CN101082062B - 单个细胞的基因表达定量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供适合进行单个细胞的基因表达的定量解析的方法。本发明提供了一种核酸检测方法，该方法包括：从至少含有单个细胞的试样获取单个细胞的步骤、溶解获取的单个细胞的细胞膜，使该细胞中的核酸溶出的细胞溶解步骤、通过溶出的核酸中的DNA分解酶使DNA分解的步骤、使该单个细胞中所含的RNA中的mRNA与固定在载体上的寡(dT)杂交的步骤、对与寡(dT)杂交了的mRNA进行逆转录反应，制作由来自单个细胞的cDNA固定在载体上得到的来自单个细胞的cDNA固定化载体文库的步骤、和边进行针对固定在载体上的cDNA的扩增反应，边进行扩增量的检测的步骤。

Description

单个细胞的基因表达定量方法
技术领域
本发明涉及将来自单个细胞的cDNA固定化到载体上得到的来自单个细胞的cDNA固定化载体文库作为解析试样的基因表达的定量解析方法。本发明还涉及将来自少量细胞的cDNA固定化到载体上得到的cDNA固定化载体文库作为解析试样的基因表达的定量解析方法。
背景技术
作为过去具有代表性的基因表达解析方法，有微阵列法以及实时PCR法，这些以往的方法多数用多个细胞构成的组织片或者多个培养细胞(～106个)作为解析试样。因为在实际的细胞内，随着时间的变化，基因的表达量发生各种变化，所以即使在相同的组织中，根据位置不同，每个细胞中的基因的表达也存在时间差异。因此，将组织和多个细胞作为试样的解析是平均了每个细胞的差别进行测定的。根据这样的数据难以得到动态变化的活着的生命的详细信息。具有生命的进行生物活动的最小单位的每个细胞中发生的生命现象都不相同，此外，用多个细胞作为解析试样的以往的基因表达解析中，难以综合性地解析细胞单独以及细胞间的生命活动。
最近，将生命作为系统加以研究的活动开始活跃。从作为生命系统的最小单位的细胞出发，为了了解生命系统，有必要对单个细胞所含有的全部分子进行分析，对细胞进行统一的解析。认为例如：在与激素和神经传递物质等生物体内的信息传递相关的组织、以及开始阶段的胚组织中，基因的表达量在各细胞中存在很大的差别。因此，单个细胞水平的基因表达解析的必要性很高。
近年来，通过试剂、检测装置等相关的显著的技术发展，实现单个细胞水平的基因表达的解析成为可能，令人深感兴趣的分子生物学性发现被报道，并引起人们的关注。不过，因为单个细胞中含有的mRNA极其微量，所以如果不解决检测灵敏度的问题，依然会局限在高表达的基因才有可能被解析。
在基因组解析时代，如何高效地解读未知的DNA序列被当成重点而进行技术开发。与此相对，在后基因组时代，将细胞作为系统进行理解，寻求的是能够高灵敏度地解析在各个单个细胞中表达的mRNA中，来自怎样的基因的mRNA、以何种程度存在的方法。这样的情况下，作为有效地回收mRNA分子、合成cDNA的方法，提出了使用寡(dT)固定化磁珠捕捉mRNA，进行逆转录反应的方法(专利文献1以及专利文献2)。
在上述的现有技术中可能存在下述技术问题。首先，专利文献1以及专利文献2所涉及的方法中，从多个细胞预先提取、纯化1μg的RNA(相当于105个细胞)，再将稀释后的微量RNA溶液作为启始材料。即，实际上，并不是从单个细胞中提取RNA。专利文献1以及专利文献2记载的RNA提取法以及纯化方法需要从一个管到另外的管反复移动试样的操作、和使RNA吸附玻璃上，反复清洗玻璃的操作，因为伴随着RNA试样的损失，所以回收单个细胞中含有的极微量的RNA(约10pg)是很困难的。此外，在这样的以往的方法中，由于每个样品的回收率都很不均一，所以不利于定量解析。此外，在专利文献1以及专利文献2涉及的方法中，在进行在磁珠上的逆转录反应后，为了实施任何常规的PCR扩增步骤，该步骤导致在原来试样中存在的来自各种基因的mRNA分子的绝对数以及存在比发生了变化，不适于作为定量解析试样。
另一方面，用于单个细胞的基因表达解析的、在1个管子中进行细胞溶解步骤、DNase处理步骤、逆转录步骤的试剂盒已经开始销售。利用本试剂进行cDNA合成，操作容易，不存在通常的核酸提取、纯化所伴随的解析试样的损失以及回收率不均一的问题。不过，因为使用该试剂合成的cDNA溶液夹带有残留试剂，抑制了PCR扩增反应，所以很难进行使用来者单个细胞全部cDNA的实时PCR解析。因此，为了降低残留试剂导致的PCR扩增抑制，必须使用再次分份的来自单个细胞的cDNA作为解析试样，导致实时PCR解析的检测灵敏度大幅度降低。而且伴随着解析，消耗了来自单个细胞的cDNA，所以可能限制了能够解析的基因的种类。
【专利文献1】特开2002-238575号公报
【专利文献2】特开2005-46138号公报
发明内容
【发明所要解决的问题】
鉴于上述问题，本发明的目的在于提供适合于单个细胞的基因表达的定量解析的方法。
【用于解决问题的手段】
本发明人等为了解决上述问题，进行了刻苦的研究，结果确认了以下内容：将回收的单个细胞在1个管子内进行细胞溶解步骤以及DNA分解酶处理步骤，然后，在该1个管子内，使用在表面上固定了寡(dT)的载体实施逆转录反应步骤，能够从单个细胞内存在的极微量mRNA，在载体表面上无损失地合成cDNA。据此发现能够制备将单个细胞的极微量mRNA固定在载体上的、来自单个细胞的cDNA固定化载体文库，能够容易地进行在以往的方法中难以实现的单个细胞水平的微量cDNA的纯化、回收。
此外，即使将来自单个细胞的cDNA固定化载体文库直接作为解析试样进行实时PCR也不会有损于定量性，而且发现，在解析后，通过洗涤该来自单个细胞的cDNA固定化载体文库，能够反复作为解析试样进行定量解析。发现由此解决了以往方法的问题：在试样中夹带的残留试剂导致的PCR抑制、解析试样的分份导致的灵敏度降低的问题、以及只能解析有限个数的基因的问题。
即，本发明包括下述发明。
(1)一种核酸检测方法，其中包括：
从含有至少单个细胞的试样获取单个细胞的步骤、
溶解获取的单个细胞的细胞膜，使该细胞中的核酸溶出的细胞溶解步骤、
在溶出了的核酸中，通过DNA分解酶使DNA分解的DNA分解步骤、
使该单个细胞中所含的RNA中的mRNA与固定在载体上的寡(dT)杂交的步骤、
对与寡(dT)杂交了的mRNA进行逆转录反应，制作由来自单个细胞的cDNA固定在载体上得到的来自单个细胞的cDNA固定化载体文库的步骤、和
边进行针对固定在载体上的cDNA的扩增反应，边进行扩增量的检测的步骤。
(2)上述(1)记载的核酸检测方法，该方法在1个管内进行如下步骤：
细胞溶解步骤、
DNA分解步骤、
使该单个细胞中所含的RNA中的mRNA与固定在载体上的寡(dT)杂交的步骤、和
对与寡(dT)杂交的mRNA进行逆转录反应，制作由来自单个细胞的cDNA固定在载体上得到的来自单个细胞的cDNA固定化载体文库的步骤。
(3)上述(1)记载的核酸检测方法，其中，在边进行针对固定在载体上的cDNA的扩增反应，边进行扩增量的检测的步骤之后，还包括：
回收载体、洗涤的步骤a、和
边进行针对固定在载体上的cDNA的扩增反应，边进行扩增量的检测的步骤b。
(4)上述(3)记载的核酸检测方法，其中，在步骤b之后，还具有重复步骤a以及步骤b的步骤。
(5)上述(1)记载的核酸检测方法，其中，在制备来自单个细胞的cDNA固定化载体文库的步骤中，单个细胞中所含的mRNA实质上全部使之杂交。
(6)上述(1)记载的核酸检测方法，其中，载体是粒子，粒子的总表面积在0.1cm2以上。
(7)上述(1)记载的核酸检测方法，其中，载体是粒子，扩增反应溶液中所含有的全部粒子的总和在全部液量的1％以下。
(8)上述(1)记载的核酸检测方法，其中，载体是粒子，扩增反应溶液中粒子的体积占有率在0.1％以下。
(9)上述(1)记载的核酸检测方法，其中，固定在载体上的寡(dT)的总分子数量在1012个分子以上。
(10)上述(6)～(9)的任一项所述的核酸检测方法，其中，粒径是1μm，粒子数是107～108。
(11)上述(6)～(9)的任一项所述的核酸检测方法，其中，粒径是2.8μm，粒子数是106～107。
(12)上述(6)～(11)的任一项所述的核酸检测方法，其中，粒子是磁珠。
(13)核酸检测方法，包括：
从含有细胞的试样获取103个以下的多个细胞的步骤、
溶解获取的细胞的细胞膜，使该细胞中的核酸溶出的细胞溶解步骤、
在溶出了的核酸中，通过DNA分解酶使DNA分解的DNA分解步骤、
使该细胞中所含的RNA中的mRNA与固定在载体上的寡(dT)杂交的步骤、
对与寡(dT)杂交了的mRNA进行逆转录反应，制备来自该细胞的cDNA固定在载体上得到的cDNA固定化载体文库的步骤、和
边进行针对固定在载体上的cDNA的扩增反应，边进行扩增量的检测的步骤。
发明的效果
根据本发明，能够制备来自单个细胞的cDNA固定化载体文库，能够容易地实施以往难以实现的单个细胞水平的微量cDNA的纯化以及回收。此外，因为能够将在以往方法中的试样中夹带的残留试剂(细胞溶解试剂以及DNase试剂等)除去，所以可以不必考虑残留试剂导致的PCR抑制，能够不用将来自单个细胞的cDNA试样分份，使用全部量进行扩增反应。即，能够用比以往更高的灵敏度进行PCR解析。
附图说明
【图1】表示本发明的核酸检测方法的一个实施方式的流程图。
【图2】表示本发明中的在载体表面上的mRNA逆转录反应的一个实施方式。
【图3】表示本发明中的在载体表面上的mRNA逆转录反应的一个实施方式。
【图4】表示本发明中实时PCR的一个实施方式。
【图5】表示在实时PCR中，以用于标准曲线的试样中的模板数为横轴，以Ct为纵轴得到的标准曲线的图。标准曲线拟合公式的斜率表示有PCR扩增效率，R2值表示定量性的精度。
【图6】表示作为阴性对照的0个细胞、以及单个细胞(n＝6个)中含有的编码4种基因的mRNA的拷贝数的计算结果。此外，mRNA的拷贝数是根据来自单个细胞的cDNA的固定化磁珠文库试样得到的Ct值在标准稀释系列试样的标准曲线上定点算出的。
【图7】表示对1个细胞试样(n＝6)、10个细胞试样(n＝3)以及1000个细胞试样(n＝3)，通过本发明的方法定量解析试样中含有的mRNA分子数的结果。横轴表示细胞数、纵轴表示拷贝数。
【图8】表示将由单个细胞制备的cDNA试样中含有的残留试剂定义为100％，制成含有其中的0％、3％、6％、9％的残留试剂的标准曲线，研究残留试剂导致的PCR抑制的影响的结果。图8-1的横轴表示模板分子数，纵轴表示Ct(Threshold cycle)。图8-2的横轴表示解析试样中含有的残留试剂(％)，纵轴表示分子数(测定值)。
【图9】表示在本发明的方法的载体表面上，在进行来自单个细胞的mRNA的逆转录反应的步骤中，对最佳磁珠数的研究结果。图9-1表示在磁珠的直径是1μm的情况，图9-2表示磁珠的直径是2.8μm的情况的图，横轴表示逆转录中使用的磁珠数，纵轴表示拷贝数/细胞。
【图10】图10-1表示在本发明的方法的载体表面上，在进行来自单个细胞的mRNA的逆转录反应的步骤中，对最佳载体总表面积的研究结果。横轴表示载体的总表面积(cm2)，纵轴表示拷贝数/细胞。图10-2表示将图10-1的曲线的横轴设定为在载体表面上固定的寡(dT)总分子数而建立的图。
【图11】表示在本发明的方法的扩增量检测步骤中，对最佳磁珠数的研究结果。图11-1表示使用直径1μm、图11-2表示使用直径2.8μm的磁珠时的图，横轴表示模板分子数，纵轴表示Ct(Thre shold Cycle)。
【图12】表示在本发明的方法的扩增量检测步骤中，对最佳反应溶液中的载体体积占有率的研究结果。图的横轴表示反应溶液中的载体体积占有率，纵轴表示测定误差(Ct_StdDev)。
符号说明
201：用寡(dT)30捕捉有mRNA1分子的磁珠
202：在磁珠表面上固定的寡(dT)30
203：1分子mRNA
204：mRNA3’末端的多聚A序列
205：由逆转录反应合成的cDNA
301：在磁珠表面上固定了的寡(dT)30
302：捕捉有多个mRNA分子的磁珠
303：编码基因A的mRNA
304：编码基因B的mRNA
305：编码基因C的mRNA
306：编码基因A的mRNA的多聚A序列
307：编码基因B的mRNA的多聚A序列
308：编码基因C的mRNA的多聚A序列
309：由逆转录反应合成的基因A的cDNA
310：由逆转录反应合成的基因B的cDNA
311：由逆转录反应合成的基因C的cDNA
401：来自b2M的1分子的cDNA
402：来自b2M的1分子的cDNA结合的磁珠
403：b2M实时PCR引物(R)
404：PCR产物(R链)
405：b2M实时PCR引物(F)
406：PCR产物(F链)
407：b2M基因特异性探针
408：破坏了的b2M基因特异性探针
409：荧光体
410：磁珠上固定了的寡(dT)
具体实施方式
本发明涉及核酸检测方法，包括下述步骤：
从含有至少单个细胞的试样获取单个细胞的步骤、
溶解获取的单个细胞的细胞膜，使该细胞中的核酸溶出的细胞溶解步骤、
在溶出了的核酸中，通过DNA分解酶使DNA分解的DNA分解步骤、
使该单个细胞中所含的RNA中的mRNA与固定在载体上的寡(dT)杂交的步骤、
对与寡(dT)杂交了的mRNA进行逆转录反应，制作由来自单个细胞的cDNA固定在载体上得到的来自单个细胞的cDNA固定化载体文库的步骤、和
边进行针对固定在载体上的cDNA的扩增反应，边进行扩增量的检测的步骤。此外，为了防止试样损失，优选在1个管子内实施从细胞溶解步骤到制作由来自单个细胞的cDNA固定在载体上得到的来自单个细胞的cDNA固定化载体文库的步骤。
至少含有单个细胞的试样只要含有动物、植物以及微生物等的细胞以及组织等的mRNA，没有特别的制限。从试样获取单个细胞的步骤可以通过本技术领域惯用的方法进行实施。例如，通过用胰酶处理培养细胞，使细胞剥离、释放，使胰酶失活后，离心细胞混悬液，去除上清，将得到的细胞块悬浮在缓冲液中，使用血球计数板等一边进行细胞计数，一边稀释到500细胞/mL左右，在显微镜下，使用移液器，从细胞稀释液的液滴中吸取单个细胞，释放到管中。为了避免RNA分解，优选将获取的细胞保持在低温下。
溶解单个细胞的细胞膜，使该细胞中的核酸溶出的细胞溶解步骤，可以使用ProteinaseK的这样的蛋白分解酶、异硫氰酸胍、盐酸胍这样的高离盐(Chaotropic盐)、Tween以及SDS这样的表面活性剂实施。通过该步骤能够将在上述步骤中获取的单个细胞中含有的核酸、即DNA以及RNA溶出。
然后，将在上述细胞溶解步骤中溶出的核酸中的DNA通过DNA分解酶(DNase)进行分解。由此能够分解细胞溶解试样中含有的基因组DNA，得到作为核酸仅仅含有RNA的试样。具体而言，向细胞溶解试样中加入DNase I等，温育，反应后，迅速加入EDTA，通过加热使DNase I失活。
在下面的步骤中，将单个细胞中含有的RNA中的mRNA与固定在载体上的寡(dT)杂交。优选使单个细胞中所含的mRNA实质上全部杂交。因为mRNA含有多聚A序列，所以可以使用与该序列互补的寡(dT)，使其杂交，能够只使单个细胞中含有的RNA中的mRNA结合到载体上。寡(dT)可以根据常规方法合成，寡(dT)的聚合度只要是能够与mRNA的多聚A序列杂交，能使mRNA结合到固定了寡(dT)的载体上的聚合度即可。即，通过将寡(dT)的聚合度设立在一定以上，能够防止与多聚A序列的杂交变弱，防止使对mRNA的捕捉率降低；通过将寡(dT)的聚合度设立在一定以下，能够防止寡(dT)在载体表面上的固定率降低，能够防止由于自体形成高级结构而抑制与mRNA的多聚A序列的杂交。所以寡(dT)的聚合度通常为5～200、优选为20～40。此外，可以使用代替寡(dT)使用多聚U等的、含有能够与mRNA的多聚A序列互补的序列，这些序列的使用也包括在本发明中。
固定化寡(dT)的载体是水不溶性的，只要是在加热变性时不是溶融的，就没有特别的制限。作为该材料，可以列举例如：金、银、铜、铝、钨、钼、铬、铂、钛、镍等金属；不锈钢、耐盐酸高镍合金、铬镍铁合金、蒙耐尔合金、杜拉铝等合金；结晶硅；玻璃、石英玻璃、溶融石英、合成石英、氧化铝、钢玉、陶瓷、镁橄榄石以及感光性玻璃等玻璃材料；聚酯树脂、聚苯乙烯、聚乙烯树脂、聚丙烯树脂、ABS树脂(Acrylonitrile Butadiene Styrene树脂)、尼龙、丙烯酸树脂、氟树脂、聚碳酸酯树脂、聚氨酯树脂、甲基戊烯树脂、苯酚树脂、三聚氰胺树脂、环氧树脂以及氯乙烯树脂等的塑料；琼脂糖、糊精、纤维素、聚乙烯醇、硝酸纤维素、几丁质、脱乙酰几丁质。此外，对载体的形状没有特别的限定，可列举滴定板、平板、膜、管以及粒子等。作为载体，可以通过使用粒子，利用比单位体积更大的表面积，促进反应，迅速并且有效地进行处理。此外，作为粒子，通过使用磁化的或者可被磁化的磁珠，对于分离处理等，能够自动化、有效地或者迅速地进行。
对于将寡(dT)向载体上固定化的方法没有特别的限定，例如，可以列举通过共价键、离子键、物理吸附、生物学性结合(例如，生物素和亲和素或者链霉亲和素的结合、抗原和抗体的结合等)进行固定化的方法等。寡(dT)为间隔序列、例如可以通过含有1～10个碳原子的烃基，固定到载体上。
通过共价键将寡(dT)向载体上的固定化，可以通过例如向寡(dT)导入官能团，并且将与该官能团具有反应性的官能团导入到载体表面，通过使二者进行反应来实施。例如，向寡(dT)导入氨基，向载体导入具有活性酯基、环氧基、醛基、碳化二亚胺基、异硫氰酸基或者异氰酸基的物质，使之能够形成共价键。还有，向寡(dT)导入巯基，也可以向载体导入活性酯基、顺丁烯二酰亚胺基或者二硫键基。作为活性酯基，可列举例如，p-硝基苯基、N-羟基琥珀酰亚胺基、琥珀酸酰亚胺基、邻苯二甲酸亚胺基、5-降冰片-2、3-二羧基酰亚胺基等。
作为将官能团导入到载体表面的方法之一，可列举通过具有所期望的官能团的硅烷偶联剂处理载体的方法。作为偶联剂的例子，可以使用γ-氨丙基三乙氧基硅烷、N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷、N-β-(氨乙基)-β-氨基丙基甲基二甲氧基硅烷、或者γ-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷等。作为将结合部位的官能团导入到载体上的其他方法，可以列举等离子处理方法。通过这样的等离子处理能向固相的表面导入羟基和氨基等官能团。等离子处理可以使用本领域技术人员已知的装置。
作为通过物理吸附使寡(dT)固定到载体上的方法，可以列举用多聚阳离子(多聚赖氨酸、聚烯丙基胺、聚乙烯基亚胺等)表面处理的载体上，利用寡(dT)的电荷使之静电结合的方法等。
固定在载体上的寡(dT)的总量优选在1012分子以上。
作为载体，使用粒子的时候，粒子的直径通常在50μm以下。此外，优选固定寡(dT)、与来自单个细胞的mRNA杂交的粒子的总表面积在0.1cm2以上、以及溶液中的粒子的体积占有率在1％以下。使用的粒子最佳数量根据粒子上固定的寡(dT)数以及粒径适当选择。寡(dT)的固定量在约5x1012分子/cm2的条件下、特别是粒径在1.0μm的情况下、粒子数优选107～108；特别是粒径在2.8μm的情况下、粒子数优选106～107。
因为在单个细胞内存在的全部的mRNA分子有105～106个分子，所以认为如果使用比该分子数多的107个的粒子，则每个粒子至多捕捉1分子mRNA。因为每个粒子表面上固定的寡(dT)非常多，所以推测即使用更少个数的粒子进行逆转录反应，逆转录反应的效率也不会降低。所以使用实时PCR进行定量解析的时候，只要在逆转录反应的效率不降低的范围内，也可以向固定有多个寡(dT)的每个粒子上，捕捉来自多个基因的多个mRNA分子，合成来自多个基因的cDNA。
使固定了寡(dT)的载体与mRNA杂交的反应，可以通过将寡(dT)固定化载体和含有具有多聚A序列的mRNA试样在缓冲液中温育来实施。所述的用于杂交的温育优选在温度70℃下平稳地搅拌5分钟左右进行，之后，以0.1℃/秒左右，缓慢地将温度降低到室温。作为上述缓冲液，优选尽量去除了RNase活性的缓冲液。此外，优选在温育后，洗涤、除去试样中的载体非结合成分。
在随后的步骤中，对与寡(dT)杂交的mRNA进行逆转录反应，制作由来自单个细胞的cDNA固定在载体上得到的来自单个细胞的cDNA固定化载体文库。cDNA的合成可以通过将寡(dT)作为引物，将杂交的mRNA作为模板，在脱氧核糖核苷酸的存在下，使用逆转录酶使之反应来实施(参见图2)。
在逆转录反应后，通过实施用缓冲液洗涤载体，去除上清的操作，能够去除残留试剂，例如，细胞溶解试剂以及DNA分解酶，然后可以不抑制PCR扩增反应地进行反应。所以不用将来自单个细胞的cDNA试样分份，使用全部量进行解析。其结果能够提高检测精度。作为载体使用磁珠的时候，用磁铁捕捉各管内的磁珠，去除含有cDNA制备所需要的残留试剂的上清，然后将各管内的磁珠在缓冲液中悬浮，用磁铁捕捉后，通过进行去除上清的洗涤操作，能够简便地制备不含有残留试剂的来自单个细胞的cDNA固定化载体文库。
使用上述步骤得到的来自单个细胞的cDNA固定化载体文库，一边实施PCR，通过光学性地检测扩增量，能检测、定量单个细胞中含有的来自特定基因的mRNA。优选使用来自上述单个细胞的cDNA固定化载体文库，实施实时PCR。
实时PCR是对PCR的扩增量进行实时的监测解析的方法，不需要进行电泳，迅速性和定量性优良。在该方法中，通常使用热循环仪和分光荧光光度计一体化的实时PCR专用装置。首先，将梯度稀释的已知量的DNA作为基准进行PCR，将其作为基础，在扩增进行到指数级的区域内达到一定的扩增产物量的循环数(threshold cycle；Ct值)作为纵轴坐标，将初始的DNA量(分子数)作为横轴坐标，制成标准曲线。即使对未知浓度的样品也能在相同的条件下进行反应，求得Ct值，将该值根据标准曲线能够测定得到样品中的目的的DNA量。
下面，对固定在载体上的cDNA一边进行PCR一边进行扩增量的检测的步骤的一个实施方式进行说明。在来自单个细胞的cDNA固定化载体文库中存在的、固定了来自特定的基因的cDNA的载体上，PCR溶液中存在的实时PCR引物(R)与来自该基因的cDNA退火。然后，通过互补链延伸反应合成与该cDNA互补的PCR产物(R链)。然后，在热变性后，重复上述反应，同时PCR溶液中存在的实时PCR引物(F)与生成的PCR产物(R链)退火，进行互补链延伸反应，生成PCR产物(F链)。这样，在最初的PCR循环中，以在载体上固定的cDNA分子作为模板进行反应，接着，转换到PCR液相体系，PCR产物(R链)以及PCR产物(F链)分别与实时PCR引物(F)以及实时PCR引物(R)各自退火，PCR产物以指数性地累积到液相中。
在实时PCR中，其扩增量的检测(PCR产物的检测)可以通过本技术领域中通常使用的方法来实施。可列举例如，intercalater法、荧光探针法等。intercalater法是将与双链DNA结合的发出荧光的试剂(例如，intercalater法：SYBR(注册商标)GreenI)添加到PCR反应体系中的方法。intercalater法因为与由PCR反应合成的双链DNA结合，因为通过激发光的照射发出荧光，通过检测该荧光强度，能够监测扩增产物的生成量。也能够测定扩增DNA的融解温度。荧光探针法是将用在5′末端用荧光物质(FAM等)修饰的、在3′末端用消光物质(TAMRA等)修饰的寡核苷酸(基因特异性探针)添加到PCR反应体系中的方法。荧光探针在退火步骤中与模板DNA特异性地杂交，因为在探针上存在消光物质，所以即使照射激发光，也能够抑制荧光的发生。在进行延伸反应步骤的时候，通过Taq DNA聚合酶具有的5′→3′核酸外切酶活性，分解与模板杂交的基因特异性探针，将荧光色素从探针上释放，通过解除了消光物质的抑制，能够发出荧光。通过测定该荧光强度，能够监测扩增产物的量。在本发明的核酸检测方法中，优选使用荧光探针法。
荧光发光是微弱的，但与伴随有非特异性荧光发光的荧光发光intercalater法相比，由于几乎没有非特异性荧光发光的的荧光探针法这一方面能够将背景抑制的很低，所以能够以更高的灵敏度进行测定(更高的S/N比)。所以，对由单个细胞得到的极微量的核酸进行定量的时候，适合使用荧光探针法。
在一个实施方式中，本发明的核酸检测方法在边进行针对固定在载体上的cDNA的扩增反应，边进行扩增量的检测的步骤之后，还包括回收载体，洗涤的步骤a、和边进行针对固定在载体上的cDNA的扩增反应，边进行扩增量的检测的步骤b。在该实施方式中，对来自特定基因的cDNA进行扩增反应，通过检测该扩增量，实施该基因的表达解析后，通过回收载体，洗涤，能够再利用来自单个细胞的cDNA固定化载体文库。来自单个细胞的cDNA固定化载体文库因为通过洗涤操作能够反复作为解析试样而加以利用，所以使用相同的来自单个细胞的cDNA固定化载体文库，能够对相同细胞中各种基因的mRNA拷贝数进行定量。
在其他的实施方式中，本发明的核酸检测方法在上述步骤b之后，还包括重复步骤a以及步骤b的步骤。本实施方式中，仅就进行表达定量解析的基因数，也可以重复步骤a以及步骤b。所以对步骤a以及步骤b的重复次数没有特别限制，可以根据目的基因数进行适当的设定。
根据本发明的来自单个细胞的cDNA固定化载体文库，能够容易地实施在以往难以进行的单个细胞水平的微量cDNA的纯化以及回收。此外，因为可以除去在以往的方法中试样中夹带的残留试剂(细胞溶解试剂以及DNase试剂等)，所以不必考虑残留试剂造成的PCR抑制，能够不用将来自单个细胞的cDNA试样分份，以总量进行扩增反应。即，可在比以往更高的灵敏度进行PCR解析。此外，以往因为解析的每个试样都消耗了，所以对能够解析的来自单个细胞的极微量的cDNA的基因数有所限制，来自单个细胞的cDNA固定化载体文库因为通过洗涤操作可以反复作为PCR解析试样使用，所以可以对相同细胞中各种基因的表达进行定量解析。
将上述的来自单个细胞的cDNA固定化到载体上得到的来自单个细胞的cDNA固定化载体文库作为解析试样的核酸检测方法，能够用作使用了以多个细胞为解析材料的来自多个细胞的cDNA固定化到载体上得到的cDNA固定化载体文库的核酸检测方法而应用。特别是可以对少量的细胞有效地适用。在使用103个细胞以下的少数的细胞作为解析试样的情况下，在以往的表达解析法中伴随着灵敏度不足的问题和测定误差大的问题。与此相对，如果使用本发明的方法，即使使用少量的细胞，也能够高精度地定量解析。
即，在一个实施方式中，本发明涉及的核酸检测方法，该方法包括：
从细胞含有试样获取103个以下的多个细胞的步骤、
溶解获取的细胞的细胞膜，使该细胞中的核酸溶出的细胞溶解步骤、
在溶出了的核酸中，通过DNA分解酶使DNA分解的DNA分解步骤、
使该细胞中含有的RNA中的mRNA与固定在载体上的寡(dT)杂交的步骤、
对与寡(dT)杂交了的mRNA进行逆转录反应，制备将来自该细胞的cDNA固定在载体上得到cDNA固定化载体文库的步骤、和
边进行针对固定在载体上的cDNA的扩增反应，边进行扩增量的检测的步骤。
下面通过实施例对本发明进行进一步具体的说明。不过，下述的实施例并不限定本发明。
【实施例】
关于作为预先作为解析对象基因而选择的多个基因，对作为解析试样的单个细胞中存在多少来自各基因的mRNA分子进行定量的解析方法，按照图1记载的流程所示的步骤1-1到步骤1-6的操作进行实施。即，获取单个细胞(步骤1-1)，然后溶解细胞(步骤1-2)，除去单个细胞的基因组DNA的DNase处理(步骤1-3)，以及使用固定了寡(dT)的载体进行逆转录反应，制备来自单个细胞的cDNA的固定化载体文库(步骤1-4)。不仅能够将来自单个细胞的cDNA的固定化载体文库上，而且为了有效地提高了cDNA合成效率，此外为了将各试样间的不均一性降低到最小限度，步骤1-1到步骤1-4在1个管子内实施。使用制备的来自单个细胞的cDNA固定化载体文库，进行实时PCR，对单个细胞中的作为解析对象基因的表达进行定量(步骤1-5)。此外，通过回收、洗涤该来自单个细胞的cDNA固定化载体文库(步骤1-6)、作为解析试样再利用、实施对多个基因的定量解析。下面对所涉及的各步骤进行详细的说明。
单个细胞的获取
首先，为了实施将图1的步骤1-1所示的单个细胞获取，将American Type Culture Collection(ATCC)提供的人大肠癌细胞(HCT116)用适量的Advanced D-MEM培养液(GIBCO公司)(含有5％的谷氨酰胺、10％灭活的胎牛血清)混悬，将该溶液装入灭菌的瓶中，在37℃、5％的CO2条件下培养1～2天时间。在显微镜下确认无微生物等造成污染，细胞正常地增殖。然后，用3mL的磷酸缓冲液(pH7.4、GIBCO公司)洗涤附着在灭菌的瓶底部的培养细胞，添加胰酶1mL(GIBCO公司)，在37℃、温育3分钟，剥离、释放细胞。为了使细胞混悬液中的胰酶失活，添加3mL Advanced D-MEM培养液(含有5％的谷氨酰胺、10％的灭活FBS)。将该细胞混悬液(约4mL)转移到15mL的管中，离心(1000rpm、3分钟、4℃)后、去除上清。将集中在15mL管底的细胞块用10mL左右的磷酸缓冲液(pH7.4)悬浮，使用血球计数板(Burker-Turk型)进行细胞数计数。此外，因为该血球计数板能够计数的细胞数在105～107个/mL左右，所以再将计数的细胞混悬液稀释调整到500细胞/mL左右。将该细胞稀释液100μL(即含有约50个细胞)转移到96孔板(FALCON公司)的盖子的低洼处(面积；2cm2)上，形成液滴。然后在显微镜下(倍率100倍)，使用移液器(Drummond公司、Tip的前端直径；190μm)，与1μL的磷酸缓冲液(pH7.4)一起吸取单个细胞。因为迅速地吹出会使细胞破碎，所以向PCR管(Axygen Scientific公司、低吸着性管)的底部预先添加磷酸缓冲液(pH7.4)1μL，向其中插入Tip的前端，缓慢地吹出单个细胞。以相同的操作，取样单个细胞试样(在2μL磷酸缓冲液中含有单个细胞)6次，取样作为阴性对照用的0个细胞(2μL的磷酸缓冲液)试样1次。此外，为了避免RNA分解，将选出的细胞在冰上静置，迅速进行下面的步骤。
细胞溶解
将SuperScriptIII CellsDirectc DNA Synthesis System(Invitrogen公司)附带的Resuspension缓冲液8μL以及LysisBnhancer0.8μL混合，制备细胞溶解用试剂混合物，将其分装到装有试样的各个管中，每管1.1μL，通过在75℃、进行10分钟的热处理，溶解细胞(图1的步骤1-2)。
DNase(DNA分解酶)处理
然后，为了分解试样中含有的基因组DNA，将试样在冰上冷却3分钟后，混合DNaseI(1U/μL、Invitrogen公司)4.0μL以及10xDNaseI缓冲液2.88μL，制备DNase处理用试剂混合物，将其装入装有试样的各个管中，每管0.86μL，在室温下温育5分钟。反应后，迅速向装有试样的各管加入2.5mM的EDTA1.2μL，进行在70℃下5分钟的加热处理，使DNase I失活(图1的步骤1-3)。
向磁珠表面的寡(dT)30固定化
通过下述操作，将寡(dT)30(序列号1)固定到磁珠上。将表面包被了链霉亲和素的磁珠(直径1μm、107个/μL、DYNAL BIOTECH公司)均匀悬浮，使之达到相同的浓度，将100μL(含有磁珠109个)采取到1.5mL的管中。将磁铁接近1.5mL的管，捕捉磁珠，去除上清。然后，将Binding & Washing缓冲液(5mM Tris-HCl(pH7.5)、0.5mM EDTA、1M NaC l)100μL与磁珠混合，用磁铁捕捉磁珠后，通过去除上清，洗涤磁珠。重复该洗涤操作3次。向在5’末端修饰了2分子生物素、其后含有6个碳原子作为间隔序列的寡(dT)30(100pmo l/μL)6.67μL中加入Binding & Washing缓冲液，制备400μL的寡(dT)30稀释液(含有1.67pmo l/μL、4.0x1014分子)。向400μL该寡(dT)30稀释溶液中加入洗涤过的磁珠，用混旋器仔细混合60分钟，利用链霉亲和素-生物素结合，向磁珠表面结合寡(dT)30。为了去除未与磁珠结合的过剩的寡(dT)30，用磁铁捕捉磁珠，去除上清，用Binding & Wa shing缓冲液洗涤磁珠2次。然后，为了去除RNase，用溶液A(0.1N NaOH、0.05MNaC l、DEPC处理)洗涤2次，用溶液B(0.1M NaC l、DEPC处理)洗涤1次后，加入200μL的灭菌水，制备固定了寡(dT)30的磁珠悬浊液(0.5x107个/μL、推测寡(dT)30固定数：约2.0x105分子/个磁珠)。
在磁珠表面上的mRNA逆转录反应
制备将上述制备的固定了寡(dT)30的磁珠悬浊液(0.5x107个/μL)16μL、dNTP Mix(分别10mM)8μL、以及0.1％Tween溶液124.8μL混合的溶液，向装入了试样的各管中分别加入18.6μL(含有磁珠107个)，在70℃进行5分钟的加热处理后，冷却到4℃。由此向图2的磁珠(201)上固定的寡(dT)30(202)上杂交mRNA(203)的3’末端上的多聚A序列(204)。然后，将混合了5x RT缓冲液48μL、DTT(0.1M)8μL、RNase OUT(40U/μL)8μL、以及Super ScriptIIIRT(200U/μL)8μL的溶液分别加入到装有试样的各个管中，每管9μL，进行50℃，50分钟→85℃，5分钟的加热处理，冷却到4℃，得到cDNA溶液(约33μL)(图1的步骤1-4)。即，如图2所记载的那样，从作为模板的mRNA(203)在磁珠表面上通过逆转录反应合成cDNA(205)。在逆转录反应后，用磁铁捕捉各管内的磁珠，除去含有cDNA制备所需要的残留试剂的上清。然后，将各管内的磁珠用Tris-HCI(10mM、pH7.5)100μL悬浮，用磁铁捕捉后，进行2次去除上清的洗涤操作。由此，得到来自单个细胞的cDNA的固定化磁珠文库(磁珠107个)。通过上述操作、单个细胞内存在的全部的105～106分子的mRNA，因为使用比该分子数多的107个的磁珠进行逆转录，所以每个磁珠至多能够捕捉mRNA的1分子，进行逆转录。
1个磁珠的表面上固定的寡(dT)30(202)达到约2x105分子之多，所以推测使用比107个更少数量的磁珠也能进行逆转录反应，也不会导致逆转录反应效率降低。所以，使用实时PCR进行定量解析时，只要在逆转录反应的效率不降低的范围内，可以例如，如图3所记载的那样，通过向固定了约2x105分子的寡(dT)30(301)的每个磁珠(302)上，将来自基因A的1分子的mRNA(303)、来自基因B的1分子的mRNA(304)、来自基因C的2分子的mRNA(305)的各个多聚A序列(306、307、308)与寡(dT)30(301)杂交，进行捕捉，能够合成来自基因A的1分子的cDNA(309)、来自基因B的1分子的cDNA(310)、来自基因C的2分子的cDNA(311)。
b2M标准曲线制作用的标准试样的制备
来自单个细胞的cDNA固定化磁珠文库(磁珠107个)中，为了定量来自b2M基因的cDNA存在多少分子进行了实时PCR。首先，将已知分子数的b2M基因序列DNA(PCR产物)固定到磁珠表面上，如下所述地制备实时PCR的标准曲线用标准试样。
与上述的将寡(dT)30固定到磁珠的操作相同，将表面用链霉亲和素包被的磁珠(直径1μm、107个/μL、DYNAL BIOTECH公司)很好地悬浮，使之达到相同的浓度，将50μL(磁珠5x108个)采取到1.5mL的管中。将磁铁接近1.5mL的管，捕捉磁珠，去除上清。然后，将Binding& Washing缓冲液50μL和磁珠混合，用磁铁捕捉磁珠后，通过去除上清对磁珠进行洗涤。重复该洗涤操作3次，之后用Binding&Washing缓冲液50μL悬浮磁珠。然后，使用比实时PCR引物组(序列号10以及序列号11)更外侧位置的标准模板制备用PCR引物组(序列号2以及序列号3)((R)引物在5’末端修饰了2分子的生物素)，对b2M进行PCR扩增，由此得到了264bp的b2M_PCR产物(在(R)链的5’末端添加2分子的生物素)。将用Binding & Washing缓冲液稀释到浓度106分子/μL的b2M_PCR产物溶液50μL添加到洗涤的磁珠50μL中，混合，每次5μL共10次，边混合，边用振荡仪很好地搅拌(600rpm、60分钟、室温)，利用链霉亲和素-生物素的结合，向磁珠表面固定b2M_PCR产物(共计100μL)。为了除去未结合在磁珠上的b2M_PCR产物，用磁铁捕捉磁珠，去除上清，用Binding & Washing缓冲液100μL洗涤磁珠3次(并且，用实时PCR研究上清以及洗涤液中的b2M_PCR产物的残留量，确认在磁珠表面固定了几乎全部的PCR产物)。然后，将固定了该b2M_PCR产物的磁珠用NaOH(0.1M)50μL进行洗涤，尝试使b2M_PCR产物单链化。即，通过该操作，仅将添加了2分子生物素的b2M_PCR产物(R)链固定到磁珠上，去除b2M_PCR产物(F)链。然后用50μL的Tris-HCl(10mM、pH7.5)进行2次洗涤后，用50μL相同的溶液将磁珠悬浮，得到作为单链DNA的b2M_PCR产物(R)链的浓度为106分子/μL的标准试样(磁珠浓度；107个/μL)。将其用未固定的磁珠(洗涤完毕的、107个/μL)重复进行10倍稀释，制备磁珠的浓度是一定(107个/μL)的、并且b2M_PCR产物(R)链的模板浓度为106分子/μL～101分子/μL的标准稀释系列试样A。此外，将未固定到磁珠上的b2M_PCR产物(R)链(106/μL)用Tris-HCl(10mM、pH7.5)进行同样的稀释，制备106分子/μL～101分子/μL的标准稀释系列试样B。
来自b2M的mRNA分子的实时PCR测定
然后，在冰上将2x TaqMan Universal PCR Master Mix(ABI公司)80μL、10μM的实时PCR用引物(F)(序列号10)以及(R)(序列号11)分别16μL、以及基因特异性探针(序列号18)(2.5μM)16μL、0.1％Tween溶液32μL混合，制备PCR溶液A，将该PCR溶液向来自单个细胞的cDNA固定化磁珠文库试样(磁珠107个)分别加入20μL，均匀悬浮，作为试样的反应溶液，转移到384孔微孔板中。然后，在冰上将2x TaqMan Universal PCR Master Mix(ABI公司)390μL、10μM的实时PCR用引物(F)(序列号10)以及(R)(序列号11)各78μL、以及基因特异性探针(序列号18)(2.5μM)78μL、0.1％Tween溶液117μL混合，制备PCR溶液B，将该PCR Mix按照每孔19μL，分别添加到384孔微孔板中，向其中作为模板分别加入标准稀释系列试样A以及标准稀释系列试样B各1μL。此外，为了制成准确的标准曲线，对各标准稀释系列分别进行n＝3次测定。将装入了各反应溶液的384孔微孔板用光学检测用封条密封，在实时PCR装置中，进行95℃10分钟的热变性后，进行95℃15秒钟→60℃1分钟的50个循环，由各扩增循环中PCR产物进行荧光检测。
图4表示了本发明的实时PCR的一个实施方式。在来自单个细胞的cDNA固定化磁珠文库试样(磁珠107个)中存在的、固定了b2M的cDNA1分子(401)的磁珠(402)上，首先将PCR溶液中存在的b2M实时PCR引物(R)(403)与b2M的cDNA(401)退火。然后，通过互补链延伸反应，合成与b2M的cDNA(401)的互补的PCR产物(R链)(404)。然后，在热变性后，重复上述反应的同时，在PCR溶液中存在的实时PCR引物(F)(405)与生成的PCR产物(R链)(404)退火，进行互补链延伸反应，生成PCR产物(F链)(406)。这样，在最初的PCR循环中，将固定在磁珠上的b2M的cDNA分子(401)作为模板，进行反应，然后，PCR转换到液相体系中，PCR产物(R链)(404)以及PCR产物(F链)(406)分别与实时PCR引物(F)(405)以及实时PCR引物(R)(403)分别退火，PCR产物以指数级在液相中累积。然后，b2M基因特异性探针(407)与该PCR产物(R链)(404)杂交，同时实时PCR引物(F)(405)向PCR产物(R链)(404)的3’末端退火，进行延伸反应。b2M基因特异性探针(407)的3’末端上修饰了消光体以及Tm温度调节分子，因为在其5’末端上修饰有荧光体(FAM)，所以在现有状态下，检测不到荧光信号。不过，因为延伸反应中DNA合成酶一边破坏b2M基因特异性探针(407)，一边合成互补链，所以从破坏的b2M基因特异性探针(408)上释放荧光体(409)，检测到荧光信号。即，检测到与PCR产物数成比例的强度的荧光信号。
来自b2M的mRNA分子数的定量解析
使用附带的解析用软件SDS ver.2.1，计算出各扩增曲线的(以荧光值为纵轴、循环数为横轴作图得到的S型曲线)的Ct值(Thre sholdCycle，PCR产物达到阈值时的循环数)。以标准曲线用试样中的模板数为横轴，Ct为纵轴作图得到的标准曲线的图如图5所示。发现与未固定模板的(即不含磁珠)标准稀释系列试样B的标准曲线相比，模板是磁珠表面上固定了的标准稀释系列试样A的标准曲线，其斜率从-3.717向-4.027移动，PCR扩增效率稍微降低，由R2值为0.9995的高值可知，不会损害定量性。即，由此认定作为定量磁珠(107个)表面上的模板的方法，能够适用于实时PCR。将来自单个细胞的cDNA固定化磁珠文库试样(磁珠107个)得到的Ct值在标准稀释系列试样A的标准曲线标示出来，能够计算出在单个细胞中含有的编码b2M的mRNA拷贝数(图6)。
对磁珠上固定了的其他基因的mRNA的定量解析
再利用相同的来自单个细胞的cDNA固定化磁珠文库试样(磁珠107个)，尝试对与其他的基因相关的每个单个细胞中的mRNA拷贝数进行定量测定(即，重复图1的步骤1-6以及步骤1-5)。
首先，与上述记载的b2M基因的情况相同，对每个基因使用标准模板制备用PCR引物组((R)引物的5’末端修饰2分子的生物素)(EEF1G：序列号4、序列号5)(SDHA：序列号6、序列号7)(TBP：序列号8、序列号9)，分别进行PCR扩增，利用该PCR产物的链霉亲和素-生物素结合，固定到磁珠表面，通过NaOH(0.1M)进行单链化，磁珠浓度保持在107个/μL，并且分别制备PCR(R)链的模板浓度为106分子/μL～101分子/μL的标准稀释系列试样。
然后进行测定b2M的mRNA的第1次的实时PCR后，将含有来自单个细胞的cDNA固定化磁珠文库试样(磁珠107个)的反应溶液与磁铁接近，由此捕捉磁珠，去除上清。然后用Tween0.1％溶液40μL混悬磁珠，用磁铁捕捉磁珠后，进行2次去除上清的操作。通过该操作，去除来自单个细胞的cDNA固定化磁珠文库试样中含有的b2M基因特异性探针(序列号18)、实时PCR引物组(F)(R)(序列号10以及序列号11)、以及PCR产物(图1的步骤1-6)。以该洗涤的来自单个细胞的cDNA固定化磁珠文库试样、以及EEF1G的标准稀释系列试样作为模板，使用EEF1G的实时PCR引物组(EEF1G：序列号12、序列号13)、基因特异性探针(EEF1G：序列号19)，进行第2次实时PCR定量测定。然后，将第1次实时PCR后和同样地用Tween0.1％溶液洗涤的来自单个细胞的cDNA固定化磁珠文库试样、以及SDHA的标准稀释系列试样作为模板，使用SDHA的实时PCR引物组(SDHA：序列号14、序列号15)、基因特异性探针(SDHA：序列号20)，进行第3次实时PCR定量测定。然后用Tween0.1％溶液洗涤的来自单个细胞的cDNA固定化磁珠文库试样、以及TBP的标准稀释系列试样作为模板，使用TBP的实时PCR引物组(TBP：序列号16、序列号17)、基因特异性探针(TBP：序列号21)，进行第4次实时PCR定量测定。
以标准稀释系列试样中的模板分子数为横轴，将Ct作为纵轴制成标准曲线，将洗涤的来自单个细胞的cDNA固定化磁珠文库试样(磁珠107个)得到的Ct值在标准曲线上定点，计算出EEF1G、SDHA、以及TBP这3个基因在单个细胞中含有的mRNA拷贝数(图6)。在分别取样6次的各个单个细胞试样中，测定的4个基因在每个单个细胞中的mRNA拷贝数如图6的图所述的那样，BEF1G最高，为1000拷贝/细胞左右，然后依次是b2M、SDHA、TBP。此外，确认从作为阴性对照的0个细胞的试样没有检测到任何的荧光信号。为了确认从单个细胞试样得到的结果的可靠性，对于10个细胞试样以及1000个细胞试样使用同样的方法(从图1步骤1-1到步骤1-6)对试样中含有的mRNA分子数进行了定量解析。结果如图7所示。对于低表达的TBP基因，线性、即定量性稍微低一些，不过，确认了对于b2M、EEF1G、SDHA的3基因具有高的定量性。
对来自单个细胞的cDNA固定化磁珠文库的有用性的确认(针对残 留试剂导致的PCR抑制的研究)
另一方面，在不使用磁珠的以往方法中，在1个管子内，能够实施细胞溶解步骤、DNase处理步骤、以及逆转录反应，制备cDNA，不过不能实施与使用磁珠的情况下的相同的纯化步骤。因此，发生了在试样中夹带残留试剂，由此导致了PCR扩增抑制。所以，将来自单个细胞制备得到的cDNA试样中含有的残留试剂定义为100％的时候，制成其中含有0％、3％、6％、9％的残留试剂的标准曲线(模板：用EEF1G基因的标准模板制备用PCR引物组(序列号4、序列号5)扩增的PCR产物，实时PCR引物：序列号12、序列号13、基因特异性探针；序列号19)，讨论残留试剂对PCR抑制的影响。结果如图8所示。
如图8-1所示，表示PCR扩增效率的标准曲线的斜率，对于不含残留试剂的标准曲线(0％)，伴随着残留试剂量的增加，大幅度地降低。此外，含有残留试剂1％、2％、3％、6％、9％、含有已知浓度的模板数分别为333个分子、666个分子、1000个分子、2000个分子、3000个分子的试样用实时PCR进行解析的时候，得到了如图8-2所示的结果。对于虚线所示的理想值，用实线所示的实际测定值直到残留试剂为3％是一致的，含有比此值以上的残留试剂时候，远离理想值很大，不能准确定量。即，在1个管子内，在进行从单个细胞制备cDNA的以往方法中，必需将得到的来自单个细胞的cDNA试样再分份得到的产物(至多为3％)作为实时PCR解析的试样使用。这可能成为导致测定灵敏度大幅度地降低的原因。与此相对，通过本发明制备的来自单个细胞的cDNA固定化文库，因为能够进行逆转录反应后的纯化步骤，所以试样中的残留试剂为0％，可以将来自单个细胞的cDNA以总量作为实时PCR的解析试样使用。
逆转录反应中磁珠的直径以及数目的研究
在直径为1μm以及2.8μm的磁珠中，每1个磁珠上固定的寡(dT)分子数分别大约为2x105分子、1.8x106分子。如果仅仅计算寡(dT)的数目的话，对1细胞中含有的mRNA的分子数(105～106分子)进行逆转录所必须的磁珠只要有5个(φ1μm)或者1个(φ2.8μm)即可。不过推测实际上磁珠数越少，逆转录的效率降低。反之，推测如果磁珠数过多的话，在实时PCR中会抑制荧光发光的检测。所以选择表达量为1000拷贝/细胞左右的EEF1G基因，在进行将来自单个细胞的mRNA在磁珠表面上进行逆转录反应的步骤(图1的步骤1-4)中，对最佳的磁珠数进行了研究。其结果发现在直径为1μm的磁珠在107～108个、直径为2.8μm的磁珠在106～108个的情况下得到了1000拷贝左右的测定结果值，能够反应效率良好地进行测定(图9-1以及图9-2)。由此认为在使用少量的磁珠的情况下，测定值大幅度降低，有效地逆转录以及载体回收率是其原因。此外，针对这个结果，将直径1μm以及2.8μm的磁珠总表面积作为图的横轴作图，可知逆转录的效率不依赖于磁珠的直径。通过这个结果可以确认，在载体的总表面积在约0.1cm2以上(在本实施例中使用的载体表面中寡(dT)的固定量；约5x1013分子/cm2)的情况下，逆转录反应良好(图10-1)。将该图的横轴设定为在载体表面上固定的寡(dT)总分子数进行作图，则如图10-2所示，在将来自单个细胞的mRNA在磁珠表面上进行逆转录反应的步骤中，确认需要1012分子以上的寡(dT)。
另一方面，在检测扩增量的步骤中尝试对最佳的磁珠数进行研究。此外，作为模板，使用将以EEF1G基因的标准模板制备用PCR引物组(序列号4、序列号5)扩增的PCR产物固定到磁珠上的产物，使用实时PCR引物组(序列号12、序列号13)、以及基因特异性探针(序列号19)。使用直径为1μm以及2.8μm的磁珠的本实施例的结果分别如图11-1以及图11-2所示。同时，伴随着磁珠数的增加，标准曲线向上方移动，由此能确认抑制了信号检测，因为其程度与磁珠数相对应是一定的，所以R2值依然是高值，因此可以确认如果是至少直径1μm的磁珠达到108个，直径2.8μm磁珠达到107个左右的话，能够定量测定。不过，如图中的误差线所示的那样，因为伴随着磁珠数的增加，测定误差也会增大，所以使用比上述多的磁珠进行定量解析的话，有可能会使测定精度大幅度地降低。即，横轴表示反应溶液中的载体体积占有率，纵轴表示测定误差(Ct的标准偏差值(σ))作图(图12)进行研究的话，能够确认伴随着载体体积占有率的增加，测定误差增大，测定精度降低。所以，得到了以下的结果：反应溶液中载体的体积占有率为1％以下是合适的，此外，在对精度有要求的定量测定的情况下，优选反应溶液中载体的体积占有率在0.1％以下。
对作为解析试样而使用的细胞数的研究
在将103细胞以下这样的少量的细胞作为解析试样使用的情况下，用以往的表达解析法，会伴随着灵敏度不足的问题和测定误差大的问题。与此相反，本发明的方法如图7所示的，即使使用多个细胞(～103细胞)，也能高精度地定量解析。
                                序列表
<110>日立公司
<120>单个细胞的基因表达的定量方法
<130>H600300
<160>21
<170>PatentIn Ver.2.1
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Claims (13)

1.核酸检测方法，其中包括：
从含有至少单个细胞的试样以不破碎地获取单个细胞的步骤、
溶解获取的单个细胞的细胞膜，使该细胞中的核酸溶出的细胞溶解步骤、
在溶出了的核酸中，通过DNA分解酶使DNA分解的DNA分解步骤、
使该单个细胞中所含的RNA中的mRNA与固定在载体上的聚合度为5～40的寡(dT)杂交的步骤、
对与寡(dT)杂交了的mRNA进行逆转录反应，制作由来自单个细胞的cDNA固定在载体上得到的来自单个细胞的cDNA固定化载体文库的步骤、和
边进行针对固定在载体上的cDNA的扩增反应，边进行扩增量的检测的步骤。
2.权利要求1记载的核酸检测方法，其中，在1个管内进行以下步骤：
细胞溶解步骤、
DNA分解步骤、
使该单个细胞中所含的RNA中的mRNA与固定在载体上的寡(dT)杂交的步骤、和
对与寡(dT)杂交了的mRNA进行逆转录反应，制作由来自单个细胞的cDNA固定在载体上得到的来自单个细胞的cDNA固定化载体文库的步骤。
3.权利要求1记载的核酸检测方法，其中，在边进行针对固定在载体上的cDNA的扩增反应，边进行扩增量的检测的步骤之后，还包括：
回收载体、洗涤的步骤a、和
边进行针对固定在载体上的cDNA的扩增反应，边进行扩增量的检测的步骤b。
4.权利要求3记载的核酸检测方法，其中，在步骤b之后，还具有重复步骤a以及步骤b的步骤。
5.权利要求1记载的核酸检测方法，其中，制备来自单个细胞的cDNA固定化载体文库的步骤中，使单个细胞中所含的mRNA实质上全部杂交。
6.权利要求1记载的核酸检测方法，其中，载体是粒子，使用的粒子的总表面积在0.1cm2以上。
7.权利要求1记载的核酸检测方法，其中，载体是粒子，扩增反应溶液中粒子的体积占有率在1％以下。
8.权利要求1记载的核酸检测方法，其中，载体是粒子，扩增反应溶液中粒子的体积占有率在0.1％以下。
9.权利要求1记载的核酸检测方法，其中，固定在载体上的寡(dT)的总分子数量在1012个分子以上。
10.权利要求6～9的任一项记载的核酸检测方法，其中，粒子的粒径是1μm，粒子数是107～108。
11.权利要求6～9的任一项记载的核酸检测方法，其中，粒子的粒径是2.8μm，粒子数是106～107。
12.权利要求6～11的任一项记载的核酸检测方法，其中，粒子是磁珠。
13.核酸检测方法，其中包括：
从含有细胞的试样以不破碎地获取103个以下的多个细胞的步骤、
溶解获取的细胞的细胞膜，使该细胞中的核酸溶出的细胞溶解步骤、
在溶出了的核酸中，通过DNA分解酶使DNA分解的DNA分解步骤、
使该细胞中所含的RNA中的mRNA与固定在载体上的聚合度为5～40的寡(dT)杂交的步骤、
对与寡(dT)杂交了的mRNA进行逆转录反应，制作来自该细胞的cDNA固定在载体上得到的cDNA固定化载体文库的步骤、和
边进行针对固定在载体上的cDNA的扩增反应，边进行扩增量的检测的步骤。
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