件限制产量不高，需要通过发酵大量获得菌丝体以满足其在食品等行业的应用，但目前已报道的培养基和培养条件对制备崂山牛肝菌菌种及液体培养效果并不理想，因此迫切需要提供新的崂山食用牛肝菌液体菌种的培养方法。
发明内容
本发明的任务在于提供一种新的崂山牛肝菌液体菌种的培养方法，该方法能快速地进行崂山牛肝菌菌丝体的液体发酵培养。
其技术解决方案是：
一种崂山食用牛肝菌液体菌种的培养方法，包括步骤：
a使用菌种制备培养基培养崂山食用牛肝菌离体部分子实体制备菌种，上述的菌种制备培养基由下述原料及重量份配制而成。
马铃薯 190～210
葡萄糖 18～21
松根细粉 15～25
维生素B1 0.0008～0.0012
琼脂 12～18
蒸馏水 1000
pH值 4.6～5.0
上述步骤a中，包括步骤：
a1将新鲜马铃薯洗净，去皮，切成小块，称取；量取蒸馏水，放入大烧杯中煮沸后加入马铃薯及松根细粉，小火煮沸30分钟，然后过滤取滤液，在滤液中加入琼脂、葡萄糖，煮至琼脂完全溶解，调节pH值为4.8，在121℃条件下高温灭菌30分钟；待灭菌完成后，取出冷却至50℃，加入维生素B1母液，混匀，在超净工作台上倒平皿，凝固后即可使用。
上述步骤a中，包括步骤：
a2取新鲜崂山食用牛肝菌子实体，在超净工作台上无菌操作，用解剖刀切取子实体组织，将子实体组织分离后迅速移植到含有菌种制备培养基的平皿上，待长出菌丝体后，转皿扩繁。
上述步骤a2中，包括步骤：
a21将崂山食用牛肝菌子实体，用小刀小心削去柄基部泥土和表面脏物，将子实体一掰为二，在用解剖刀切取菌柄连接处的菌盖中心组织块直径3～5mm，迅速用接种针挑取移放到平皿上，在25℃条件下培养观察。
上述崂山食用牛肝菌液体菌种的培养方法，还包括步骤：
b使用液体培养基按照液体培养方法进行菌丝体的发酵培养，上述的液体培养基由下述原料及重量份配制而成。
马铃薯 190～210
葡萄糖 18～21
松根细粉 15～25
维生素B1 0.0008～0.0012
蒸馏水 1000
上述步骤b中，包括步骤：
b1量取蒸馏水，放入大烧杯中煮沸后加入马铃薯及松根细粉，小火煮沸30分钟，然后过滤取滤液，在滤液中加入葡萄糖，调节pH值为4.6～5.0，121℃条件下高温灭菌30分钟；待灭菌完成后，取出冷却至50℃，加入维生素B1，混匀，装/分装在三角瓶中备用。
上述步骤b中，包括步骤：
b2将在上述步骤a2中获得已活化好的菌丝体连同培养基，切成4cm2左右的菌饼，接种于步骤b1中瓶装液体培养基中，在25℃、150～300r/min回旋式摇床上振荡培养，滤纸过滤得湿菌丝体。
本发明提供了一种崂山食用牛肝菌菌种的培养方法，与已报道有关牛肝菌的培养方法比，本发明提供的培养基的配方简单，其中添加了松根粉，培养基pH也低于已报道培养基的pH，培养温度也较其它牛肝菌的培养温度低，崂山牛肝菌液体菌种在此培养条件下生长良好，获得的菌丝体的可溶性蛋白、糖以及游离氨基酸含量都与野生崂山食用牛肝子实体的含量相当。
具体实施方式
实施例1-1
将新鲜马铃薯洗净，去皮，切成小块，称取；量取1000毫升蒸馏水，放入大烧杯中煮沸后加入马铃薯205克，干燥的松根细粉19克，小火煮沸30分钟，然后将用两层纱布过滤，在煮汁中加入琼脂15克、葡萄糖20克，煮至琼脂完全溶解将溶液定溶至1000毫升，盐酸调pH至4.8；121℃条件下高压灭菌30分钟。待灭菌完成后，取出冷却至50℃，加入维生素B1母液(50mg/ml)20微升，混匀，在超净工作台上倒平皿，凝固后即可使用。
取夏季产于崂山上北九水等地带的新鲜崂山食用牛肝菌子实体，用小刀小心削去柄基部泥土和表面脏物，在超净工作台上无菌操作，将子实体一掰为二，在用解剖刀切取菌柄连接处的菌盖中心组织块直径3、4或5mm，迅速用接种针挑取移放到含有菌种制备培养基的平皿上，25℃条件下培养7天后，即在25℃条件下培养观察、待长出菌丝体后，转皿扩繁。直至获得已活化好的菌丝体作为菌种，将菌种连同培养基放入冷藏(冻)设备中保存备用。
实施例1-2
量取1000毫升蒸馏水，放入大烧杯中煮沸后加入马铃薯196克，干燥的松根细粉21克，小火煮沸30分钟，然后将用两层纱布过滤，在煮汁中加入葡萄糖19克，定容至1000毫升，用盐酸调pH为5.0；120℃条件下高压灭菌30分钟。待灭菌完成后，取出冷却至50℃，加入维生素B1母液(50mg/ml)20微升，混匀，装/分装在三角瓶中。
按上述示例说明，可制取选定用量及数量的三角瓶装液体培养基。
将保存于冷藏(冻)设备中的菌种取出，用无菌打孔器在超净工作台上打取约3、4或5cm2的菌饼接种于30ml瓶装液体培养基中，25℃，振荡(250r/min)培养6天，转接到装有2升液体培养基的8升三角瓶内，25℃，振荡(250r/min)培养7天，滤纸过滤得12.7克菌丝体，采用考马斯亮蓝R250比色法测得菌丝体中蛋白含量为0.450％，采用蒽酮比色法测得菌丝体中可溶性多糖含量为0.820％，采用茚三酮法测得菌丝体中游离氨基酸含量为0.175％，三种成分与野生崂山牛肝菌子实体的含量相当(表1)。
表1 子实体和菌丝体中可溶性蛋白、糖及氨基酸含量
| 样品 | 可溶性蛋白含量(％) | 可溶性糖含量(％) | 氨基酸含量(％) |
| 子实体 | 0.471 | 0.832 | 0.172 |
| 菌丝体 | 0.450 | 0.820 | 0.175 |
实施例2-1
将新鲜马铃薯洗净，去皮，切成小块，称取；量取1000毫升蒸馏水，放入大烧杯中煮沸后加入马铃薯190克，干燥的松根细粉15克，小火煮沸30分钟，然后将用两层纱布过滤，在煮汁中加入琼脂12克、葡萄糖18克，煮至琼脂完全溶解将溶液定溶至1000毫升，盐酸调pH至4.6；120、121或130℃条件下高压灭菌30分钟。待灭菌完成后，取出冷却至50℃，加入维生素B1母液(50mg/ml)16微升，混匀，在超净工作台上倒平皿，凝固后即可使用。
取夏季产于崂山上北九水等地带的新鲜崂山食用牛肝菌子实体，用小刀小心削去柄基部泥土和表面脏物，在超净工作台上无菌操作，将子实体一掰为二，在用解剖刀切取菌柄连接处的菌盖中心组织块直径3、4或5mm，迅速用接种针挑取移放到含有菌种制备培养基的平皿上，25℃条件下培养7天后，即在25℃条件下培养观察、待长出菌丝体后，转皿扩繁。直至获得已活化好的菌丝体作为菌种，将菌种连同培养基放入冷藏(冻)设备中保存备用。
实施例2-2
量取1000毫升蒸馏水，放入大烧杯中煮沸后加入马铃薯190克，干燥的松根细粉15克，小火煮沸30分钟，然后将用两层纱布过滤，在煮汁中加入葡萄糖18克，定容至1000毫升，用盐酸调pH为4.6；120、121或130℃条件下高压灭菌30分钟。待灭菌完成后，取出冷却至50℃，加入维生素B1母液(50mg/ml)16微升，混匀，装/分装在三角瓶中。
按上述示例说明，可制取选定用量及数量的三角瓶装液体培养基。
将保存于冷藏(冻)设备中的菌种取出，用无菌打孔器在超净工作台上打取约3、4或5cm2的菌饼接种于30ml瓶装液体培养基中，25℃，振荡(150r/min)培养5、6、7或8天，转接到装有2升液体培养基的8升三角瓶内，25℃，振荡(150r/min)培养7、8或9天，滤纸过滤得菌丝体。
实施例3-1
将新鲜马铃薯洗净，去皮，切成小块，称取；量取1000毫升蒸馏水，放入大烧杯中煮沸后加入马铃薯210克，干燥的松根细粉25克，小火煮沸30分钟，然后将用两层纱布过滤，在煮汁中加入琼脂18克、葡萄糖21克，煮至琼脂完全溶解将溶液定溶至1000毫升，盐酸调pH至5.0；120、121或130℃条件下高压灭菌30分钟。待灭菌完成后，取出冷却至50℃，加入维生素B1母液(50mg/ml)24微升，混匀，在超净工作台上倒平皿，凝固后即可使用。
取夏季产于崂山上北九水等地带的新鲜崂山食用牛肝菌子实体，用小刀小心削去柄基部泥土和表面脏物，在超净工作台上无菌操作，将子实体一掰为二，在用解剖刀切取菌柄连接处的菌盖中心组织块直径3、4或5mm，迅速用接种针挑取移放到含有菌种制备培养基的平皿上，25℃条件下培养6、7或8天后，即在25℃条件下培养观察、待长出菌丝体后，转皿扩繁。直至获得已活化好的菌丝体作为菌种，将菌种连同培养基放入冷藏(冻)设备中保存备用。
实施例3-2
量取1000毫升蒸馏水，放入大烧杯中煮沸后加入马铃薯210克，干燥的松根细粉25克，小火煮沸30分钟，然后将用两层纱布过滤，在煮汁中加入葡萄糖21克，定容至1000毫升，用盐酸调pH为4.8；120℃条件下高压灭菌30分钟。待灭菌完成后，取出冷却至50℃，加入维生素B1母液(50mg/ml)24微升，混匀，装/分装在三角瓶中。
按上述示例说明，可制取选定用量及数量的三角瓶装液体培养基。
将保存于冷藏(冻)设备中的菌种取出，用无菌打孔器在超净工作台上打取约3、4或5cm2的菌饼接种于30ml瓶装液体培养基中，25℃，振荡(300r/min)培养5、6、7或8天，转接到装有2升液体培养基的8升三角瓶内，25℃，振荡(300r/min)培养7、8或9天，滤纸过滤得菌丝体。
本发明还可用于其他产地食用牛肝菌菌种的培养。
Claims (7)
1.一种崂山食用牛肝菌液体菌种的培养方法，其特征在于：包括步骤：
a使用菌种制备培养基培养崂山食用牛肝菌离体部分子实体制备菌种，上述的菌种制备培养基由下述原料及重量份配制而成。
马铃薯 190～210
葡萄糖 18～21
松根细粉 15～25
维生素B1 0.0008～0.0012
琼脂 12～18
蒸馏水 1000
pH值4.6～5.0
2.根据权利要求1所述的崂山食用牛肝菌液体菌种的培养方法，其特征在于：所述步骤a中，包括步骤：
a1将新鲜马铃薯洗净，去皮，切成小块，称取；量取蒸馏水，放入大烧杯中煮沸后加入马铃薯及松根细粉，小火煮沸30分钟，然后过滤取滤液，在滤液中加入琼脂、葡萄糖，煮至琼脂完全溶解，调节pH值为4.6～5.0，在120℃条件下高压灭菌30分钟；待灭菌完成后，取出冷却至50℃，加入维生素B1母液，混匀，在超净工作台上倒平皿，凝固后即可使用。
3.根据权利要求1所述的崂山食用牛肝菌液体菌种的培养方法，其特征在于：所述步骤a中，包括步骤：
a2取新鲜崂山食用牛肝菌子实体，在超净工作台上无菌操作，用解剖刀切取子实体组织，将子实体组织分离后迅速移植到含有菌种制备培养基的平皿上，待长出菌丝体后，转皿扩繁。
4.根据权利要求3所述的崂山食用牛肝菌液体菌种的培养方法，其特征在于：所述步骤a2中，包括步骤：
a21将崂山食用牛肝菌子实体，用小刀小心削去柄基部泥土和表面脏物，将子实体一掰为二，在用解剖刀切取菌柄连接处的菌盖中心组织块直径3-5mm，迅速用接种针挑取移放到平皿上，在25℃条件下培养观察。
5.根据权利要求1至4任一要求所述的崂山食用牛肝菌液体菌种的培养方法，特征在于：其还包括步骤：
b使用液体培养基按照液体培养方法进行菌丝体的发酵培养，上述的液体培养基由下述原料及重量份配制而成。
马铃薯 190～210
葡萄糖 18～21
松根细粉 15～25
维生素B1 0.0008～0.0012
蒸馏水 1000
6.根据权利要求5所述的崂山食用牛肝菌液体菌种的培养方法，其特征在于：所述步骤b中，包括步骤：
b1量取蒸馏水，放入大烧杯中煮沸后加入马铃薯及松根细粉，小火煮沸30分钟，然后过滤取滤液，在滤液中加入葡萄糖，调节pH值为4.6～5.0，120℃条件下高压灭菌30分钟；待灭菌完成后，取出冷却至50℃，加入维生素B1，混匀，装/分装在三角瓶中备用。
7.根据权利要求5所述的崂山食用牛肝菌液体菌种的培养方法，其特征在于：所述步骤b中，包括步骤：
b2将在上述步骤a2中获得已活化好的菌丝体连同培养基，切成4cm2的菌饼，接种于步骤b1中瓶装液体培养基中，在25℃、150～300r/min回旋式摇床上振荡培养，滤纸过滤得湿菌丝体。
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Legal Events
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Owner name: HAN YI Free format text: FORMER OWNER: QINGDAO UNIVERSITY Effective date: 20080912 |
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Effective date of registration: 20080912 Address after: 308, Ningxia Road, Shandong, Qingdao Province, China: 266071 Applicant after: Han Yi Address before: 308, Ningxia Road, Shandong, Qingdao Province, China: 266071 Applicant before: Qingdao University |
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| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: QINGDAO UNIVERSITY Free format text: FORMER OWNER: HAN YI Effective date: 20110303 |
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Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 266071 NO.308, NINGXIA ROAD, QINGDAO CITY, SHANDONG PROVINCE TO: 266071 NO.308, NINGXIA ROAD, SOUTH DISTRICT, QINGDAO CITY |
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Effective date of registration: 20110303 Address after: 266071 Qingdao City, Ningxia Road No. 308 Patentee after: Qingdao University Address before: 266071 Ningxia Road, Shandong, China, No. 308, No. Patentee before: Han Yi |
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Granted publication date: 20101117 Termination date: 20180719 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |