CN101065667A - 诊断和治疗妊娠并发症的方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了通过测量可溶内皮糖蛋白的水平或生物学活性，诊断妊娠相关的高血压病症或发展妊娠相关的高血压病症的倾向的方法。本文还公开了使用改变可溶内皮糖蛋白水平或生物学活性的化合物来治疗妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫和子痫)的方法。

Description

诊断和治疗妊娠并发症的方法
关于联邦资助的研究的声明
部分地在国立卫生研究院(NIH)资助号DK 064255和HL 079594的政府资助下完成了本发明。政府具有本发明的某些权利。
发明领域
总体地说，本发明涉及患有妊娠相关的高血压病症的受试者的检测和治疗。
发明背景
先兆子痫是高血压、水肿和蛋白尿的综合征，其影响5-10％的妊娠，并导致相当大的产妇和胎儿发病率及死亡率。先兆子痫造成全世界每年至少200,000名产妇死亡。先兆子痫的症状一般地在妊娠第20周后出现，且通常是通过常规测量妇女的血压和尿而检测出来的。然而，这些监控方法不能有效诊断早期综合征，如果采取有效的治疗，所述诊断就可减少对受试者或发育中胎儿的危险。
目前还没有已知的先兆子痫疗法。先兆子痫的严重程度可从轻度直至威胁生命。轻度形式的先兆子痫可通过卧床休息和经常监控来治疗。对于中度至严重的病例，建议住院并接受血压药物治疗或抗惊厥剂药物治疗，以防止癫痫发作。如果状况威胁到母亲或婴儿的生命，则要终止妊娠并在预产期前分娩出婴儿。
胎儿和胎盘的正确发育是由几种生长因子或血管生成因子介导的。这些血管生成因子中的一种是内皮糖蛋白，其也称作CD105。内皮糖蛋白是一种同源二聚体细胞膜糖蛋白，其主要在内皮细胞(如合胞体滋养层、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和血管内皮细胞)上表达。内皮糖蛋白与β聚糖，一种转化生长因子(TGF)-β受体III型共有序列同一性。已经表明，内皮糖蛋白是TGF-β受体复合物的调节组分，其调节血管生成、增殖、分化和细胞凋亡。内皮糖蛋白也结合TGF-β超家族的几种其它成员，包括活化素-A、骨形态发生蛋白(BMP)-2和BMP-7。具体地，内皮糖蛋白以高亲和力结合TGF-β1和TGF-β3，并与TGF-β信号传导受体I和II型形成异源三聚体结合。内皮糖蛋白基因的编码区的突变造成出血性毛细管扩张1型(HHT1)，后者是一种显性遗传的血管病症，其特征在于多系统的血管发育异常和复发性出血。还已经鉴别出了可溶形式的内皮糖蛋白，并发现其以增高的水平存在于转移性乳腺癌和结肠直肠癌患者中；但是，尚不清楚可溶内皮糖蛋白在癌症的发病机理中的确切功能作用。尚未报道可溶内皮糖蛋白生成与先兆子痫或正常妊娠有关。
已经报道几种因子与胎儿和胎盘发育有关，且更具体地与先兆子痫有关。它们包括血管内皮生长因子(VEGF)、可溶的Flt-1受体(sFlt-1)和胎盘生长因子(PlGF)。VEGF是内皮细胞-特异性的促分裂原、血管生成诱导物和血管通透性的介质。已经表明VEGF对于肾小球毛细血管修复是重要的。VEGF作为同源二聚体与两种同源跨膜酪氨酸激酶受体(fms-样酪氨酸激酶(Flt-1)和激酶结构域受体(KDR))之一结合，所述受体在从很多不同组织获得的内皮细胞中差别表达。Flt-1(而不是KDR)由促成胎盘形成的滋养层细胞高度表达。PlGF是VEGF家族成员，其也参与胎盘发育。PlGF由细胞滋养层及合胞体滋养层表达，且能够诱导内皮细胞的增殖、迁移及活化。PlGF作为同源二聚体与Flt-1受体结合，但不与KDR受体结合。PlGF和VEGF均可对促有丝分裂活性和血管生成作出贡献，后者对于发育中的胎盘是至关重要的。
近来已经在人脐静脉内皮细胞的培养基中鉴别了sFlt-1，其缺少受体的跨膜和胞质结构域，并随后在胎盘组织中证实了体内表达。sFlt-1以高亲和力与VEGF结合，但不会刺激内皮细胞的有丝分裂发生。
小心地调节血管生成和促有丝分裂信号传导途径对于由发育中的胎盘的滋养层细胞维持适宜的增殖、迁移和血管生成是至关重要的。
需要准确诊断有危险患有或患有先兆子痫或子痫的受试者的方法，特别是在发作最严重的症状之前。还需要进行治疗。
发明概述
我们已经发现了诊断和治疗妊娠相关的高血压病症(包括先兆子痫和子痫)的方法。
利用基因表达分析，我们已经发现在来自患有与高血压有关的妊娠并发症(包括先兆子痫)的孕妇的胎盘组织样品中，可溶内皮糖蛋白(sE)的水平显著提高。内皮糖蛋白是TGF-β受体复合物的部分，后者起调节血管生成的作用。内皮糖蛋白可以以高亲和力结合TGF-β家族成员，后者是TGF-β受体的配体。在受影响的个体中，过量的可溶内皮糖蛋白可以耗尽胎盘的必需量的必需血管生成和促有丝分裂因子。在本发明中，使用结合或中和可溶内皮糖蛋白的化合物来减少提高的水平的可溶内皮糖蛋白。另外，还提供了可溶内皮糖蛋白的抗体，以及用于降低生物学活性的可溶内皮糖蛋白的水平的RNA干扰和反义核碱基(nucleobase)寡聚体。最后，本发明提供了可溶内皮糖蛋白水平的测量，作为妊娠相关的高血压病症(包括先兆子痫子痫和子痫或其素因)的早期诊断和控制的检测工具。
因此，在一个方面，本发明提供了通过给受试者施用能结合可溶内皮糖蛋白的化合物来治疗或预防受试者的妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的方法，其中施用的时间和量足以治疗或预防受试者的妊娠相关的高血压病症的至少一种症状。妊娠相关的高血压病症的非限制性实例包括先兆子痫、子痫、妊娠高血压、慢性高血压、HELLP综合征和具有小于胎龄儿婴儿(SGA)的妊娠。在一个优选的实施方案中，化合物是特异性地结合可溶内皮糖蛋白的纯化的可溶内皮糖蛋白抗体或其抗原结合片段。在另一个优选的实施方案中，化合物是能特异性地结合可溶内皮糖蛋白的生长因子，如TGF-β家族成员(例如，TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP-2和BMP-7)或其片段。
在另一个优选的实施方案中，该方法也包括施用化合物，如纯化的sFlt-1抗体，sFlt-1抗原结合片段，烟碱，茶碱，腺苷，硝苯地平，米诺地尔，硫酸镁，血管内皮生长因子(VEGF)，包括所有同工型如VEGF189、VEGF121、VEGF165或其片段，或胎盘生长因子(PlGF)，包括所有同工型和其片段，其中施用的时间和量足以治疗或预防受试者的妊娠相关的高血压病症。
在另一个方面，本发明涉及通过给受试者施用化合物(例如，化合物、多肽、肽、抗体或其片段)，所述化合物增加能结合可溶内皮糖蛋白的生长因子的水平，来治疗或预防受试者的妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的方法。施用化合物的时间和量足以治疗或预防妊娠相关的高血压病症。在优选的实施方案中，化合物增加TGF-β家族成员(例如，TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP-2和BMP-7)和其片段的水平。这样的化合物的非限制性实例包括环孢菌素、α生育酚、美西麦角、溴隐亭和爱道美。
在另一个有关的方面，本发明涉及通过给受试者施用化合物(例如，化合物、多肽、肽、抗体或其片段)，所述化合物抑制生长因子结合可溶内皮糖蛋白多肽，来治疗或预防受试者的妊娠相关的高血压病症的方法。施用化合物的时间和量足以治疗或预防妊娠相关的高血压病症。在优选的实施方案中，化合物结合可溶内皮糖蛋白，并阻止生长因子结合。这样的化合物的非限制性实例包括通过筛选得到的抗体和小分子化合物。
在另一个方面，本发明提供了通过给受试者施用能降低可溶内皮糖蛋白表达或生物学活性的化合物，来治疗或预防受试者的妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的方法，其中所述施用足以治疗或预防受试者的妊娠相关的高血压病症。在优选的实施方案中，化合物是纯化的抗体或其抗原结合片段或抑制选自下述的蛋白水解酶的酶活性的化合物：基质金属蛋白酶(MMP)、组织蛋白酶或弹性蛋白酶。MMP包括MMP 1-26中的任一种，优选MMP9或膜型MMP1。
合意地，通过它的抑制内皮糖蛋白的血管生成活性的能力，如通过血管生成测定所测得的，鉴别能抑制可溶内皮糖蛋白的生物学活性的化合物。在这样的测定的一个实例中，在matrigel管形成测定中使用先兆子痫患者的血清来诱导抗血管生成状态。然后加入化合物，且抗血管生成状态减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，指示着治疗上有效的化合物。
能抑制可溶内皮糖蛋白的生物学活性的化合物，可以是反义核碱基寡聚体，其具有至少一条与可溶内皮糖蛋白的序列的至少一部分至少80％、优选地85％、90％、95％、99％或100％互补的链。在一个实施方案中，反义核碱基寡聚体与可溶内皮糖蛋白的至少8、10、优选地20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个连续核苷酸互补，且可以减少或抑制可溶内皮糖蛋白的表达或生物学活性。合意地，反义核碱基寡聚体是8至30个核苷酸长。
能抑制可溶内皮糖蛋白的生物学活性的化合物，也可以是双链RNA(dsRNA)分子，其具有至少一条与可溶内皮糖蛋白核酸分子的序列的至少一部分至少80％、优选地85％、90％、95％、99％或100％互补的链。在一个实施方案中，双链RNA是小干扰RNA(siRNA)，它是19至25个核苷酸长，且可以减少或抑制可溶内皮糖蛋白的表达或生物学活性。在其它优选的实施方案中，dsRNA与可溶内皮糖蛋白分子的核酸序列的至少18、优选地19、20、21、22、23、24、25、35、45、50或更多个连续核苷酸具有100％核酸同一性。合意地，dsRNA是siRNA。
在任一个上述方面的各实施方案中，该方法还包含给受试者施用抗高血压化合物(例如，腺苷、硝苯地平、米诺地尔和硫酸镁)的步骤。在上述方面的其它实施方案中，所述受试者是妊娠的人、产后的人、非妊娠的人、或非人类(例如，牛、马、绵羊、猪、山羊、狗或猫)。本发明的治疗方法可以用于治疗或预防妊娠相关的高血压病症，包括先兆子痫、子痫、妊娠高血压、慢性高血压、HELLP综合征和具有SGA婴儿的妊娠。优选的病症是先兆子痫和子痫。在上述方面的各实施方案中，该方法可以与下述的本发明的诊断方法相结合，以监控治疗中的受试者或确定有效治疗剂量。
本发明的任一个治疗方面也可以包括，施用一种或多种其它的化合物，如纯化的sFlt-1抗体，sFlt-1抗原结合片段，烟碱，茶碱，腺苷，硝苯地平，米诺地尔，硫酸镁，血管内皮生长因子(VEGF)，包括所有同工型如VEGF189、VEGF121或VEGF165或其片段；胎盘生长因子(PlGF)，包括所有同工型和其片段，其中施用的时间和量足以治疗或预防受试者的先兆子痫或子痫。在美国专利申请公开号20040126828和20050025762和PCT公开号WO 2004/008946中，描述了这样的化合物的优选实例。合意地，所述化合物是能结合sFlt-1或降低sFlt-1表达的化合物。
可以单独地或与本发明的一种或多种其它方法组合地，使用本发明的任一个治疗方面。在一个实例中，可以组合使用MMP抑制剂和抗体，以中和存在的可溶内皮糖蛋白，并通过膜结合形式的切割，阻断可溶内皮糖蛋白的进一步生成。
在另一个方面，本发明涉及特异性地结合可溶内皮糖蛋白的纯化的抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，抗体阻止生长因子(例如，TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP-2和BMP-7)与可溶内皮糖蛋白的结合。在另一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。在其它优选的实施方案中，抗体或其抗原结合片段是人或人源化抗体。在其它实施方案中，抗体缺少Fc部分。在其它实施方案中，抗体是F(ab′)2、Fab或Fv结构。在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段存在于药学上可接受的载体中。
在另一个方面，本发明提供了诊断受试者患有妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)或具有其素因的方法，其包含测量来自受试者的样品中的可溶内皮糖蛋白多肽的水平。在优选的实施方案中，可溶内皮糖蛋白的水平是游离的、结合的或总的可溶内皮糖蛋白的水平。在有些实施方案中，可溶内皮糖蛋白的水平是降解或酶切割产生的可溶内皮糖蛋白多肽的水平。妊娠相关的高血压病症或发展妊娠相关的高血压病症的倾向的诊断，可以源自与正常参照样品相比可溶内皮糖蛋白的相对水平的变化(例如，增加)，或源自超过正常参照值的可溶内皮糖蛋白的绝对水平的检测。例如，通常，在非妊娠状态期间，可溶内皮糖蛋白的循环血清或血浆浓度范围是2-7ng/ml，而在正常妊娠期间，是10-20ng/ml。关于包含测量可溶内皮糖蛋白的绝对水平的实施方案，认为大于15ng/ml、20ng/ml或优选地大于25ng/ml的水平，是妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的诊断指标。在其它优选的实施方案中，该方法还包括，如美国专利申请公开号20040126828、20050025762和2005017044和PCT公开号WO2004/008946和WO 2005/077007所述，测量sFlt-1、VEGF或PlGF多肽中的至少一种在来自受试者的样品中的水平。该方法也可以包括，测量sFlt-1、VEGF或PlGF多肽中的至少两种在来自受试者的样品中的水平，并使用度量(metric)计算sFlt-1、VEGF或PlGF的水平之间的关系，其中受试者样品相对于参照样品的变化，可诊断妊娠相关的高血压病症或发展妊娠相关的高血压病症的倾向。在优选的实施方案中，该方法也包括确定体重指数(BMI)、胎儿的胎龄(GA)或二者，并在度量中包含BMI或GA或二者。在一个实施方案中，度量是先兆子痫抗血管生成指数(PAAI)：[sFlt-1/VEGF+PlGF]，其中PAAI用作抗血管生成活性的指标。在一个实施方案中，大于10、更优选地大于20的PAAI，指示着先兆子痫或子痫。在另一实施方案中，度量是下面的可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数：(sFlt-1+0.25(可溶内皮糖蛋白多肽))/PlGF。可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数的值的增加，是妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的诊断指标。例如，在21-32周期间大于75的值或在＞32周后大于100的值，诊断妊娠相关的高血压病症，如先兆子痫或子痫。用于本发明的诊断方法中的另一种度量是：(可溶内皮糖蛋白+sFlt-1)/PlGF。任一种方法也可以包括，确定体重指数(BMI)、胎儿的胎龄(GA)或二者，并在度量中包含BMI或GA或二者。
在上述方面的各实施方案中，样品是体液，如尿、羊水、血液、血清、血浆和脑脊液。合意地，通过免疫学测定(如ELISA)，确定可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF多肽的水平。在另一个实例中，单独地或与升高的sFlt-1和降低的游离PlGF或VEGF结合地，使用大于20、优选地大于25ng/ml的可溶内皮糖蛋白的水平，诊断妊娠相关的高血压病症，如先兆子痫或子痫。
在一个实施方案中，可溶内皮糖蛋白的水平的增加，是先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫的的倾向的指标。在上述方面的优选的实施方案中，测量的sFlt-1多肽的水平是游离的、结合的或总的sFlt-1多肽的水平。在其它实施方案中，sFlt-1多肽也可以包含sFlt-1片段、降解产物或酶切割产物。在上述方面的其它优选的实施方案中，VEGF或PlGF的水平是游离的VEGF或PlGF的水平。
在另一个方面，本发明提供了诊断受试者患有妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)或具有其素因的方法，其包含测量来自受试者的样品中的内皮糖蛋白核酸分子(例如，mRNA)、优选可溶内皮糖蛋白核酸的水平，并将其与参照样品相对比，其中与参照样品(例如，正常参照)相比水平的变化(例如，增加)，诊断受试者的妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)，或诊断发展妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的倾向。在其它实施方案中，该方法还可以包含，测量来自受试者的样品中的sFlt-1、VEGF或PlGF核酸分子(例如，mRNA)的水平，并将其与参照样品相对比，其中与正常参照样品相比水平的变化(例如，VEGF或PlGF水平的降低或sFlt-1水平的增加)，诊断受试者的妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)，或诊断发展妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的倾向。
在上述诊断方面的优选的实施方案中，在两个或更多个场合测量水平，且测量之间的水平的变化是妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的诊断指标。在一个优选的实施方案中，使用从第一次测量到下一次测量的可溶内皮糖蛋白的水平的增加(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)，诊断妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)。在上述诊断方面的另一个实施方案中，将可溶内皮糖蛋白的水平与正常参照样品相对比，且与正常参照样品相比可溶内皮糖蛋白的水平的增加(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)是先兆子痫或子痫的指示。
在另一个方面，本发明提供了诊断受试者患有妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)或具有其素因的方法，其包括确定受试者的内皮糖蛋白基因的核酸序列，并将其与参照序列相对比，其中受试者核酸序列的改变受试者中基因产物的水平或生物学活性的变化，诊断受试者患有妊娠相关的高血压病症，或有发展妊娠相关的高血压病症的倾向。在一个实施方案中，变化是核酸序列的多态性。在另一个实施方案中，sFlt-1、VEGF或PlGF的核酸序列或其任意组合，也确定基因，并与参照序列相对比。这些序列中的任一个或多个改变受试者中基因产物的水平或生物学活性的变化，诊断患有妊娠相关的高血压病症的受试者。
在上述方面的各实施方案中，样品是受试者的体液(例如，尿、羊水、血液、血清、血浆或脑脊液)，其中可溶内皮糖蛋白和sFlt-1、VEGF或PlGF通常是可检测的。在其它实施方案中，样品是组织或细胞(例如，胎盘组织或胎盘细胞、内皮细胞、白细胞和单核细胞)。在上述方面的其它实施方案中，受试者是非妊娠的人、妊娠的人或产后的人。在上述方面的其它实施方案中，受试者是非人类(例如，牛、马、绵羊、猪、山羊、狗或猫)。在一个实施方案中，受试者是非妊娠的或妊娠的人，且该方法用于诊断发展先兆子痫或子痫的倾向。在其它实施方案中，也测量BMI或GA或二者。在上述方面的各实施方案中，可溶内皮糖蛋白的核酸或多肽的水平相对于参照的增加是先兆子痫或子痫的诊断指标。
在另一个方面，本发明提供了诊断受试者患有妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)或具有其素因的方法，其包括测量可溶内皮糖蛋白配体(如TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP-2和BMP-7)在来自受试者的样品中的水平。
在任一个上述诊断方面的各实施方案中，妊娠相关的高血压病症是先兆子痫、子痫、妊娠高血压、慢性高血压、HELLP综合征或具有SGA婴儿的妊娠。在任一个诊断方面，在两个或更多个场合完成水平的测量，且测量之间的水平的增加是妊娠相关的高血压病症的诊断指标。该诊断方法可以合意地用于在发作症状之前(例如，至少4、5、6、7、8、9或10周前)，诊断妊娠相关的高血压病症。
在另一个方面，本发明提供了用于诊断受试者的妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的试剂盒，其包含用于检测内皮糖蛋白核酸或其片段的核酸序列，或其互补序列。在一个优选的实施方案中，核酸序列与编码可溶内皮糖蛋白的核酸或其片段杂交，优选地以高严格性。在一个优选的实施方案中，试剂盒还包含用于检测sFlt-1、VEGF或PlGF的核酸序列。
在一个有关的方面，本发明提供了用于诊断受试者的妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的试剂盒，其包含可溶内皮糖蛋白结合分子(例如，特异性地结合可溶内皮糖蛋白的抗体或其抗原结合片段)。在一个实施方案中，组分是免疫学测定、酶促测定或比色测定。在上述方面的其它实施方案中，试剂盒诊断妊娠的或非妊娠的受试者发展先兆子痫或子痫的倾向。在上述方面的优选的实施方案中，试剂盒也包含用于检测sFlt-1、VEGF或PlGF多肽的组分。在其它优选的实施方案中，使用试剂盒来检测可溶内皮糖蛋白，并进一步检测VEGF、sFlt-1和PlGF，并确定样品的诊断比率(例如，PAAI或可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数)。
在优选的实施方案中，诊断试剂盒包含关于试剂盒组分的预期用途的标签或说明书。在一个实施方案中，诊断试剂盒贴有标签，或包含关于用于诊断受试者的妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)、或发展妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的倾向的说明书。在一个优选的实施方案中，诊断试剂盒包含关于使用试剂盒来确定受试者样品的可溶内皮糖蛋白水平、并将可溶内皮糖蛋白水平与参照值相对比的标签或说明书。应当理解，参照值将取决于试剂盒的预期用途。例如，可以将样品与正常可溶内皮糖蛋白参照值相对比，其中可溶内皮糖蛋白水平的增加是妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的指示。也可以将样品与参照相对比，所述参照是来自已知患有先兆子痫的受试者的值或样品，其中可溶内皮糖蛋白水平的降低是妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的指示。
在一个有关的方面，本发明涉及通过提供组分来测量和/或对比可溶内皮糖蛋白多肽或核酸的水平和参照样品，来诊断受试者患有妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)或具有其素因的装置，其中与正常参照值相比可溶内皮糖蛋白水平的变化，诊断受试者的妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)。在优选的实施方案中，该装置包含侧向流(lateral flow)或测验片格式的膜，所述膜用于测量和对比尿样品中的多肽水平。
该装置也可以包含用于对比在来自受试者的样品中的可溶内皮糖蛋白和至少一种sFlt-1、VEGF和PlGF核酸分子或多肽相对于参照样品的水平的组分，其中可溶内皮糖蛋白和至少一种sFlt-1、VEGF和PlGF核酸分子或多肽的水平的变化，诊断受试者的先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫的倾向。在一个优选的实施方案中，该装置包含用于对比可溶内皮糖蛋白和至少一种sFlt-1、VEGF和PlGF多肽的水平的度量组分。
本文所述的任一种诊断方法和试剂盒也可以用于监控已经诊断为患有先兆子痫或子痫或处于患有先兆子痫或子痫的危险中的受试者，以监控治疗过程中的受试者或确定有效治疗剂量。在一个实例中，在治疗性监控中使用的试剂盒可以具有参照可溶内皮糖蛋白值，它是先兆子痫或子痫的指示，其中受试者样品的可溶内皮糖蛋白值相对于参照样品的降低，可以用于指示治疗化合物的治疗功效或有效剂量。在优选的实施方案中，试剂盒贴有标签，或包含关于用于治疗性监控或治疗剂量确定的说明书，且治疗性化合物可以包含在试剂盒中。单独地，或与sFlt-1、VEGF或PlGF蛋白或核酸的水平或其任意组合结合，测量可溶内皮糖蛋白蛋白或核酸的水平。在其它优选的实施方案中，将可溶内皮糖蛋白的水平与参照样品相对比，后者是妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的指示，且可溶内皮糖蛋白相对于参照样品的水平的变化(例如，降低)，是治疗性化合物的治疗功效或有效剂量的指示。在一个实例中，在施用治疗过程中或之后测得的可溶内皮糖蛋白多肽或核酸的水平相对于施用治疗之前的值的降低(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)，指示着妊娠相关的高血压病症的改善。在另一个实例中，测量血清或血浆中的可溶内皮糖蛋白的绝对水平，并用于监控化合物的治疗功效。例如，优选地以使可溶内皮糖蛋白的水平小于25ng/ml、优选地小于20ng/ml的剂量，施用治疗性化合物。
在包含测量sFlt-1的上述治疗性监控方面的实施方案中，sFlt-1多肽或核酸水平的降低，指示着先兆子痫或子痫的改善。在另一个实施方案中，以使sFlt-1多肽的水平小于2ng/ml的剂量，施用治疗性化合物。在包含测量VEGF或PlGF的实施方案中，在施用治疗过程中或之后测得的VEGF或PlGF多肽或核酸的水平相对于治疗之前的值的增加，指示着先兆子痫或子痫的改善。在除了测量可溶内皮糖蛋白以外包含测量sFlt-1、VEGF或PlGF的实施方案中，该方法可以包含，使用度量计算sFlt-1、VEGF或PlGF的水平之间的关系，其中受试者样品中所述水平之间的关系相对于参照样品的变化，是先兆子痫或子痫的诊断指标。这样的度量的一个实例是PAAI。在该实例中，受试者PAAI值的降低(例如，小于20，优选地小于10)指示着先兆子痫或子痫的改善。PAAI的降低(例如，小于20，优选地小于10)也可以指示治疗性化合物的有效剂量。另一个实例是下面的可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数，其中该值的增加是妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的诊断指标。
在与诊断或监控治疗性处理有关的方面的优选的实施方案中，使用免疫学测定(如ELISA)或蛋白印迹测量多肽。可溶内皮糖蛋白的水平可以是游离的、结合的(即，结合在配体上)或总的(即，游离的+结合的)可溶内皮糖蛋白的水平，以及由降解或酶切割产生的可溶内皮糖蛋白的水平。对于任一种监控方法，可以在两个或更多个场合完成水平的测量，且测量之间的水平的变化是先兆子痫或子痫的诊断指标。
在另一个方面，本发明提供了鉴别改善妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的化合物的方法，其包含使表达内皮糖蛋白核酸分子的细胞接触候选化合物，并对比候选化合物接触的细胞中的核酸分子的表达水平和候选化合物未接触的对照细胞中的表达水平，其中内皮糖蛋白核酸分子的表达的变化，将该候选化合物鉴别为可以用于改善妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的化合物。
在另一个方面，本发明提供了鉴别改善妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的化合物的方法，其包含使表达可溶内皮糖蛋白多肽的细胞接触候选化合物，并对比候选化合物接触的细胞中的多肽表达水平和候选化合物未接触的对照细胞中的多肽表达水平，其中可溶内皮糖蛋白多肽的表达的变化，将该候选化合物鉴别为可以用于改善妊娠相关的高血压病症的化合物。在一个实施方案中，使用免疫学测定、酶促测定或免疫测定，测定表达的变化。在一个实施方案中，表达的变化是可溶内皮糖蛋白的水平的降低。表达的变化可以源自转录的变化或翻译的变化。
在另一个方面，本发明提供了鉴别改善妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的化合物的方法，其包含使表达可溶内皮糖蛋白多肽的细胞接触候选化合物，并对比候选化合物接触的细胞中的可溶内皮糖蛋白多肽的生物学活性和候选化合物未接触的对照细胞中的生物学活性水平，其中可溶内皮糖蛋白多肽的生物学活性的变化，将该候选化合物鉴别为可以改善妊娠相关的高血压病症的化合物。在一个实施方案中，变化是可溶内皮糖蛋白的生物学活性的降低，如使用血管生成测定、生长因子结合测定或任一种本文所述的测定所测得的。
在另一个方面，本发明提供了鉴别改善妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的化合物的方法，其包含检测可溶内皮糖蛋白多肽和候选化合物的结合，其中结合可溶内皮糖蛋白多肽的化合物可以用于改善妊娠相关的高血压病症。
在另一个方面，本发明提供了鉴别改善妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的化合物的方法，其包含检测在有候选化合物存在下，可溶内皮糖蛋白多肽和生长因子之间的结合，其中与不存在候选化合物时可溶内皮糖蛋白多肽和生长因子之间的结合相比结合的降低，将该候选化合物鉴别为可以用于改善妊娠相关的高血压病症的化合物。在一个实施方案中，生长因子是TGF-β家族成员。
在另一个方面，本发明提供了鉴别阻止可溶内皮糖蛋白多肽和生长因子之间的结合的多肽的方法。该方法包含，检测在有候选多肽存在下，可溶内皮糖蛋白多肽和生长因子之间的结合，其中与不存在候选多肽时可溶内皮糖蛋白多肽和生长因子之间的结合相比结合的降低，将该候选多肽鉴别为阻止可溶内皮糖蛋白多肽和生长因子之间的结合的多肽。在一个实施方案中，生长因子是TGF-β家族成员。
在一个有关的方面，本发明提供了根据前述方面鉴别出的化合物，其中该化合物是特异性地结合可溶内皮糖蛋白多肽、并阻止可溶内皮糖蛋白多肽结合TGF-β家族成员的多肽。在一个优选的实施方案中，该多肽是结合可溶内皮糖蛋白的抗体，优选地是特异性地结合可溶内皮糖蛋白的抗体。
尽管本文所述的方法具体地提及先兆子痫和子痫，但应当理解，本发明的诊断和监控方法也适用于与高血压有关的一般妊娠并发症，包括但不限于妊娠高血压、HELLP综合征和具有小于胎龄儿(SGA)婴儿的妊娠。
就本发明的目的而言，在下面定义了下列缩写和术语。
“变化”指通过标准的本领域已知的方法，如下面描述的那些，检测的基因或多肽表达水平的变化(提高或降低)。如本文所使用的，变化包括表达水平10％的变化、优选表达水平25％的变化、更优选表达水平40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的变化。“变化”还指本发明任一多肽(例如，可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF)的生物学活性的变化(提高或降低)。如本文所使用的，变化包括生物学活性10％的变化、优选生物学活性25％的变化、更优选生物学活性40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的变化。可溶内皮糖蛋白的生物学活性的实例是血管生成测定和使用已知配体(如活化素-A、BMP 2、BMP-7、TGF-β1和TGF-β3)的结合测定。通过本领域标准的或本文所述的配体结合测定、免疫测定和血管生成测定，可以测量可溶内皮糖蛋白的生物学活性。这样的测定的一个实例是，体外matrigel内皮管形成测定，其中内皮糖蛋白信号传导的拮抗作用导致毛细管形成的大量丧失(Li等，Faseb Journal 14：55-64(2000))。PlGF或VEGF的生物学活性的其它实例包括通过免疫测定、配体结合测定或斯卡查德图分析测得的与受体的结合，以及通过BrdU标记、细胞计数实验、或DNA合成的定量测定(如3H-胸苷掺入)测得的细胞增殖或迁移的诱导。sFlt-1的生物学活性的实例包括通过免疫测定、配体结合测定或斯卡查德图分析测得的与PlGF和VEGF的结合。本文描述了测定每种多肽的生物学活性的其它实例。
“反义核碱基寡聚体”指核碱基寡聚体，不管多长，其与内皮糖蛋白基因的编码链或mRNA互补。“核碱基寡聚体”指包括至少8个核碱基、优选至少12个、且最优选至少16个碱基的链的化合物，它们通过连接基团连接在一起。在此定义中包括天然的和非天然的寡核苷酸，修饰和未修饰的，以及寡核苷酸模拟物，如蛋白核酸、锁定核酸和阿糖核酸。很多核碱基和连接基团都可用于本发明的核碱基寡聚体中，包括在引入本文作为参考的美国专利公开号20030114412(见例如，公开文本的27-45段)和20030114407(见例如，公开文本的35-52段)中描述的那些。所述核碱基寡聚体还可靶向翻译起始和终止位点。优选地，反义核碱基寡聚体包含约8-30个核苷酸。反义核碱基寡聚体还可包含至少40、60、85、120或更多个连续的核苷酸，它们与内皮糖蛋白mRNA或DNA互补，且可像全长mRNA或基因一样长。
“体重指数”指使用身高和体重测量产生的数字，它会给出体重是否属于健康范围的一般信息。通常用于确定体重指数的公式是，以千克计的人体重除以以米计的人身高的平方，或体重(kg)/(身高(m))2。
“化合物”指任意的小分子化合物、抗体、核酸分子、或多肽，或其片段。特别用于本发明的治疗方法的化合物可以使可溶内皮糖蛋白的水平或生物学活性改变(优选地降低)至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
“嵌合抗体”指多肽，其至少含有与另一种蛋白的至少部分相连的抗体分子的抗原结合部分(通常，免疫球蛋白的恒定结构域)。
“双链RNA(dsRNA)”指包含有义和反义链的核糖核酸分子。dsRNA通常用于介导RNA干扰。
“内皮糖蛋白”也称作CD 105，指具有内皮糖蛋白生物学活性的哺乳动物生长因子(见Fonsatti等，Oncogene 22：6557-6563，2003；Fonsatti等，Curr.Cancer Drug Targets 3：427-432，2003)，且与下述GenBank编号中的任一个定义的蛋白同源：AAH29080和NP_031958(小鼠)；AAS67893(大鼠)；NP_000109、P17813、VSP_004233和CAA80673(人)；和A49722(猪)，或记载在美国专利号6,562,957中。内皮糖蛋白是同源二聚体细胞膜糖蛋白，其在来自胎盘的增殖中的血管细胞和合胞体滋养层中高水平地表达。内皮糖蛋白存在两种不同的同工型，L和S，它们的不同之处是在胞质尾的47个氨基酸。两种同工型都包含在本文使用的术语内皮糖蛋白中。内皮糖蛋白结合TGF-β家族成员，且在有TGF-β存在下，内皮糖蛋白可以结合TGF-β信号传导受体RI和RII，并加强对生长因子的响应。内皮糖蛋白生物学活性包含：结合TGF-β家族成员，如活化素-A、BMP 2、BMP-7、TGF-β1和TGF-β3；诱导血管生成，调节细胞增殖、附着、迁移、侵入；和激活内皮细胞。内皮糖蛋白生物学活性的测定是本领域已知的，且包括配体结合测定或斯卡查德图分析；用于测量细胞增殖的BrdU标记、细胞计数实验或DNA合成的定量测定(如3H-胸苷掺入)；和血管生成测定，如在本文或在McCarty等，Intl.J.Oncol.21：5-10，2002；Akhtar等Clin.Chem.49：32-40，2003；和Yamashita等，J.Biol.Chem.269：1995-2001，1994中所述的那些。“可溶内皮糖蛋白”指任何循环的、非膜结合形式的内皮糖蛋白，其至少包括蛋白的胞外部分的部分(见图1)。可溶内皮糖蛋白可以源自蛋白水解酶对膜结合形式的内皮糖蛋白的切割。一个潜在的切割位点是在氨基酸437处，从而产生可溶内皮糖蛋白多肽，其包括内皮糖蛋白多肽的氨基酸1-437(见图2A和2B)。尽管不希望受理论的约束，可溶内皮糖蛋白保留的胞外配体结合结构域可能允许它结合配体如TGF-β1和TGF-β3，从而造成TGF-β的缺乏。另外，由于内皮糖蛋白是内皮特异性的分子，所以TGF-β缺乏可能在内皮细胞中是最大的。可溶内皮糖蛋白也可以包含循环降解产物或片段，其源自内皮糖蛋白的酶切割，且保持内皮糖蛋白生物学活性。现在尚不清楚可溶内皮糖蛋白的生物学功能，但是预测会造成TGF-β和其它已知配体的缺乏。通过测量游离活化素A或游离TGF-β3的水平，或通过使用本领域已知的或本文所述的血管生成测定，可以测定可溶内皮糖蛋白生物学活性。
“内皮糖蛋白核酸”指编码任一种上述的内皮糖蛋白蛋白的核酸。例如，人内皮糖蛋白的基因由14个外显子组成，其中外显子1编码信号肽序列，外显子2-12编码胞外结构域，外显子13编码跨膜结构域，且外显子14编码C-末端胞质结构域(见图1、2A和2B)。合意地，内皮糖蛋白核酸编码可溶内皮糖蛋白(见图2A)。
“表达”指通过标准的本领域已知的方法检测基因或多肽。例如，多肽表达常常通过蛋白印迹检测，DNA表达常常通过DNA印迹或聚合酶链反应(PCR)检测，而RNA表达常常通过RNA印迹、PCR、或RNA酶保护测定检测。
“片段”指多肽或核酸分子的部分。优选地，该部分含有，参照核酸分子或多肽的整个长度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸或氨基酸。优选地，可溶内皮糖蛋白的片段包含4-437个氨基酸和10-1311个核苷酸。
“胎龄”指胎儿龄，其从母亲的最后月经期的第一天开始计起，通常按周计。
“妊娠高血压”指妊娠20周后没有蛋白尿的高血压的发展。
“先兆子痫或子痫的历史”指以前在受试者自身或相关家族成员中诊断的先兆子痫或子痫或妊娠诱发的高血压。
“同源的”指在比较序列的长度上，与已知基因或蛋白序列具有至少30％同源性、更优选40％、50％、60％、70％、80％、且最优选90％或更高同源性的任何基因或蛋白序列。“同源的”蛋白还可具有比较蛋白的至少一种生物学活性。通常，就蛋白而言，比较序列的长度为至少10个氨基酸，优选地20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400个或至少437个氨基酸或更多。就核酸而言，比较序列的长度通常为至少25、50、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200或至少1311个核苷酸或更多。“同源性”还指用于产生抗体的表位与抗体针对的蛋白或其片段之间的相当大相似性。在该情况下，同源性指足以引发可以特异性地识别讨论中的蛋白的抗体产生的相似性。
“人源化抗体”指能够结合预定抗原的免疫球蛋白氨基酸序列变体或其片段。通常，抗体包含轻链和重链的至少可变结构域。抗体还可以包含重链的CH1、铰链、CH2、CH3或CH4区。人源化抗体包含主要具有人免疫球蛋白氨基酸序列的构架区(FR)和主要具有非人免疫球蛋白氨基酸序列(“输入”序列)的互补性决定区(CDR)。
通常，人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。通常，人源化抗体基本上包含至少一个、且通常两个可变结构域(Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Fv)的全部，其中全部或基本上全部CDR区与非人免疫球蛋白的那些相对应，且全部或基本上全部FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最优地将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少部分，通常是人免疫球蛋白恒定区的部分。“互补性决定区(CDR)”指在每个免疫球蛋白轻链和重链中的可变区的3个高变序列。“构架区(FR)”指位于免疫球蛋白轻链和重链的3个高变序列(CDR)的任一侧的氨基酸序列。
人源化抗体的FR和CDR区不需要与亲代序列准确对应，例如，输入CDR或共有FR可以通过置换、插入或缺失至少一个残基来诱变，从而使得在该位点的CDR或FR残基不与共有或输入抗体相对应。然而，这种突变将不是广泛的。通常，至少75％、优选90％、且最优选95％的人源化抗体残基将与亲代FR和CDR序列的残基相对应。
“杂交”指在各种严格性条件下，在互补多核苷酸序列或其部分之间配对以形成双链分子(见，例如，Wahl和Berger，MethodsEnzymol.152：399，1987；Kimmel，Methods Enzymol.152：507，1987)。例如，严格的盐浓度通常低于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，优选低于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，且最优选低于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。低严格性杂交可在没有有机溶剂(例如甲酰胺)存在的条件下获得，而高严格性杂交可在有至少约35％甲酰胺、且最优选至少约50％甲酰胺存在下获得。严格的温度条件通常包括至少约30℃、更优选至少约37℃、且最优选至少约42℃的温度。各种其它参数，如杂交时间，去污剂如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度，以及包含或不包含载体DNA，都是本领域技术人员熟知的。通过根据需要组合这些不同条件，实现各种严格性水平。在一个优选的实施方案中，杂交在30℃，在750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠和1％SDS中进行。在一个更优选的实施方案中，杂交在37℃，在500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑精DNA(ssDNA)中进行。在一个最优选的实施方案中，杂交在42℃，在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中进行。对这些条件的有用变化对于本领域技术人员是显而易见的。
对于绝大多数应用而言，杂交之后的洗涤步骤还可在严格性方面有变化。洗涤严格性条件可由盐浓度和温度来限定。如上所述，洗涤严格性可通过降低盐浓度或提高温度来提高。例如，洗涤步骤的严格盐浓度优选低于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠，且最优选低于约15mM NaCl和1.5mM柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格温度条件通常包含至少约25℃、更优选至少约42℃、且最优选至少约68℃的温度。在一个优选的实施方案中，洗涤步骤将在25℃，在30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。在一个更优选的实施方案中，洗涤步骤将在42℃，在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。在一个最优选的实施方案中，洗涤步骤将在68℃，15mMNaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。这些条件的其它变化对于本领域技术人员是显而易见的。杂交技术是本领域技术人员熟知的，且在下面描述，例如Benton和Davis(Science 196：180，1977)；Grunstein和Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 72：3961，1975)；Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology，WileyInterscience，New York，2001)；Berger和Kimmel(Guide to MolecularCloning Techniques，1987，Academic Press，New York)；和Sambrook等，Molecular Cloizing：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York。
“子宫内发育迟缓(IUGR)”指导致出生重量比胎儿胎龄的预测胎儿重量低10％的综合征。目前世界卫生组织(World HealthOrganization)有关低出生重量的标准是重量低于2,500gm(5 lbs.8oz.)，或根据美国通过种族、经产数和婴儿性别得出的胎龄出生重量表，低于胎龄的第10百分位(Zhang和Bowes，Obstet.Gynecol 86：200-208，1995)。这些低出生重量的婴儿还被称作“小于胎龄儿(SGA)”。已知先兆子痫是与IUGR或SGA有关的状况。
“度量”指一种测量。度量可用于，例如，比较目标多肽或核酸分子的水平。示例性的度量包含但不限于，数学公式或算法，如比率。所用度量是这样的，其可最好地区别患有妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的受试者与正常对照受试者之间的可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF、PlGF的水平，或其任意组合。根据所用度量，妊娠相关的高血压病症的诊断指标可明显高于或低于参照值(例如，与未患妊娠相关的高血压病症的对照受试者相比)。通过测量游离的、结合的(即，结合于生长因子)或总的(即，游离的+结合的)可溶内皮糖蛋白的量，可以确定可溶内皮糖蛋白水平。通过测量游离的、结合的(即，结合于生长因子)或总的sFlt-1(游离的+结合的)的量，可以测量sFlt-1水平。通过测量游离PlGF或游离VEGF(即，未结合于sFlt-1)的量，可以确定VEGF或PlGF水平。一个示例性的度量是[sFlt-1/(VEGF+PlGF)]，也称作先兆子痫抗血管生成指数(PAAI)。另一个实例是下面的可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数：(sFlt-1+0.25(可溶内皮糖蛋白多肽))/PlGF。可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数的值的增加，是先兆子痫或子痫的诊断指标。另一个示例性的度量如下：  (可溶的内皮糖蛋白(enodglin)+sFlt-1)/PlGF。本发明的任一个度量还可以包含母亲的BMI或婴儿的GA。
“先兆子痫抗血管生成指数(PAAI)”指用作抗血管生成活性的指标的sFlt-1/VEGF+PlGF比率。大于10、更优选地大于20的PAAI，是妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或先兆子痫的危险)的指示。
“可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数”指(sFlt-1+0.25可溶内皮糖蛋白)/PlGF比率。例如，75或更高、优选地100或更高、或更优选地200或更高的值，是与高血压有关的妊娠并发症(如先兆子痫或子痫)的指示。
“可操作地连接的”指在适宜的分子(例如，转录激活物蛋白)与调节序列结合时，基因和调节序列以允许基因表达的方式连接。
“药学上可接受的载体”指对于所治疗的哺乳动物而言生理学上可接受的且仍然保留与其一起施用的化合物的治疗性质的载体。一种示例性的药学上可接受的载体物质是生理盐水。其它生理学上可接受的载体和它们的制剂是本领域技术人员已知的，且在下列文献中描述，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，(第20版)，ed.A.Gennaro，2000，Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia，PA。
“胎盘生长因子(PlGF)”指哺乳动物生长因子，它与GenBank编号P49763限定的蛋白同源，且具有PlGF生物学活性。PlGF是属于VEGF家族的糖基化同源二聚体，且可通过可变剪接机理以两个不同的同工型发现。PlGF由胎盘中的细胞滋养层及合胞体滋养层表达，且PlGF生物学活性包含诱导内皮细胞(特别是滋养层细胞)的增殖、迁移及活化。
“多态性”指可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、PlGF或VEGF核酸分子中的基因变异、突变、缺失或添加，它是发展先兆子痫或子痫的素因的指示。这样的多态性是熟练的技术人员已知的，且记载在，例如，Raab等(Biochem.J.339：579-588，1999)和Parry等(Eur.JImmunogenet.26：321-323，1999)。多态性可以存在于基因的启动子序列、可读框、内含子序列或非翻译3′区中。内皮糖蛋白基因的这样的多态性的已知实例包括内含子7中的6碱基GGGGGA插入，在外显子7的3′末端以外的26个碱基处(Ann.Neurol.41：683-6，1997)。
“妊娠相关的高血压病症”指与血压升高有关或特征在于血压升高的任何状况或疾病或妊娠。这些状况中包括先兆子痫(包括过早先兆子痫、重度先兆子痫)、子痫、妊娠高血压、HELLP综合征(溶血、升高的肝酶、低血小板)、胎盘分离(abruption placenta)、慢性高血压、具有子宫内发育限制的妊娠和具有小于胎龄儿(SGA)婴儿的妊娠。应当指出，尽管具有SGA婴儿的妊娠并非经常与高血压有关，但它也包含在该定义中。
“先兆子痫”指多系统病症，其特征在于具有蛋白尿或水肿或两者的高血压、肾小球功能障碍、脑水肿、肝水肿或凝结异常，这是由于妊娠或新近妊娠的影响。所有形式的先兆子痫，如过早的、轻度的、中度的和重度先兆子痫，都包含在该定义中。先兆子痫通常发生在妊娠第20周后。先兆子痫通常被定义为下列症状的一些组合：(1)妊娠20周后，收缩血压(BP)＞140mmHg且舒张BP＞90mmHg(通常测量2次，间隔4-168小时)，(2)新发作的蛋白尿(利用测验片进行尿分析为1+，24-小时尿收集中的蛋白＞300mg，或单次随机的尿样品的蛋白/肌酸酐比＞0.3)，和(3)产后12周高血压及蛋白尿消除。重度先兆子痫通常被定义为：(1)舒张BP＞110mmHg(通常测量2次，间隔4-168小时)或(2)蛋白尿，其特征在于24-小时尿收集中的蛋白测量值为3.5g或更高，或利用测验片测量，2份随机的尿样品具有至少3+蛋白。在先兆子痫中，高血压和蛋白尿通常彼此在7天内发生。在重度先兆子痫中，可同时出现严重高血压、严重蛋白尿和HELLP综合征(溶血、升高的肝酶、低血小板)或子痫，或每次仅出现一个症状。HELLP综合征的特征在于血小板减少症(＜100000细胞/μl)、提高的LDH(＞600IU/L)和提高的AST(＞70IU/L)的迹象。有时候，重度先兆子痫可导致癫痫发作的发展。这种严重的综合征形式被称作“子痫”。子痫还可包含几种器官或组织的功能障碍或损害，如肝脏(例如，肝细胞损害、门管周坏死)和中枢神经系统(例如，脑水肿和脑出血)。认为癫痫发作的病因是由脑水肿和肾脏小血管病灶痉挛发展继发的。
“过早先兆子痫”指在＜37周或＜34周发作症状的先兆子痫。
“蛋白”或“多肽”或“多肽片段”指任何多于2个氨基酸的链，不管翻译后的修饰(例如，糖基化或磷酸化)，其构成天然存在的多肽或肽的全部或部分，或构成非天然存在的多肽或肽。
“参照样品”指用于比较目的的任何样品、标准或水平。“正常的参照样品”可以是从相同受试者采取的在先样品，来自不患有任何妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的妊娠受试者的样品，来自不患有妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的妊娠受试者的样品，妊娠且在妊娠早期(例如，在前三个月或次三个月，或在检测到妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)之前)采取样品的受试者，妊娠且不具有妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)历史的受试者，未妊娠的受试者，在已知正常浓度(即，不指示妊娠相关的高血压病症，如先兆子痫或子痫)的纯化参照多肽的样品。“参照标准或水平”指源自参照样品的值或数字。正常的参照标准或水平可以是源自正常受试者的值或数字，所述正常受试者与样品受试者在至少一项下面的标准方面匹配：胎儿的胎龄、母亲年龄、妊娠之前的母亲血压、妊娠过程中的母亲血压、母亲的BMI、胎儿体重、先兆子痫或子痫的以前诊断和先兆子痫或子痫的家族史。“阳性参照”样品、标准或值是源自已知患有妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的受试者的样品或值或数字，所述受试者与样品受试者在至少一项下面的标准方面匹配：胎儿的胎龄、母亲年龄、妊娠之前的母亲血压、妊娠过程中的母亲血压、母亲的BMI、胎儿体重、妊娠相关的高血压病症的以前诊断和妊娠相关的高血压病症的家族史。
“降低或抑制”指通过前述测定(见“表达”)检测的，与未处理的样品相比，引起蛋白或核酸水平共降低优选20％或更多、更优选40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的变化的能力。
“样品”指组织活组织检查、细胞、体液(例如，血液、血清、血浆、尿、唾液、羊水或脑脊液)或从受试者得到的其它样品。合意地，生物样品包括可溶内皮糖蛋白核酸分子或多肽或二者。
“小干扰RNA(siRNA)”指分离的dsRNA分子，优选长度超过10个核苷酸(nt)，更优选长度超过15个核苷酸，且最优选长度超过19个核苷酸，其用于鉴别将要降解的靶基因或mRNA。19-25个核苷酸是siRNA的最优选大小。siRNA还可包含短发夹RNA，其中siRNA双链体的两个链都包含在单一RNA分子中。siRNA包含任何形式的dsRNA(更大dsRNA的蛋白酶剪切产物、部分纯化的RNA、基本纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA)，以及与天然存在的RNA不同之处在于一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换和/或变化的改变的RNA。这种改变可包含非-核苷酸物质的添加，例如向19、20、21、22、23、24或25nt RNA的末端添加或内部添加(在RNA的一个或多个核苷酸上)。在优选的实施方案中，RNA分子包含3′羟基。本发明RNA分子中的核苷酸还可包含非链的核苷酸，包括非天然存在的核苷酸或脱氧核糖核苷酸。共同地，将所有这种改变的RNA称作RNA的类似物。本发明的siRNA只需与具有介导RNA干扰(RNAi)的能力的天然RNA充分相似。如本文所使用的，RNAi指通过向细胞或生物中引入小干扰RNA或dsRNA所致的特定mRNA分子的ATP-依赖性的靶向切割和降解。如本文所使用的，“介导RNAi”指区别或鉴别要降解哪个RNA的能力。
“可溶内皮糖蛋白结合分子”指特异性地结合可溶内皮糖蛋白多肽的蛋白或小分子化合物。可溶内皮糖蛋白结合分子可以是，例如，抗体、抗体相关肽、可溶内皮糖蛋白结合抗体的一个或多个CDR区或可溶内皮糖蛋白相互作用蛋白。
“可溶的Flt-1(sFlt-1)”(也称作sVEGF-R1)指可溶形式的Flt-1受体，其与GenBank编号U01134定义的蛋白同源，且具有sFlt-1生物学活性。sFlt-1多肽的生物学活性可使用任何标准方法测定，例如，通过测定与VEGF结合的sFlt-1。sFlt-1缺少Flt-1受体的跨膜结构域和胞质酪氨酸激酶结构域。sFlt-1可以以高亲和力结合VEGF和PlGF，但不能诱导增殖或血管生成，并因此与Flt-1和KDR受体在功能上有所不同。sFlt-1最初从人脐内皮细胞纯化，且随后表明在体内由滋养层细胞产生。如本文所使用的，sFlt-1包含任何sFlt-1家族成员或同工型。sFlt-1也可以指源自Flt-1受体的酶切割且保留sFlt-1生物学活性的降解产物或片段。在一个实例中，从胎盘释放出的特定金属蛋白酶可以切割Flt-1受体的胞外结构域，以将Flt-1 N-末端部分释放到循环中。
“特异性地结合”指识别并结合本发明的多肽、但基本上不识别并结合样品(例如生物学样品)中的其它分子的化合物或抗体，其自然包含本发明的多肽。在一个实例中，特异性地结合可溶内皮糖蛋白的抗体不结合膜结合的内皮糖蛋白。在另一个实例中，特异性地结合可溶内皮糖蛋白的抗体识别内皮糖蛋白的氨基酸1-437内的区域，所述区域是可溶内皮糖蛋白独有的，而全长内皮糖蛋白没有。
“受试者”指哺乳动物，包括但不限于，人或非人哺乳动物，如牛、马、绵羊、猪、山羊、狗或猫。在该定义中包含妊娠的、产后的和未妊娠的哺乳动物。
“基本上相同”指，当最佳地比对时，例如，使用下述的方法，与第二个核酸或氨基酸序列(例如，内皮糖蛋白或可溶内皮糖蛋白序列)共有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸或氨基酸序列。“相当大的同一性”可以用于指各种类型和长度的序列，如全长序列、表位或免疫原性肽、功能结构域、编码和/或调节序列、外显子、内含子、启动子和基因组序列。通过属于本领域技术范围内的各种方式，可以确定两个多肽或核酸序列之间的百分比同一性，例如，使用可公开得到的计算机软件，如Smith Waterman Alignment(Smith，T.F.和M.S.Waterman(1981)J Mol Biol 147：195-7)；包含在GeneMatcher PlusTM中的“BestFit”(Smith和Waterman，Advancesin Applied Mathematics，482-489(1981))，Schwarz和Dayhof(1979)Atlas of Protein Sequence and Structure，Dayhof，M.O.，Ed pp353-358；BLAST程序(Basic Local Alignment Search Tool；(Altschul，S.F.，W.Gish，等(1990)J Mol Biol 215：403-10)，BLAST-2，BLAST-P，BLAST-N，BLAST-X，WU-BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2，CLUSTAL，或Megalign(DNASTAR)软件。另外，本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在对比的序列长度上达到最大比对所需的任何算法。通常，就蛋白而言，对比序列的长度是至少10个氨基酸，优选地20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400或至少437个氨基酸或更多。就核酸而言，对比序列的长度通常是至少25、50、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200或至少1311个核苷酸或更多。应当理解，为了确定序列同一性的目的，当对比DNA序列和RNA序列时，胸腺嘧啶核苷酸相当于尿嘧啶核苷酸。保守置换通常包含下列组内的置换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
“先兆子痫的症状”指下列任何一个：(1)妊娠20周后，收缩血压(BP)＞140mmHg且舒张BP＞90mmHg，(2)新发作的蛋白尿(利用测验片进行尿分析为1+，24小时尿收集中的蛋白＞300mg，或随机尿的蛋白/肌酸酐比＞0.3)，和(3)产后12周高血压及蛋白尿消除。先兆子痫的症状还可包含肾功能障碍和肾小球内皮增生或肥大。“子痫的症状”指由于妊娠或新近妊娠的影响所致的下列症状中任何一个的发展：癫痫发作、昏迷、血小板减少症、肝水肿、肺水肿和脑水肿。
“转化生长因子β(TGF-β)”指哺乳动物生长因子，其具有TGF-β生物学活性，且是在脊椎动物中普遍存在的结构上有关的旁分泌多肽家族的成员，且是后生动物生长、分化和形态发生因子大家族的原型(综述见，Massaque等Ann Rev Cell Biol 6：597-641(1990)；Massaque等Trends Cell Biol 4：172-178(1994)；Kingsley Gene Dev.8：133-146(1994)；和Sporn等J Cell Biol 119：1017-1021(1992)。如上面的Kingsley所述，TGF-β超家族具有至少25个成员，且可以分成具有高度相关序列的不同亚家族。最明显的亚家族包含下面的：TGF-β亚家族，其包含至少4个与TGF-β1的相似性比与TGF-β超家族的其它成员更高的基因；活化素亚家族，其包含同源-或异源-二聚体或两个亚基抑制素β-A和抑制素β-B。包括哺乳动物因子BMP2和BMP4的decapentaplegic亚家族，当植入皮下或肌肉中时，可以诱导异位骨和软骨的形成。包括许多哺乳动物同源物成员的60A亚家族具有骨诱导活性，包括BMP5-8。TGF-β超家族的其它成员包括总分化因子1(GDF-1)、GDF-3/VGR-2、背蛋白、结节的(nodal)、苗勒氏(mullerian)抑制物质(MIS)和神经胶质衍生的神经营养生长因子(GDNF)。应当指出，DPP和60A亚家族的彼此相关性比与TGF-β超家族的其它成员的相关性更紧密，且经常一起归入称作DVR(dpp和vg1相关的)的更大分子集合的部分。除非在它使用的上下文中可以看出，在贯穿本说明书中使用的术语TGF-β应当理解为，通常指适合的TGF-β超家族的成员(Massague等，Annu.Rev.Biochem.67：753-91，1998；Josso等，Curr.Op.Gen.Dev.，7：371-377，1997)。TGF-β起调节许多细胞类型的生长、分化、运动性、组织重建、神经发生、创伤修复、细胞凋亡和血管生成的功能。TGF-β也抑制许多细胞类型的细胞增殖，并可以刺激基质蛋白的合成。
“治疗量”指施用给患有先兆子痫或子痫的患者时，足以引起本文所述先兆子痫或子痫症状的定性或定量减轻的量。“治疗量”还指当施用给患有先兆子痫或子痫的患者时，如通过本文所述的测定测得的，足以引起内皮糖蛋白或sFlt-1表达水平降低、或VEGF或PlGF表达水平提高的量。
“治疗”指为了治疗目的，施用化合物或药物组合物。“治疗疾病”或用于“治疗性处理”指给已经患病的受试者施用治疗，以改善受试者状况。优选地，基于下述任何一个特征症状的鉴别，或使用本文所述的诊断方法，诊断受试者患有与高血压有关的妊娠并发症，如先兆子痫或子痫。“预防疾病”指预防性地处理还没有发病，但易感或另外有发展特定疾病危险的受试者。优选地，使用本文所述的诊断方法，确定受试者有发展先兆子痫或子痫的危险。因此，在权利要求和实施方案中，治疗是为了治疗或预防目的而施用于哺乳动物的。
“滋养层”指覆盖胚泡的中外胚层细胞层，其侵蚀子宫粘膜，且胚胎通过它从母体接受营养；该细胞有助于胎盘的形成。
“血管内皮生长因子(VEGF)”指哺乳动物生长因子，其与美国专利号5,332,671；5,240,848；5,194,596；和Charnock-Jones等(Biol.Reproduction，48：1120-1128，1993)中定义的生长因子同源，且具有VEGF生物学活性。VEGF以糖基化同源二聚体的形式存在，且包含至少4种不同的可变剪接的同工型。天然VEGF的生物学活性包括，促进血管内皮细胞或脐静脉内皮细胞的选择性生长，并诱导血管生成。如本文所使用的，VEGF包含任何VEGF家族成员或同工型(例如，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF189、VEGF165或VEGF121)。优选地，VEGF是VEGF121或VEGF165同工型(Tischer等，J.Biol.Chem.266，11947-11954，1991；Neufed等，Cancer Metastasis 15：153-158，1996)，其在引入本文作为参考的美国专利号6,447,768；5,219,739；和5,194,596中描述。还包含VEGF的突变体形式，如在Gille等(J.Biol.Chem.276：3222-3230，2001)中描述的KDR-选择性VEGF和Flt-选择性VEGF。如本文所使用的，VEGF也包括任何修饰形式的VEGF，如LeCouter等(Science 299：890-893，2003)所述的那些。虽然优选人VEGF，但本发明不限于人形式，且包含VEGF的其它动物形式(例如，小鼠、大鼠、狗或鸡)。
“载体”指DNA分子，其通常来源于质粒或噬菌体，向其中可插入或克隆DNA片段。重组载体将包含一个或多个独特的限制位点，且能够在规定的宿主或载体生物中自主复制，从而使得克隆的序列可复制。载体包含与基因或编码区可操作地连接的启动子，这样，转染进受体细胞后，可表达RNA。
从其优选实施方案的下列描述以及权利要求中，可以明白本发明的其它特征和优点。
附图简述
本专利或申请文件含有至少一份彩色绘制的附图。在请求并支付必需的费用后，专利局会提供本专利或专利申请公开文件的具有彩色附图的副本。
图1是显示内皮糖蛋白蛋白的示意图。SP：信号肽，ZP：透明带结构域，CL：潜在切割位点(氨基酸437)，以释放可溶内皮糖蛋白，TM：跨膜结构域，Cyto：胞质结构域。
图2A显示了可溶内皮糖蛋白的预测的cDNA序列(SEQ ID NO：1)。图2B显示了可溶内皮糖蛋白的预测的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图3是显示来自正常妊娠的胎盘(N)、来自轻度先兆子痫妊娠的胎盘(p)和来自重度先兆子痫妊娠的胎盘(P)的内皮糖蛋白mRNA水平的RNA印迹。
图4是显示胎盘中的内皮糖蛋白蛋白水平的蛋白印迹。样品来自两个先兆子痫患者p32和p36，其在2003呈递给Beth Israel DeaconessMedical Center，且产妇血清来自妊娠妇女。使用从Santa CruzBiotechnology，Inc.，(Santa Cruz，CA)得到的N-末端抗体，探测蛋白印迹，其显示了胎盘中的110kD带和存在于胎盘和血清样品中的更小的63kD带。
图5中的图显示了可溶内皮糖蛋白在具有正常妊娠、轻度先兆子痫、重度先兆子痫和并发早产的无先兆子痫妊娠的妇女中的循环浓度。在分娩前24小时内，得到所有血液样品。使用购自R&DSystems，MN(目录号DNDG00)的ELISA试剂盒，测量可溶内皮糖蛋白。这些数据表明，在临床疾病时，先兆子痫患者中的可溶内皮糖蛋白水平显著升高。
图6中的图显示了在各个胎龄组窗口期间，5个不同研究组的妊娠妇女在整个妊娠中的平均可溶内皮糖蛋白浓度。
图7中的图显示了在各个胎龄组窗口期间，5个不同研究组的妊娠妇女在整个妊娠中的平均sFlt1浓度。
图8中的图显示了在各个胎龄组窗口期间，5个不同研究组的妊娠妇女在整个妊娠中的平均PlGF浓度。
图9中的图显示了在临床症状之前采取的样品的先兆子痫抗血管生成的可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数值。
图10中的图显示了根据临床过早的先兆子痫(PE＜37周)之前的周数的可溶内皮糖蛋白的平均浓度。
图11中的图显示了根据临床过早的先兆子痫(PE＜37周)之前的周数的可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数值。
图12中的图显示了对于在症状之前和之后的足孕先兆子痫(PE＞37周)，整个妊娠过程中的可溶内皮糖蛋白水平的变化。
图13中的图显示了对于在症状之前和之后的足孕先兆子痫(PE＞37周)，整个妊娠过程中的可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数水平的变化。
图14中的图显示了在妊娠高血压期间和在妊娠高血压之前(妊娠高血压前1-5周(在妊娠的33-36周))的妇女和血压正常对照中测得的可溶内皮糖蛋白水平。
图15中的图显示了在妊娠高血压期间和在妊娠高血压之前(妊娠高血压前1-5周(在妊娠的33-36周))的妇女和血压正常对照中测得的可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数水平。
图16中的图显示了在33-36周妊娠窗口期间，在患有重度SGA、轻度SGA的妇女和血压正常对照中测得的可溶内皮糖蛋白水平。
图17中的图显示了在33-36周妊娠窗口期间，在患有重度SGA、轻度SGA的妇女和血压正常对照中测得的可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数水平。
图18中的图显示了相同妊娠患者中的sFlt1和可溶内皮糖蛋白的浓度的彼此关系图。
图19显示了在25.2周采取的先兆子痫胎盘的内皮糖蛋白(红色)和平滑肌肌动蛋白(绿色)的双免疫荧光染色的显微照片。用于检测内皮糖蛋白的抗体将全长内皮糖蛋白和可溶内皮糖蛋白都染色。适当的妊娠窗口的对照胎盘源自早产患者。
图20显示了在41.3周采取的先兆子痫胎盘的内皮糖蛋白(红色)和平滑肌肌动蛋白(绿色)的双免疫荧光染色的显微照片。用于检测内皮糖蛋白的抗体将全长内皮糖蛋白和可溶内皮糖蛋白都染色。适当的妊娠窗口的对照胎盘源自早产患者。
图21A是使用先兆子痫胎盘和血清两者进行内皮糖蛋白的免疫沉淀法和蛋白印迹实验得到的放射自显影图照片。图21B是使用先兆子痫胎盘进行内皮糖蛋白的免疫沉淀法和蛋白印迹实验得到的放射自显影图照片。3种不同的N和P样品代表着单个的患者。就两幅图而言，使用商业上可得到的单克隆抗体进行免疫沉淀法，并使用多克隆抗体进行蛋白印迹。产生的这两种抗体都针对内皮糖蛋白蛋白的N-末端区，并检测全长和截短的可溶内皮糖蛋白蛋白两者。
图22中的图显示了使用在生长因子减少的matrigel中的HUVEC进行血管生成测定的结果。在有可溶内皮糖蛋白或sFlt1或二者存在下，进行血管生成测定，并定量内皮管长度。C-代表对照，E-代表1μg/ml的可溶内皮糖蛋白，且S代表1μg/ml的sFlt1。E+S代表1μg/mlE+1μg/ml sFlt1的组合。数据代表着3个独立实验的平均值。
图23中的图显示了如材料和方法中所述，使用伊文思蓝(Evansblue)泄漏，在小鼠中评估的几种器官床中的微血管通透性。C-对照(GFP)，E-可溶内皮糖蛋白，S-sFlt1，且S+E-sFlt1+可溶内皮糖蛋白。数据代表着4个独立实验的平均值。
图24中的图显示了在有剂量范围为200pg/ml-200ng/ml的TGF-β1(B1)和TGF-β3(B3)存在下，进行微血管反应性实验的大鼠肾微血管直径的百分比变化。在有1μg/ml可溶内皮糖蛋白(E)存在下，重复这些相同的实验。显示的这些数据代表着4个独立实验的平均值。
图25中的图显示了在有1ng/ml VEGF(V)、TGF-β1(B1)和组合(V+B1)存在下，肾微血管的血管直径的百分比变化。还显示了在有各1μg/ml的sFlt1(S)和可溶内皮糖蛋白(E)(V+B1+S+E)存在下，该组合的作用。数据代表着4个独立实验的平均值。
图26A是在处死时从注射了sFlt1和对照腺病毒(CMV)的组合的妊娠大鼠采取的血液样品的外周涂片的照片。图26B是在处死时从注射了sFlt1和表达可溶内皮糖蛋白的腺病毒的组合的妊娠大鼠采取的血液样品的外周涂片的照片，并表现出活性溶血，如由裂红细胞和升高的网状细胞计数所证实的。箭头代表裂红细胞。
图27A-D的一系列显微照片显示了表8所述的各种动物组的肾组织学(H&E染色)。图27A显示了对照组的肾组织学，没有肾小球内皮增生的迹象。图27B显示了可溶内皮糖蛋白注射组的肾组织学，没有肾小球内皮增生的迹象。图27C显示了sFlt1注射的大鼠的肾组织学，显示出中等内皮增生(用箭头指示)。图27D显示了可溶内皮糖蛋白和sFlt1注射的大鼠的肾组织学，显示出非常肿胀的肾小球和严重的肾小球内皮增生，在足细胞内存在蛋白再吸收小滴。在60X(原始放大率)拍摄所有光显微照片。
详细描述
我们已经发现，在从患有妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的妇女采集的血清样品中，可溶内皮糖蛋白水平提高。可溶内皮糖蛋白可以由蛋白水解酶切割膜结合形式的胞外部分来形成。过量的可溶内皮糖蛋白可以耗尽胎盘的必需量的这些必需的血管生成和促有丝分裂因子。因而，可溶内皮糖蛋白是妊娠相关的高血压病症(包括先兆子痫和子痫)的极好的诊断标记。此外，我们已经发现，干扰可溶内皮糖蛋白结合生长因子的治疗剂，降低可溶内皮糖蛋白表达或生物学活性的试剂，或提高生长因子的水平的试剂，可以用于治疗或预防受试者的妊娠相关的高血压病症，如先兆子痫或子痫。这类试剂包含，但不限于，可溶内皮糖蛋白的抗体，降低可溶内皮糖蛋白的水平的反义或RNAi的寡核苷酸，提高生长因子的水平的化合物，阻止膜结合形式的内皮糖蛋白的蛋白酶剪切、从而预防可溶内皮糖蛋白的释放的化合物，和结合可溶内皮糖蛋白并封闭生长因子结合位点的小分子。本发明也涉及测量可溶内皮糖蛋白的水平的方法，作为妊娠相关的高血压病症(包括先兆子痫和子痫)的早期诊断和控制的检测工具。
尽管本文提供的详细描述具体地涉及可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF，但本领域技术人员会明白，该详述也应用于可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF的家族成员、同工型和/或变体。
诊断学
本发明涉及基于检测可溶内皮糖蛋白的测定，以检测妊娠相关的高血压病症，如先兆子痫、子痫，或发展这样状况的倾向。尽管本文所述的方法具体地涉及先兆子痫和子痫，但应当理解，本发明的诊断和监控方法适用于任何妊娠相关的高血压病症，包括但不限于，妊娠高血压、具有小于胎龄儿(SGA)婴儿的妊娠、HELLP、慢性高血压、先兆子痫(轻度、中度和重度)和子痫。
在受试者样品中测量内皮糖蛋白的水平，无论是游离的、结合的还是总的水平，并将其用作先兆子痫、子痫或发展这样状况的倾向的指标。
患有先兆子痫、子痫或发展这样状况的倾向的受试者，会表现出可溶内皮糖蛋白多肽的表达的增加。可溶内皮糖蛋白多肽可包含全长可溶内皮糖蛋白、降解产物、可溶内皮糖蛋白的可变剪接的同工型、可溶内皮糖蛋白的酶切割产物等。特异性地结合可溶内皮糖蛋白多肽的抗体，可以用于诊断先兆子痫或子痫，或鉴别处于发展这样状况的危险中的受试者。在本发明的方法中有用的抗体的一个实例是针对内皮糖蛋白的N-末端区的单克隆抗体，其在商业上可从Santa CruzBiotechnology，Inc.(目录号sc-20072)得到。已知许多种测量这样的多肽的表达中的变化的规程，包括免疫学方法(如ELISA和RIA)，且其提供诊断先兆子痫或子痫或发展这样状况的危险的基础。另外，可溶内皮糖蛋白多肽水平的提高，可诊断患有先兆子痫、子痫或发展这样状况的倾向的受试者。
升高水平的可溶内皮糖蛋白是先兆子痫或子痫的阳性指标。例如，如果可溶内皮糖蛋白的水平相对于参照升高(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)，则认为这是先兆子痫或子痫的阳性指标。另外，可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF的水平相对于正常水平的任何可检测的变化，是子痫、先兆子痫或发展这样状况的倾向的指示。通常，在非妊娠状态期间，可溶内皮糖蛋白的循环血清浓度范围是2-7ng/ml，而在正常妊娠期间，是10-20ng/ml。认为升高的可溶内皮糖蛋白的血清水平(大于15ng/ml、优选地大于20ng/ml、且最优选地大于25ng/ml或更高)，是先兆子痫的阳性指标。
在一个实施方案中，与sFlt-1、VEGF或PlGF多肽或核酸的水平、或其任意组合结合，测量可溶内皮糖蛋白的水平。测量sFlt-1、VEGF和PlGF的方法，记载在这里整体引作参考的PCT公开号WO2004/008946和美国公开号20040126828中。在其它优选的实施方案中，还测量体重指数(BMI)和胎儿的胎龄，并包括诊断度量。
在一个实施方案中，使用包含可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF、或其中的任意组合的度量，来确定至少两种蛋白的水平之间的关系是否可指示先兆子痫或子痫。在一个实例中，度量是PAAI(sFlt-1/VEGF+PlGF)，其与可溶内皮糖蛋白测量结合，用作抗血管生成指数，后者可诊断先兆子痫、子痫或发展这样状况的倾向。如果可溶内皮糖蛋白的水平相对于参照样品升高(例如，1.5倍、2倍、3倍、4倍或甚至高达10倍或更高)，且PAAI大于10、更优选地大于20，则认为受试者患有先兆子痫、子痫，或处于发展它们的迫切危险中。PAAI(sFlt-1/VEGF+PlGF)比率仅仅是可以用作诊断指标的有用度量的一个实例。它无意限制本发明。实际上，可以检测受试者中相对于正常对照的可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、PlGF或VEGF的水平的变化或其任意组合的任何度量，都可以用作诊断指标。另一个实例是下面的可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数：(sFlt-1+0.25(可溶内皮糖蛋白多肽))/PlGF。可溶内皮糖蛋白度量的该值的增加，是先兆子痫或子痫的诊断指标。超过100、优选地超过200的可溶内皮糖蛋白指数是先兆子痫或子痫的诊断指标。另一个实例是下面的指数：(可溶内皮糖蛋白+sFlt-1)/PlGF。该指数还可以包含母亲的BMI或婴儿的GA。
标准方法可用于测量任何体液(包含但不限于，尿、血清、血浆、唾液、羊水或脑脊液)中的可溶内皮糖蛋白、VEGF、PlGF或sFlt-1多肽的水平。这类方法包含免疫测定，ELISA，使用针对可溶内皮糖蛋白、VEGF、PlGF或sFlt-1的抗体的蛋白印迹，以及定量酶免疫测定技术，如Ong等(Obstet.Gynecol.98：608-611，2001)和Su等(Obstet.Gynecol.，97：898-904，2001)描述的那些。ELISA测定是测量可溶内皮糖蛋白、VEGF、PlGF或sFlt-1的水平的优选方法。优选地，测量可溶内皮糖蛋白。
源自内皮糖蛋白、sFlt-1、PlGF或VEGF核酸序列的寡核苷酸或更长的片段，可以用作探针，来不仅监控表达，而且鉴别具有内皮糖蛋白、sFlt-1、PlGF或VEGF核酸分子的遗传性变异、突变或多态性的受试者，这些是发展先兆子痫或子痫的素因的指示。这些多态性可以影响核酸或多肽表达水平或生物学活性。这样的多态性是熟练的技术人员已知的且记载在，例如，上面的Raab等和Parry等(Eur.JImmunogenet.26：321-3，1999)。例如，已经描述了内皮糖蛋白基因的多态性，且其中的许多与称作遗传性出血性毛细管扩张(telengiectasia)I型(HHT1)的显性血管病症有关。这些突变中的许多会导致不稳定的可溶形式的内皮糖蛋白的生成，从而导致在HHT患者的内皮细胞和单核细胞中发现的内皮糖蛋白降低的表达(Raab等，同上)。在另一个实例中，GenBank数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)的调查揭示了该基因和Flt-1/sFlt-1的启动子区的至少330种已知多态性。相对于正常参照样品的遗传性变异、突变或多态性的检测，可以用作先兆子痫、子痫或发展先兆子痫或子痫的倾向的诊断指标。
这种基因变化可存在于基因的启动子序列、可读框、内含子序列或非翻译3’区中。有关基因变化的信息，可用于诊断受试者患有先兆子痫、子痫或发展这样状况的倾向。如全文所述，可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF的水平或生物学活性的特定变化，或其任意组合，可以与先兆子痫或子痫或它们的素因的可能性相关联。结果，本领域技术人员在检测了给定突变后，可以测定蛋白的一种或多种生物学活性，以确定该突变是否会引起或增加先兆子痫或子痫的可能性。
在一个实施方案中，患有先兆子痫、子痫或发展这样状况的倾向的受试者将表现出编码内皮糖蛋白(优选地可溶内皮糖蛋白)或sFlt-1的核酸的表达的增加，或PlGF或VEGF水平的变化。用于检测这种变化的方法是本领域的标准方法，且由上面的Ausubel等描述。在一个实例中，使用RNA印迹或实时PCR检测内皮糖蛋白(优选地可溶内皮糖蛋白)、sFlt-1、PlGF或VEGF mRNA水平。
与能够检测内皮糖蛋白或可溶内皮糖蛋白核酸分子的PCR探针(包含基因组序列或紧密相关分子)杂交，可用于和源自患有先兆子痫或子痫或处于发展这样状况的危险中的受试者的核酸序列杂交。探针的特异性，不论其是从高特异性区(例如5’调节区)还是从低特异性区(例如，保守基序)制造的，以及杂交或扩增的严格性(最高、高、中等或低)，都可确定探针是否与天然存在的序列、等位基因变体或其它相关序列杂交。杂交技术可用于鉴别可溶内皮糖蛋白核酸分子中指示先兆子痫或子痫的突变，或可用于监控编码可溶内皮糖蛋白多肽的基因的表达水平(例如，通过RNA印迹，Ausubel等，同上)。
在另一实施方案中，通过直接分析内皮糖蛋白或可溶内皮糖蛋白核酸分子的序列，可诊断受试者发展先兆子痫或子痫的倾向。
本文所述的任一种核酸或多肽的测量，可以发生在至少两个不同的场合，并将与正常参照水平相比随时间推移产生的水平的变化，用作先兆子痫、子痫或发展这样状况的倾向的指标。
存在于患有先兆子痫、子痫或发展这样状况的倾向的受试者的体液中的任一种可溶内皮糖蛋白多肽或核酸的水平，与正常对照受试者的水平相比，或与以前从相同受试者的相同体液得到的采样相比，可以增加少至10％、20％、30％或40％或多至50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。从一次测量至下一次测量，存在于患有先兆子痫、子痫或发展这样状况的倾向的受试者的体液中的可溶内皮糖蛋白多肽或核酸的水平，可以随时间推移改变少至10％、20％、30％或40％或多至50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％。
与患有先兆子痫、子痫或发展这样状况的倾向的受试者的体液中的可溶内皮糖蛋白的水平结合测量的sFlt-1、VEGF或PlGF的水平，与正常对照中的sFlt-1、VEGF或PlGF的水平相比，可以改变少至10％、20％、30％或40％或多至50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。从一次测量至下一次测量，与患有先兆子痫、子痫或发展这样状况的倾向的受试者的体液中的可溶内皮糖蛋白的水平结合测量的sFlt-1、VEGF或PlGF的水平，可以随时间推移改变少至10％、20％、30％或40％或多至50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％。
在一个实施方案中，在发作先兆子痫症状前的妊娠早期，收集受试者的体液样品(例如，尿、血浆、血清、羊水或脑脊液)。在另一实例中，样品可以是在发作先兆子痫症状前的妊娠早期收集的组织或细胞。组织和细胞的非限制性实例包含胎盘组织、胎盘细胞、内皮细胞和白细胞如单核细胞。在人类中，例如，在妊娠的前三个月、次三个月或第三个三个月期间，收集孕妇肘前静脉的产妇血清样品。优选地，在前三个月(例如在4、6、8、10或12周)期间，或其中的任何时间间隔进行测定，或在次三个月(例如在14、16、18、20、22或24周)期间，或其中的任何时间间隔进行测定。这样的测定还可在次三个月结束时或第三个三个月时进行，例如，在26、28、30、32、34、36或38周，或其中的任何时间间隔。优选地，在该时间段内，将可溶内皮糖蛋白的水平测量两次。就产后先兆子痫或子痫的诊断而言，可溶内皮糖蛋白的测定可在产后进行。就发展先兆子痫或子痫的倾向的诊断而言，在发作妊娠之前进行测定。在一个实例中，就治疗的监控和控制而言，在诊断先兆子痫后、在妊娠过程中进行测定。
在一个特定的实例中，可在妊娠过程中收集系列血液样品，并通过ELISA测定可溶内皮糖蛋白多肽的水平。在另一个实例中，在次三个月期间和第三个三个月的早期收集样品，且从第一次取样到下一次取样的可溶内皮糖蛋白的水平的增加，是先兆子痫或子痫或发展任一种的倾向的指示。
本发明也包含测量受试者体液(优选地尿)中的可溶内皮糖蛋白(例如，TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP-2和BMP-7)配体的任一种配体，且可溶内皮糖蛋白配体水平的变化(例如，增加或减少)是先兆子痫或子痫的指示。
在兽医实践中，可在妊娠过程中的任何时间进行测定，但优选地在妊娠早期、发作先兆子痫症状前进行。已知妊娠期限在物种之间广泛变化，测定时间选择将由兽医决定，但通常与人类妊娠过程的测定时间选择相对应。
可以单独地，或与本文所述的任何其它诊断方法结合地，使用本文所述的诊断方法，以更准确地诊断先兆子痫或子痫的存在、严重程度或估计的发作时间。此外，本文所述的诊断方法可与用于准确诊断先兆子痫或子痫的存在、严重程度或估计的发作时间的任何其它诊断方法结合使用。
本文所述诊断方法还可用于监控并控制受试者的先兆子痫或子痫。在一个实例中，施用治疗，直到血液、血浆或血清可溶内皮糖蛋白水平小于25ng/ml。在另一个实例中，如果测得受试者具有比正常对照升高水平的可溶内皮糖蛋白，则可以施用治疗，直到血清PlGF水平升高到约400pg/mL。在该实施方案中，重复测量可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、PlGF和VEGF的水平，或它们中的任一种或全部，作为不仅诊断疾病，而且监控先兆子痫和子痫的治疗和控制的方法。
诊断试剂盒
本发明还提供诊断试验试剂盒。例如，诊断试验试剂盒可包含可溶内皮糖蛋白的抗体，和用于检测、且更优选用于评价抗体与可溶内皮糖蛋白多肽之间的结合的工具。对于检测，标记抗体或可溶内皮糖蛋白多肽，且抗体或可溶内皮糖蛋白多肽是基质-结合的，这样在抗体与可溶内皮糖蛋白多肽之间结合后，通过测定附着到基质上的标记的量，就可以确定可溶内皮糖蛋白多肽-抗体的相互作用。常规的ELISA是本领域已知的检测抗体-基质相互作用的常见方法，且可以与本发明的试剂盒一起提供。实际上，可在任何体液(包含但不限于尿、血清、血浆、唾液、羊水或脑脊液)中检测可溶内皮糖蛋白多肽。本发明也提供了包含可溶内皮糖蛋白核酸的诊断试验试剂盒，所述可溶内皮糖蛋白核酸可以用于检测和确定可溶内皮糖蛋白核酸的水平。测定可溶内皮糖蛋白多肽的水平相对于参照(如存在于正常对照中的水平)的变化的试剂盒，可用作本发明方法中的诊断试剂盒。
本发明的诊断试剂盒可以包含用于检测美国专利申请公开号20040126828、20050025762和2005017044和PCT公开号WO2004/008946和WO 2005/077007所述的sFlt-1、VEGF或PlGF多肽或核酸的抗体或核酸。
合意地，试剂盒包含进行上述的任一种诊断方法必需的所有组分。例如，试剂盒合意地包含膜，其中在该膜上固定化了可溶内皮糖蛋白结合试剂或结合可溶内皮糖蛋白结合试剂的试剂。该膜可以支持在测验片结构上，在那里通过将测验片结构置于样品中，将样品沉积于膜上，或该膜可以支持在侧向流盒中，在那里通过盒子中的开口，将样品沉积于膜上。
诊断试剂盒通常还包含关于试剂盒组分的预期用途的标签或说明书，和用于确立标准曲线的参照样品或纯化的蛋白。在一个实例中，试剂盒含有关于使用试剂盒来诊断先兆子痫、子痫或发展先兆子痫或子痫的倾向的说明书。在另一个实例中，试剂盒含有关于使用试剂盒来监控治疗先兆子痫或子痫的治疗性处理或剂量方案的说明书。诊断试剂盒也可以包含关于使用试剂盒来确定受试者样品的PAAI或可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数、并将PAAI或可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数与参照样品值相对比的标签或说明书。应当理解，参照样品值将取决于试剂盒的预期用途。例如，可以将样品与正常参照值相对比，其中PAAI或可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数或可溶内皮糖蛋白值的增加，是先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫的倾向的指示。在另一个实例中，用于治疗性监控的试剂盒可以具有参照PAAI或可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数值或可溶内皮糖蛋白值，它是先兆子痫或子痫的指示，其中与参照样品相比受试者样品的PAAI或可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数值的降低或可溶内皮糖蛋白值的降低，可以用于指示治疗性化合物的治疗功效或有效剂量。
筛选测定
如上面所讨论的，可溶内皮糖蛋白核酸或多肽的水平在患有先兆子痫、子痫或发展这样状况的倾向的受试者中升高。基于这些发现，本发明的组合物可用于候选化合物的高通量低成本筛选，以鉴别调节可溶内皮糖蛋白多肽或核酸分子的表达的那些，所述表达在患有先兆子痫或子痫的受试者中发生变化。
许多方法都可用于进行筛选测定，以鉴别改变可溶内皮糖蛋白核酸分子的表达的新候选化合物。在一个工作实施例中，将各种浓度的候选化合物加入到表达可溶内皮糖蛋白核酸序列的培养细胞的培养基中。示例性的细胞培养物包含滋养层(例如，BEWO、JAR和JEG细胞)和HUVEC。可以用蛋白酶(例如，基质金属蛋白酶)处理表达高水平的膜结合形式的内皮糖蛋白的细胞，所述蛋白酶切割内皮糖蛋白的胞外结构域以形成可溶内皮糖蛋白。然后，这些细胞可以用于筛选新候选化合物。然后测量基因表达，例如，通过微阵列分析、RNA印迹分析(Ausubel等，同上)或RT-PCR，其中使用从核酸分子制备的任何适宜片段作为杂交探针。将在有候选化合物存在下的基因表达水平与在缺少候选化合物的对照培养基中测量的水平相比较。促进可溶内皮糖蛋白基因、核酸分子或多肽、或其功能等价物的表达的降低的化合物，被认为可用于本发明中；可使用这类分子，例如，作为治疗受试者的先兆子痫或子痫的治疗剂。
在另一个工作实施例中，可使用相同的一般方法和标准的免疫学技术，如使用对可溶内皮糖蛋白多肽特异性的抗体进行的蛋白印迹或免疫沉淀法，在多肽产生水平测量候选化合物的作用。例如，免疫测定可用于检测或监控本发明至少一种多肽在生物中的表达。能够结合这种多肽的多克隆或单克隆抗体(如上所述产生的)，可用于任何标准免疫测定形式(例如，ELISA、蛋白印迹或RIA测定)中，以测量所述多肽的水平。在某些实施方案中，促进可溶内皮糖蛋白多肽表达或生物学活性的降低的化合物，被认为是特别有用的。同样，可使用这类分子，例如，作为延迟、改善或治疗受试者的先兆子痫或子痫、或先兆子痫或子痫症状的治疗剂。
在另一个工作实施例中，可筛选候选化合物中特异性地结合可溶内皮糖蛋白多肽的那些。这种候选化合物的功效取决于它与这类多肽或其功能等价物相互作用的能力。使用任意数目的标准结合技术和功能测定(例如，上面的Ausubel等描述的那些)，可容易地测定这种相互作用。在一个实施方案中，可体外测试候选化合物的特异性地结合本发明多肽的能力。在另一实施方案中，可通过降低可溶内皮糖蛋白多肽和生长因子(如TGF-β、TGF-β3、活化素-A、BMP-2和BMP-7)的结合，测试候选化合物降低可溶内皮糖蛋白多肽的生物学活性的能力。
在另一个工作实施例中，将可溶内皮糖蛋白核酸表达成具有可检测的报道分子的转录或翻译融合体，并在异源启动子(如诱导型启动子)的控制下，在分离的细胞(例如，哺乳动物或昆虫细胞)中表达。然后，使表达融合蛋白的细胞与候选化合物接触，并将可检测的报道分子在该细胞中的表达与可检测的报道分子在未处理的对照细胞中的表达进行比较。降低可溶内皮糖蛋白可检测的报道分子的表达的候选化合物，是可用于治疗先兆子痫或子痫的化合物。在优选实施方案中，候选化合物改变与核酸融合的报道基因或核酸的表达。
在一个特定的工作实施例中，使用基于层析的技术，可以鉴别结合可溶内皮糖蛋白多肽的候选化合物。例如，通过标准技术，可以从被工程改造以表达多肽(例如，上述那些)的细胞，纯化本发明的重组多肽，且可将其固定化在柱上。然后，使候选化合物的溶液通过柱，且基于结合多肽并固定化在柱上的能力，鉴别对可溶内皮糖蛋白多肽特异性的化合物。为了分离化合物，洗涤柱，以除去非-特异性结合的分子，然后使目标化合物从柱上释放，并收集。类似的方法可用于分离与多肽微阵列结合的化合物。如果需要，可以进一步纯化(例如，通过高效液相层析)通过该方法(或任何其它适宜方法)分离的化合物。此外，还可测试这些候选化合物的降低可溶内皮糖蛋白多肽的活性的能力。也可以使用通过该方法分离的化合物，例如，作为治疗人受试者的先兆子痫或子痫的治疗剂。认为鉴定为以小于或等于10mM的亲和常数结合本发明多肽的化合物，特别适用于本发明。或者，任何体内蛋白相互作用检测系统，例如，任何双杂交测定，均可用于鉴别结合本发明多肽的化合物或蛋白。
潜在的拮抗剂包含结合可溶内皮糖蛋白核酸序列或可溶内皮糖蛋白多肽的有机分子、肽、肽模拟物、多肽、核酸以及抗体。
可溶内皮糖蛋白DNA序列还可用于发现和开发治疗先兆子痫或子痫的治疗性化合物。编码的蛋白在表达后，可用作药物筛选的靶。此外，通过标准技术(Ausubel等，同上)，可分离编码所编码蛋白的氨基末端区的DNA序列、或Shine-Delgarno序列、或其它翻译促进序列。
任选地，在上述任何测定的任一个中鉴别的化合物，被证实可以用于测定降低可溶内皮糖蛋白的生物学活性的化合物。
本发明的小分子优选地具有低于2,000道尔顿、更优选300-1,000道尔顿、且最优选400-700道尔顿的分子量。优选地，这些小分子是有机分子。
试验化合物和提取物
通常，根据本领域已知的方法，从天然产物或合成的(或半-合成的)提取物的大文库或化学文库或多肽或核酸文库中，鉴别能够降低可溶内皮糖蛋白多肽的活性的化合物。药物发现与开发领域的技术人员将理解，试验提取物或化合物的准确来源对于本发明的筛选程序并不特别重要。用于筛选的化合物可包含已知化合物(例如，用于其它疾病或病症的已知治疗剂)。或者，事实上，使用本文所述方法，可筛选任意数目的未知的化学提取物或化合物。这种提取物或化合物的实例包含但不限于，基于植物、真菌、原核生物或动物的提取物、发酵液体培养基、和合成化合物，以及现有化合物的修饰。还有很多方法也可用于随机地生成或定向地合成(例如，半合成或全合成)任意数目的化合物，包含但不限于，基于糖、脂类、肽、及核酸的化合物。合成化合物文库在商业上可从Brandon Associates(Merrimack，NH)和Aldrich Chemical(Milwaukee，WI)得到。或者，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库，在商业上可从很多来源得到，包含Biotics(Sussex，UK)、Xenova(Slough，UK)、Harbor Branch Oceangraphics Institute(Ft.Pierce，FL)和PharmaMar，U.S.A.(Cambridge，MA)。此外，如果需要，按照本领域已知的方法，例如，通过标准的提取和分级分离方法，可以产生天然的及合成产生的文库。此外，如果需要，使用标准的化学、物理或生物化学的方法，可以很容易地修饰任何文库或化合物。
此外，药物发现与开发领域的技术人员可容易地理解，不论何时，都应该应用反筛选(dereplication)(例如，分类反筛选、生物学反筛选和化学反筛选、或其任意组合)或除去已知脱换物(molt)-破坏活性的材料的复制或重复的方法。
当发现粗提取物可降低可溶内皮糖蛋白多肽活性、或结合可溶内皮糖蛋白多肽时，进一步分级分离阳性的先导提取物，是分离负责所观察到的作用的化学组分所必需的。因此，提取、分级分离和纯化方法的目的是，认真表征和鉴别粗提取物内的降低可溶内皮糖蛋白多肽的活性的化学实体。这种异质提取物的分级分离和纯化方法是本领域已知的。如需要，根据本领域已知方法，化学地修饰可用作治疗人先兆子痫或子痫的治疗剂的化合物。
治疗
本发明涉及用于治疗或预防受试者的先兆子痫或子痫的方法和组合物。假设患有先兆子痫、子痫或具有这样状况的素因的受试者中的可溶内皮糖蛋白的水平升高，则降低可溶内皮糖蛋白多肽或核酸分子的表达水平和/或生物学活性的任何试剂，都可以用于本发明的方法中。这样的试剂包含化合物如TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2或BMP7，其可以破坏可溶内皮糖蛋白结合配体；特异性地结合可溶内皮糖蛋白的纯化的抗体或抗原结合片段；反义核碱基寡聚体；和用于介导RNA干扰的dsRNA。其它有用的化合物包括可以改变可溶内皮糖蛋白的生物学活性的任意化合物，例如，如通过血管生成测定所测得的。下面详细描述了示例性的治疗方法。这些方法也可以与如PCT公开号WO 2004/008946和美国专利公开号20040126828所述的降低sFlt-1水平、或升高VEGF或PlGF水平、或降低sFlt-1水平的方法相组合。
靶向TGF-β信号传导途径的治疗剂
TGF-β是至少25种生长因子的家族的原型，所述生长因子在许多细胞类型中调节生长、分化、运动性、组织重建、神经发生、创伤修复、细胞凋亡和血管生成。TGF-β也抑制许多细胞类型的细胞增殖，并可以刺激基质蛋白的合成。除了在它使用的上下文中可以看出以外，在贯穿本说明书中使用的术语TGF-β应当理解为，通常指适合的TGF-β超家族的任一个或所有成员。可溶内皮糖蛋白结合TGF-β家族的几个特定成员，包括TGF-β1、TGF-β3、活化素、BMP-2和BMP-7，且可以用于耗尽发育中的胎儿或胎盘的必需的促有丝分裂因子和血管生成因子。本发明涉及提高这些配体的水平来结合可溶内皮糖蛋白和中和可溶内皮糖蛋白的作用的方法。
纯化的蛋白
在本发明的一个优选的实施方案中，给受试者施用纯化形式的任何可溶内皮糖蛋白配体，如TGF-β家族蛋白，包含但不限于TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2和BMP7，以治疗或预防先兆子痫或子痫。
纯化的TGF-β家族蛋白包含任何下述的蛋白：其氨基酸序列与TGF-β1或TGF-β3或任何已知TGF-β家族成员的氨基酸序列同源，更合意地基本相同，其可诱导血管生成。非限制性实例包含来自R&D Systems，MN的人TGF-β1(Cat#240-B-002)和人TGF-β3(Cat#243-B3-002)。
抑制内皮糖蛋白(endgolin)的蛋白酶剪切的治疗性化合物
我们已经鉴别了内皮糖蛋白的胞外结构域中的潜在切割位点，蛋白水解酶会在这里切割膜结合形式的内皮糖蛋白，从而释放出可溶形式的胞外结构域。我们的切割位点的序列比对表明，基质金属蛋白酶(MMP)负责切割和释放可溶内皮糖蛋白。或者，组织蛋白酶或弹性蛋白酶也可以参与切割事件。MMP也称作胶原酶、明胶酶和溶基质素，且存在26个已知的家族成员(综述见Whittaker和Ayscough，Cell Transmissions 17：1(2001))。优选的MMP是MMP9，已知它在先兆子痫患者的胎盘中受到上调(Lim等，Am.J.Pathol.151：1809-1818，1997)。通过酶原的激活和内源抑制剂(如金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPS))的抑制，控制MMP的活性。MMP的抑制剂是锌结合蛋白。存在4种已知的内源抑制剂(TIMP 1-4)，其综述见上面的Whittaker等。一种优选的MMP抑制剂是膜型-MMP1的抑制剂，已经表明它会切割β聚糖，即与内皮糖蛋白(enodglin)共有相似性的一种分子(Velasco-Loyden等，J.Biol.Chem.279：7721-7733(2004))。此外，已经鉴别出了许多种天然存在的和合成的MMP抑制剂，且其综述也见上面的Whittaker等。实例包含针对MMP的抗体，和各种化合物，包括马马司他、巴马司他、CT1746、BAY 12-9566、普马司他(prinomastat)、CGS-27023A、D9120、BMS275291(BristolMyers Squibb)和trocade，其中的一些现在处于临床试验中。已知MMP、组织蛋白酶或弹性蛋白酶在释放和上调可溶内皮糖蛋白水平中的潜在作用，本发明也提供了已知抑制参与可溶内皮糖蛋白的切割和释放的任意MMP、组织蛋白酶或弹性蛋白酶的活性的任意化合物(如上述的那些)在治疗或预防受试者的先兆子痫或子痫中的用途。
增加可溶内皮糖蛋白结合蛋白的治疗性化合物
本发明提供了已知刺激或升高可溶内皮糖蛋白结合蛋白(包含但不限于TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2和BMP7)的血清水平的任意化合物在治疗或预防受试者的先兆子痫中的用途。可以单独地，或与上述纯化的蛋白或用于提高本文所述的TGF-β家族蛋白蛋白水平的任何其它方法组合地，使用这些化合物。在一个实例中，在每天两次100-200mg的剂量，使用环孢菌素来刺激TGF-β1生产。
除了可以提高可溶内皮糖蛋白结合蛋白的血清水平的化合物的用途以外，本发明提供了与本文所述的任一种治疗方法结合使用的任意慢性高血压药物治疗的用途。用于治疗妊娠过程中的高血压的药物治疗包含甲基多巴、盐酸肼苯哒嗪或拉贝洛尔。对于这些药物治疗中的每一种而言，施用方式和剂量可由医师或按照制造商的说明书确定。
改变可溶内皮糖蛋白的抗血管生成活性的治疗性化合物
使用血管生成测定，可以鉴别其它治疗性化合物。例如，将具有升高水平的可溶内皮糖蛋白的先兆子痫血清加入matrigel管形成测定中，将诱导抗血管生成状态。然后，可以将测试化合物加入测定中，且抗血管生成状态逆转10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，表明该化合物可以降低可溶内皮糖蛋白的生物学活性，且可用作治疗性化合物。
治疗性核酸
近来的工作表明，将能够表达内皮细胞促分裂原(如VEGF)的核酸(DNA或RNA)递送到血管损伤部位，将诱导受损血管的增殖和再次内皮化(reendothelialization)。虽然本发明不涉及血管损伤，但这些用于向内皮细胞递送核酸的普通技术也可用于本发明中，以用于递送编码可溶内皮糖蛋白结合蛋白(如TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2和BMP7)的核酸。该技术也可以用于递送编码蛋白的核酸，所述蛋白已知已知抑制参与可溶内皮糖蛋白的切割和释放的任意MMP、组织蛋白酶或弹性蛋白酶的活性，如上述的那些，以用于治疗或预防受试者的先兆子痫或子痫。这些普通技术在美国专利号5,830,879和6,258,787中描述，它们引入本文作为参考。
在本发明中，核酸可以是任何核酸(DNA或RNA)，包含编码可溶内皮糖蛋白结合蛋白(如TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2和BMP7)的基因组DNA、cDNA和mRNA。使用本领域的常规操作，例如，重组DNA、PCR扩增，可获得编码所需蛋白的核酸。
递送核酸的方式
对于本文所述的任一种核酸应用，可以使用标准的施用核酸的方法。例如，为了简化编码可溶内皮糖蛋白结合蛋白的核酸的操作和处理，优选地将核酸插入到与启动子可操作地连接的盒中。启动子必须能够驱动可溶内皮糖蛋白结合蛋白在所需靶宿主细胞中的表达。适宜启动子的选择可很容易实现。优选地，人们可使用高表达启动子。适宜启动子的实例是763-碱基对巨细胞病毒(CMV)启动子。还可使用劳斯肉瘤病毒(RSV)(Davis等，Hum.Gene Ther.4：151-159，1993)和小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子。某些蛋白可使用它们的天然启动子表达。还可包含可增强表达的其它元件(例如，产生高水平表达的增强子或系统，如tat基因和tar元件)。重组载体可以是质粒载体，如pUC118、pBR322或其它已知的质粒载体，它包含，例如，大肠杆菌(E.coli)复制起点(见，Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratorypress，1989)。质粒载体还可包含选择标记，如氨苄青霉素抗性的β内酰胺酶基因，前提是，标记多肽不会不利地影响所治疗生物的代谢。所述盒还可结合合成递送系统(如PCT公开号WO95/22618中公开的系统)中的核酸结合部分。
可通过适合所用载体的任何方法，将核酸引入到细胞中。许多这类方法都是本领域熟知的(Sambrook等，同上和Watson等，“Recombinant DNA”，Chapter 12，第2版，Scientific AmericanBooks，1992)。通过如磷酸钙沉淀、电穿孔、脂质体-介导的转染、基因枪、显微注射、病毒壳体-介导的转移、聚凝胺-介导的转移或原生质体融合等方法，可以转移重组载体。关于脂质体制备、内含物的靶向和递送的程序的综述，见Mannino和Gould-Fogerite(BioTechniques，6：682-690，1988)，Felgner和Holm(Bethesda Res.Lab.Focus，11：21，1989)以及Maurer(Bethesda Res.Lab.Focus，11：25，1989)。
重组载体(质粒载体或病毒载体)的转移，可通过直接注射到羊水中或通过静脉内递送来完成。
还可使用利用腺病毒载体或腺伴随载体(AAV)进行的基因递送。腺病毒存在于许多动物物种中，致病性并不高，且可在分裂中的和休眠的细胞中同等复制。作为一般规律，基因递送所用的腺病毒缺少病毒复制所需的一个或多个基因。用于递送可溶内皮糖蛋白结合蛋白的复制-缺陷型重组腺病毒载体，可根据本领域已知的技术生产(见，Quantin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：2581-2584，1992；Stratford-Perricadet等，J Clin.Invest.，90：626-630，1992；和Rosenfeld等，Cell，68：143-155，1992)。基因疗法在子宫内使用的实例，见美国专利号6,399,585。
一旦转染，核酸就由损伤部位的细胞表达一段时间，这段时间足以提高可溶内皮糖蛋白结合蛋白的血清水平。因为含有核酸的载体通常没有被掺入到细胞基因组中，所以目标蛋白的表达只进行有限的时间。通常，在治疗水平表达蛋白约2天到几周，优选约1-2周。DNA的再次应用，可用于提供治疗性蛋白表达的额外时间段。
抑制可溶内皮糖蛋白表达的治疗性核酸
本发明还涉及反义核碱基寡聚体在直接下调可溶内皮糖蛋白mRNA的表达中的用途。通过结合互补核酸序列(有义或编码链)，反义核碱基寡聚体能够抑制蛋白表达，可能是通过RNA酶H对RNA链的酶促切割。优选地，反义核碱基寡聚体能够降低表达升高水平的可溶内皮糖蛋白的细胞中的可溶内皮糖蛋白蛋白表达。优选地，与用对照寡核苷酸处理的细胞相比，可溶内皮糖蛋白蛋白表达降低了至少10％，优选地20％或更大，更优选地40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。选择和制备反义核碱基寡聚体的方法是本领域熟知的。使用反义核碱基寡聚体下调VEGF表达的实例，见美国专利号6,410,322，其引入本文作为参考。测定蛋白表达水平的方法也是本领域熟知的，且包含蛋白印迹、免疫沉淀法和ELISA。
本发明还涉及RNA干扰(RNAi)在抑制可溶内皮糖蛋白的表达中的用途。RNA干扰(RNAi)是近来发现的转录后基因沉默(PTGS)的机理，其中与目标基因或mRNA相对应的双链RNA(dsRNA)被引入到生物中，从而导致对应mRNA的降解。在RNAi反应中，dsRNA分子的有义和反义链被加工成长度为21-23个核苷酸(nt)且具有2-核苷酸3’尾的小RNA片段或区段。或者，可以合成合成的dsRNA，它们长21-23nt，且具有2-核苷酸3’尾，纯化，并用于反应中。这些21-23nt dsRNA被称作“指导RNA”或“短干扰RNA”(siRNA)。
然后，siRNA双链体与核酸酶复合物结合，该核酸酶复合物由靶向且破坏内源mRNA的蛋白构成，所述内源mRNA与复合物内的siRNA具有同源性。虽然仍然不清楚复合物内的蛋白的特性，但复合物的功能是，通过siRNA链中的一条和内源mRNA之间的碱基配对相互作用，靶向同源的mRNA分子。然后，从siRNA的3’末端切割下约12nt的mRNA，并降解。以这种方式，可靶向特定基因并将其降解，由此导致靶定的基因的蛋白表达的丧失。也可以化学地合成siRNA，或从化学地合成siRNA的公司(例如，Dharmacon ResearchInc.，Pharmacia或ABI)得到。
dsRNA的特殊要求和修饰在PCT公开号WO01/75164(引入本文作为参考)中描述。尽管dsRNA分子的长度可发生变化，但最优选地，使用siRNA分子，它是21-23核苷酸dsRNA，具有特征性的2-3-核苷酸3’突出端，通常为(2’脱氧)胸苷或尿嘧啶。siRNA通常包含3’羟基。还可使用单链的siRNA以及平端形式的dsRNA。为了进一步提高RNA的稳定性，可使3’突出端稳定化以防降解。在一个这样的实施方案中，通过包含嘌呤核苷酸(如腺苷或鸟苷)，稳定化RNA。或者，用修饰的类似物置换嘧啶核苷酸，例如，用(2’-脱氧)胸苷置换尿苷2-核苷酸突出端是可耐受的，且不会影响RNAi的功效。2’羟基的不存在显著提高组织培养基中突出端的核酸酶抗性。
或者，可以使用PCT公开号WO01/75164(引入本文作为参考)中提出的方法中的任一种，或使用RNA体外转录的标准程序和Elbashir等(Genes&Dev.，15：188-200，2001)描述的dsRNA退火程序，制备siRNA。还可按照上面Elbashir等所述，获得siRNA，即在加工dsRNA以产生约21-约23个核苷酸的siRNA的条件下，在合胞体囊胚层果蝇(Drosophila)胚胎的无细胞的果蝇裂解物中温育与靶基因序列相对应的dsRNA，然后使用本领域技术人员已知的技术分离。例如，凝胶电泳可用于分离21-23nt RNA，然后可以从凝胶切片洗脱。此外，层析(例如，大小排阻层析)、甘油梯度离心及用抗体进行的亲和纯化，都可用于分离21-23nt RNA。
许多种方法可以用于将dsRNA或寡核苷酸转染或导入进哺乳动物细胞。例如，存在几种商业上可得到的转染试剂，包括但不限于：TransIT-TKOTM(Mirus，目录号MIR 2150)、TransmessengerTM(Qiagen，目录号301525)和OligofectamineTM(Invitrogen，目录号MIR 12252-011)。每种转染试剂的规程都可从生产商得到。
在本发明中，dsRNA或siRNA与可溶内皮糖蛋白mRNA的mRNA序列互补，且可降低或抑制可溶内皮糖蛋白的表达。优选地，与用对照dsRNA或siRNA处理的细胞相比，可溶内皮糖蛋白蛋白的表达降低了至少10％，更优选地25％，且最优选地至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。测定蛋白表达水平的方法也是本领域熟知的，且包含蛋白印迹、免疫沉淀法和ELISA。
在本发明中，所用核酸包含以任何方式提高核酸稳定性或功能的任何修饰。实例包含对磷酸主链、核苷酸间的连接或糖部分的修饰。
在早期妊娠中有用的基于可溶内皮糖蛋白的治疗性化合物
已经表明，全长内皮糖蛋白信号传导的抑制增强绒毛外植块培养物中的滋养层侵袭力(Caniggia I等，Endocrinology，1997，138：4977-88)。因此，可溶内皮糖蛋白可能增强早期妊娠过程中的滋养层侵袭力。因此，提高不患有妊娠相关的高血压病症或发展妊娠相关的高血压病症的倾向的妇女在早期妊娠时的可溶内皮糖蛋白水平的组合物，对于促进胎盘形成是有益的。提高可溶内皮糖蛋白水平的组合物的实例包括纯化的可溶内皮糖蛋白多肽、可溶内皮糖蛋白编码核酸分子和提高可溶内皮糖蛋白的水平或生物学活性的化合物或生长因子。
基因和蛋白表达的测定
下面的方法可以用于评价蛋白或基因表达，并确定任一种上述方法在提高可溶内皮糖蛋白结合蛋白水平、或降低可溶内皮糖蛋白蛋白水平中的功效。
使用诸如ELISA、蛋白印迹或使用特异性抗体的免疫测定的方法，测量受试者血清的可溶内皮糖蛋白的水平。也可以测量受试者血清的TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2、BMP7或已知结合可溶内皮糖蛋白的任意蛋白配体的水平。用于测量蛋白的血清水平的方法包括ELISA、蛋白印迹或使用特异性抗体的免疫测定。此外，可以进行体外血管生成测定，以确定受试者的血液是否已经从抗血管生成状态转化成促血管生成状态。这样的测定记载在实施例4中。认为阳性结果是可溶内皮糖蛋白、TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2、BMP7或已知结合可溶内皮糖蛋白的任意蛋白配体的水平增加了至少10％、20％、优选地30％、更优选地至少40％或50％、且最优选地至少60％、70％、80％、90％或更多。也可以将阳性结果视作，使用体外血管生成测定测得，从抗血管生成状态至促血管生成状态转化了至少10％、优选地20％、30％、40％、50％、且最优选地至少60％、70％、80％、90％或更多。
也可以测量来自受试者的血清或尿样品中的编码TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2、BMP7或可溶内皮糖蛋白的核酸或多肽的水平。存在几种本领域已知的测定基因表达的方法。一些实例包括，从受试者的血液样品制备RNA，并使用RNA进行RNA印迹、基于PCR的扩增、或RNA酶保护测定。认为阳性结果是可溶内皮糖蛋白、TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2、BMP7核酸的水平增加了至少10％、20％、优选地30％、更优选地至少40％或50％、且最优选地至少60％、70％、80％、90％或更多。
使用抗体进行治疗性处理
在从患有先兆子痫的孕妇采集的血清样品中发现的提高水平的可溶内皮糖蛋白，表明可溶内皮糖蛋白可起“生理学库”的作用，以结合胎儿或胎盘的正确发育和血管生成所需的滋养层细胞和母体内皮细胞的功能性生长因子，并将其耗尽。使用化合物(如抗体)来结合可溶内皮糖蛋白并中和可溶内皮糖蛋白的活性(例如，结合TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2、BMP7)，可以通过增加游离的TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2和BMP7，帮助预防或治疗先兆子痫或子痫。这种增加将使胎盘发育和胎儿营养所需的滋养层增殖、迁移和血管生成能够增加，且使全身的母体内皮细胞健康。
本发明提供了特异性地结合可溶内皮糖蛋白的配体-结合结构域的抗体。所述抗体用于中和可溶内皮糖蛋白的活性，且认为最有效的机理是通过直接封闭TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2或BMP7的结合位点，然而，不排除其它机理。用于治疗目的的抗体的制备和使用方法在几个专利中描述，包含美国专利号6,054,297；5,821,337；6,365,157；和6,165,464，且它们引入本文作为参考。抗体可以是多克隆的或单克隆的；优选单克隆抗体。
单克隆抗体，特别是源自啮齿类动物(包含小鼠)的那些已经用于治疗各种疾病；然而，它们的用途有限制，包括诱导引起治疗功效的快速清除和降低的人抗-小鼠免疫球蛋白反应。例如，啮齿类动物单克隆抗体在临床使用中的主要限制是，在治疗过程中的抗-球蛋白反应(Miller等，Blood，62：988-995 1983；Schroff等，Cancer Res.，45：879-885，1985)。
本领域已经尝试通过构建“嵌合”抗体来克服这个问题，其中动物抗原-结合可变结构域与人恒定结构域偶联(美国专利号4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855，1984；Boulianne等，Nature，312：643-646，1984；Neuberger等，Nature，314：268-270，1985)。这种嵌合抗体的生产和使用在下面描述。
结合可溶内皮糖蛋白的配体的竞争性抑制，可用于预防或治疗先兆子痫或子痫。这种提高可拯救内皮功能障碍，并使促血管生成/抗血管生成因子的平衡向着血管生成的方向移动。
本发明单克隆抗体的混合物可用作先兆子痫或子痫的有效治疗。该混合物可包含少至2、3或4种不同抗体，或多至6、8或10种不同抗体。此外，本发明抗体可与抗-高血压药物(例如，甲基多巴、盐酸肼苯哒嗪、或拉贝洛尔)或用于治疗先兆子痫、子痫或与先兆子痫或子痫有关的症状的任何其它药物治疗结合使用。
抗体的制备
特异性地结合sFlt-1受体的单克隆抗体可通过本领域已知的方法生产。这些方法包括由Kohler和Milstein(Nature，256：495-497，1975)和Campbell(“Monoclonal Antibody Technology，TheProduction and Characterization of Rodent and HumanHybridomas”，Burdon等，Eds.，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，Volume 13，Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，1985)描述的免疫学方法，以及由Huse等(Science，246，1275-1281，1989)描述的重组DNA方法。
单克隆抗体可从培养的杂交瘤细胞的上清液制备，或从通过将杂交瘤细胞腹膜内地接种到小鼠中诱导的腹水制备。最初由Kohler和Milstein(Eur.J.Immunol，6，511-519，1976)描述的杂交瘤技术已经广泛用于生产杂交细胞系，其分泌高水平的抗许多特定抗原的单克隆抗体。
免疫接种宿主动物或从其培养的抗体产生性细胞的途径和程序，通常与用于抗体刺激和产生的确定的且常规的技术一致。通常，将小鼠用作试验模型，然而，任何哺乳动物受试者(包含人受试者)或源自它的抗体产生性细胞，都可按照本发明方法进行操作，以作为产生哺乳动物(包含人)杂交细胞系的基础。
免疫接种之后，免疫淋巴样细胞与骨髓瘤细胞融合，以产生杂交细胞系，它们可被无限培养和传代培养，以产生大量单克隆抗体。就本发明的目的而言，为融合选择的免疫淋巴样细胞是淋巴细胞和它们的正常分化的后代，采集自免疫的动物的淋巴结组织或脾组织。优选使用脾细胞，因为它们可提供关于小鼠系统更浓且更方便的抗体产生性细胞来源。骨髓瘤细胞提供融合的杂合体连续繁殖的基础。骨髓瘤细胞是源自浆细胞的肿瘤细胞。鼠骨髓瘤细胞系可从例如美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)获得。还描述过人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(Kozbor等，J.Immunol.，133：3001-3005，1984；Brodeur等，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York，pp.51-63，1987)。
杂交细胞系可在细胞培养基中体外维持。一旦确立了杂交瘤细胞系，就可在多种营养足够的培养基(如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基)中维持。此外，杂交细胞系可以以许多常规方式贮藏并保存，包含冷冻和在液氮下贮藏。可使冷冻的细胞系复苏，并无限培养，重新开始合成和分泌单克隆抗体。通过常规方法，如沉淀、离子交换层析、亲和层析等，回收组织培养上清液中分泌的抗体。
抗体可在任何哺乳动物中制备，包含小鼠、大鼠、兔、山羊和人。抗体可以是下列免疫球蛋白种类之一的成员：IgG、IgM、IgA、IgD或IgE及其亚类，且优选是IgG抗体。
尽管用于产生单克隆抗体的优选动物是小鼠，但本发明不限于此；事实上，可使用人抗体，并证实是优选的。这类抗体可使用人杂交瘤获得(Cole等，“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”，Alan R.Liss Inc.，p.77-96，1985)。在本发明中，可以使用通过剪接具有适宜抗原特异性的小鼠抗体分子的基因和人抗体分子的基因而生产嵌合抗体的技术(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.81，6851-6855，1984；Neuberger等，Nature 312，604-608，1984；Takeda等，Nature 314，452-454，1985)；这类抗体包含在本发明的范围之内并在下面描述。
作为细胞融合技术的另一选择，EB病毒(EBV)无限增殖化B细胞可用于生产本发明的单克隆抗体(Crawford等，J Gen.Virol.，64：697-700，1983；Kozbor和Roder，J.Immunol.，4：1275-1280，1981；Kozbor等，Methods Enzymol.，121：120-140，1986)。通常，该程序由从适宜来源(通常是感染的细胞系)分离EB病毒，并使靶抗体分泌细胞暴露于含病毒的上清液组成。洗涤细胞，并在适宜的细胞培养基中培养。随后，可通过EB病毒核抗原的存在，鉴别存在于细胞培养物中的病毒转化的细胞，且可使用本领域已知的标准方法，鉴别转化的抗体分泌细胞。产生单克隆抗体(如重组DNA)的其它方法，也包含在本发明的范围内。
可溶内皮糖蛋白免疫原的制备
可溶内皮糖蛋白本身可作为免疫原使用，或可与载体蛋白或其它物体(如琼脂糖珠)结合使用。可溶内皮糖蛋白可从已知表达内源性蛋白的细胞(如人脐静脉内皮细胞)纯化(滋养层或HUVEC；Burrows等，Clin.Cancer Res.1：1623-1634，1995；Fonsatti等，Clin.CancerRes.6：2037-2043，2000)。可以用蛋白水解酶(例如，基质金属蛋白酶)处理表达膜结合的内皮糖蛋白的细胞，以切割胞外结构域，从而产生可溶形式。此外，使用标准的重组DNA技术，可以将编码可溶内皮糖蛋白的核酸分子或其部分插入到已知载体中，以用于在宿主细胞中表达。适合可溶内皮糖蛋白表达的宿主细胞包括杆状病毒细胞(例如，Sf9细胞)、细菌细胞(例如，大肠杆菌)和哺乳动物细胞(例如，NIH3T3细胞)。
此外，可合成肽，并将其用作免疫原。制备肽抗体的方法是本领域熟知的，且通常需要将肽与适宜的载体分子(如血清清蛋白)偶联。肽包含与GenBank编号AAH29080和NP_031958(小鼠)、AAS67893(大鼠)、NP_000109，P17813、VSP_004233和CAA80673(人)、和A49722(猪)相对应的可溶内皮糖蛋白氨基酸序列的任一部分基本相同的任何氨基酸序列。肽可以是任何长度，优选10个氨基酸或更长，更优选25个氨基酸或更长，且最优选地40、50、60、70、80、100、200、300、400、437个氨基酸或更长。优选地，所述氨基酸序列与任意人内皮糖蛋白序列的序列至少60％、更优选85％、且最优选90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致。肽可以是商业获得的，或使用本领域熟知的技术制备的，如，例如Merrifield固相方法(Science，232：341-347，1985)。所述程序可使用商业得到的合成仪，如Biosearth 9500自动化肽机器，使用氟化氢实现阻断氨基酸的切割，且使用Waters Delta Prep 3000仪器，在15-20μm VydacC4 PrepPAK柱上，通过制备型HPLC纯化肽。
抗体的功能等价物
本发明还包含本说明书中描述的抗体的功能等价物。功能等价物包括所具有的氨基酸序列与本发明抗体可变区或高变区的氨基酸序列基本上相同的多肽。功能等价物具有可与所述抗体的结合特性相比较的结合特性，且包括，例如，嵌合的、人源化的和单链抗体及其片段。生产这种功能等价物的方法记载在，例如，PCT公开号WO93/21319；欧洲专利申请号239,400；PCT公开号WO 89/09622；欧洲专利申请号338,745；欧洲专利申请号332424；以及美国专利号4,816,567中；每篇均引入本文作为参考。
嵌合抗体优选地具有基本上或排它地源自人抗体恒定区的恒定区、以及基本上或排它地源自除人以外的哺乳动物可变区序列的可变区。这类人源化抗体是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原-结合子序列)，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。使非人抗体人源化的方法是本领域熟知的(综述见Vaswani和Hamilton，Ann Allergy AsthmaImmunol.，81：105-119，1998和Carter，Nature Reviews Cancer，1：118-129，2001)。通常，人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常被称作输入残基，它们通常是从输入可变结构域得到的。可以基本上按照本领域已知的方法进行人源化(Jones等，Nature，321：522-525，1986；Riechmann等，Nature，332：323-329，1988；和Verhoeyen等，Science，239：1534-1536，1988)，其中用啮齿类动物的CDR或其它CDR序列置换人抗体的相应序列。因此，这种人源化抗体是嵌合抗体，其中基本上小于完整的人可变结构域的序列已经被来自非人的相应序列置换(见，例如，美国专利号4,816,567)。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中有些CDR残基(且很可能有些FR残基)被来自啮齿类动物类似位点的残基置换(Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596，1992)。
制备人源化抗体的其它方法描述在美国专利号5,821,337和6,054,297以及Carter(同上)中，它们全部引入本文作为参考。人源化抗体选自任一免疫球蛋白种类，包含IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。当不需要细胞毒性活性时，如在本发明中，恒定结构域优选为IgG2类。人源化抗体可包含来自超过一个种类或同种型的序列，且选择特定的恒定结构域来最优化所需的效应子功能，在本领域普通技术范围之内。
人抗体还可使用本领域已知的各种技术产生，包含噬菌体展示文库(Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597，1991和Winter等，Annu.Rev.Immunol.，12：433-455，1994)。Cole等和Boerner等的技术还可用于制备人单克隆抗体(Cole等，同上；Boerner等，J.Immunol.，147：86-95，1991)。
除人以外的适宜的哺乳动物包括可从其制备单克隆抗体的任何哺乳动物。除人以外的哺乳动物的实例包括，例如，兔、大鼠、小鼠、马、山羊或灵长类动物；优选小鼠。
抗体的功能等价物还包括单链抗体片段，也称作单链抗体(scFv)。单链抗体片段是重组多肽，其通常结合抗原或受体；这些片段包含与抗体可变轻链序列(VL)的至少一个片段连接的抗体可变重链氨基酸序列(VH)的至少一个片段，其中具有或没有一个或多个相互连接的接头。这种接头可以是短的、柔性的肽，选择它们来确保VL和VH结构域一旦连接即发生正确的三维折叠，以便维持单链抗体片段所来源的完整抗体的靶分子结合特异性。通常，VL或VH序列的羧基末端通过这种肽接头与互补的VL和VH序列的氨基酸末端共价连接。单链抗体片段可通过分子克隆、抗体噬菌体展示文库或类似技术产生。这些蛋白可在真核生物细胞或原核生物细胞(包含细菌)中产生。
单链抗体片段包含这样的氨基酸序列，其具有在本说明书中描述的完整抗体的至少一个可变区或CDR，但缺少那些抗体的恒定结构域的一些或全部。这些恒定结构域不是抗原结合所必需的，但构成完整抗体结构的主要部分。单链抗体片段可因此克服与使用含恒定结构域的部分或全部的抗体有关的某些问题。例如，单链抗体片段倾向于无生物学分子与重链恒定区之间的不需要的相互作用，或其它不需要的生物学活性。此外，单链抗体片段明显小于完整抗体，且因此比完整抗体具有更大的毛细管通透性，从而允许单链抗体片段局部化，并更有效地结合靶抗原结合部位。另外，抗体片段可在原核细胞中相对大规模地产生，由此促进它们的产生。此外，相对较小的单链抗体片段使它们与完整抗体相比不太可能诱导受体的免疫反应。
功能等价物还包括具有与完整抗体的结合特性相同或可比较的结合特性的抗体片段。这种片段可包含一个或两个Fab片段或F(ab′)2片段。优选地，抗体片段包含完整抗体的全部6个CDR，虽然含有少于所有这样的区域(如3、4或5个CDR)的片段也是功能性的。
此外，功能等价物可以是下列免疫球蛋白种类之一的成员，或可组合所述成员：IgG、IgM、IgA、IgD或IgE，及其亚类。
抗体功能等价物的制备
抗体等价物是通过本领域已知方法制备的。例如，可从完整抗体酶促地制备抗体片段。优选地，抗体等价物是从编码这种等价物的DNA制备的。通过使编码全长抗体所需的DNA部分以外全部缺失，可以制备编码抗体片段的DNA。
通过重组基本上或排它地编码人恒定区的DNA和编码基本上或排它地源自除人以外的哺乳动物的可变区序列的可变区的DNA，可以制备编码嵌合抗体的DNA。通过重组编码除了基本上或排它地源自相应人抗体区的CDR之外的恒定区和可变区的DNA和编码基本上或排它地源自除人以外的哺乳动物的CDR的DNA，可以制备编码人源化抗体的DNA。
编码抗体片段的DNA分子的适宜来源包括表达全长抗体的细胞，如杂交瘤。所述片段本身可作为抗体等价物使用，或可如上所述重组成等价物。
本部分所述的DNA缺失和重组可通过已知方法进行，如在上列公开的专利申请中描述的那些。
抗体筛选和选择
使用标准的本领域已知的方法分离并纯化单克隆抗体。例如，可使用标准的本领域已知的方法，如针对可溶内皮糖蛋白肽抗原的ELISA或蛋白印迹分析，筛选抗体。这种技术的非限制性实例描述在美国专利号6,365,157的实施例II和III中，其引入本文作为参考。
抗体的治疗用途
当体内用于治疗或预防先兆子痫或子痫时，将本发明抗体以治疗有效量施用给受试者。优选地，肠胃外施用所述抗体或通过连续输注静脉内施用所述抗体。给药和剂量方案取决于疾病的严重程度和受试者的整体健康状况。施用的抗体的量通常为约0.001-约10mg/kg受试者体重、优选0.01-约5mg/kg受试者体重。
对于肠胃外施用，将抗体与药学上可接受的肠胃外载体一起配制成单位剂量注射形式(溶液、悬浮液、乳状液)。这种载体本身是无毒且无治疗性的。这种载体的实例是水、盐水、林格液、葡萄糖溶液以及5％人血清清蛋白。还可使用不含水的载体，如固定油以及油酸乙酯。可将脂质体用作载体。所述载体可包含少量添加剂，如提高等渗性和化学稳定性的物质，例如缓冲剂及防腐剂。通常以约1mg/ml-10mg/ml的浓度，在这种载体中配制抗体。
联合疗法
任选地，先兆子痫或子痫治疗可与任何其它标准的先兆子痫或子痫疗法联合施用；这样的方法是熟练的技术人员已知的，且包括美国专利申请公开号20040126828、20050025762和2005017044和PCT公开号WO 2004/008946和WO 2005/077007中所述的方法。
施用的剂量和方式
优选地，在妊娠过程中施用治疗，以用于治疗或预防先兆子痫或子痫，或在妊娠后施用治疗，以治疗产后先兆子痫或子痫。施用技术和剂量依赖于化合物类型(例如，化合物、纯化的蛋白、抗体、反义、RNAi或核酸载体)而变化，且是本领域技术人员熟知的或容易确定的。
本发明的治疗性化合物可与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂一起，以单位剂量形式施用。施用可以是肠胃外、静脉内、皮下、经口或局部直接注射到羊水中。通过连续输注而静脉内递送，是施用本发明治疗性化合物的优选方法。
所述组合物的形式可以是经口施用的丸剂、片剂、胶囊、液体或持续释放的片剂；或用于静脉内、皮下或肠胃外施用的液体；或用于局部施用的聚合物或其它持续释放载体。
用于制备制剂的本领域熟知的方法见，例如，“Remington：TheScience and Practice of Pharmacy”(20th ed.，ed.A.R.GennaroAR.，2000，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，PA)。用于肠胃外施用的制剂可包含，例如，赋形剂、无菌水、盐水、聚(亚烷基)二醇如聚乙二醇、植物来源的油或氢化萘。生物相容的、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，可用于控制化合物的释放。纳米颗粒(nanoparticulate)制剂(例如，可生物降解的纳米颗粒、固体脂类纳米颗粒、脂质体)可用于控制化合物的生物分布。其它潜在有效的肠胃外递送系统包括乙烯乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的输注系统及脂质体。制剂中化合物的浓度取决于多种因素，包含所施用药物的剂量以及施用途径。
所述化合物可任选地作为药学上可接受的盐(如制药工业通常使用的无毒酸加成盐或金属络合物)来施用。酸加成盐的实例包括，有机酸如乙酸、乳酸、双羟萘酸(pamoic)、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸、三氟乙酸等；聚合酸如鞣酸、羧甲基纤维素等；和无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等。金属络合物包括锌、铁等。
用于经口使用的制剂包括，含有与无毒的药学可接受赋形剂相混合的活性成分的片剂。这些赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂或填充物(例如，蔗糖和山梨糖醇)、润滑剂、助流剂和抗结合剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石)。
经口使用的制剂还可以咀嚼片剂的形式提供，或以硬胶囊的形式提供，其中将活性成分与惰性固体稀释剂混合，或以软胶囊的形式提供，其中将活性成分与水或油性介质混合。
施用化合物的剂量和时间选择取决于各种临床因素，包含受试者的整体健康状况和先兆子痫症状的严重程度。一般而言，一旦检测出先兆子痫或发展先兆子痫的倾向，则使用纯化蛋白的连续输注来治疗或预防所述状况的进一步发展。治疗可持续1-100天，更优选1-60天，且最优选1-20天时间段，或直到妊娠结束。剂量可根据每种化合物以及状况的严重程度而变化，并通过滴定来获得稳态的血清浓度，即10-20ng/ml可溶内皮糖蛋白；和/或1-500pg/mL游离VEGF或游离PlGF或二者，优选地1-100pg/mL，更优选地5-50pg/mL、且最优选地5-10pg/mL VEGF或PlGF或1-5ng sFlt-1。
本文所述的诊断方法可以用于监控在治疗过程中的先兆子痫或子痫，或确定治疗性化合物的剂量。在一个实例中，在治疗过程中施用治疗性化合物，并确定PAAI。如果PAAI小于20、优选地小于10，则认为治疗剂量是有效剂量。在另一个实例中，在治疗过程中施用治疗性化合物，并确定可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数。如果可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数小于200、优选地小于100，则认为治疗剂量是有效剂量。
受试者监控
使用本发明的方法和组合物，可以监控患有先兆子痫、子痫或发展这样的状况的倾向的受试者的疾病状况或治疗。例如，监控存在于体液(如尿、血浆、羊水或CSF)中的可溶内皮糖蛋白多肽的表达。可溶内皮糖蛋白监控可以与监控sFlt-1、VEGF或PlGF多肽的表达的方法相结合。这种监控可以用于，例如，评价特定药物在受试者中的功效或评价疾病发展。降低可溶内皮糖蛋白核酸分子或多肽的表达的治疗在本发明中特别有用。
实施例
下面的实施例意在解释本发明。它们无意以任何方式限制本发明。
实施例1.先兆子痫孕妇中提高水平的内皮糖蛋白mRNA和蛋白
在鉴别在先兆子痫中起病理学作用的新的分泌因子的尝试中，我们使用Affymetrix U95A微阵列芯片进行了患有先兆子痫的17位孕妇和13位正常孕妇的胎盘组织的基因表达谱分析。我们发现，内皮糖蛋白的基因在患有先兆子痫的妇女中被上调。
为了证实内皮糖蛋白在先兆子痫中的上调，我们进行RNA印迹以分析与血压正常的孕妇相比的先兆子痫孕妇中的胎盘内皮糖蛋白mRNA水平(图3)，并进行蛋白印迹以测量与血压正常的孕妇相比的先兆子痫孕妇中的内皮糖蛋白的血清蛋白水平(图4)。先兆子痫被定义为：(1)妊娠20周后，收缩血压(BP)＞140mmHg且舒张BP＞90mmHg，(2)新发作的蛋白尿(利用测验片进行尿分析为1+，24小时尿收集中的蛋白＞300mg，或随机的尿蛋白/肌酸酐比＞0.3，和(3)产后12周，高血压及蛋白尿消除。排除患潜在的高血压、蛋白尿或肾病的患者。基于是否存在肾炎范围的蛋白尿(24小时尿收集中的蛋白＞3g或尿蛋白/肌酸酐比大于3.0)，将患者分成轻度先兆子痫和重度先兆子痫。轻度先兆子痫组中的平均尿蛋白/肌酸酐比为0.94+/-0.2，而重度先兆子痫组为7.8+/-2.1。各组的平均胎龄如下：正常38.8+/-0.2周、轻度先兆子痫34+/-1.2周、重度先兆子痫31.3+/-0.6周和早产的29.5+/-2.0周。分娩后立即获得胎盘样品。从每个胎盘随机采集4份样品，放在RNA later稳定溶液(Ambion，Austin，TX)中，并在-70℃贮藏。使用Qiagen RNAeasy Maxi试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行RNA分离。
用内皮糖蛋白的编码区中的400碱基对探针(UnigeneHs.76753)和作为标准化对照的GAPDH探针探测的RNA印迹显示了胎盘内皮糖蛋白mRNA的增加。用内皮糖蛋白氨基末端的抗体探测的蛋白印迹显示了与血压正常的孕妇相比，先兆子痫孕妇中内皮糖蛋白蛋白的胎盘和产妇血清水平两者的增加。
实施例2.证实先兆子痫患者的胎盘和血清中的可溶内皮糖蛋白多肽
用于测量先兆子痫妇女的胎盘和血清中的内皮糖蛋白蛋白水平的蛋白印迹分析提示了更小的蛋白(63kDa)的存在，它存在于先兆子痫孕妇的胎盘和血清中。我们已经证实，该更小的片段是内皮糖蛋白的胞外结构域。该截短形式可能是从胎盘合胞体滋养层(syncitiotrophoblast)和内皮细胞流出的，并在先兆子痫患者中过量地循环。该可溶形式的内皮糖蛋白可以通过结合正常血管健康必需的循环配体，起抗血管生成剂的作用。
实施例3.具有正常妊娠的妇女对先兆子痫妊娠的妇女中的可溶内皮糖蛋白的循环浓度
为了对比正常的、轻度先兆子痫或重度先兆子痫妇女的血清中的循环的可溶内皮糖蛋白的水平，我们对取自这些妇女的血液样品进行了ELISA分析。以是否存在肾炎范围的蛋白尿(24小时尿收集中的蛋白＞3g或尿蛋白/肌酸酐比大于3.0)为基础，将患者分成轻度和重度先兆子痫。轻度先兆子痫组中的平均尿蛋白/肌酸酐比是0.94+/-0.2，而重度先兆子痫组是7.8+/-2.1(图5)。如前所述(Maynard等，J.Clin.Invest.111：649-658，2003)，使用从R&D Systems，MN(目录号DNDG00)商业上得到的ELISA试剂盒，进行ELISA。
实施例4.血管生成的模型测定
内皮管测定可以用作血管生成的体外模型。将生长因子减少的Matrigel(7mg/mL，Collaborative Biomedical Products，Bedford，MA)放在预冷的48孔细胞培养平板的孔(100μl/孔)中，并在37℃温育25-30分钟，以允许聚合。用10％患者血清处理第3-5代人脐静脉内皮细胞(30,000+在300μl没有血清的内皮基础培养基中，Clonetics，Walkersville，MD)，铺平板到Matrigel包被的孔上，并在37℃温育12-16小时。然后通过4X倒置相差显微镜(NikonCorporation，Tokyo，日本)评价管形成，并使用Simple PCI成像分析软件进行分析(管面积和总长度)。
实施例5.作为妇女的先兆子痫和子痫的诊断指标的可溶内皮糖蛋白蛋白水平(Romero研究)
该研究设计用于评价在临床先兆子痫的过程中是否改变可溶内皮糖蛋白和它是否可以用于预测妇女的先兆子痫和子痫。
在Wayne State University/NICHD Perinatology Branch，Detroit，MI的Roberto Romero博士的协助下，完成了该研究。如Chaiworapongsa等(The Journal of Maternal-Fetal and NeonatalMedicine，January 2005，17(1)：3-18)以前所述，使用库存的生物学样品数据库，进行了回顾纵向案例对照研究。所有妇女都在Sotero del Rio Hospital，Santiago，智利登记产前临床，并直到分娩。在前和次三个月中，以4-周时间间隔安排产前诊断，且在第三个三个月直至分娩，每2周安排产前诊断。对于下面的6个时间间隔中的每一个，只选择每位患者的血浆样品一次：妊娠的(1)7-16周，(2)16-24周，(3)24-28周，(4)28-32周，(5)32-37周，和(6)＞37周。对于每个先兆子痫病例，通过在临床诊断先兆子痫时的胎龄(+/-2周)匹配，选择一个对照。诊断先兆子痫的临床标准与上面的Chaiworapongsa等以前所述的相同。
血浆内皮糖蛋白水平的测量
将保藏在-70℃的血浆样品解冻，并使用从R&D systems，Minneapolis，MN.(目录号DNDG00)商业上得到的ELISA试剂盒，测量一批血浆可溶内皮糖蛋白水平。
统计学分析
使用协方差分析来评价在调整血液取样的胎龄和样品保藏时间间隔后，注定发展先兆子痫的患者和正常妊娠之间的可溶内皮糖蛋白的血浆浓度差异。使用卡方或Fisher准确检验来对比比例。使用的统计包是SPSS V.12(SPSS Inc.，Chicago，IL)。假定的显著性为p值小于0.05。
结果
在表1中描述了研究群体的临床特征。患有先兆子痫的组包括比对照组更多的未经产的妇女，且比对照组更早分娩。重要的是，先兆子痫组的胎儿出生重量更小，且存在更高比例的携带小于胎龄儿(SGA)婴儿的妇女。
表1.研究群体的临床特征
    正常妊娠n＝44   先兆子痫n＝44     p
年龄(岁)未经产抽烟分娩时的GA(周)出生重量(克)出生重量＜第10百分位     29±611(25％)10(22.7％)39.7±1.13,372±3830   26±630(68.2％)1(2.3％)36.9±2.72,710±76616(36.4％)     0.04*＜0.001*0.007*＜0.001*＜0.001*＜0.001*
将值表达为平均值±标准差或数字(％)
GA：胎龄
在表2中描述了患有先兆子痫的患者的临床特征。32位(72％)患者患有重度先兆子痫，而10位患者患有严重的早发先兆子痫，确定其发作＜34周。
表2.患有先兆子痫的患者的临床特征
血压(mmHg)收缩舒张平均动脉压蛋白尿(测验片)天冬氨酸转氨酶α(SGOT)(U/L)血小板计数β(×103)(μ/L)重度先兆子痫诊断先兆子痫时的GA≤34周诊断先兆子痫时的GA≥37周 155±15100±8118±93±0.829±31206±5932(72.7％)10(22.7％)27(61.4％)
将值表达为平均值±标准差或数字(％)
α(n＝26)；β(n＝42)
在表3中显示了在6胎龄窗口中测量的对照和先兆子痫妇女的血清可溶内皮糖蛋白水平。在先兆子痫中，将它们的样品分成2组：临床先兆子痫(在先兆子痫症状时采取的样品)和临床前先兆子痫(在临床症状之前采取的样品)。数据表明，在中期妊娠(妊娠的24-28周)时，注定发展先兆子痫的妇女中的血清可溶内皮糖蛋白浓度开始升高，并在妊娠28-32周变成对照的至少3倍。当与胎龄匹配的对照相比较时，从患有临床先兆子痫的妇女采取的血液样品显示出非常急剧的(几乎10-15倍)升高。
表3.正常妊娠和先兆子痫的血浆可溶内皮糖蛋白浓度
 正常妊娠   p   临床前样品先兆子痫     p  临床样品先兆子痫  pβ
第1次血液取样(7.1-16周)可溶内皮糖蛋白(ng/ml)胎龄(周)范围第2次血液取样(16.1-24周)可溶内皮糖蛋白(ng/ml)胎龄(周)范围第3次血液取样(24.1-28周)可溶内皮糖蛋白(ng/ml)胎龄(周)范围第4次血液取样(28.1-32周)可溶内皮糖蛋白(ng/ml)胎龄(周)范围第5次血液取样(32.1-36.9周)可溶内皮糖蛋白(ng/ml)胎龄(周)范围第6次血液取样(＞＝37周)可溶内皮糖蛋白(ng/ml)胎龄(周)范围 3.89±.92812.3±2.28.4-15.9n＝373.36±1.1119.4±1.716.3-23.4n＝443.18±.72925.9±1.324.1-28.0n＝383.7±1.129.9±1.128.3-32.0n＝425.79±2.4234.7±1.332.4-36.6n＝378.9±4.539.4±1.037.0-40.7n＝27 0.90.20.10.060.009*0.2＜0.001*1.00.003*1.0 3.96±1.2811.6±2.47.7-15.1n＝343.79±1.3720.2±2.116.7-24.0n＝365.27±4.1226.4±1.124.6-28.0n＝2910.2±9.830.2±1.028.7-32.0n＝3310.51±6.5934.8±1.532.6-36.7n＝20- 0.01*1.0＜0.001*1.0 96.1±25.730.4±1.429.4-31.4n＝2δ43.14±25.634.5±1.232.6-36.6n＝1315.23±10.6138.8±1.137.6-41.4n＝27 0.051.0＜0.001*1.00.006*0.05
pβ：在先兆子痫的临床表现时和正常妊娠的样品之间比较
将值表达为平均值±标准差
δ2位先兆子痫患者在临床表现时不能获得血液样品
为了检查血浆可溶内皮糖蛋白浓度和临床诊断先兆子痫的时间间隔之间的关系，根据从血液采样到临床诊断的时间间隔，将处于不同胎龄的先兆子痫患者的血浆样品分成5组：(1)在临床诊断时，(2)临床表现前2-5.9周，(3)临床表现前6-10.9周，(4)临床表现前11-15.9周，和(5)临床表现前16-25周。表4中的数据证实，在注定发展先兆子痫的妇女中，在发作先兆子痫症状之前6-10.9周，血浆可溶内皮糖蛋白水平开始升高，且在出现症状之前2-5.9周，是至少3倍。
表4.正常和先兆子痫孕妇中的血浆可溶内皮糖蛋白浓度
血液取样   正常妊娠   先兆子痫   p
在临床表现时可溶内皮糖蛋白(ng/ml)胎龄(周)范围临床表现前2-5.9周可溶内皮糖蛋白(ng/ml)胎龄(周)范围临床表现前的时间间隔(周)临床表现前6-10.9周可溶内皮糖蛋白(ng/ml)胎龄(周)范围临床表现前的时间间隔(周)临床表现前11-15.9周可溶内皮糖蛋白(ng/ml)胎龄(周)范围临床表现前的时间间隔(周)临床表现前16-25周内皮糖蛋白(ng/ml)胎龄(周)范围临床表现前的时间间隔(周) 7.63±4.2237.2±3.028.9-40.7n＝424.67±2.3231.6±3.824.1-36.3n＝273.61±1.0528.5±2.919.7-32.6n＝373.35±0.7724.5±3.117.6-27.9n＝193.44±1.0717.6±3.59.1-23.4n＝42 27.72±26.2037.1±2.729.4-41.4n＝42δ15.07±10.1532.8±2.827.1-36.7n＝273.8±1.15.89±3.0728.5±2.919.6-34.4n＝378.3±1.43.57±0.9224.2±3.317.7-28.0n＝1913.2±1.33.69±1.1816.5±4.58.0-22.7n＝4220.6±3.6 ＜0.001*0.9＜0.001*0.2＜0.001*0.90.50.80.30.2
将值表达为平均值±标准差
δ2位先兆子痫患者在临床表现时不能获得血液样品
为了检查血浆可溶内皮糖蛋白浓度鉴别注定发展先兆子痫的患者的诊断潜力，将患者分成早发先兆子痫(PE＜34周)和晚发先兆子痫(PE＞34周)。对于患有早发先兆子痫的患者，从妊娠的约16-24周开始，先兆子痫(临床诊断前)的平均血浆可溶内皮糖蛋白水平显著高于正常妊娠(表5)，其中在24-28周和28-32周妊娠窗口中具有非常大的不同。相反地，对于患有晚发先兆子痫的患者，仅仅在28-32周，临床前先兆子痫的血浆可溶内皮糖蛋白浓度显著高于正常妊娠，其中在妊娠的32-36周具有非常大的不同(表6)。
表5.正常孕妇和在妊娠34周或更早发展临床先兆子痫的患者中的血浆可溶内皮糖蛋白浓度
  正常妊娠   p   临床前样品先兆子痫   p     临床样品先兆子痫δ  pβ
第1次血液取样(7.1-16周)可溶内皮糖蛋白(ng/ml)胎龄(周)范围第2次血液取样(16.1-24周)可溶内皮糖蛋白(ng/ml)胎龄(周)范围第3次血液取样(24.1-28周)可溶内皮糖蛋白(ng/ml)胎龄(周)范围第4次血液取样(28.1-32周)可溶内皮糖蛋白(ng/ml)胎龄(周)范围第5次血液取样(32.1-36.9周)可溶内皮糖蛋白(ng/ml)胎龄(周)范围 3.89±.92812.3±2.28.4-15.9n＝37336±1.1119.4±1.716.3-23.4n＝443.189±.72925.9±1.324.1-28.0n＝383.70±1.1029.9±1.128.3-32.0n＝425.79±2.4234.7±1.332.4-36.6n＝37 0.70.40.02*0.7＜0.001*0.03*0.01*1.0 3.81±1.1111.6±2.68.0-15.1n＝84.60±1.7219.8±2.917.3-23.9n＝710.22±6.1726.8±0.626.0-27.3n＝617.66±8.929.7±1.128.7-31.3n＝6 0.008*1.0 96.10±25.7630.4±1.429.4-31.4n＝2δ53.38±32.0933.5±0.532.6-34.0n＝6 0.051.00.001*＜0.001*
pβ：在先兆子痫的临床表现时和正常妊娠的样品之间比较
将值表达为平均值±标准差
δ：2位先兆子痫患者在临床表现时不能获得血液样品
表6.正常孕妇和先兆子痫患者(妊娠34周)中的血浆可溶内皮糖蛋白浓度
  正常妊娠     p   临床前样品先兆子痫  p   临床样品先兆子痫  pβ
第1次血液取样(7.1-16周)可溶内皮糖蛋白(ng/ml)胎龄(周)范围第2次血液取样(16.1-24周)可溶内皮糖蛋白(ng/ml)胎龄(周)范围第3次血液取样(24.1-28周)可溶内皮糖蛋白(ng/ml)胎龄(周)范围第4次血液取样(28.1-32周)可溶内皮糖蛋白(ng/ml)胎龄(周)范围第5次血液取样(32.1-36.9周)可溶内皮糖蛋白(ng/ml)胎龄(周)范围第6次血液取样(＞＝37周)可溶内皮糖蛋白(ng/ml)胎龄(周)范围 3.89±.92812.3±2.28.4-15.9n＝373.36±1.1119.4±1.716.3-23.4n＝443.18±.72925.9±1.324.1-28.0n＝383.70±1.1029.9±1.128.3-32.0n＝425.79±2.4234.7±1.332.4-36.6n＝378.98±45.1239.4±1.037.0-40.7n＝27 0.90.20.40.04*0.10.40.001*02＜0.001*1.0 4.01±1.3511.6±2.47.7-15.1n＝263.59±1.2320.3±1.916.7-24.0n＝293.98±2.1326.3±1.124.6-28.0n＝238.57±9.4530.3±1.028.7-32.0n＝2710.51±6.5934.8±1.532.6-36.7n＝20- ＜0.001*0.9 34.36±16.3035.4±0.934.3-36.6n＝715.23±10.6138.8±1.137.6-41.4n＝27 ＜0.001*0.70.006*0.05
pβ：在先兆子痫的临床表现时和正常妊娠的样品之间比较
将值表达为平均值±标准差
总结
这些实验的结果证实，当与胎龄匹配的对照相比较时，患有临床先兆子痫的妇女具有非常高水平的循环可溶内皮糖蛋白。结果还证实，注定发展先兆子痫(临床前先兆子痫)的妇女具有比预测正常妊娠的妇女更高的血浆可溶内皮糖蛋白水平。在发作临床症状前至少6-10周，可以检测到可溶内皮糖蛋白水平的增加。最后，这些结果证实，早发和晚发先兆子痫都具有升高的循环可溶内皮糖蛋白浓度，但是该变化在早发先兆子痫中更显著。
实施例6.作为妇女的先兆子痫和子痫的诊断指标的可溶内皮糖蛋白蛋白水平(CPEP研究)
如上所述，我们已经发现，在先兆子痫胎盘中，上调可溶内皮糖蛋白，即一种促血管生成蛋白TGF-β的细胞表面受体，并在内皮和合胞体滋养层上表达。在上述实验中，我们已经表明，在先兆子痫中，过量的可溶内皮糖蛋白通过胞外结构域的脱落，从胎盘释放进循环中；可溶内皮糖蛋白然后可以与sFlt1(一种结合胎盘生长因子(PlGF)和VEGF的抗血管生成因子)协同作用，以造成内皮功能障碍。为了检验该假说，我们将发展先兆子痫的妇女和患有其它妊娠并发症(如妊娠高血压(GH)和并发小于胎龄儿(SGA)婴儿的妊娠)的那些妇女在整个妊娠过程中的可溶内皮糖蛋白、sFlt1和游离PlGF的血清浓度，与具有血压正常的对照妊娠的妇女的所述浓度进行了对比。在NIH的Richard Levine博士的协助下完成了该研究。
该研究有两个基本目的。第一个目的是，确定与血压正常的对照相比，在发作先兆子痫和其它妊娠病症(如妊娠高血压或并发小于胎龄儿(SGA)婴儿的妊娠)之前，是否可以检测到升高的可溶内皮糖蛋白、sFlt1的血清浓度，和降低的PlGF水平。第二个目的是，在患有先兆子痫、妊娠高血压或SGA的妇女中，其中分别检查在发作临床症状之前和之后得到的样品，和在血压正常对照中，描述可溶内皮糖蛋白、sFlt-1和游离PlGF的产妇血清浓度相对于胎龄的时间进程。
方法
临床信息
该研究是4,589位参与钙预防先兆子痫试验(Calcium for Pre-eclampsia Prevention trial)(CPEP)的健康未经产妇女群体(cohort)中嵌套(nested)的妊娠并发症(过早的先兆子痫、足孕先兆子痫、妊娠高血压、具有SGA婴儿的妊娠、血压正常的对照妊娠)的病例对照研究。从每个研究组中，选择120个随机病例。研究方法与最近进行的先兆子痫的嵌套病例对照研究相同(Levine等，N.Eng.J.Med.2004，350：672-83)。从每个妇女得到研究登记之前(13-21周)、在26-29周、在36周和在怀疑高血压或蛋白尿时的血液样品。在生产和分娩开始之前的妊娠过程中的任何时间收集的所有血清样品都适合用于研究。病例包括120位妇女，其发展足孕先兆子痫、妊娠高血压或SGA，且其分娩活产或死产男婴(无已知的结构或染色体异常)，且从她们得到基线血清样品。对于过早的先兆子痫，研究了来自CPEP群体的定义为(PE＜37周)的所有72位患者。在上面的Levine等(2004)中，描述了诊断先兆子痫的临床标准。在从发作妊娠高血压前1天至随后7天的时间间隔中，要求所有妊娠高血压病例都具有正常的尿蛋白测量。使用Zhang&Bowes的胎龄出生重量表，它是种族、未经产和婴儿性别特异性的，将SGA定义为＜第10和＜第5(严重SGA)百分位。从分娩活产或死产婴儿(无已知的主要的结构畸形或染色体异常)的没有先兆子痫或妊娠高血压或SGA的妇女，随机地选择对照，并一个对照对应一个病例地匹配临床中心、在收集第一个血清样品时的胎龄(±1周)、冷冻贮藏时间(±1年)和冻融次数。共研究了1674个血清样品。进行胎龄的匹配，以控制sFlt-1、VEGF和PlGF水平的胎龄-相关的差异。进行冷冻贮藏时间的匹配，以使由冷冻贮藏过程中可能的降解引起的差异最小化。进行临床中心的匹配，以控制先兆子痫比率在不同中心之间显著不同的事实，这可能是由于疾病的病理生理学的差异。此外，中心可能使用略有不同的收集、制备和保藏样品的方法。还进行融化次数的匹配，以确保病例和对照已经同等地进行冻融降解。
ELISA测量
由不知道临床结果的单个研究助理，在Karumanchi实验室中进行各种血管生成标记的ELISA。
从R&D systems(Minneapolis，MN)得到可溶内皮糖蛋白(DNDG00)、sFlt1(DVR100)、PlGF(DPG00)的商业上可得到的ELISA试剂盒。
统计学分析
使用T-检验来对比对数变换后的各种测量值，以确定显著性。认为P＜0.05是统计学上显著的。
结果
在图6-8中，显示了在如该方法中所述的各个胎龄组窗口期间，5个不同研究组的妊娠妇女在整个妊娠中的平均可溶内皮糖蛋白(图6)、sFlt1(图7)和PlGF(图8)浓度。对于先兆子痫组和妊娠高血压组，在这里未显示在发作临床症状后采取的样品。与胎龄-匹配的对照样品相比，从过早的先兆子痫前9-11周开始，可溶内皮糖蛋白和sFlt1升高，且游离PlGF降低，在先兆子痫发作后，分别达到5倍(46.4vs9.8ng/ml，P＜.0001)、3倍(6356vs2316pg/ml，P＜.0001)和1/4(144vs546pg/ml，P＜.0001)的水平。对于足孕先兆子痫，可溶内皮糖蛋白从12-14周开始升高，游离PlGF从9-11周开始降低，且sFlt1在先兆子痫发作前＜5周升高。在妊娠10-42周，sFlt1和游离PlGF的血清浓度在具有SGA或平均胎龄儿/大于胎龄儿(AGA/LGA)婴儿的妊娠之间没有显著差异。从17-20周开始，SGA妊娠的血清可溶内皮糖蛋白适度增加(7.2vs5.8ng/ml，P＝.03)，与AGA/LGA妊娠中的12.9ng/ml相比，在轻度和严重SGA的37-42周，分别达到15.7和43.7ng/ml的浓度(严重SGA vs AGA/LGA，P＝.002)。在妊娠高血压研究中，与GA-匹配的对照样品相比，在妊娠高血压前＜1-5周，可溶内皮糖蛋白的适度增加是显而易见的，在发作妊娠高血压后，达到可溶内皮糖蛋白的2倍的水平(29.7vs12.5ng/ml，P＝.002)。在21-32周得到的样品的调整的随后早产PE的优势比(odds ratio)，与所有其它四分位相比，是对照可溶内皮糖蛋白浓度的最高四分位(＞7.2ng/ml)，为9.8(95％CI 4.5-21.5)。
将先兆子痫的可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数定义为(sFlt1+0.25可溶内皮糖蛋白)/PlGF。在贯穿5个不同研究组的各个胎龄组中，计算该指数。在图9中显示了在临床症状之前采取的样品的先兆子痫抗血管生成的可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数。早在妊娠17-20周时，观察到升高的可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数值，并似乎随着妊娠向严重过早的先兆子痫的发展，变得更急剧。在足孕先兆子痫、SGA和GH中，当与对照妇女相比较时，在妊娠末期(33-36周)存在适度升高。
图10和11描述了根据临床过早的先兆子痫(PE＜37周)之前的周数，可溶内皮糖蛋白的平均浓度(图10)和可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数(图11)。甚至早在发作过早的先兆子痫之前的9-11周，注定发展先兆子痫的妇女的可溶内皮糖蛋白和可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数升高2-3倍，其中在临床症状之前的1-5周急剧升高(＞5倍)。
图12和13显示了在症状之前和之后，在贯穿足孕先兆子痫(PE＞37周)的妊娠中，可溶内皮糖蛋白(图12)和可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数(图13)的变化。从妊娠33-36周开始，观察到可溶内皮糖蛋白和可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数的升高，在临床先兆子痫时达到平均2倍的水平。
图14和15显示了当与血压正常的对照相比较时，在妊娠高血压期间、在妊娠高血压之前1-5周(在妊娠的33-36周期间)的妇女中测得的可溶内皮糖蛋白(图14)和可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数(图15)的适度升高。
图16和17显示了当与对照妊娠相比较时，在33-36周妊娠窗口期间，在患有严重SGA的妇女且不是所有患有SGA的妇女中测得的可溶内皮糖蛋白(图16)和可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数(图17)的适度升高。
总结
该研究的结果表明，当与正常对照妊娠相比较时，在妊娠33周之前测量时，在注定发展过早的先兆子痫的妇女和患有临床过早的先兆子痫(PE＜37周)的妇女中的可溶内皮糖蛋白水平和可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数水平急剧升高。因此可溶内皮糖蛋白水平和可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数水平(在33周之前)不仅可以用于诊断过早的先兆子痫，而且可以用于预测先兆子痫。似乎早在先兆子痫症状之前10-12周，可溶内皮糖蛋白水平和可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数水平就开始升高。
当在妊娠晚期(33-36周妊娠窗口)测量时，可溶内皮糖蛋白水平和可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数水平在足孕先兆子痫(PE＞37周)中也显著升高，并在妊娠高血压和严重SGA中适度升高。因此，当在妊娠33周之后测量时，可溶内皮糖蛋白水平和可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数水平也可以用于鉴别其它妊娠并发症，如SGA和妊娠高血压。
实施例7.可溶内皮糖蛋白参与先兆子痫的发病机理
我们已经表明，在先兆子痫胎盘中，上调可溶内皮糖蛋白，即一种促血管生成蛋白TGF-β的细胞表面受体，并在内皮和合胞体滋养层上表达。我们还已经表明，在先兆子痫中，过量的可溶内皮糖蛋白通过胞外结构域的脱落，从胎盘释放进循环中。下面所述的实验用于检验下述假说，即可溶内皮糖蛋白可以与sFlt1(一种结合胎盘生长因子(PlGF)和VEGF的抗血管生成因子)协同作用，以造成内皮功能障碍。
材料和方法
试剂
从R&D systems(Minneapolis，MN)得到重组人内皮糖蛋白、人sFlt1、小鼠内皮糖蛋白、小鼠sFlt1、人TGF-β1、人TGF-β3、小鼠VEGF。从Santa Cruz Biotechnology，Inc.得到针对人内皮糖蛋白N-末端区的小鼠单克隆抗体(目录号sc 20072)和多克隆抗体(sc20632)。从R&D systems，MN得到人sFlt1、小鼠sFlt1和人可溶内皮糖蛋白的ELISA试剂盒。
腺病毒的产生
以前已经描述了针对sFlt1的腺病毒和对照腺病毒(CMV)(Maynard等，J.Clin.Invest.111：649：658(2003))，并在RichardMulligan博士的协助下，在Harvard Medical Core facility产生。为了产生可溶内皮糖蛋白腺病毒，我们使用了Adeasy试剂盒(Stratagene)。简而言之，使用人cDNA全长内皮糖蛋白克隆(Invitrogen，CA)作为模板，并使用下面的寡核苷酸作为引物，PCR扩增了人可溶内皮糖蛋白(Thr 27-Leu 586)：正向5′-ACG AAG CTTGAA ACA GTC CAT TGT GAC CTT-3′(SEQ ID NO：3)，和反向5′TTA GAT ATC TGG CCT TTG CTT GTG CAA CC-3′(SEQ ID NO：4)。将扩增的PCR片段首先亚克隆进pSecTag2-B(Invitrogen，CA)，并确认DNA序列。使用pSecTag2 B-可溶内皮糖蛋白作为模板，PCR扩增编码His-标记的人可溶内皮糖蛋白的哺乳动物表达构建体，并亚克隆进pShuttle-CMV载体(Stratagene；Kpn1和Sca1位点)，即一种腺病毒转移载体，以用于进行腺病毒产生。然后，使用根据生产商说明书的标准操作规程，产生表达可溶内皮糖蛋白(sE)的腺病毒，并通过蛋白印迹确认表达。然后，如以前所述的(Kuo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：4605-4610(2001))，在293细胞上扩增证实的克隆，并在CsCl2密度梯度上进行纯化。通过光学吸光度方法(Sweeney等，Virology，2002，295：284-288)，滴定最终产物。以从以前使用基于标准噬斑稀释的滴定测定试剂盒(BD Biosciences Clontech，PaloAlto，CA，Cat.No.Kl 653-1)和光学吸光度方法滴定的病毒制备物(prep)衍生的公式为基础，将效价表达为噬斑形成单位(pfu)/mL。
患者
在得到适当的IRB-批准的同意后，在Beth Israel DeaconessMedical Center招募该研究的所有患者。将先兆子痫定义为：(1)以前血压正常的患者在妊娠20周后，收缩BP＞140且舒张BP＞90，(2)新发作的蛋白尿(利用测验片进行尿分析为1+，或24-小时尿收集中的蛋白＞300mg，或随机的尿蛋白/肌酸酐比＞0.3)，和(3)产后12周高血压及蛋白尿消除。排除患有基线高血压、蛋白尿或肾病的患者。为了该研究的目的，以是否存在肾病范围的蛋白尿(24小时尿收集中的蛋白＞3g或尿蛋白/肌酸酐比大于3.0)为基础，将患者分成轻度和重度先兆子痫。当患者具有血小板减少症(＜100000细胞/μl)、升高的LDH(＞600IU/L)和升高的AST(＞70IU/L)的迹象时，定义为HELLP综合征。包含健康的孕妇作为对照。包含8位因为其它医学原因早产的患者作为另外的对照。在分娩后立即得到胎盘样品。在征得知情的同意后，在分娩时(分娩胎盘之前0-12小时)，从妊娠患者收集血清。这些实验得到了Beth Israel Deaconess Medical Center的Institutional Review Board的批准。
ELISA和蛋白印迹
使用来自R&D systems，MN的商业试剂盒，根据生产商的说明书，进行各种蛋白(sFlt1，可溶内皮糖蛋白)的ELISA。如别处所述(Maynard等，同上)，使用蛋白印迹和ELISA来检查大鼠血浆中腺病毒感染的转基因的表达。
免疫沉淀(IP)实验
将随后为蛋白印迹的IP用于鉴别和表征先兆子痫患者的胎盘组织和血清样品中的可溶内皮糖蛋白。用冷PBS洗涤人胎盘组织，并在匀浆缓冲液[10mM Tris-HCl，pH 7.4；15mM NaCl；60mM KCl；1mM EDTA；0.1mM EGTA；0.5％NonidetP-40；5％蔗糖；购自Roche(Indianapolis，IN)的蛋白酶混合物]中裂解10分钟。然后，用抗人单克隆小鼠内皮糖蛋白抗体(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，SantaCruz，CA)，对胎盘裂解物进行免疫沉淀。根据生产商的说明书，使用免疫纯的IgG定向试剂盒(Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois，美国)，通过定向偶联3-5mg纯化的抗体到2ml A蛋白-琼脂糖上，制备免疫亲和柱。然后，用含有蛋白酶混合物的RIPA缓冲液充分洗涤柱，并用0.1mol/L甘氨酸-HCl缓冲液pH 2.8洗脱结合的蛋白。将洗脱液收集在含有1mol/L Tris-HCl缓冲液的0.5-ml级分中。合并含有蛋白的级分，并用CENTRICON离心浓缩器(MilliporeCorp.，Bedford，Massachusetts，美国)浓缩9至10倍。在4-12％梯度凝胶(Invitrogen)上分离免疫沉淀的样品，并将蛋白转移到聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)膜上。使用多克隆抗人兔内皮糖蛋白第一抗体(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)，通过蛋白印迹检测内皮糖蛋白蛋白。
内皮管测定
将生长因子减少的matrigel(7mg/mL，Collaborative BiomedicalProducts，Bedford，MA)放在预冷的48孔细胞培养平板的孔(100l/孔)中，并在37℃温育30分钟，以允许聚合。用重组蛋白的各种组合(可溶内皮糖蛋白、sFlt1或二者)处理HUVEC细胞(30,000+在300μl没有血清的内皮基础培养基中，Clonetics，Walkersville，MD)，铺平板到Matrigel包被的孔上，并在37℃温育12-16小时。然后通过4X倒置相差显微镜(Nikon Corporation，Tokyo，日本)评价管形成，并使用Simple PCI成像分析软件进行定量分析(管面积和总长度)。
微血管通透性实验
经眶后静脉丛，给Balb-C小鼠注射1×108pfu表达GFP或可溶内皮糖蛋白或sFlt1或其组合的腺病毒，并在48小时后进行微血管通透性测定。通过腹膜内(IP)注射0.5ml阿佛丁，麻醉小鼠。将100ml 1％伊文思蓝染料(溶于PBS中)注射进尾静脉。40分钟后，通过心脏穿刺，给小鼠灌注含有2mM EDTA的PBS 20分钟。收获器官(脑、肺、肝、肾)，并在甲酰胺中温育3天，以洗脱伊文思蓝染料。使用620nm波长，测量甲酰胺溶液的OD。
肾微血管反应性实验
使用大鼠肾微血管(70-170μm内径)，如以前所述(Maynard等，同上)，进行微血管反应性实验。在所有实验组中，在用U46619(血栓烷激动剂)预收缩微血管至在40mmHg扩张压下的基线直径的40-60％后，检查肾微血管的松弛反应。一旦达到稳定状态张力，就以标准化的次序，检查对各种试剂(如TGF-β1或TGF-β3或VEGF)的反应。所有药物都是腔外地(extraluminally)施用的。
动物模型
通过尾静脉注射，给妊娠的和非妊娠的Sprague-Dawley大鼠注射2×109pfu腺病毒(Ad CMV或Ad sFlt1或Ad sE或Ad sFlt1+AdsE)。在妊娠的第8-9天(次三个月早期)注射妊娠的大鼠，并在妊娠的第16-17天(第三个三个月早期)测量血压。用戊巴比妥钠(60mg/kg，腹膜内地(i.p.))麻醉之后，测量大鼠的血压。分离颈动脉，并插入与压力转换器(Millar Instruments，Houston，TX)相连的3-Fr高保真度微尖(microtip)导管。记录血压，并求10分钟时间段内的平均值。在安死术之前得到血液、组织和尿样品。在测量血压的当天(注射腺病毒后第8天)，测量血浆水平，从而认识到腺病毒注射后7-10天与这些蛋白的表达的峰水平相对应。通过蛋白印迹，初步证实了循环sFlt-1和可溶内皮糖蛋白水平，然后使用商业上可得到的鼠ELISA试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，MN)进行定量。通过两个标准测验片，测量两种尿清蛋白，并使用商业上可得到的大鼠清蛋白ELISA试剂盒(Nephrat试剂盒，Exocell Inc，Philadelphia，PA)，通过竞争性酶联免疫测定进行定量。使用苦味酸比色方法试剂盒(Metra肌酸酐测定试剂盒，Quidel Corp，SanDiego，CA)，测量尿肌酸酐。使用商业上可得到的试剂盒(ThermoElectron，Louisville，CO)，测量AST和LDH。使用自动血细胞计数器(Hemavet 850，Drew Scientific Inc，Oxford，CT)，测量来自大鼠血液的血小板计数。对血液外周涂片进行瑞特染色，以检测循环血液中的裂红细胞。测量血压和收集样品后，处死大鼠，并收获器官用于组织学。计数产仔数，并称量单个胎盘和胎儿的重量。将收获的肾置于布安氏液中，用石蜡包埋，切片，并用H&E、PAS或Masson氏三色染料染色。
统计学对比
将结果表达为平均值±平均值的标准误(SEM)，并通过使用ANOVA分析方差，进行多个组之间的对比。当p＜0.05时，报告显著差异。
结果
先兆子痫患者中升高的可溶内皮糖蛋白
使用表7所述患者的血清样品，我们测量了各个组的先兆子痫患者和对照妊娠患者中的可溶内皮糖蛋白的循环浓度。
表7：各个患者组的临床特征和循环可溶内皮糖蛋白
正常(n＝30) 轻度先兆子痫(n＝11)   重度先兆子痫，无HELLP(n＝17)   重度先兆子痫有HELLP(n＝11) 早产(n＝8)
产妇年龄(岁)胎龄(周)初产(％)收缩血压(mmHg)舒张血压(mmHg)蛋白尿(g蛋白/g肌酸酐)尿酸(mg/dl)血细胞比容(％)血小板计数肌酸酐(mg/dl)可溶内皮糖蛋白(ng/ml) 32.4338.6543.3122720.375.2735.52380.5518.73   33.1831.91*63.6157*99*2.5*6.2433.62300.6236.12*   29.529.06*47.1170*104*8.64*7.29*33.72490.6252.55*   33.7326.52*90.9166*103*5.16*6.3133.569.4*0.6499.83***   31.8830.99*62.5123770.67.3534.32290.6710.9
*P＜0.05，**P＜0.005
在轻度先兆子痫中，可溶内皮糖蛋白的平均血清浓度至少高2倍，而在重度先兆子痫患者中高3-4倍。在并发HELLP综合征的先兆子痫患者中，可溶内皮糖蛋白浓度为胎龄匹配的对照样品的至少5-10倍。另外，妊娠患者中的可溶内皮糖蛋白水平与sFlt1水平相关联(图18)。关联的R2值是0.6。(应当指出，这里报道的sFlt-1循环浓度是以前公布的至少4-5倍(Maynard等，同上)。这是由于来自R&D systems的新ELISA试剂盒的灵敏度的差异，其在测定稀释液中缺少尿素，因此总是产生比以前公布的更高的值)。换而言之，具有最高水平的可溶内皮糖蛋白的患者也具有最高循环水平的sFlt1。可溶内皮糖蛋白的起源最可能是胎盘的合胞体滋养层，如在我们的胎盘免疫组织化学上看到的增强染色所证实的(图19和20)。这些图表明，内皮糖蛋白蛋白由合胞体滋养层表达，并在先兆子痫中极大地上调。我们的蛋白印迹数据(图21A和21B)和RNA印迹还证实，可溶内皮糖蛋白是内皮糖蛋白蛋白的胞外结构域的脱落形式，其大小约65kDA，在先兆子痫胎盘中过量地表达，且它在先兆子痫胎盘中过量地循环。该蛋白的预测长度是约437个氨基酸。
可溶内皮糖蛋白是抗血管生成分子，并诱导血管功能障碍
我们使用血管生成的体外模型来理解可溶内皮糖蛋白的功能。可溶内皮糖蛋白适当地抑制内皮管形成，sFlt1的存在会进一步对其进行强化(图22)。在先兆子痫中，已经报道除了内皮功能障碍外，还存在增强的微血管通透性，如由水肿和增强的依文斯蓝结合的清蛋白胞外泄漏所证实的。为了观察可溶内皮糖蛋白是否诱导微血管泄漏，我们使用用可溶内皮糖蛋白和sFlt处理了48小时的小鼠。可溶内皮糖蛋白和sFlt1的组合，诱发肺、肝和肾中清蛋白泄漏的急剧增加，和脑中的适度泄漏，如使用伊文思蓝测定所证实的(图23)。单独的可溶内皮糖蛋白诱发肝中的适度泄漏。这些数据表明，可溶内皮糖蛋白和sFlt1组合是有效的抗血管生成分子，且可以诱发显著的血管泄漏。
为了评价可溶内皮糖蛋白的血流动力学作用，在大鼠肾微血管中进行了一系列微血管反应性实验。我们首先研究了TGF-β1和TGF-β3(内皮糖蛋白的两种已知的配体)的作用。TGF-β1和TGF-β3都诱发血管直径的剂量依赖性的增加。重要的是，在过量可溶内皮糖蛋白存在下，两种TGF的作用都显著减弱(图24)。最后，VEGF和TGF-β1的组合诱发血管舒张，后者受到过量可溶内皮糖蛋白和sFlt1的阻断(图25)。这表明，sFlt1和可溶内皮糖蛋白可以对抗血管生成生长因子(如VEGF和TGF-β1)诱发的生理性血管舒张，并诱发高血压。
可溶内皮糖蛋白和sFlt1的体内作用
为了评价可溶内皮糖蛋白和sFlt1对血管的作用，我们借助于妊娠大鼠中的腺病毒表达系统。在妊娠的第8天，通过尾静脉将编码对照基因(CMV)或可溶内皮糖蛋白或sFlt1或sFlt1+可溶内皮糖蛋白的腺病毒注射进Sprague-Dawley大鼠。在第17天，检查动物的先兆子痫表型。表8包括血流动力学和生物化学数据。
表8.腺病毒处理的大鼠动物模型的血流动力学和生物化学数据
组 N MAP(mmHg) 尿Alb/creat(μg/mg) 血小板计数×1000/μl LDHU/L  ASTU/L 胎儿体重(gms)
对照(CMV) 4 86.33 84.17 1378 257  43 4.56
sFlt1 4 134* 3478.3* 1247 324  78 3.55
sE 4 112* 366.90 1406 463  95 3.20
sFlt1+sE 4 145* 6478.2* 538* 1428*  187* 2.50*
MAP-平均动脉压(舒张压+1/3脉压)；Alb/Creat-清蛋白/肌酸酐比；LDH-乳酸脱氢酶；AST-天冬氨酸转氨酶。
*当与对照组相比较时，P＜0.05
胎儿体重是每组随机选择的4个胎儿的总和。
sFlt1的平均循环浓度，在sFlt1组中是410ng/ml，且在sFlt1+sE组中是430ng/ml。sE的平均循环浓度，在sE组中是318ng/ml，且在sFlt1+sE组中是319ng/ml。
单独的可溶内皮糖蛋白诱发轻度高血压。sFlt1诱发高血压和蛋白尿两者，如以前所报道的。重要的是，sFlt1和可溶内皮糖蛋白的组合诱发严重的高血压、肾病范围的蛋白尿、胎儿的生长限制和发展HELLP综合征的生物化学迹象(升高的LDH、升高的AST和减少血小板计数)(表8)。通过揭示裂红细胞和网织细胞增多的外周涂片，证实了可溶内皮糖蛋白+sFlt1组中的溶血迹象(图26A-B)。最后，肾组织学也证实了可溶内皮糖蛋白+sFlt1组的严重的肾小球内皮增生(图27A-27D)。
总结
这些结果证实，可溶内皮糖蛋白在先兆子痫胎盘中受到上调，且在先兆子痫患者中以非常高的水平存在。最高水平的可溶内皮糖蛋白存在于患有HELLP综合征的患者中，该HELLP综合征是先兆子痫的最严重形式之一。这些结果还证实，可溶内皮糖蛋白水平与妊娠患者中升高的sFlt1相关联，且在存在更高的循环sFlt1水平的那些患者中更高。此外，这些结果证实，可溶内皮糖蛋白是抗血管生成分子，并在许多内皮测定(如血管生成测定、微血管通透性测定和微血管反应性实验)中破坏内皮功能。重要的是，可溶内皮糖蛋白可以放大sFlt1在这些体外内皮测定中的毒性结果。而且，在体内测定中，可溶内皮糖蛋白的腺病毒表达诱发轻度高血压，而没有任何显著的蛋白尿。但是，在有sFlt1存在下，可溶内皮糖蛋白诱发显著的血管损伤，如由严重高血压、蛋白尿、肾小球内皮增生、HELLP综合征的发展和胎儿生长限制的存在所证实的。这些数据表明，可溶内皮糖蛋白在产妇先兆子痫综合征的病因中起重要作用，并强调了对中和可溶内皮糖蛋白以用于治疗先兆子痫的试剂的需要。
可溶内皮糖蛋白释放的机理可能是内皮糖蛋白分子的胞外区的蛋白酶剪切。在先兆子痫组织中受到上调的特定蛋白酶可以作为候选分子。一个实例是膜类型的基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)，已经表明它切割β聚糖，即与内皮糖蛋白共有相似性的一种分子(Velasco-Loyden等，J.Biol.Chem.279：7721-33(2004))。因此，这些蛋白酶的抑制剂可以作为治疗先兆子痫的有价值的靶。
其它实施方案
为了解释的目的，提供了本发明的具体的实施方案的描述。它们不意欲是穷尽性的，也无意将本发明的范围限制为本文所述的具体形式。尽管已经参照几个实施方案描述了本发明，但本领域的技术人员应当理解，在不脱离如权利要求书所述的本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。本文中提到的所有专利、专利申请和出版物均引作参考。
其它实施方案在权利要求书中。
                         序列表
                         序列表
<110>Beth Israel Deaconess Medical Center et al.
<120>诊断和治疗妊娠并发症的方法
<130>01948/106W02
<150>60/613,170
<151>2004-09-24
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1311
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
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<210>2
<211>437
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
Met Asp Arg Gly Thr Leu Pro Leu Ala Val Ala Leu Leu Leu Ala Ser
1               5                   10                  15
Cys Ser Leu Ser Pro Thr Ser Leu Ala Glu Thr Val His Cys Asp Leu
            20                  25                  30
Gln Pro Val Gly Pro Glu Arg Gly Glu Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln
        35                  40                  45
Val Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val
    50                  55                  60
His Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu
65                  70                  75                  80
Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu
                85                  90                  95
Leu Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val Phe Leu His Leu Gln Ala Leu
            100                 105                 110
Gly Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln
        115                 120                 125
Glu Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr
    130                 135                 140
Gln Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala
145                 150                 155                 160
Glu Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln
                165                 170                 175
Gly Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg
            180                 185                 190
Thr Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro Ala Leu Val Arg Gly Cys His
        195                 200                 205
Leu Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu Ala His Ile Leu Arg Val Leu
    210                 215                 220
Pro Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Lys Val Glu Leu
225                 230                 235                 240
Ser Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro
                245                 250                 255
Pro Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala Asn His Asn Met Gln Ile Trp
            260                 265                 270
Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg
        275                 280                 285
Gly Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg
    290                 295                 300
Met Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala
305                 310                 315                 320
Ser Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr
                325                 330                 335
Ser Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro
            340                 345                 350
Glu Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Thr Lys Cys Ala Asp Asp Ala Met
        355                 360                 365
Thr Leu Val Leu Lys Lys Glu Leu Val Ala His Leu Lys Cys Thr Ile
    370                 375                 380
Thr Gly Leu Thr Phe Trp Asp Pro Ser Cys Glu Ala Glu Asp Arg Gly
385                 390                 395                 400
Asp Lys Phe Val Leu Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Cys Gly Met Gln Val
                405                 410                 415
Ser Ala Ser Met Ile Ser Asn Glu Ala Val Val Asn Ile Leu Ser Ser
            420                 425                 430
Ser Ser Pro Gln Arg
        435
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
acgaagcttg aaacagtcca ttgtgacctt                                     30
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
ttagatatct ggcctttgct tgtgcaacc                                      29

Claims (106)

1.治疗或预防受试者的妊娠相关的高血压病症的方法，所述方法包含给所述受试者施用能特异性地结合可溶内皮糖蛋白的化合物的步骤，其中所述施用的时间和量足以治疗或预防所述受试者的所述妊娠相关的高血压病症。
2.权利要求1的方法，其中所述妊娠相关的高血压病症选自：先兆子痫、子痫、妊娠高血压、慢性高血压、HELLP综合征和具有小于胎龄儿(SGA)婴儿的妊娠。
3.权利要求2的方法，其中所述妊娠相关的高血压病症是先兆子痫或子痫。
4.权利要求1的方法，其中所述化合物是纯化的可溶内皮糖蛋白抗体或可溶内皮糖蛋白抗原结合片段。
5.权利要求1的方法，其中所述化合物是生长因子。
6.权利要求5的方法，其中所述生长因子选自：转化生长因子(TGF)-β1或TGF-β3、活化素A、骨形态发生蛋白(BMP)-2或BMP-7。
7.权利要求1的方法，还包含施用选自下述的化合物：纯化的sFlt-1抗体、sFlt抗原结合片段、烟碱、茶碱、腺苷、硝苯地平、米诺地尔、硫酸镁、血管内皮生长因子(VEGF)和胎盘生长因子(PlGF)。
8.权利要求7的方法，其中所述VEGF是VEGF121或VEGF165。
9.权利要求1的方法，还包含给受试者施用抗高血压化合物的步骤。
10.权利要求1的方法，其中所述受试者是妊娠的人。
11.权利要求1的方法，其中所述受试者是产后的人。
12.权利要求1的方法，其中所述受试者是非人类。
13.权利要求12的方法，其中所述受试者选自：牛、马、绵羊、猪、山羊、狗和猫。
14.治疗或预防受试者的妊娠相关的高血压病症的方法，所述方法包含给所述受试者施用增加能结合可溶内皮糖蛋白的生长因子的水平的化合物的步骤，其中所述施用的量和时间足以治疗或预防所述受试者的所述妊娠相关的高血压病症。
15.权利要求14的方法，其中所述生长因子选自：TGF-β1、TGF-3β、活化素A、BMP-2和BMP-7。
16.权利要求14的方法，其中所述化合物选自：环孢菌素、α生育酚、美西麦角、溴隐亭和爱道美。
17.治疗或预防受试者的妊娠相关的高血压病症的方法，所述方法包含给所述受试者施用抑制生长因子结合可溶内皮糖蛋白多肽的化合物，其中所述施用足以治疗或预防所述受试者的所述妊娠相关的高血压病症。
18.权利要求17的方法，其中所述化合物结合可溶内皮糖蛋白，并阻断生长因子结合。
19.治疗或预防受试者的妊娠相关的高血压病症的方法，所述方法包含给所述受试者施用能降低可溶内皮糖蛋白表达或生物学活性的化合物，其中所述施用足以治疗或预防所述受试者的所述妊娠相关的高血压病症。
20.权利要求19的方法，其中所述化合物是抑制选自基质金属蛋白酶(MMP)、组织蛋白酶和弹性蛋白酶的蛋白水解酶的化合物。
21.权利要求20的方法，其中所述MMP是MMP9。
22.权利要求20的方法，其中MMP是膜类型基质金属蛋白酶-1。
23.权利要求19的方法，其中所述化合物包含与内皮糖蛋白核酸序列的至少部分至少95％互补的反义核碱基寡聚体，其中所述施用足以治疗或预防所述受试者的所述妊娠相关的高血压病症。
24.权利要求23的方法，其中所述反义核碱基寡聚体是8-30个核苷酸长。
25.权利要求19的方法，其中所述化合物包含双链RNA分子，其具有一条与内皮糖蛋白核酸序列的至少部分至少95％互补的链，其中所述施用足以治疗或预防所述受试者的所述妊娠相关的高血压病症。
26.权利要求25的方法，其中所述双链RNA是19-25个核苷酸长的小干扰RNA(siRNA)。
27.权利要求19的方法，所述化合物包含特异性地结合可溶内皮糖蛋白的纯化的抗体或抗原结合片段。
28.权利要求14、17或19的方法，其中所述妊娠相关的高血压病症选自：先兆子痫、子痫、妊娠高血压、慢性高血压、HELLP综合征和具有小于胎龄儿(SGA)婴儿的妊娠。
29.权利要求28的方法，其中所述妊娠相关的高血压病症是先兆子痫或子痫。
30.权利要求1或19的方法，其中所述方法还包含监控所述受试者的所述妊娠相关的高血压病症，其中所述监控包括测量来自所述受试者的样品中的可溶内皮糖蛋白多肽的水平。
31.权利要求30的方法，其中所述样品是血清或血浆，且小于25ng/ml的可溶内皮糖蛋白多肽水平指示着所述妊娠相关的高血压病症的改善。
32.权利要求30的方法，其中在两个或更多个场合进行所述的水平测量，且测量之间的所述水平的降低指示着所述妊娠相关的高血压病症的改善。
33.权利要求30的方法，其中将所述水平的测量与阳性参照样品相比较，且可溶内皮糖蛋白的水平相对于所述阳性参照样品的降低，指示着所述受试者的所述妊娠相关的高血压病症的改善。
34.权利要求30的方法，其中所述监控用于确定化合物的治疗剂量。
35.权利要求30的方法，其中使用免疫学测定进行所述测量。
36.权利要求30的方法，其中所述可溶内皮糖蛋白的水平是游离的、结合的或总的可溶内皮糖蛋白的水平。
37.权利要求30的方法，其中所述可溶内皮糖蛋白的水平是由降解或酶切割产生的内皮糖蛋白多肽的水平。
38.权利要求30的方法，其中所述监控包含测量sFlt-1、VEGF或PlGF多肽中的至少一种在来自所述受试者的样品中的水平。
39.权利要求38的方法，还包含使用度量计算所述可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF的水平之间的关系，其中受试者样品相对于参照样品的所述水平之间的关系的变化，是所述受试者的妊娠相关的高血压病症的诊断指标。
40.权利要求39的方法，其中所述度量是先兆子痫抗血管生成指数(PAAI)：[sFlt-1/VEGF+PlGF]。
41.权利要求40的方法，其中小于20的PAAI值指示着所述先兆子痫或子痫的改善。
42.权利要求39的方法，其中所述度量是可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数：[(sFlt-1+0.25可溶内皮糖蛋白)/PlGF]或[(可溶内皮糖蛋白+sFlt-1)/PlGF]。
43.权利要求39的方法，其中所述度量用于确定治疗性化合物的剂量。
44.权利要求43的方法，其中以使PAAI小于20的剂量施用所述治疗性化合物。
45.权利要求1或19的方法，其中所述方法还包含监控所述受试者的妊娠相关的高血压病症，其中所述监控包含测量内皮糖蛋白核酸分子在来自所述受试者的样品中的水平。
46.权利要求45的方法，其中将所述内皮糖蛋白核酸的水平与参照样品相比较，且受试者样品中所述水平相对于所述参照的变化，是所述受试者的妊娠相关的高血压病症的诊断指标。
47.特异性地结合可溶内皮糖蛋白的抗体或其抗原结合片段。
48.权利要求47的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段阻止生长因子与可溶内皮糖蛋白的结合。
49.权利要求48的抗体或其抗原结合片段，其中所述生长因子选自：TGF-β1、TGF-β3、活化素A、BMP-2和BMP-7。
50.权利要求47的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单克隆抗体。
51.权利要求47的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是人或人源化抗体。
52.权利要求47的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体缺少Fc部分。
53.权利要求47的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是F(ab′)2、Fab或Fv结构。
54.权利要求47的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段存在于药学上可接受的载体中。
55.诊断受试者患有妊娠相关的高血压病症或具有其素因的方法，所述方法包含测量来自受试者的样品中的可溶内皮糖蛋白多肽的水平。
56.权利要求55的方法，其中所述妊娠相关的高血压病症是先兆子痫、子痫、妊娠高血压、慢性高血压、HELLP综合征和具有SGA婴儿的妊娠。
57.权利要求56的方法，其中所述妊娠相关的高血压病症是先兆子痫或子痫。
58.权利要求55的方法，其中所述可溶内皮糖蛋白的水平是游离的、结合的或总的可溶内皮糖蛋白的水平。
59.权利要求55的方法，其中大于20ng/ml的可溶内皮糖蛋白水平是妊娠相关的高血压病症或发展妊娠相关的高血压病症的倾向的诊断指标。
60.权利要求55的方法，其中使用免疫学测定进行所述测量。
61.权利要求60的方法，其中所述免疫学测定是ELISA。
62.权利要求55的方法，其中所述可溶内皮糖蛋白多肽水平相对于正常参照的增加是妊娠相关的高血压病症或发展妊娠相关的高血压病症的倾向的诊断指标。
63.权利要求55的方法，其中在两个或更多个场合进行所述水平测量，且测量之间的所述水平的变化是妊娠相关的高血压病症的诊断指标。
64.权利要求55的方法，其中所述监控还包含测量sFlt-l、VEGF或PlGF多肽中的至少一种在来自所述受试者的样品中的水平。
65.权利要求64的方法，还包含使用度量计算可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF的所述水平之间的关系，其中受试者样品相对于参照样品的所述水平之间的关系的变化，是所述受试者的妊娠相关的高血压病症的诊断指标。
66.权利要求65的方法，其中所述度量是先兆子痫抗血管生成指数(PAAI)：[sFlt-1/VEGF+PlGF]。
67.权利要求66的方法，其中大于10的PAAI值是所述受试者的妊娠相关的高血压病症的诊断指标。
68.权利要求65的方法，其中所述度量是可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数：[(sFlt-1+0.25可溶内皮糖蛋白)/PlGF]。
69.权利要求68的方法，其中大于100的可溶内皮糖蛋白抗血管生成指数值是所述受试者的妊娠相关的高血压病症的诊断指标。
70.权利要求65的方法，其中所述度量是[(可溶内皮糖蛋白+sFlt-1)/PlGF]。
71.权利要求66、68或70的方法，其中所述度量还包含母亲的体重指数或胎儿的胎龄。
72.诊断受试者患有妊娠相关的高血压病症或具有其素因的方法，所述方法包含测量内皮糖蛋白核酸分子在来自所述受试者的样品中的水平，并将它与参照相比较，其中所述水平相对于参照的变化，诊断妊娠相关的高血压病症或发展妊娠相关的高血压病症的倾向。
73.权利要求72的方法，其中所述妊娠相关的高血压病症是先兆子痫、子痫、妊娠高血压、HELLP综合征、慢性高血压或具有小于胎龄儿婴儿的妊娠。
74.权利要求73的方法，其中所述妊娠相关的高血压病症是先兆子痫或子痫。
75.权利要求72的方法，其中所述水平的变化是增加。
76.权利要求72的方法，其中所述内皮糖蛋白核酸是可溶内皮糖蛋白核酸。
77.权利要求72的方法，还包含测量sFlt-1、VEGF或PlGF核酸分子中的至少一种在来自所述受试者的样品中的水平，并将其与参照样品相对比，其中所述水平的变化诊断妊娠相关的高血压病症或发展妊娠相关的高血压病症的倾向。
78.诊断受试者患有妊娠相关的高血压病症或具有其素因的方法，所述方法包含确定来自所述受试者的样品中的内皮糖蛋白基因的核酸序列，并将其与参照序列相对比，其中受试者核酸序列的改变所述受试者中基因产物的表达水平的变化，诊断受试者患有妊娠相关的高血压病症或有发展妊娠相关的高血压病症的倾向。
79.权利要求78的方法，其中所述妊娠相关的高血压病症是先兆子痫、子痫、妊娠高血压、HELLP综合征、慢性高血压或具有小于胎龄儿婴儿的妊娠。
80.权利要求79的方法，其中所述妊娠相关的高血压病症是先兆子痫或子痫。
81.权利要求55、72或78的方法，其中所述样品是所述受试者的体液，其中所述可溶内皮糖蛋白通常是可检测到的。
82.权利要求81的方法，其中所述体液选自：尿、羊水、血液、血清、血浆和脑脊液。
83.权利要求55、72或78的方法，其中所述样品是细胞或组织。
84.权利要求83的方法，其中所述细胞选自：内皮细胞、白细胞、单核细胞或源自胎盘的细胞。
85.权利要求83的方法，其中所述组织是胎盘组织。
86.权利要求55、72或78的方法，其中所述受试者是未妊娠的人、妊娠的人、产后的人或非人类，且所述方法诊断发展先兆子痫或子痫的倾向。
87.权利要求86的方法，其中所述非人类选自牛、马、绵羊、猪、山羊、狗或猫。
88.权利要求72的方法，其中在两个或更多个场合进行所述水平测量，且测量之间的所述水平的变化是所述妊娠相关的高血压病症的诊断指标。
89.权利要求55、72或78的方法，其中所述方法用于在发作症状前至少4周诊断妊娠相关的高血压病症或发展妊娠相关的高血压病症的倾向。
90.试剂盒，其用于诊断受试者的妊娠相关的高血压病症或发展妊娠相关的高血压病症的倾向，其包含具有内皮糖蛋白核酸序列的核酸分子或其互补序列或其任意组合，和将所述核酸分子用于妊娠相关的高血压病症或发展妊娠相关的高血压病症的倾向的说明书。
91.权利要求90的试剂盒，其中所述试剂盒还包含VEGF、sFlt-1或PlGF的核酸序列，或其互补序列，或其任意组合。
92.权利要求90的试剂盒，其中所述内皮糖蛋白核酸是可溶内皮糖蛋白核酸。
93.试剂盒，其用于诊断受试者的妊娠相关的高血压病症，其包含可溶内皮糖蛋白结合分子，和使用所述可溶内皮糖蛋白结合分子来诊断妊娠相关的高血压病症或发展妊娠相关的高血压病症的倾向的说明书。
94.权利要求93的试剂盒，其中所述可溶内皮糖蛋白结合分子是特异性地结合可溶内皮糖蛋白的抗体或其抗原结合片段。
95.权利要求93的试剂盒，其中所述试剂盒还包含VEGF、sFlt-1或PlGF结合分子。
96.权利要求90或93的试剂盒，其中所述妊娠相关的高血压病症是先兆子痫、子痫、慢性高血压、HELLP综合征、妊娠高血压或具有SGA婴儿的妊娠。
97.鉴别改善妊娠相关的高血压病症的化合物的方法，所述方法包含使表达内皮糖蛋白核酸分子的细胞接触候选化合物，并对比所述候选化合物接触的所述细胞中的所述内皮糖蛋白核酸分子的表达水平和所述候选化合物未接触的对照细胞中的表达水平，其中所述内皮糖蛋白核酸分子的表达的变化，将所述候选化合物鉴别为改善妊娠相关的高血压病症的化合物。
98.权利要求97的方法，其中所述变化是所述可溶内皮糖蛋白核酸分子的水平的降低。
99.鉴别改善妊娠相关的高血压病症的化合物的方法，所述方法包含使表达可溶内皮糖蛋白多肽的细胞接触候选化合物，并对比所述候选化合物接触的所述细胞中的所述可溶内皮糖蛋白多肽的表达水平和所述候选化合物未接触的对照细胞中的多肽表达水平，其中所述内皮糖蛋白多肽的表达的变化，将所述候选化合物鉴别为改善妊娠相关的高血压病症的化合物。
100.权利要求99的方法，其中使用免疫学测定、酶法测定或免疫测定来测量所述表达的变化。
101.权利要求99的方法，其中所述表达的变化是可溶内皮糖蛋白水平的降低。
102.权利要求99的方法，其中所述表达的变化是转录或翻译的变化。
103.鉴别改善妊娠相关的高血压病症的化合物的方法，所述方法包含使表达可溶内皮糖蛋白多肽的细胞接触候选化合物，并对比所述候选化合物接触的所述细胞中的所述多肽的生物学活性和所述候选化合物未接触的对照细胞中的生物学活性水平，其中所述内皮糖蛋白多肽的生物学活性的变化，将所述候选化合物鉴别为改善妊娠相关的高血压病症的化合物。
104.鉴别改善妊娠相关的高血压病症的化合物的方法，所述方法包含检测在有候选化合物存在下，可溶内皮糖蛋白多肽和生长因子之间的结合，其中与没有所述候选化合物存在时所述可溶内皮糖蛋白多肽和所述生长因子之间的结合相比所述结合的降低，将所述候选化合物鉴别为改善妊娠相关的高血压病症的化合物。
105.鉴别阻止可溶内皮糖蛋白多肽和生长因子之间的结合的多肽或其片段的方法，所述方法包含检测在有所述候选多肽存在下，可溶内皮糖蛋白多肽和生长因子之间的结合，其中与没有所述候选多肽存在时所述可溶内皮糖蛋白多肽和所述生长因子之间的结合相比所述结合的降低，将所述候选多肽鉴别为阻止可溶内皮糖蛋白多肽和生长因子之间的结合的多肽。
106.鉴别改善妊娠相关的高血压病症的化合物的方法，所述方法包含检测可溶内皮糖蛋白多肽和候选化合物之间的结合，其中结合所述可溶内皮糖蛋白多肽的化合物改善所述妊娠相关的高血压病症。
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