CN101088977A - 4,5－二羟基－2－甲氧基苯甲醛及其发酵法制备和应用 - Google Patents
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Abstract
4，5－二羟基－2－甲氧基苯甲醛及其发酵法制备和应用，属于生物发酵及生化分离技术领域。本发明涉及从鸡腿蘑液体发酵液分离获得一种新的化合物4，5－二羟基－2－甲氧基苯甲醛，其制备方法为将鸡腿蘑发酵液离心取上清液，上清液用AB－8型大孔树脂层析柱吸附，超纯水洗脱去蛋白质和糖，收集乙醇洗脱液，浓缩、冷冻干燥，再依次用C18低压层析柱、C18中压层析柱分离提纯，制备得到该产品。4，5－二羟基－2－甲氧基苯甲醛添加或不添加赋形剂用于制备治疗和防治糖尿病疾病的药物或保健品。
Description
技术领域
4，5-二羟基-2-甲氧基苯甲醛及其发酵法制备和应用，属于生物发酵及生化分离技术领域。本发明涉及从鸡腿蘑液体发酵液分离获得一种新的化合物4，5-二羟基-2-甲氧基苯甲醛，它具有式(I)的化学结构，本发明还涉及该物质防治糖尿病的应用。
背景技术
鸡腿蘑(Coprinus Comatus)，学名毛头鬼伞，被联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)确定为具“天然、营养、保健”三种功能为一体的16种珍稀食用菌之一。现代研究表明，鸡腿蘑具有降低血糖、防止肝损伤、抗肿瘤、提高机体免疫力等功效。
糖尿病是一种常见多发的慢性代谢性疾病，千百年来它一直严重危害着人类的健康与生命。高血糖引起的一系列代谢紊乱是造成糖尿病血管病变的主要因素，多年来的研究表明其机理是通过多种途径介导的，其中蛋白质非酶糖基化反应是主要因素之一。该反应最终可形成一系列不可逆的糖基化终产物(Advanced glycosylation end products，AGEs)。在糖尿病患者体内，随着AGEs反应的发生和加速，会导致胶原蛋白发生交联耦合、心室隔膜增厚及动脉硬化，从而引起一系列病理生理改变。因此，抑制和减少AGEs的形成也是近年来糖尿病研究中的热点问题之一。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种化合物(I)4，5-二羟基-2-甲氧基苯甲醛。
本发明的目的之二在于提供化合物(I)的制备方法。
本发明的目的之三在于提供化合物(I)在制备治疗和防治糖尿病疾病药物或保健品方面的应用。
本发明的技术方案：化合物4，5-二羟基-2-甲氧基苯甲醛，化学结构式如下：
化合物(I)
本发明所述的化合物(I)的制备方法为：
步骤1：将鸡腿蘑发酵液3000转/分钟的条件下离心20分钟，取上清液用AB-8型大孔树脂层析柱吸附，吸附结束后，用超纯水洗脱除去蛋白质、多糖，直至流出液测不出糖和蛋白，然后用10倍柱体积20％体积浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩、冷冻干燥，所得组分称为M1；
步骤2：将步骤1中冷冻干燥的M1组分用超纯水溶解后用C18低压层析柱分离，每次上样量为5～8mg，用0.5∶9.5-8∶2的甲醇-水梯度洗脱，流速2mL/分钟，紫外检测器280nm检测，收集到4个组分，按出峰顺序取第3个组分浓缩、冷冻干燥，所得组分称为M1-3；
步骤3：将步骤2中冷冻干燥的M1-3组分用超纯水溶解后用C18中压层析柱分离，每次上样量为0.5～1mg，用0.5∶9.5-6∶4的甲醇-水梯度洗脱，流速1.0～1.6mL/分钟，紫外检测器280nm检测，根据出峰情况收集主峰物质，浓缩、冷冻干燥，所得组分称为M1-3-1；
步骤4：将步骤3中冷冻干燥的M1-3-1组分按步骤3的柱层析分离和收集条件重复一次，所收集到的物质即为化合物4，5-二羟基-2-甲氧基苯甲醛。
化合物(I)的结构分析：经分析，化合物(I)确定为4，5-二羟基-2-甲氧基苯甲醛(4，5-Dihydroxy-2-Methoxy-Benzaldehyde)。HR MS m/z：168.0426(计算值：168.0423)，分子式：C8H8O4。MSm/z：167，165，146，139，137，125，121，109，107。UVλmax：206，232，287。IR(KBr)cm-1：3411.88，3230.09，2925.79，1630.50，1601.12，1486.15，1453.42，1384.80，1229.39，1161.62，1079.46。化合物(I)核磁共振图谱分析如下：
由1HNMR(CD3OD)分析可得以下信息：化学位移信号δ3.74(s，3H，-OCH3)显示有一个甲氧基，δ6.5～6.0 ppm的多重峰显示有苯基存在，且多重峰的耦合常数j＜1则表明两个芳氢质子应为对位取代，δ10.06则可以推断该结构具有醛基，10.06ppm为醛基的化学位移。
结合13CNMR(CD3OD)分析：δC192.25和δC61应为-CHO和-OCH3的信号，δC：111.58ppm、107.96ppm、149.21ppm、165.78ppm、101.78ppm、166.13ppm为苯基的化学位移。
| 碳位 | δc | δH(Hz) |
| 12345678 | 111.58166.13101.78165.78149.21107.9661.00192.25 | --6.14(t，1H)--6.50(t，1H)3.74(s，3H)10.06(s，1H) |
本发明所述的鸡腿蘑发酵液是在培养基中不加苦瓜的条件下按专利公开说明书CN166939A所述的方法制备。
按照本发明的方法，化合物4，5-二羟基-2-甲氧基苯甲醛的应用，该化合物(I)添加或不添加赋形剂用于制备治疗和防治糖尿病疾病的药物或保健品。
本发明的有益效果：本发明涉及从鸡腿蘑液体发酵液分离获得一种新的化合物4，5-二羟基-2-甲氧基苯甲醛，该产品添加或不添加赋形剂用于制备治疗和防治糖尿病疾病的药物或保健品。
附图说明
图1化合物(I)高分辩质谱报告(HR MS)。中国科学院上海有机化学研究所提供分析检测报告。
图2化合物(I)核磁共振碳谱(13C)。
图3化合物(I)核磁共振氢谱(1H)。
图4化合物(I)质谱图(MS)。中国科学院上海有机化学研究所提供分析检测报告。
图5化合物(I)红外图谱(IR)。中国科学院上海有机化学研究所提供分析检测报告。
具体实施方式
实施例1：鸡腿蘑发酵液的制备
在新鲜的斜面培养基中接入鸡腿蘑菌丝体，鸡腿蘑菌种是CGMCC No.5.252(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，培养温度25.5℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有75mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中(共5瓶)，于25.5℃、150转/分钟摇床培养130小时。其中所述摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖25，玉米粉15，麸皮7.5，酵母膏3，玉米浆3，KH2PO4 3，MgSO44，起始pH值为6.3。
将上述摇瓶菌种接入装有150mL扩大培养基的500mL三角瓶中(共24瓶)，接种量为每500mL三角瓶接入11mL摇瓶种子，于25.5℃、150转/分钟摇床培养93小时。其中所述扩大培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖20，玉米粉15，麸皮8，KH2PO4 3，MgSO4 4.5，起始pH值为6.3。
将上述扩大培养的菌种3600mL接入装有44.9L一级种子培养基的75L种子罐中，种子罐中发酵液的总体积为48.5L；维持罐温25.5℃，罐压0.05MPa，搅拌速率120转/分钟，通风量1∶0.6v/v/m，发酵时间85小时。其中种子罐中的一级种子培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖20，玉米粉20，麸皮8，KH2PO43，MgSO4 2，起始pH值为6.3。
然后将48.5L一级种子菌神接入装有600L发酵培养基的1000L发酵罐中，发酵罐中发酵液的总体为648.5L。维持罐温25.5℃，罐压0.05MPa，搅拌速率100转/分钟，通风量1∶0.5v/v/m，发酵时间96小时。其中发酵罐中的发酵培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖15，玉米粉15，麸皮7.5，KH2PO4 3，MgSO42，起始pH值为6.4。
发酵结束，共获得648.5L鸡腿蘑发酵液。
实施例2：化合物(I)的制备及结构分析
制备步骤1：取2L鸡腿蘑发酵液3000转/分钟的条件下离心20分钟，取上清液用AB-8型大孔树脂层析柱吸附，吸附结束后，用超纯水洗脱除去蛋白质、多糖等物质，直至流出液测不出糖和蛋白，然后用10倍柱体积20％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩、冷冻干燥。
制备步骤2：将步骤1中冷冻干燥的组合物用超纯水溶解后用C18低压层析柱(26mm×50cm)分离，每次上样量为5.5mg。甲醇-水梯度洗脱(0.5∶9.5-8∶2)，流速2mL/分钟，紫外检测器280nm检测。根据出峰情况共收集到4个组分，按出峰顺序取第3个组分浓缩、冷冻干燥。
制备步骤3：将步骤2中冷冻干燥的组合物用超纯水溶解后用C18中压层析柱(15mm×40cm)分离，每次上样量为0.6mg。甲醇-水梯度洗脱(0.5∶9.5-6∶4)，流速1.6 mL/分钟，紫外检测器280nm检测。根据出峰情况收集主峰物质，浓缩、冷冻干燥。
制备步骤4：将制备步骤3中冷冻干燥的组合物用超纯水溶解后用C18中压层析柱(15mm×40cm)分离，每次上样量为0.6mg。甲醇-水梯度洗脱(0.5∶9.5-6∶4)，流速1.6mL/分钟，紫外检测器280nm检测。收集主峰物质，浓缩、冷冻干燥，即为化合物(I)。
化合物(I)的结构分析如上述。
实施例3：化合物(I)的制备
制备步骤2中的上样量为8.0mg。步骤3中的上样量为1mg，流速为1.0mL/分钟。步骤4中的上样量为1mg，流速为1.0mL/分钟。其余操作同实施例2。
实施例4：化合物(I)对体外非酶糖基化(AGEs)抑制率的测定
将化合物(I)用超纯水溶解，分别配制成0.5mg/mL，1.0mg/mL，2.0mg/mL三个浓度，化合物(I)在不同浓度下对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率如下：
| 浓度(mg/mL) | 抑制率(％) |
| 0.51.02.0 | 60.53±2.0582.84±0.5595.86±0.12 |
化合物(I)溶液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的测试方法如下：
1]体外非酶糖基化系统
将BSA(牛血清白蛋白)(10mg/mL)、己二醛(12mg/mL)和NaN3(叠氮化钠)(2mg/mL)溶于pH7.4、0.2mol/L的PBS(磷酸缓冲液)中。
2]体外非酶糖基化系统，用化合物(I)溶液干预实验
取1mL上述PBS溶液，干预组加入1mL化合物(I)溶液，以加1 mL蒸馏水的未干预组为空白，震荡混匀，37℃避光孵育15天，而后定容至10mL待测。
3]AGEs的测定及抑制率的计算
采用Hitachi Fluorescence Spectrophotometer 650-60型荧光分光光度计测定荧光强度，测定时激发波长选择370nm，狭缝5nm，发射波长选择440nm，狭缝6nm。
化合物(I)溶液对非酶糖基化反应的抑制作用以抑制率表示。抑制率根据下列公式计算：
实施例5：含化合物(I)的组合物片剂的制备
将实施例2获得的化合物(I)与一定的辅料按一定比例混合，制备成化合物(I)组合物片剂。其配方如下(质量百分比)：化合物(I)，90％；微晶纤维素，6％；胶体二氧化硅，2％；硬酯酸镁2％。该片剂用于制备治疗和防治糖尿病疾病的药物或保健品。
以上已详细描述了本发明的实施方案，对本领域技术人员来说很显然可以做很多改进和变化而不会背离本发明的基本精神。所有这些变化和改进都在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1、化合物4，5-二羟基-2-甲氧基苯甲醛，其化学结构式为：
2、权利要求1所述化合物4，5-二羟基-2-甲氧基苯甲醛的制备方法，其特征在于从鸡腿蘑发酵液中制备，方法为：
步骤1：将鸡腿蘑发酵液3000转/分钟的条件下离心20分钟，取上清液用AB-8型大孔树脂层析柱吸附，吸附结束后，用超纯水洗脱除去蛋白质、多糖，直至流出液测不出糖和蛋白，然后用10倍柱体积20％体积浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩、冷冻干燥，所得组分称为M1；
步骤2：将步骤1中冷冻干燥的M1组分用超纯水溶解后用C18低压层析柱分离，每次上样量为5～8mg，用0.5∶9.5-8∶2的甲醇-水梯度洗脱，流速2mL/分钟，紫外检测器280nm检测，收集到4个组分，按出峰顺序取第3个组分浓缩、冷冻干燥，所得组分称为M1-3；
步骤3：将步骤2中冷冻干燥的M1-3组分用超纯水溶解后用C18中压层析柱分离，每次上样量为0.5～1mg，用0.5∶9.5-6∶4的甲醇-水梯度洗脱，流速1.0～1.6mL/分钟，紫外检测器280nm检测，收集主峰物质，浓缩、冷冻干燥，所得组分称为M1-3-1；
步骤4：将步骤3中冷冻干燥的M1-3-1组分按步骤3的柱层析分离和收集条件重复一次，所收集到的物质即为化合物4，5-二羟基-2-甲氧基苯甲醛。
3、权利要求1所述化合物4，5-二羟基-2-甲氧基苯甲醛的应用，其特征在于4，5-二羟基-2-甲氧基苯甲醛添加或不添加赋形剂用于制备治疗和防治糖尿病疾病的药物或保健品。
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