CN113348966A - 一种中华腐生牛肝菌液体菌种培养基及培养方法 - Google Patents

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何明霞
许欣景
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Abstract

本发明属于微生物领域，公开了一种中华腐生牛肝菌液体菌种培养基及培养方法。所述培养基中包含：马铃薯：150～200g，麸皮：10～25g，葡萄糖：10～15g，酵母粉：2～3g，CaCO3：1～2g，KH2PO4：2～3g，MgSO4：1～2g，维生素B1：1～2片，水：1000mL。本发明提供的培养基适于中华腐生牛肝菌快速生长，培养过程根据菌丝生长特性分时段控制摇床转速，促进菌丝恢复、萌发及生长，方法操作简单、成本低，菌丝球细腻均匀，菌棒接种后，菌丝球多点式萌发，有效增加了菌丝体与培养料的接触面积；较之固体菌种，菌丝生长速度快，污染率低，菌龄一致，有效缩短了菌种培养周期。

Description

一种中华腐生牛肝菌液体菌种培养基及培养方法
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体是涉及一种中华腐生牛肝菌液体菌种培养基及培养方法。
背景技术
云南省热带作物科学研究所联合海南医学院，对采自云南省西双版纳州及海南省海口市的野生中华腐生牛肝菌进行分子鉴定及生物学特性研究，并于2021年4月，将Buchwaldoboletus xylophilus命名为“中华腐生牛肝菌”，该中华腐生牛肝菌菌株BU001菌株，于2021年5月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.：21959。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
中华腐生牛肝菌(Buchwaldoboletus xylophilus)隶属于真菌界、担子菌门、担子菌纲、牛肝菌目，牛肝菌科、腐生牛肝菌属，因其能够营腐生生活而得名。中华腐生牛肝菌在国外分布于马来西亚、斯里兰卡、菲律宾等地，国内分布于云南省西双版纳州、海南省海口市、香港等热带、亚热带地区，属于中高温型大型真菌。目前，中华腐生牛肝菌野生资源稀少，属于濒危物种。为保护中华腐生牛肝菌种质资源，云南省热带作物科学研究所牛肝菌团队通过深入调查中华腐生牛肝菌的生长环境，根据其生长特性研究菇房人工栽培中华腐生牛肝菌的方法，并获得成功，使中华腐生牛肝菌成为目前可以菇房人工栽培的牛肝菌种类之一，成为继暗褐网柄牛肝菌后实现的又一个可菇房人工栽培的牛肝菌种类，对中华腐生牛肝菌资源保护和后续的开发利用具有重要意义。
中华腐生牛肝菌栽培种采用固体菌种进行接种，菌种萌发时间长，菌丝生长缓慢，导致中华腐生牛肝菌栽培菌种制备周期长，污染率高，菌棒生长不一致，制约了中华腐生牛肝菌工厂化、规模化栽培。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述背景技术的不足，提供一种适用于中华腐生牛肝菌快速生长的液体菌种培养基及培养方法。采用本方面的培养基， 6～8d即可制得晶莹剔透的中华腐生牛肝菌液体菌种菌球，菌棒接种后，菌丝多点式萌发，有效增加了菌丝体与培养料的接触面积；较之固体菌种，菌丝生长速度快，污染率低，菌龄一致，有效缩短了菌种培养周期。
为达到本发明的目的，本发明的中华腐生牛肝菌液体菌种培养基包含：
马铃薯：150～200g
麸皮：10～25g
葡萄糖：10～15g
酵母粉：2～3g
CaCO3：1～2g
KH2PO4：2～3g
MgSO4：1～2g
维生素B1：1～2片
水：1000mL。
进一步地，本发明还提供了一种中华腐生牛肝菌液体菌种的培养方法，所述方法包含以下步骤：
(1)配制培养基：按比例称取马铃薯、麸皮、葡萄糖、酵母粉、CaCO3、 KH2PO4、MgSO4、维生素B1，将马铃薯150～200g洗净、削皮、切片，麸皮10～25g用纱布包裹，将马铃薯和麸皮放入1000mL自来水中，煮沸 20～25min；纱布过滤得到马铃薯、麸皮浸提液，然后依次加入葡萄糖10～15g、酵母粉2～3g、CaCO31～2g、KH2PO42～3g、MgSO41～2g、维生素B1 1～2片(10mg/ 片)，用自来水定容至1000mL，得到中华腐生牛肝菌液体菌种培养基；
(2)分装：将配制好的培养基分装至三角瓶中，封口；
(3)灭菌：将分装好的三角瓶置于灭菌锅中灭菌，冷却备用；
(4)接种：在无菌操作台内挑取直径约为3～6mm的中华腐生牛肝菌试管菌种块，放入上述液体培养基中；
(5)培养：接种后的三角瓶静置4～6h，让菌丝恢复，然后置于摇床中， 25～29℃，100～160rpm/min，避光培养6～8d即可得到中华腐生牛肝菌液体菌种；进一步的培养过程中前3d摇床转速为100～130rpm/min，促进菌丝萌发及菌丝球形成，后3～5d摇床转速设为130～160rpm/min，增加溶氧量促进菌球快速扩繁生长。
本发明提供的培养基适于中华腐生牛肝菌快速生长，培养过程根据菌丝生长特性分时段控制摇床转速，促进菌丝恢复、萌发及生长。该方法操作简单、成本低，菌丝球细腻均匀，菌棒接种后，菌丝球多点式萌发，有效增加了菌丝体与培养料的接触面积；较之固体菌种，菌丝生长速度快，污染率低，菌龄一致，有效缩短了菌种培养周期。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。应当理解，以下描述仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1 至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
实施例1
(1)一种中华腐生牛肝菌液体菌种培养基，培养基配方为：
马铃薯：200g
麸皮：15g
葡萄糖：15g
酵母粉：2g
CaCO3：2g
KH2PO4：2g
MgSO4：1g
维生素B1：2片
水：1000mL。
(2)一种中华腐生牛肝菌液体菌种培养方法：
a.培养基配制：按上述比例称取马铃薯、麸皮、葡萄糖、酵母粉、CaCO3、 KH2PO4、MgSO4、维生素B1，将马铃薯200g洗净、削皮、切片，麸皮15g 用4层纱布包裹，将马铃薯和麸皮放入1000mL自来水中，煮沸25min；4 层纱布过滤得到马铃薯、麸皮浸提液，然后依次加入葡萄糖15g、酵母粉 2g、CaCO3 2g、KH2PO4 2g、MgSO4 1g、维生素B1 2片(20mg)，用自来水定容至1000mL，得到中华腐生牛肝菌液体菌种培养基；
b.分装：将配制好的培养基分装至500mL三角瓶中，每瓶装液量为200 mL，用橡皮塞封口；
c.灭菌：将分装好的三角瓶置于高温高压灭菌锅中121℃灭菌 30～35min，冷却备用；
d.接种：在无菌操作台内挑取5～7块直径约为3～6mm的中华腐生牛肝菌试管菌种块，放入上述液体培养基中。
e.培养：接种后的三角瓶静置4h，让菌丝恢复；然后置于摇床中， 25～29℃，120rpm/min，避光培养3d，促使菌丝萌发并形成少量菌丝球，然后调大摇床转速，将摇床转速设置为160rpm/min，增加培养基溶氧量促进菌球快速扩繁生长，同时可避免菌丝球过大或不均匀，继续暗光培养3d，即可得到晶莹剔透，大小均匀的中华腐生牛肝菌液体菌种。
实施例2
(1)一种中华腐生牛肝菌液体菌种培养基，培养基配方为：
马铃薯：150g
麸皮：20g
葡萄糖：15g
酵母粉：3g
CaCO3：2g
KH2PO4：3g
MgSO4：2g
维生素B1：1片
水：1000mL。
(2)一种中华腐生牛肝菌液体菌种培养方法：
a.培养基配制：按上述比例称取马铃薯、麸皮、葡萄糖、酵母粉、CaCO3、 KH2PO4、MgSO4、维生素B1，将马铃薯150g洗净、削皮、切片，麸皮20g 用4层纱布包裹，将马铃薯和麸皮放入1000mL自来水中，煮沸20～25min；4层纱布过滤得到马铃薯、麸皮浸提液，然后依次加入葡萄糖15g、酵母粉 3g、CaCO3 2g、KH2PO4 3g、MgSO4 2g、维生素B1 1片(10mg)，用自来水定容至1000mL，得到中华腐生牛肝菌液体菌种培养基；
b.分装：将配制好的培养基分装至500mL三角瓶中，每瓶装液量为200 mL，用橡皮塞封口；
c.灭菌：将分装好的三角瓶置于高温高压灭菌锅中121℃灭菌 30～35min，冷却备用；
d.接种：在无菌操作台内挑取5～7块直径约为3～6mm的中华腐生牛肝菌试管菌种块，放入上述液体培养基中；
e.培养：接种后的三角瓶静置6h，让菌丝恢复，然后置于摇床中， 25～29℃，100rpm/min，避光培养3d，促使菌丝萌发并形成少量菌丝球，然后调大摇床转速，将摇床转速设置为150rpm/min，增加培养基溶氧量促进菌球快速扩繁生长，同时可避免菌丝球过大或不均匀，继续暗光培养5d，即可得到晶莹剔透，大小均匀的中华腐生牛肝菌液体菌种。
对比例1
对比例1与上述实施例1的区别在于摇床培养阶段未根据中华腐生牛肝菌菌丝生长情况而改变摇床转速。对比例的具体实施方法为：
(1)一种中华腐生牛肝菌液体菌种培养基，培养基配方为：
马铃薯：200g
麸皮：15g
葡萄糖：15g
酵母粉：2g
CaCO3：2g
KH2PO4：2g
MgSO4：1g
维生素B1：2片
水：1000mL。
(2)一种中华腐生牛肝菌液体菌种培养方法：
a.培养基配制：按上述比例称取马铃薯、麸皮、葡萄糖、酵母粉、CaCO3、 KH2PO4、MgSO4、维生素B1，将马铃薯200g洗净、削皮、切片，麸皮15g 用4层纱布包裹，将马铃薯和麸皮放入1000mL自来水中，煮沸25min；4 层纱布过滤得到马铃薯、麸皮浸提液，然后依次加入葡萄糖15g、酵母粉 2g、CaCO3 2g、KH2PO4 2g、MgSO4 1g、维生素B1 2片(20mg)，用自来水定容至1000mL，得到中华腐生牛肝菌液体菌种培养基；
b.分装：将配制好的培养基分装至500mL三角瓶中，每瓶装液量为200 mL，用橡皮塞封口；
c.灭菌：将分装好的三角瓶置于高温高压灭菌锅中121℃灭菌 30～35min，冷却备用；
d.接种：在无菌操作台内挑取5～7块直径约为3～6mm的中华腐生牛肝菌试管菌种块，放入上述液体培养基中。
e.培养：接种后的三角瓶置于摇床中，25～29℃，130rpm/min，避光定速培养11d得到菌丝球大小不均匀的中华腐生牛肝菌液体菌种。该对比例获得的液体菌种菌丝球偏大、不均匀、培养周期长，不适宜中华腐生牛肝菌栽培种制备。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种中华腐生牛肝菌液体菌种培养基，其特征在于，所述培养基中包含：
马铃薯：150～200g
麸皮：10～25g
葡萄糖：10～15g
酵母粉：2～3g
CaCO3：1～2g
KH2PO4：2～3g
MgSO4：1～2g
维生素B1：1～2片
水：1000mL。
2.一种中华腐生牛肝菌液体菌种的培养方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
(1)配制培养基：按比例称取马铃薯、麸皮、葡萄糖、酵母粉、CaCO3、KH2PO4、MgSO4、维生素B1，将马铃薯150～200g洗净、削皮、切片，麸皮10～25g用纱布包裹，将马铃薯和麸皮放入1000mL自来水中，煮沸20～25min；纱布过滤得到马铃薯、麸皮浸提液，然后依次加入葡萄糖10～15g、酵母粉2～3g、CaCO31～2g、KH2PO42～3g、MgSO41～2g、维生素B11～2片，用自来水定容至1000mL，得到中华腐生牛肝菌液体菌种培养基；
(2)分装：将配制好的培养基分装至三角瓶中，封口；
(3)灭菌：将分装好的三角瓶置于灭菌锅中灭菌，冷却备用；
(4)接种：在无菌操作台内挑取直径约为3～6mm的中华腐生牛肝菌试管菌种块，放入上述液体培养基中；
(5)培养：接种后的三角瓶静置4～6h，让菌丝恢复，然后置于摇床中，25～29℃，100～160rpm/min，避光培养6～8d即可得到中华腐生牛肝菌液体菌种。
3.根据权利要求2所述的中华腐生牛肝菌液体菌种的培养方法，其特征在于，所述步骤(5)中培养前3d摇床转速为100～130rpm/min，促进菌丝萌发及菌丝球形成，后3～5d摇床转速设为130～160rpm/min，增加溶氧量促进菌球快速扩繁生长。
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