CN104412107B - 用sFlt-1/PlGF或内皮糖蛋白/PlGF比值来排除先兆子痫在某时期内发病的手段和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于先兆子痫的产前诊断的诊断测定领域。具体而言，它涉及用于诊断怀孕受试者是否在短时间窗口内不处于先兆子痫风险的方法，其包括：a)测定所述受试者的样品中至少一种血管发生生物标志的量，所述血管发生生物标志选自sFlt‑1、内皮糖蛋白以及PlGF；和b)将所述量与参照比较，在sFlt‑1和内皮糖蛋白的情况下，如果所述量与所述参照相比是相同或减少的，并且在P1GF的情况下，如果所述量与所述参照相比是相同或增加的，则由此诊断所述受试者在短时期内不处于发展成先兆子痫的风险，其中所述参照允许作出具有至少约98％的阴性预测值的诊断。还考虑用于进行该方法的装置和试剂盒。

Description

用sFlt-1/PlGF或内皮糖蛋白/PlGF比值来排除先兆子痫在某 时期内发病的手段和方法
本发明涉及用于先兆子痫的产前诊断的诊断测定领域。具体而言，它涉及用于诊断怀孕受试者是否在短时间窗口(window of time)内不处于先兆子痫风险的方法，其包括：a)测定所述受试者的样品中至少一种血管发生生物标志的量，所述血管发生生物标志选自sFlt-1、内皮糖蛋白以及PlGF；和b)将所述量与参照比较，在sFlt-1和内皮糖蛋白的情况下，如果所述量与参照相比是相同或减少的，并且在P1GF的情况下，如果所述量与参照相比是相同或增加的，则由此诊断所述受试者在短时期内不处于发展成先兆子痫的风险，其中所述参照允许作出具有至少约98％的阴性预测值的诊断。还考虑用于进行该方法的装置和试剂盒。
怀孕可以以不同的方式复杂化，它一方面与怀孕雌性的怀孕相关死亡率相关，另一方面还与新生儿增加的发病率和死亡率相关。比例为每100，000例活产中14.5例的母体死亡率在39岁以上的怀孕雌性中更常见，且可以由出血、血栓性肺栓塞、感染、心肌病及心血管和非心血管病症以及其中以先兆子痫最为常见的高血压病症引起(Berg 2010,Obstetrics and Gynecology:116:1302–1309)。
先兆子痫涉及所有怀孕中的约2％至8％，是全世界范围内母体和胎儿死亡率的主要贡献者(Duley 2009,Semin Perinatol:33:130–37)。先兆子痫通常定义为在怀孕第20周之后发病的妊娠相关或诱发的高血压和蛋白尿。高血压在此背景中定义为在两次独立测量时血压为140mmHg(收缩压)和/或90mmHg(舒张压)或更高，其中该两次测量相隔至少6小时进行。蛋白尿由24小时尿样品中300mg或更多的蛋白质指示。但是，先兆子痫的该定义备受争议，在学会间可能不同。详情还见于标准医学教科书和多种临床学会的指导(例如，ACOGPractice Bulletin,Clinical Management Guidelines for Obstetrician-Gynecologists,no.:33,2002年1月或Leitlinien,Empfehlungen,Stellungnahmen of theDeutschen Gesellschaft f ürund Geburtshilfe e.V.,2008年8月,NICEClinical Guideline Hypertension in pregnancy:the management of hypertensivedisorders during pregnancy,2010年8月(2011年1月修订重印))中。
先兆子痫的发病机理基本未知。但是，认为它由与螺旋动脉重塑受损相关的胎盘功能扰乱引起。先兆子痫发展过程中出现的流动缺陷与局部缺血相关，该局部缺血最终导致诸如sFlt-1和内皮糖蛋白的抗血管生成因子释放入循环中。
直至今天，先兆子痫唯一的治疗是通过提早的阴道或剖腹产分娩终止怀孕。如上文所讨论，在患先兆子痫的情况下，母体风险和胎儿活力在怀孕第34周之前显著受损。因此，应尝试推迟分娩，从而改善新生儿的存活。
先兆子痫的早期和可靠的诊断，尤其是早在怀孕第20至40周发生的先兆子痫的排除决定疾病的临床管理。应理解，患有先兆子痫的怀孕雌性需要特殊护理，如密切监测、支持性治疗措施，在进展为严重先兆子痫的情况下，需要在具有母体胎儿重症监护病房(MFICU)的专科医院中住院。尤其是，鉴于与之相关的严重副作用和不良结果，早发型先兆子痫对临床医师而言极具挑战。此外，先兆子痫的早期和可靠的诊断以及先兆子痫的预测决定预防性或治疗性干预研究的规划(Ohkuchi 2011,Hypertension 58:859-866)。另一方面，隶属于这样的风险组的患者应需要较少的特殊护理，在大多数情况下可以不住院治疗(设定为门诊患者)，其中可排除该风险组在某时间窗口内具有增加的先兆子痫风险。
多普勒超声波扫描术已应用于鉴定具有异常子宫灌注的患者，且已提示通过多普勒超声波扫描术鉴定的显示异常灌注的那些患者处于发展成先兆子痫、子痫和/或HELLP综合征的风险(Stepan 2007,Hypertension,49:818-824；Stepan 2008,Am J ObstetGynecol 198:175.e1-1)。但是，多普勒超声波扫描术的缺点是需要高度专业的医务人员来实施并评价结果。
最近，已提出血管发生因子和抗血管生成因子是先兆子痫的指示物。尤其是，已报道胎盘生长因子(PlGF)、内皮糖蛋白和可溶性fsm样酪氨酸激酶1(sFlt-1)在先兆子痫患者中改变。除报道单个因子及它们在健康个体和先兆子痫患者或处于发展先兆子痫风险的患者中的变化(见例如Rana 2007,Hypertension 50:137-142；WO2004/008946)外，已报道将sFlt-1和PlGF或内皮糖蛋白和PlGF的比值作为诊断或预测参数(见Young 2010,J MaternFetal Neonatal Med 23(5):366-370；Hagmann 2012,Clinical Chemistry 58(5):1-9)。
已报道将sFlt-1和PlGF的单一比值作为怀孕早期先兆子痫的预测性纳入(rule-in)因子(Crispi 2008,Ultrasound Obstet Gynecol 31:303-309)。此外，已单独地将怀孕不同时间点的sFlt-1和PlGF的单个比值与先兆子痫风险相关(DeVivo 2008,ActaObstetricia et Gynecologica 87:837-842；Ohkuchi 2011,同上；Kusanovic 2009,J ofMaternal-Fetal and Neonatal Medicine 22(11):1021-1038；Chaiworapongsa 2011,JMaternal-Fetal and Neonatal Medicine 24(10):1187-1207；Benton 2011,AmericanJournal of Obstetrics&Gynecology 205:1.e1)。此外，已在先兆子痫的预测(Kusanovic2009,同上)或急产(imminent delivery)的风险方面(Verlohren 2012,American Journalof Obstetrics&Gynecology 206(1):58.e1-58.e8)研究了上述比值变化程度。
但是，前面提到的现有技术主要涉及急发型先兆子痫的规则诊断或其预测。对排除某时间窗口内的急发型先兆子痫知之甚少。有较为普遍的报道提出，根据sFLt-1和PlGF的某个比值，可以排除在患者就诊当天的急发型先兆子痫(Stepan 2010,Z GeburtshNeonatol 214:234-238)。
但是，用于在表观上健康的怀孕雌性中排除某时期内的先兆子痫的可靠测定尚不可得，但却高度希望得到。
本发明潜在的技术问题可以视为提供用于满足前述需要的手段和方法。通过权利要求和下文中表征的实施方案来解决该技术问题。
本发明涉及用于诊断怀孕受试者是否在短时间窗口内不处于先兆子痫风险(即排除先兆子痫)的方法，其包括：
a)测定所述受试者的样品中至少一种血管发生生物标志的量，所述血管发生生物标志选自sFlt-1、内皮糖蛋白以及PlGF；和
b)将所述量与参照比较，在sFlt-1和内皮糖蛋白的情况下，如果所述量与参照相比是相同或减少的，并且在P1GF的情况下，如果所述量与参照相比是相同或增加的，则由此诊断所述受试者在短时期内不处于发展先兆子痫的风险，其中所述参照允许作出具有至少约98％的阴性预测值的诊断。
本发明的方法优选是离体方法。此外，它可以包括除上文明确提到的那些之外的步骤。例如，其他步骤可以涉及样品预处理或通过该方法获得的结果的评价。该方法可以手动进行或通过自动装置辅助进行。优选地，步骤(a)和/或(b)可以全部或部分通过自动装置辅助进行，例如，将适宜的机器人和传感设备用于步骤(a)中的测定，将数据处理设备上的计算机执行的计算算法和/或数据处理设备上的比较和/或诊断算法用于步骤(b)。
本文所用的术语“先兆子痫”指表征为高血压和蛋白尿的医学病症。先兆子痫发生在怀孕雌性受试者中，该高血压也称为妊高征。优选地，通过140mmHg(收缩压)和/或90mmHg(舒张压)或更高的两次血压测量来鉴定妊高征在个体中的存在，其中该两次测量相隔至少6小时。优选通过24小时尿样品中300mg或更多的蛋白质来鉴定蛋白尿的存在。先兆子痫可以进展至子痫，子痫是表征为出现强直-阵挛性癫痫发作或昏迷的威胁生命的病症。与严重先兆子痫相关的症状是24小时内少于500ml的少尿症、脑或视觉障碍、肺水肿或发绀、腹上部或右上象限疼痛、肝功能受损、血小板减少、胎儿生长受限。患有涉及肝的先兆子痫的个体可以进一步发展HELLP综合征。因此，本发明的优选的处于发展成先兆子痫风险的受试者还可能处于发展成HELLP综合征的风险。HELLP综合征与高风险的不良结果相关，该不良结果如胎盘早剥、肾衰竭、包膜下肝血肿、复发性先兆子痫、早产或甚至母体和/或胎儿死亡。先兆子痫和伴随症状以及后续疾病，诸如HELLP综合征或子痫的其他详述可见于标准医学教科书或相关医学学会的指导中。详述可见于例如ACOG Practice Bulletin,ClinicalManagement Guidelines for Obstetrician-Gynecologists,no.:33,2002年1月或Leitlinien,Empfehlungen,Stellungnahmen of the Deutschen Gesellschaft fürund Geburtshilfe e.V.,2008年8月,NICE Clinical GuidelineHypertension in pregnancy:the management of hypertensive disorders duringpregnancy,2010年8月(2011年1月修订重印)中。先兆子痫发生在多达10％通常处于妊娠中期或妊娠晚期的怀孕中。但是，一些怀孕雌性早在怀孕第20周中就发展成先兆子痫。
在怀孕第20至34周内，先兆子痫也称为早发型先兆子痫，而发生在怀孕第34周之后的先兆子痫也称为迟发型先兆子痫。应理解，与通常相对轻微的迟发型先兆子痫相比，早发型先兆子痫通常伴随更严重的副作用和不良结果。
短语“不处于发展成先兆子痫的风险”指这样的怀孕受试者，与处于发展成先兆子痫风险的怀孕受试者相比或与包括待分析受试者的群体内先兆子痫的发病率(prevalence)相比，该受试者将不在以后的预测时间窗口内以统计上显著增加的概率发展成先兆子痫。
本文所用的术语“受试者”指动物，优选哺乳动物，更优选人类。本发明的受试者应是怀孕受试者，即怀孕雌性。优选地，本发明的受试者将不患有明显的先兆子痫、子痫或HELLP综合征。优选地，本发明的受试者是已鉴定为具有异常子宫灌注的受试者，更优选地，可以是已通过其他诊断技术鉴定为处于发展成先兆子痫、子痫和/或HELLP综合征的风险的受试者。优选地，已进行了经腹多普勒超声波扫描术(见例如Albaiges 2000,ObstetGynecol 96:559-564)。具体而言，可以测量子宫动脉的搏动指数(PI)，应计算这两个动脉的平均值(mPI-UtA)，并可以与阈值比较，该阈值允许区分正常和异常结果。
更优选地，本发明的怀孕受试者处于妊娠约第20周和约第40周之间，优选妊娠约第24周和约第40周之间。因此，取决于从受试者取样时的孕周，待通过本发明的方法排除的先兆子痫可以是早发型先兆子痫或迟发型先兆子痫。
本发明的方法可以用于表观上健康的怀孕受试者的例行筛查方法。但是，本发明所设想的怀孕受试者也可以隶属于具有更高的先兆子痫发病率的风险组。患有肥胖症、高血压、自身免疫病(如红斑狼疮)、血栓形成倾向(thrombophilia)或糖尿病的怀孕受试者通常具有增加的发展成先兆子痫的概率。该情况也相同地适用于在前一次怀孕中患有先兆子痫、子痫和/或HELLP综合征的受试者。此外，首次怀孕的年长雌性也显示发展成先兆子痫的倾向。但是，发展成先兆子痫的概率随怀孕次数降低。
本文所用的术语“诊断”意指评估受试者是否在短时期内不处于发展成先兆子痫的风险。优选地，该短时期是少于4周、优选在约1周至约2周之间。如本领域技术人员将理解，对于待诊断的受试者，这种评估通常并非100％的正确。但是，该术语要求，对于某部分的受试者(例如群组研究中的群组)，该评估在本文中其他地方所示的阴性预测值正确。以后在某个时间窗口发展或不发展成先兆子痫的风险可以通过诸如本发明的方法的测试来诊断，用概括统计就假阳性/阴性和真阳性/阴性评估描述该测试的表现。高阴性预测值表示通过诊断测试作出的阴性评估的高置信水平。阴性预测值可以表示为真阴性结果数除以真阴性结果和假阴性结果的总和(即通过该诊断测试测定的所有阴性结果)。基本上，可以根据诊断测试的灵敏度和特异性及疾病或病症在某群组中的发病率来计算阴性预测值。具体而言，阴性预测值是[(特异性)(1-发病率)]/[(特异性)(1-发病率)+(1-灵敏度)(发病率)]。发病率预测可以从群组研究获得，而病例对照研究可以产生该测试的灵敏度和/或特异性。具体而言，通过本发明的方法确定的诊断的阴性预测值应为至少约98％、更优选至少约99％和最优选100％。关于统计学的其他详述描述于标准教科书(如Dowdy和Wearden,Statistics for Research,John Wiley&Sons,New York 1983)中，或见于本文中其他地方。
术语“样品”指体液的样品、分离的细胞的样品或来自组织或器官的样品。体液的样品可以通过公知的技术获得，且优选包括血液、血浆、血清或尿液的样品，更优选血液、血浆或血清的样品。组织或器官样品可以通过例如活组织检查从任意组织或器官获得。分离的细胞可以通过分离技术诸如离心或细胞分选从体液或组织或器官获得。优选地，细胞、组织或器官样品获自表达或产生本文提到的肽的那些细胞、组织或器官。
本文所用的术语“sFlt-1”指多肽，其是fms样酪氨酸激酶1的可溶性形式。该多肽在本领域中也称为可溶性VEGF受体1(sVEGF R1)(见例如Sunderji 2010,Am J ObstetGynecol 202:40e1-7)。它是在人脐静脉内皮细胞的条件培养基中鉴定的。内源sFlt1受体在层析和免疫方面类似于重组人sFlt1，并且以相当的高亲和力结合[125I]VEGF。显示人sFlt1在体外与KDR/Flk-1的胞外域形成VEGF稳定的复合体。优选地，sFlt1指Kendall1996,Biochem Biophs Res Commun 226(2):324-328中所述的人sFlt1；sFlt1的氨基酸序列还见例如Genebank检索号P17948,GI:125361(人sFlt-1)和BAA24499.1,GI:2809071(小鼠sFlt-1)(Genebank可在www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez下从美国NCBI获得)。该术语还涵盖前述人sFlt-1多肽的变体。这类变体至少具有与前述sFlt-1多肽相同的基本生物学和免疫学性质。具体而言，如果可通过本说明书提到的相同的特定的测定法，例如通过使用特异性识别该sFlt-1多肽的多克隆或单克隆抗体的ELISA测定法检测这些变体，则它们具有相同的基本生物学和免疫学性质。此外，应理解，本发明提到的变体将具有由于至少一个氨基酸取代、缺失和/或添加而不同的氨基酸序列，其中该变体的氨基酸序列分别与特定的sFlt-1多肽，优选人sFlt-1的全长具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性。两个氨基酸序列之间的同一性程度可以通过本领域公知算法来测定。优选地，通过在比较窗内比较两个最佳比对的序列来测定同一性程度，其中与参照序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗中的氨基酸序列的片段可以为了最佳比对而包含添加或缺失(例如空位或外伸)。通过以下来计算百分比：通过测定在两个序列中存在相同氨基酸残基的位置数来产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗中的总位置数并将结果乘以100来产生序列同一性的百分比。可以通过Smith 1981,Add.APL.Math.2:482中公开的局部同源性算法、通过Needleman 1970,J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法、通过Pearson1988,Proc.Natl.Acad Sci.(USA)85:2444的检索相似性的方法、通过这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、BLAST、FAST、PASTA和TFASTA)或通过目检来进行用于比较的序列的最佳比对。鉴于已鉴定出两个序列用于比较，优选利用GAP和BESTFIT来确定它们的最佳比对，从而确定同一性程度。优选地，使用空位权重5.00和空位长度权重0.30的默认值。上文提到的变体可以是等位基因变体或任意其他物种特异性同源物、旁系同源物或直向同源物。此外，本文提到的变体包括特定的sFlt-1多肽或前述类型的变体的片段或亚基，只要这些片段具有上文提到的基本免疫学和生物学性质。这类片段可以是例如sFlt-1多肽的降解产物。如果可通过本说明书提到的相同的特定的测定法，例如通过使用特异性识别该sFlt-1多肽的多克隆或单克隆抗体的ELISA测定法检测这些变体，则认为变体具有相同的基本生物学和免疫学性质。优选的测定法描述于所附实施例中。还包括由于翻译后修饰诸如磷酸化或十四烷基化而不同的变体。sFlt-1可以以结合或游离形式检测或检测为样品中的总sFlt-1量。
本文所用的术语“内皮糖蛋白”指多肽，其具有非还原时的180kDa，还原后的95kDa及处于还原和N-去糖基化形式的66kDa的分子量。该多肽能够形成二聚体，且结合TGF-β和TGF-β受体。优选地，内皮糖蛋白指人内皮糖蛋白。更优选地，人内皮糖蛋白具有Genebank检索号AAC63386.1,GI:3201489中所示的氨基酸序列。已描述了两种内皮糖蛋白亚型，S-内皮糖蛋白和L-内皮糖蛋白。L-内皮糖蛋白由具有47个氨基酸的胞质尾的总计633个氨基酸组成，而S-内皮糖蛋白由具有14个氨基酸的胞质尾的600个氨基酸组成。优选地，本文所用的内皮糖蛋白是可溶性内皮糖蛋白。本文提到的可溶性内皮糖蛋白优选描述于EP 1 804 836B1中。此外，应理解，本发明提到的变体可以具有由于至少一个氨基酸取代、缺失和/或添加而不同的氨基酸序列，其中该变体的氨基酸序列分别与特定的内皮糖蛋白具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性。该变体可以是等位基因变体、剪接变体或任意其他物种特异性同源物、旁系同源物或直向同源物。此外，本文提到的变体包括特定的内皮糖蛋白或前述类型的变体的片段，只要这些片段具有上文提到的基本免疫学和生物学性质。这类片段可以是例如内皮糖蛋白的降解产物。如果可通过本说明书提到的相同的特定的测定法，例如通过使用特异性识别该内皮糖蛋白多肽的多克隆或单克隆抗体的ELISA测定法检测这些变体，则认为变体具有相同的基本生物学和免疫学性质。优选的测定法描述于所附实施例中。还包括由于翻译后修饰诸如磷酸化或十四烷基化而不同的变体。内皮糖蛋白可以以结合或游离形式检测或检测为样品中的总内皮糖蛋白量。
本文所用的术语“P1GF(胎盘生长因子)”指胎盘衍生的生长因子，其是长度为149个氨基酸且与人血管内皮生长因子(VEGF)的血小板衍生生长因子样区高度同源的多肽。与VEGF一样，P1GF在体外和体内具有血管生成活性。例如，来源于经转染的COS-1细胞的P1GF的生物化学和功能表征揭示，它是能够在体外刺激内皮细胞生长的糖基化二聚体分泌性蛋白(Maqlione 1993,Oncogene 8(4):925-31)。优选地，PlGF指人PlGF，更优选地，指具有Genebank检索号P49763,GI:17380553中所示的氨基酸序列的人PlGF。该术语涵盖该特定的人PlGF的变体。这类变体至少具有与特定PIGF多肽相同的基本生物学和免疫学性质。如果可通过本说明书提到的相同的特定的测定法，例如通过使用特异性识别该PIGF多肽的多克隆或单克隆抗体的ELISA测定法检测这些变体，则认为变体具有相同的基本生物学和免疫学性质。优选的测定法描述于所附实施例中。此外，应理解，本发明提到的变体将具有由于至少一个氨基酸取代、缺失和/或添加而不同的氨基酸序列，其中该变体的氨基酸序列分别与特定的PIGF多肽具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性。两个氨基酸序列之间的同一性程度可以通过本领域公知算法和本文其他地方描述的算法来测定。上文提到的变体可以是等位基因变体或任意其他物种特异性同源物、旁系同源物或直向同源物。此外，本文提到的变体包括特定的PIGF多肽或前述类型的变体的片段，只要这些片段具有上文提到的基本免疫学和生物学性质。这类片段可以是例如PIGF多肽的降解产物或剪接变体。还包括由于翻译后修饰诸如磷酸化或十四烷基化而不同的变体。PIGF可以以结合或游离形式检测或检测为样品中的总PIGF量。
测定本说明书中提到的任意肽或多肽的量涉及优选半定量或定量地测量该量或浓度。测量可以直接或间接进行。直接测量涉及根据信号来测量该肽或多肽的量或浓度，该信号获自该肽或多肽自身且其强度与存在于样品中的该肽的分子的数目直接相关。这种信号(本文中有时称为强度信号)可以例如通过测量该肽或多肽的特定的物理或化学性质的强度值来获得。间接测量包括测量获自第二成分(即不是该肽或多肽自身的成分)或生物读出系统的信号，该生物读出系统例如为可测量的细胞反应、配体、标记或酶促反应产物。
根据本发明，测定肽或多肽的量可以通过用于测定样品中肽的量的所有已知手段来达到。该手段包括利用在多种夹层、竞争或其他测定形式中的标记分子的免疫测定装置和方法。该测定将产生指示该肽或多肽的存在或缺乏的信号。此外，信号强度可以优选与样品中存在的多肽的量直接或间接(例如反比)相关。其他适宜的方法包括测量该肽或多肽特定的物理或化学性质，如它的精确分子量或NMR谱。该方法优选包括生物传感器、与免疫测定偶联的光学装置、生物芯片、分析装置(如质谱仪、NMR分析仪或层析装置)。此外，方法包括基于微孔板ELISA的方法、全自动装置或机器人免疫测定(例如可在ElecsysTM分析仪上获得)、CBA(酶促钴结合测定，例如可在Roche-HitachiTM分析仪上获得)和胶乳凝集测定(例如可在Roche-HitachiTM分析仪上获得)。
优选地，测定肽或多肽的量包括以下步骤：(a)使细胞与该肽或多肽接触足够的时间，以引发细胞反应，该细胞反应的强度指示该肽或多肽的量；(b)测量该细胞反应。为了测量细胞反应，优选将样品或经处理的样品加至细胞培养物，并测量内部或外部细胞反应。细胞反应可以包括报道基因的可测量的表达或物质(例如肽、多肽或小分子)的分泌。该表达或物质将产生与该肽或多肽的量相关的强度信号。
还优选地，测定肽或多肽的量包括测量可从样品中的肽或多肽获得的特异性强度信号。如上文所讨论，这种信号可以是在该肽或多肽特异的质谱或NMR谱中在该肽或多肽特异的m/z变量(variable)下观察到的信号强度。
测定肽或多肽的量可以优选包括以下步骤：(a)使该肽与特异性配体接触；(b)优选去除未结合的配体；(c)测量结合的配体的量。结合的配体将产生强度信号。本发明的结合包括共价和非共价结合。本发明的配体可以是结合本文所述的肽或多肽的任意化合物，例如肽、多肽、核酸或小分子。优选的配体包括抗体、核酸、肽或多肽(如该肽或多肽的受体或结合配偶体及包含该肽的结合结构域的受体或结合配偶体的片段)和适配体(例如核酸或肽适配体)。制备这类配体的方法为本领域公知。例如，商业供应商也提供适宜的抗体或适配体的鉴定和产生。本领域技术人员熟悉研发具有更高亲和力或特异性的这类配体的衍生物的方法。例如，可以将随机突变引入核酸、肽或多肽。然后可以按照本领域已知的筛选方法(例如噬菌体展示)测试这些衍生物的结合。本文提到的抗体包括多克隆和单克隆抗体，及其片段，如能够结合抗原或半抗原的Fv、Fab和F(ab)2片段。本发明还包括单链抗体和人源化杂合抗体，其中将显示希望的抗原特异性的非人供体抗体的氨基酸序列与人受体抗体的序列组合。供体序列通常将至少包括供体的抗原结合氨基酸残基，但也可以包含供体抗体的其他结构上和/或功能上相关的氨基酸残基。优选地，该配体或试剂特异性结合该肽或多肽。本发明的特异性结合意指该配体或试剂应基本上不与存在于待分析样品中的其他肽、多肽或物质结合(即交叉反应)。优选地，特异性结合的肽或多肽应以比任意其他相关的肽或多肽高至少3倍、更优选高至少10倍和甚至更优选高至少50倍的亲和力结合。如果它仍可以明确地区分和测量(例如根据其在蛋白质印迹上的大小，或通过其在样品中相对更高的丰度)，则可以容许非特异性结合。配体的结合可以通过本领域已知的任意方法测量。优选地，该方法是半定量或定量的。其他适合用于测定多肽或肽的技术在下文中描述。
首先，配体的结合例如可以通过NMR或表面等离振子共振直接测量。其次，如果该配体还作为目的肽或多肽的酶活性的底物，则可以测量酶促反应产物(例如，蛋白酶的量可以通过例如在蛋白质印迹上测量切割的底物的量来测量)。备选地，该配体自身可以显示酶性质，可以使“配体/肽或多肽”复合体或分别与肽或多肽结合的配体与适宜底物接触，该适宜底物允许通过强度信号的产生来检测。对于酶促反应产物的测量，优选底物的量饱和。还可以在反应前用可检测标记标记底物。优选地，使样品与底物接触足够的时间。足够的时间指产生可检测、优选可测量的量的产物所必需的时间。可以测量出现给定(例如可检测)量的产物所必需的时间来代替测量产物的量。第三，配体可以共价或非共价偶联至允许检测和测量配体的标记上。可以通过直接或间接方法进行标记。直接标记涉及将标记直接(共价或非共价)偶联至配体。间接标记涉及第二配体与第一配体的结合(共价或非共价)。第二配体应特异性结合第一配体。该第二配体可以与适宜的标记偶联和/或是结合该第二配体的第三配体的靶标(受体)。第二、第三或甚至更高级的配体的使用通常用于增强信号。适宜的第二和更高级配体可以包括抗体、第二抗体和众所周知的链霉亲和素-生物素系统(VectorLaboratories,Inc.)。也可以用本领域已知的一种或多种标记“标记”配体或物质。这类标记可以是更高级配体的靶标。适宜的标记包括生物素、洋地毒黄苷、His标记、谷胱甘肽-S-转移酶、FLAG、GFP、myc标记、甲型流感病毒血细胞凝集素(HA)、麦芽糖结合蛋白等。在肽或多肽的情况下，该标记优选处于N端和/或C端。适宜的标记是可通过适当的检测方法检测的任意标记。典型的标记包括金颗粒、胶乳珠、吖啶酯(acridan ester)、鲁米诺、钌、酶活性标记、放射性标记、磁性标记(例如磁珠，包括顺磁和超顺磁标记)和荧光标记。酶活性标记包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶及其衍生物。适宜的检测底物包括二-氨基-联苯胺(DAB)、3,3'-5,5'-四甲基联苯胺、NBT-BCIP(氯化4-硝基四氮唑兰和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐，可作为现成的贮存液从Roche Diagnostics获得)、CDP-StarTM(Amersham Biosciences)、ECFTM(Amersham Biosciences)。适宜的酶-底物组合可以产生按照本领域已知的方法(例如用感光胶片或适宜的相机系统)测量的显色反应产物、荧光或化学发光。关于测量酶促反应，上文给出的标准类似地适用。典型的荧光标记包括荧光蛋白质(如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、德克萨斯红、荧光素和Alexa染料(例如Alexa 568)。其他荧光标记可从例如Molecular Probes(Oregon)获得。还考虑用量子点(quantum dot)作为荧光标记。典型的放射性标记包括35S、125I、32P、33P等。放射性标记可以通过任意已知且适当的方法(例如感光胶片或磷光成像仪)检测。本发明的适宜测量方法还包括例如沉淀(尤其是免疫沉淀)、电化学发光(电产生的化学发光)、RIA(放射免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、夹层酶免疫测试、电化学发光夹层免疫测定(ECLIA)、解离增强镧系元素荧光免疫测定(DELFIA)、闪烁亲近测定(SPA)、浊度测定法、比浊法、胶乳增强浊度测定法或比浊法或固相免疫测试。本领域已知的其他方法(如凝胶电泳、2D凝胶电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹和质谱分析法)可以单独或与上文所述的标记或其他检测方法组合使用。
肽或多肽的量还可以优选按以下测定：(a)使包含上文指出的肽或多肽的配体的固相支持体与包含该肽或多肽的样品接触；(b)优选去除未结合的肽或多肽以及其余样品物质；和(c)测量结合于支持体的肽或多肽的量。该配体优选选自核酸、肽、多肽、抗体和适配体，且优选以固定形式存在于固相支持体上。用于制备固相支持体的材料为本领域公知，且尤其包括市售柱材料、聚苯乙烯珠、胶乳珠、磁珠、胶体金属颗粒、玻璃和/或硅芯片和表面、硝酸纤维素条、膜、薄板、duracyte、反应盘的孔和壁、塑料管等。配体或试剂可以结合于许多不同的载体。公知的载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然纤维素和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁体。为了本发明的目的，载体的性质可以是可溶或不可溶。适合用于装配/固定该配体的方法为本领域公知，且包括但不限于离子、疏水、共价相互作用等。还考虑用“悬浮阵列”作为本发明的阵列(Nolan 2002,Trends Biotechnol.20(1):9-12)。在这类悬浮阵列中，载体(例如微珠或微球)悬浮存在。该阵列由可能标记、携带不同配体的不同微珠或微球组成。产生这类阵列的方法例如基于固相化学和光不稳定保护基团的方法广为人知(US 5,744,305)。
根据优选实施方案，通过本文公开的系统的分析单元来进行配体的结合测量。然后，可以通过本文公开的系统的计算设备来计算所测量的结合的量。
本文所用的术语“量”涵盖多肽或肽的绝对量、该多肽或肽的相对量或浓度以及与之相关或可以来源于其的任意值或参数。这类值或参数包括来自所有特异性物理或化学性质的强度信号值，例如质谱或NMR谱中的强度值，该强度信号值通过直接测量从该肽获得。此外，还涵盖通过本说明书中其他地方指出的间接测量获得的所有值或参数，例如从生物读出系统测定的响应该肽的反应水平或从特异性结合配体获得的强度信号。应理解，还可以通过所有标准数学运算获得与前述量或参数相关的值。根据本发明的优选实施方案，通过本发明的系统来进行“量”的测定，计算设备由此基于接触和测量步骤来确定该“量”，该接触和测量步骤通过该系统的一个或多个分析单元进行。
本文所用的术语“比较”涵盖将本文提到的至少一个血管发生生物标志的测定量与参照比较。应理解，本文所用的比较指在该量的值与参照之间进行的任意种类的比较。将该量与参照比较，在sFlt-1和内皮糖蛋白的情况下，如果该量与参照相比是相同或减少的，且在P1GF的情况下，如果该量与参照相比是相同或增加的，则该怀孕受试者在短时期窗口内不处于发展先兆子痫的风险(先兆子痫的“排除”)。
本发明的方法的步骤(b)中提到的比较可以手动或计算机辅助地进行。该量的值和参照例如可以相互比较，且该比较可以由计算机自动进行，该计算机执行用于比较的算法。进行该评价的计算机程序将以适宜的输出形式提供希望的评估。优选地，本发明的装置的评价单元或本发明的系统的计算设备可以用来进行该比较。进行该评价的计算机程序将以适宜的输出形式提供希望的评估。对于计算机辅助的比较，可以通过计算机程序将测定量的值与存储在数据库中的对应于适宜的参照的值比较。计算机程序可以进一步评价比较的结果，即以适宜的输出形式自动提供希望的评估。基于测定量和参照量的比较，有可能作出希望的评价。例如，比较的结果可以给出为原始数据(绝对或相对量)且在一些情况下给出为指示物，该指示物可以指示具体诊断的词、短语、符号或数值形式。
本文所用的术语“参照”指参照量或值，其代表作出具有至少约98％的阴性预测值的诊断的截断。优选地，此背景中设想的阴性预测值为约99％，或更优选100％。适宜的截断量或值可以优选地如上文所讨论的根据灵敏度、特异性及预期、先兆子痫在待研究的受试者群体中的已知(例如从文献)或估计(例如根据前瞻性群组研究)的发病率确定。用作参照的截断值或量可以通过本领域已知的多种技术测定。优选地，可以用接受者操作特征曲线(receiver operating characteristic)(ROC)来确定截断值或量(尤其见Zweig 1993,Clin.Chem.39:561-577)。ROC图是在观察数据的整个范围内持续改变判定阈值(即截断值)而得到的所有灵敏度和特异性对的图。诊断方法的临床表现取决于其准确度，即它将受试者正确分配至某种预测或诊断的能力。ROC图通过将适用于进行区分的阈值的整个范围中的灵敏度对1-特异性作图来显示两种分布(受影响和未受影响的亚组的结果)之间的重叠。y轴上是灵敏度或真阳性分数，其定义为真阳性测试结果数与真阳性测试结果数和假阴性测试结果数的总和的比值。这也称为在疾病或病症存在下的阳性。它仅从受影响的亚组计算。x轴上是假阳性分数或1-特异性，其定义为假阳性结果数与真阴性结果数和假阳性结果数的总和的比值。它是特异性的指数，全部从未受影响的亚组计算。由于通过使用来自两个不同亚组的测试结果完全分离地计算真阳性和假阳性分数，所以ROC图独立于该事件在群组中的发生率。ROC图上的每个点代表对应于特定判定阈值的灵敏度和特异性对。能完美区分(两个分布结果中无重叠)的测试具有穿过左上角的ROC图，其中真阳性分数为1.0或100％(完美的灵敏度)，假阳性分数为0(完美的特异性)。无区分(两个组的分布结果相同)的测试的理论图是从左下角至右上角的45°对角线。大多数图落在这两种极端之间。如果ROC图全部落在45°对角线以下，则通过将“阳性”标准从“大于”颠倒为“小于”来容易地纠正，反之亦然。在质量上，图越靠近左上角，测试的总体准确度越高。可以从ROC图得到截断值，其中对于给定事件的诊断或预测，该ROC图允许灵敏度和特异性的适当平衡。因此，优选通过如上文所述的建立该群组的ROC并从其得到截断值量来产生待用于本发明的前述方法的参照(即允许在不处于增加的风险的受试者之间区分的截断值)。取决于诊断方法的希望的、预先选择的灵敏度和特异型或对应的置信界限，ROC图允许衍生适宜的截断值。应理解，为了有效排除受试者处于提高的风险(即排除)，调整灵敏度和特异性，使得假阴性组最小，同时为了有效地将受试者评估为处于提高的风险(即纳入)，调整灵敏度和特异性，使得假阳性组最小。此外，可以从ROC图得到曲线下面积(AUC)值，产生生物标志的独立于截断值的总体表现的指征。此外，ROC图的每个点代表某个截断值下的灵敏度和特异性对。
本发明背景中的术语“约”意指从所示的参数或值+/-20％、+/-10％、+/-5％、+/-2％或+/-1％。这还考虑由测量技术等引起的常见偏差。但是，该术语也包括准确指示的参数或值。
有利地，已在本发明的研究中发现，在取得所研究的样品时显示无或有限的临床上明显的先兆子痫、子痫或HELLP综合征的症状的怀孕受试者中sFlt-1、内皮糖蛋白或PlGF的量及其比值(还见下文)(即sFlt1/PlGF或内皮糖蛋白/PlGF比值)可作为排除急发型先兆子痫(即在约1周至约2周的短时期内发展成先兆子痫和/或急发型HELLP综合征)的指示物。尤其是，在使用前述标志时，可以建立单个生物标志的具有高阴性预测值的截断量或值。此外，已发现约46或甚至约33或更小的sFLt-1/PlGF比值是尤其有价值的指示物，其使本发明的方法的阴性预测值接近100％。另外，如实施例(尤其是实施例4)和图8中详细公开，已发现约38的sFLt-1/PlGF比值具有特别的价值。因此，在待建立的排除诊断方面，本发明的方法以特别高的置信水平运行。此外，已发现，本发明的方法不仅可以可靠地用于受试者初次就诊时取得的样品，还可以用于在随后就诊时取得的各样品。此外，本发明的方法可以用来鉴定已通过其他诊断技术、尤其是通过子宫多普勒超声波扫描术假阳性地诊断为处于发展成先兆子痫、子痫和/或HELLP综合征的风险的受试者。通过将本发明的方法应用于已通过多普勒超声波扫描术研究诊断为处于发展成先兆子痫、子痫和/或HELLP综合征的风险的受试者，可以在短时间窗口内有效和可靠地排除此诊断为假阳性的受试者。
由于本发明，有可能更可靠地排除急发型先兆子痫的风险。此外，在将本发明的方法用作辅助诊断时，可以避免耗时、昂贵和麻烦的诊断措施，如需要经良好培训的医务人员的目前的评分系统或多普勒超声波扫描术研究。在此背景中，值得注意的是，与例如多普勒超声波扫描术研究不同，本发明的方法甚至可以自动进行或由医疗支持人员进行，而无需高度专业的医务人员。保健管理将极大地从本发明的方法受益，因为为了保健管理的目的，可以更好地估计和考虑患有先兆子痫或处于发展成先兆子痫风险的怀孕雌性所需的密集和特殊的护理(如密切监测以及住院)的需要。
应理解，上下文所作的术语的定义和解释相应地适用于本说明书和所附权利要求中所述的所有实施方案。
在本发明的方法的优选实施方案中，该方法包括在所述步骤a)中测定所述受试者的样品中的生物标志sFlt-1或内皮糖蛋白以及PlGF的量，和在步骤c)中将比值与参照值比较，如果与所述参照值相比，所述比值是相同或减少的，则由此诊断所述受试者不处于在短时期内发展成先兆子痫的风险。更优选地，该方法包括在所述步骤b)之前的另一步骤：从所述步骤a)中的样品中测定sFlt-1或内皮糖蛋白以及PlGF的量来计算所述比值。
本文中提到的术语“计算比值”涉及通过除以该量或通过使sFlt-1或内皮糖蛋白的量与P1GF的量处于某种关系而进行任意其他相当的数学计算来计算sFlt-1或内皮糖蛋白的量和PlGF的量的比值。优选地，将sFlt-1或内皮糖蛋白的量除以PlGF的量来计算比值，即该比值优选是sFlt-1的量除以PlGF的量(也称为sFlt-1/PlGF)或内皮糖蛋白的量除以PlGF的量(也称为内皮糖蛋白/PlGF)。
本文所用的术语“比较”涵盖将该比值与其他地方定义的参照比较。应理解，本文所用的比较指在该比值与该参照之间进行的任意类型的比较。已在本发明的研究中发现，降低或未增加的发展成先兆子痫的风险与针对sFlt-1或内皮糖蛋白和PlGF测定的比值相关，该比值与该参照值相比是相同或减少的。更优选地，该比值的参照值是约46、约45、约40或约35或更小，优选地，它是约33或更小。甚至更优选地，针对sFlt-1和PlGF测定的比值的该参照值是约38。前述截断值与现有技术中在就诊当天用于诊断的其他(非特异性)排除方法相比显著不同(见例如Stepan同上)，且在应用于本发明的方法中时达到令人惊奇的预测的高阴性预测值。
在本发明的方法的另一优选实施方案中，该方法进一步包括基于该诊断为患者建议管理措施。
本文所用的术语“建议”意指建立可以应用于受试者或禁止应用于受试者的患者管理措施或其组合的提议。但是，在一个具体实施方案中，应理解该术语无论如何不包括应用实际的管理措施。本文所用的患者管理措施指可以应用于患有先兆子痫的受试者以治愈、避免或处理该健康病症的所有措施。例如，患者管理措施包括监测的程度(例如，密切、定期或弱监测)、住院或流动(ambulant)维持、应用或避免药物治疗、或生活方式建议。优选地，(i)如果受试者未诊断为不处于发展成先兆子痫的风险，那么所述患者管理措施选自以下措施：密切监测、住院、施用降血压剂和生活方式建议；(ii)如果受试者诊断为不处于发展成先兆子痫的风险，那么所述患者管理措施为流动监测。
本发明还涉及管理疑似患有先兆子痫的受试者的方法，其包括上文提到的用于诊断怀孕受试者是否在短时间窗口内不处于先兆子痫风险的方法的步骤，及根据所建立的诊断管理该受试者的另一步骤。优选地，该管理包括该受试者的流动维持、定期或弱监测、避免药物施用，尤其是施用降血压剂或出生前糖皮质激素(例如倍他米松(bethamethasone))，后者用于在处于早产风险的妇女中加速胎儿肺发育。
本发明还涉及怀孕受试者的样品中的生物标志sFlt-1、内皮糖蛋白和PlGF中的至少一个或与所述生物标志特异性结合的至少一种检测剂的用途，用于诊断所述受试者是否在短时期内不处于发展成先兆子痫的风险。本发明还包括怀孕受试者的样品中的生物标志sFlt-1、内皮糖蛋白以及PlGF中的至少一个或与所述生物标志特异性结合的至少一种检测剂在建议本文中其他地方给出的患者管理措施中的用途。
另外，本发明考虑怀孕受试者的样品中的生物标志sFlt-1、内皮糖蛋白和PlGF中的至少一个或与所述生物标志特异性结合的至少一种检测剂在制备用于诊断所述受试者是否在短时期内不处于发展成先兆子痫的风险的诊断实体或药物实体或组合物中的用途。本发明还包括怀孕受试者的样品中的生物标志sFlt-1、内皮糖蛋白和PlGF中的至少一个或与所述生物标志特异性结合的至少一种检测剂在制备用于建议本文中其他地方给出的患者管理措施的诊断实体或药物实体或组合物中的用途。
本发明涉及适合于通过进行本发明的方法来诊断怀孕受试者是否在短时期内不处于发展成先兆子痫的风险的装置，其包含：
a)分析单元，其包含至少一种检测剂，所述检测剂特异性结合选自sFlt-1、内皮糖蛋白以及PlGF的至少一种血管发生生物标志，所述单元适合于测定怀孕受试者的样品中的sFlt-1、内皮糖蛋白和/或PlGF的量；和
b)评估单元，其包含执行算法的数据处理器，所述算法用于将所述量与参照比较，在sFlt-1和内皮糖蛋白的情况下，如果所述量与所述参照相比是相同或减少的，并且在P1GF的情况下，如果所述量与所述参照相比是相同或增加的，则由此诊断受试者在短时期内不处于发展成先兆子痫的风险，其中所述参照允许作出具有至少约98％的阴性预测值的诊断。
本文所用的术语“装置”涉及包含前述单元的系统，该单元彼此有效连接以允许根据本发明的方法进行诊断。可以用于分析单元的优选的检测剂在本文中其他地方公开。分析单元优选包含固定在固相支持体上的检测剂，以使该固相支持体与包含待测定其量的生物标志的样品接触。此外，分析单元还可以包含检测器，该检测器测定特异性结合一种或多种生物标志的检测剂的量。测定的量可以传输至评估单元。该评估单元包含具有执行算法的数据处理元件，如计算机，该数据处理元件通过执行基于计算机的算法来进行比值的计算、该计算的比值的比较和比较结果的评价，该基于计算机的算法实施本文中其他地方详细显示的本发明的方法的步骤。结果可以提供为参数诊断原始数据的输出。应理解，这些数据通常将需要由临床医师解释。但是，还设想专家系统装置，其中输出结果包含经处理的诊断原始数据，其解释无需专业的临床医师。
在本发明的装置的优选实施方案中，该分析单元包含检测剂，其用于测定所述受试者的样品中的生物标志sFlt-1或内皮糖蛋白以及PlGF的量，且其中在评估单元中执行的算法将sFlt-1或内皮糖蛋白与PlGF的量的比值与所述参照值比较，如果所述比值与所述参照值相比是相同或减少的，则由此诊断受试者在短时期内不处于发展成先兆子痫的风险。优选地，在评估单元中执行的该算法进一步计算sFlt-1或内皮糖蛋白与PlGF的量的比值。
在本发明的另一优选实施方案中，该评估单元进一步包含执行的算法，该算法基于本文中其他地方所示的诊断作出患者管理措施的建议。
从上文可知，根据本公开的一些实施方案，本文中公开和描述的方法的一些步骤的部分可以通过计算设备来进行。计算设备可以是例如通用计算机或便携式计算设备。还应理解，多个计算设备可以一起(如通过网络或其他数据传输方法)用于进行本文公开的方法中的一个或多个步骤。示例性计算设备包括台式电脑、笔记本电脑、个人数据助理(“PDA”)(如BLACKBERRY牌设备)、蜂窝设备、平板电脑(tablet computer)、服务器等。通常，计算设备包含能够执行多个指令(如软件程序)的处理器。
计算设备可访问存储器。存储器是计算机可读介质，且可以包含例如位于计算设备内或计算设备可通过网络访问的单个存储设备或多个存储设备。计算机可读介质可以是计算设备可访问的任意可用介质，且包括不稳定或稳定的介质。另外，计算机可读介质可以是可移动和不可移动介质中的一种或两种。作为实例而非限制，计算机可读介质可以包括计算机存储介质。示例性计算机存储介质包括但不限于RAM、ROM、EEPROM、闪速存储器或任意其他存储技术、CD-ROM、数字通用光盘(DVD)或其他光盘存储、磁带盒、磁带、磁盘存储器或其他磁存储器、或可以用来存储多条指令的任意其他介质，该指令能够通过计算设备访问并通过计算设备的处理器执行。
根据本公开的实施方案，软件可以包括指令，在通过计算设备的处理器执行时，该指令可以进行本文公开的方法的一个或多个步骤。该指令中的一些可以适合于产生控制其他机器运行的信号，从而可以通过那些控制信号来运行以改变远离计算机的材料。这些描述和介绍是数据处理领域技术人员用来例如最有效地向本领域其他技术人员传递它们的工作的实质的手段。
该多个指令还可以包含算法，通常认为该算法是用于产生希望的结果的步骤的有条理序列。这些步骤是需要物理量的物理操作的那些步骤。通常，但并非必需，这些量采用能够存储、转移、转换、组合、比较和以其他方式操作的电脉冲或磁脉冲或信号的形式。主要由于习惯用法的原因，在提到其中包含或表现这类信号的物理项目或现象时，证明将这些信号称为值、字符、显示数据、数字等有时很方便。但是，应牢记，所有这些术语和类似术语将与适当的物理量相关，此处仅用作应用于这些量的方便标记。根据本公开的一些实施方案，该指令包含算法，并通过执行该指令来进行该算法，其用于进行本文公开的一个或多个标志的测定量和适宜的参照之间的比较。结果可以输出为参数诊断原始数据或绝对量或相对量。根据本文公开的系统的多种实施方案，本文公开的系统的计算设备可以基于该计算的“量”与参照或阈值的比较来提供“诊断”。例如，系统的计算设备可以以指示具体诊断的词、符号或数值的形式提供指示物。
计算设备还可以访问输出设备。示例性输出设备包括例如传真机、显示器、打印机和文件。根据本发明的一些实施方案，计算设备可以进行本文公开的方法中的一个或多个步骤，然后经输出设备提供涉及该方法的结果、指示、比值或其他因素的输出结果。
本发明进一步涉及系统，其用于通过进行本发明的方法来辅助诊断怀孕受试者是否在短时期内不处于发展成先兆子痫的风险，其包含：
a)配置的分析单元，以使样品与特异性结合选自sFlt-1、内皮糖蛋白以及PlGF的至少一种标志的一种检测剂(多种检测剂)接触并持续足以允许该检测剂和来自样品的至少一种标志形成复合体的时间；
b)配置的分析仪单元，以测量所形成的复合体的量，其中所形成的复合体的量与存在于样品中的至少一种标志的量成比例；
c)具有处理器的计算设备，其与该分析单元有效通讯；和
d)包括可由处理器执行的多个指令的非暂时性机器可读介质，该指令在执行时将所形成的复合体的量转换为至少一个生物标志的量，以反映存在于样品中的至少一个标志的量，将该量与参照相比，帮助建立根据临床预测规则而优化的风险评估，以用于根据与参照的比较结果对处于在短时期内发展成先兆子痫的风险的受试者分类。
本公开的优选实施方案包括用于根据临床预测规则优化风险评估来对具有发展成先兆子痫风险的受试者分类的系统。系统的实例包括用来检测化学反应或生物反应的结果或用来检测化学反应或生物反应的过程的临床化学分析仪、凝固化学分析仪(化学或生物学反应)、免疫化学分析仪、尿液分析仪、核酸分析仪。更具体而言，本公开的示例性系统可以包括Roche ElecsysTM系统和e免疫测定分析仪、Abbott ArchitectTM和AxsymTM分析仪、Siemens CentaurTM和ImmuliteTM分析仪及Beckman Coulter UniCelTM和AcessTM分析仪等。
该系统的实施方案可以包括用于实施本公开的一个或多个分析仪单元。本文公开的系统的分析单元通过任意已知的有线连接、蓝牙、LANS或无线信号与本文公开的计算设备有效通讯。此外，根据本公开，分析单元可以包含进行一种或两种检测(例如用于诊断目的定性和/或定量评价样品)的独立装置或更大仪器内的模块。例如，分析单元可以进行或辅助样品和/或试剂的吸取、计量、混合。分析单元可以包含用于容纳进行测定的试剂的试剂容纳单元(reagent holding unit)。试剂例如可以以包含单个试剂或试剂组的容器或盒的形式排列，放置在保存室或输送机内的适当容器或位置中。检测试剂还可以是固定在与样品接触的固相支持体上的形式。此外，分析单元可以包括可为特定分析而优化的方法和/或检测成分。
根据一些实施方案，可以配置分析单元用于分析物(例如样品中的标志)的光学检测。配置用于光学检测的示例性分析单元包含配置用于将电磁能转化为电信号的装置，其包括单元件和多元件或阵列光学检测器。根据本公开，光学检测器能够监测光电磁信号，并提供相对于基线信号的电输出信号或响应信号，该信号指示分析物在位于光程中的样品中的存在和/或浓度。这类装置还可以包括例如光电二极管(包括雪崩光电二极管)、光电晶体管、光电导检测器、线性传感器阵列、CCD检测器、CMOS检测器(包括CMOS阵列检测器)、光电倍增管和光电倍增管阵列。根据某些实施方案，光学检测器(如光电二极管或光电倍增管)可以包含附加的信号调节或处理电子设备。例如，光学检测器可以包括至少一个前置放大器、电子滤波器或集成电路。适宜的前置放大器包括例如集成的、跨阻抗的和电流增益(电流镜)的前置放大器。
此外，本公开的一个或多个分析单元可以包含用于发光的光源。例如，分析单元的光源可以包含至少一个发光元件(如发光二极管、电动辐射源，如白炽灯、电致发光灯、气体放电灯、高强度放电灯、激光)，以用于测量所测试的样品的分析物浓度或使得能够进行能量转移(例如，通过荧光共振能量转移或催化酶)。
此外，系统的分析单元可以包括一个或多个保温单元(例如，用于维持样品或试剂处于指定的温度或温度范围)。在一些实施方案中，分析仪单元可以包括用于使样品经受反复温度循环并监测样品中扩增产物的量的变化的热循环仪，包括实时热循环仪。
此外，本文公开的系统的分析单元可以包含或有效连接至反应容器或容器进料单元。示例性进料单元包括将样品和/或试剂递送至反应容器的液体处理单元，如吸取单元。吸取单元可以包含可重复使用的可洗涤针头，例如钢针，或一次性吸管端。分析单元可以进一步包含一个或多个混合单元，例如振荡包含液体的容器的振荡器，或混合容器或试剂容器中的液体的搅拌器。
本发明还涉及适用于进行本发明的方法的试剂盒，其包含至少一种检测剂和进行所述方法的说明书，所述检测剂用于测定选自sFlt-1、内皮糖蛋白以及PlGF的血管发生生物标志的量。
本文所用的术语“试剂盒”指优选分离或在单个容器中提供的前述成分的汇集。容器还包含进行本发明的方法的说明书。这些说明书可以是手册的形式，或可以通过计算机程序代码提供，在计算机或数据处理设备上执行时，该计算机程序代码能够进行本发明的方法中提到的计算和比较并相应地确定诊断。计算机程序代码可以在数据存储介质或设备(如光学存储介质(例如光盘))上或直接在计算机或数据处理设备上提供。此外，该试剂盒可以优选包含在本文中其他地方所述的生物标志的标准量，以用于校准目的。
在本发明的试剂盒的优选实施方案中，该试剂盒包含用于测定怀孕受试者的样品中sFlt1和/或内皮糖蛋白的量的检测剂和用于测定PlGF的量的检测剂。
在一些实施方案中，本文公开的试剂盒包括用于实施所公开的方法的至少一种成分或成分的包装组合。“包装组合”意指该试剂盒提供含有本文公开的一种或多种成分(如探针(例如抗体))、对照、缓冲液、试剂(例如缀合物和/或底物)说明书等的组合的单个包装。包含单个容器的试剂盒也包括在“包装组合”的定义之内。在一些实施方案中，该试剂盒包括至少一种探针，例如对本文公开的生物标志的表位具有特异性亲和力的抗体。例如，该试剂盒可以包括用荧光团标记的抗体或作为融合蛋白的成员的抗体。在该试剂盒中，探针可以是固定的，且可以以特定构象固定。例如，可以在试剂盒中提供固定的探针来特异性结合靶蛋白、检测样品中的靶蛋白和/或从样品去除靶蛋白。
根据一些实施方案，试剂盒在至少一个容器中包括至少一种探针，该探针可以是固定的。试剂盒也可以在一个或多个容器中包括任选地固定的多种探针，例如，多个探针可以存在于单个容器或分离的容器中，例如，其中每个容器包含单种探针。
在一些实施方案中，试剂盒可以包括一种或多种非固定的探针和一种或多种包括或不包括固定的探针的固相支持体。一些实施方案可以包含将一种或多种探针固定至固相支持体所需的一些或全部试剂和材料，或使固定的探针与样品内的特定蛋白质结合所需的一些或全部试剂和材料。
在某些实施方案中，可以将单种探针(包括同一探针的多个拷贝)固定在单种固相支持体上，并在单个容器中提供。在其他实施方案中，在单个容器中提供各自特异地针对不同靶蛋白或单种靶蛋白的不同形式的两种或多种探针(如特异性探针)。在一些这类实施方案中，可以在多个不同容器中提供固定的探针(例如以一次性使用的形式)，或者可以在多个不同容器中提供多种固定的探针。在其他实施方案中，该探针可以固定在多种不同类型的固相支持体上。本文公开的试剂盒考虑一种或多种固定的探针和一个或多个容器的任意组合，可以选择其任意组合来得到适用于希望的用途的试剂盒。
试剂盒的容器可以是适用于包装和/或包含本文公开的一种或多种成分(包括例如探针(例如抗体)、对照、缓冲液和试剂(例如缀合物和/或底物))的任意容器。适宜的材料包括但不限于玻璃、塑料、纸板箱或其他纸制品、木材、金属及其任意合金。在一些实施方案中，该容器可以完全包住一种或多种固定的探针或可以简单地覆盖探针来最小化灰尘、油等的污染和暴露于光下。在一些其他实施方案中，该试剂盒可以包含单个容器或多个容器，且在存在多个容器时，每个容器可以与所有其他容器相同，不同于其他，或不同于一些但不是全部其他容器。
在本发明的一方面，考虑辅助排除短时间窗口内的先兆子痫的方法，其包括：
a)测定怀孕受试者的样品中本文提到的至少一种血管发生生物标志的量，该测定包括：(i)使该样品与特异性结合该至少一种血管发生生物标志的检测剂接触并持续足以允许该检测剂和来自样品的生物标志形成复合体的时间；(ii)测量所形成的复合体的量，其中该所形成的复合体的量与存在于样品中的至少一种生物标志的量成比例；和(iii)将所形成的复合体的量转换为至少一种生物标志的量，其反映存在于样品中的至少一种生物标志的量；
b)将该量与参照比较；和
c)基于步骤b)中比较的结果辅助排除短时间窗口内的先兆子痫。
在一方面，适宜的检测剂可以是特异性结合待通过本发明的方法研究的受试者的样品中的至少一种血管发生生物标志的抗体。在一方面，可以应用的另一检测剂可以是特异性结合样品中的至少一种血管发生生物标志的适配体。还在一方面，在测量所形成的复合体的量之前将样品从检测剂和至少一种血管发生生物标志之间形成的复合体去除。因此，在一方面，检测剂可以固定在固相支持体上。还在一方面，可以通过应用洗涤溶液来将样品从固相支持体上所形成的复合体去除。所形成的复合体应与存在于样品中的至少一种血管发生生物标志的量成比例。应理解，待应用的检测剂的特异性和/或灵敏度限定了在样品中包含的能够被特异性结合的至少一种血管发生生物标志的比例的程度。关于如何进行测定的其他细节还见于本文中其他地方。应将所形成的复合体的量转换为至少一种血管发生生物标志的量，其反映确实存在于样品中的量。在一方面，这种量基本上可以是存在于样品中的量，或者在另一方面，由于所形成的复合体和存在于原始样品中的量之间存在关系，该量可以是其的某个比例。
还在前述方法的一方面，步骤a)可以通过分析单元(在一方面，本文中其他地方定义的分析单元)进行。在其他方面，步骤a)至c)的任意步骤或所有步骤可以通过本文中其他地方定义的分析单元进行。
在本发明的方法的一方面，将步骤a)中测定的量与参照比较。在一方面，该参照是本文中其他地方定义的参照。还在另一方面，该参照考虑测量的复合体的量和存在于原始样品中的量之间的比例关系。因此，在本发明的方法的一方面，所应用的参照是采用反映所使用的检测剂的局限性的人工参照。在另一方面，在进行比较时也可以考虑该关系，例如，在实际比较测定量的值与参照之前包括测定量的归一化和/或校正计算步骤。同样，测定量的归一化和/或校正计算步骤采用这样的比较步骤，使得所使用的检测剂的局限性得到正确反映。在一方面，该比较例如通过计算机系统等辅助自动地进行。
基于比较进行辅助诊断，该比较通过步骤b)中将受试者明确地分配入不处于在短时间窗口内发展成先兆子痫的风险的受试者组或含糊地将它从该组排除进行。如本文中其他地方已讨论，所研究的受试者的分配不可能在所研究的病例中100％正确。研究受试者所分配入的受试者组是人为组，因为它们是基于统计学考虑(即基于本发明的方法应当运行的某个预先选择的可能性程度)建立的。因此，该方法可以建立辅助诊断，该辅助诊断在一方面可以需要通过其他技术进一步强化诊断。在本发明的另一方面，该辅助诊断例如通过计算机系统等辅助自动地建立。
在本发明的方法的一方面，该方法进一步包括根据本文中其他地方所示的步骤c)中建立的辅助诊断的结果来治疗/开处方给/建议或管理受试者的步骤。
在前述方法的一方面，步骤b)和/或c)通过本文中其他地方所示的评估单元进行。
本说明书中引用的所用参照文献以其整体公开内容及本说明书中明确提到的公开内容并入本文作为参考。
附图简述
图1显示不同怀孕周的sFlt-1/PlGF比值。空心圆代表在取样(就诊)后1周内未测定到先兆子痫(PE)的病例，灰色圆是具有先兆子痫(PE)的病例。(A)n＝94，在46的截断值以下，未检测到PE病例；(B)n＝269；在38的截断值以下，仅检测到少数PE病例。
图2显示怀孕不同周的sFlt-1/PlGF比值。空心圆代表在取样(就诊)后2周内未测定到先兆子痫(PE)的病例。灰色圆代表具有先兆子痫(PE)的病例。在46的截断值以下，未检测到PE病例。(A)n＝94，在46的截断值以下，未检测到PE病例；(B)n＝269；在38的截断值以下，仅检测到少数PE病例。
图3(A)显示sFlt-1/PlGF比值的双变量分布分析和直至先兆子痫(PE)发病的天数；(B)与(A)中相同，但具有更大的群组。
图4(A)显示在取样(就诊)后1周内无先兆子痫(PE)发病的ROC曲线及其统计学分析。1.0的AUC(曲线下面积)达到完美的诊断测试，0.5的AUC是无用的诊断测试。AUC的置信区间反映基于现有数据的估计的准确度；n＝94；(B)与(A)中相同，但n＝269。
图5(A)显示在取样(就诊)后2周内无先兆子痫(PE)发病的ROC曲线及其统计学分析。1.0的AUC(曲线下面积)达到完美的诊断测试，0.5的AUC是无用的诊断测试。AUC的置信区间反映基于现有数据的估计的准确度；n＝94；(B)与(A)中相同，但n＝269。
图6显示使用sFlt-1/PlGF比值(A)和内皮糖蛋白/PlGF比值(B)得到的盒形图；1周PE的n＝94，4周PE的n＝88。各图左侧显示来自具有异常多普勒超声波扫描术结果(mPI-UtA>95百分位)的患者的测量，右侧显示来自具有正常结果的患者的测量。此外，对一周(左图)和四周(右图)内发展(红色框)或不发展(绿色框)PE/HELLP的患者分别测量。图表显示，尤其是在具有异常多普勒超声波扫描术结果的患者中，sFlt-1/PlGF比值和内皮糖蛋白/PlGF比值都具有预测患者是否将在一周内和四周内发展或不发展成PE的潜力。尤其是对于四周内的PE/HELLP的预测，sFlt-1/PlGF比值似乎比内皮糖蛋白/PlGF比值更准确地区分。
图7显示使用sFlt-1/PlGF比值得到的盒形图(所示盒形图n＝269)。各图左侧显示来自具有异常多普勒超声波扫描术结果(mPI-UtA>95百分位)的患者的测量，右侧显示来自具有正常结果的患者的测量。此外，对一周(A)、两周(B)和四周(C)内发展或不发展成PE/HELLP的患者分别测量。图表显示，尤其是在具有异常多普勒超声波扫描术结果的患者中，sFlt-1/PlGF具有预测患者是否将在一周内、两周内和四周内发展或不发展成PE的潜力。
图8：对于预测(PROGNOSIS)研究(具有500名患者)，测定了四周内的先兆子痫的sFlt1-PlGF比值的截断值，以及该截断值的表现。为了避免过度拟合，应用了交叉验证法，即Monte Carlo交叉验证。为此，按2比1的比例将所有数据分为两个不相交的子集(训练集和测试集)。此分割之后，在训练集上测定模型，并在测试集上评估预测。在随机选择的训练集-测试集-分割上重复此方法1999次。结果是通过盒形图反映的具有1999个截断值的1999个预测模型，具有例如约38的中位数。这是与见于大群组中的用于排除一周内先兆子痫的截断值相同的截断值(实施例4)。
实施例
以下实施例仅是说明本发明。任何情况下，它们不应解释为限制本发明的范围。
实施例1：sFlt-1、内皮糖蛋白以及PlGF的血液水平的测定
用市售免疫测定测定了sFlt-1、PlGF和内皮糖蛋白的血液水平。具体而言，使用了以下测定。
使用来自Roche ElecsysTM-或cobas eTM系列的分析仪，用夹层免疫测定测定了sFlt-1。该测定包含对各多肽特异的两种单克隆抗体。这些抗体中的第一种是生物素化抗体，第二种是用Tris(2,2’-双吡啶基)钌(II)络合物标记的抗体。在第一温育步骤中，将两种抗体与样品温育。形成包含要测定的肽和两种不同抗体的夹层复合体。在下一温育步骤中，将链霉亲和素包被的珠子加至此复合体。珠子与夹层复合体结合。然后将反应混合物吸入测量室，珠子在测量室中通过磁性被捕获在电极的表面上。然后电压的施加诱导通过光电倍增管测量的来自钌络合物的化学发光发射。发光量取决于电极上的夹层复合体的量。sFlt-1测试可从Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,德国购得。关于该测定的其他详述见于包装说明书中。sFlt-1的测量范围包括10至85,000pg/ml之间的量。
用可从R&D Systems,Inc,Minneapolis,US购得的人内皮蛋白/CD105免疫测定法测量内皮糖蛋白。此测定利用定量夹层酶免疫测定技术。将对内皮糖蛋白特异的单克隆抗体包被至微量培养板上。将标准品和样品吸入孔，通过固定的抗体结合存在的任意内皮糖蛋白。洗去任意未结合的物质后，向孔中加入对内皮糖蛋白特异的酶联单克隆抗体。洗涤去除任意未结合的抗体-酶试剂后，向孔中加入底物溶液，显示与初始步骤中结合的内皮糖蛋白的量成比例的颜色。终止显色，并测量颜色强度。关于该测定的其他详述见于包装说明书中。内皮糖蛋白的测量范围包括0.001ng/L至10ng/ml之间的量。
用两种PlGF特异性抗体在夹层免疫测定中测试PlGF，该夹层免疫测定在ElecsysTM-或cobas eTM-系列分析仪(详述见上文)上进行。PlGF测试可从RocheDiagnostics GmbH,Mannheim,德国购得。关于该测定的其他详述见于包装说明书中。PlGF的测量范围包括3至10,000pg/ml的量。
实施例2：作为1周内的结果分析先兆子痫
在用于产生ROC曲线的表格中，可以选择具有目标NPV的截断值，并估计此截断值下的灵敏度、特异性和PPV。对于所有这些比例，置信区间可基于当前样本量获得。
对于怀孕后第24+/-0周和40+/-0周之间的患者，在首次就诊时获得的样品中测定的sFlt-1/PlGF比值方面，45的截断值产生100％(95％置信下限96.58％)的NPV来预测先兆子痫，具有100％(LCL95 66.37％)的灵敏度估计和80.92％(LCL95 73.13％)的特异性估计。PPV估计为26.47％(LCL95 12.88％)。34：106个受试者在此截断值下测试为阳性/阴性，预期该34个受试者中的9个发展成PE，但该106个受试者中没有一个发展成PE。
对于怀孕后第24+/-0周和40+/-0周之间的患者，在多次就诊时获得的样品中测定的sFlt-1/PlGF比值方面，估计45的截断值产生99.43％(95％置信下限97.96％)的npv，具有86.67％(LCL95 63.66％)的灵敏度估计和80.60％(LCL95 76.56％)的特异性估计。PPV估计为13.40％(LCL95 7.33％)。97：351个就诊受试者在此截断值下测试为阳性/阴性，预测该94个就诊中的13个发展成PE，但该351个就诊中只有2个发展成PE。
结果还总结在下表中：
表1：AUC、LCL95和UCL95值
反应 生物标志 auc LCL95 ucl95
1周内发展成PE _sFlt_1_PlGF比值 0.9211 0.8703 0.9719
1周内发展成PE _内皮糖蛋白_PlGF比值 0.9118 0.8448 0.9788
1周内发展成PE tst_res_sFlt_1_pg_ml 0.933 0.8889 0.9771
1周内发展成PE tst_res_PlGF_pg_ml 0.8482 0.7608 0.9356
1周内发展成PE 内皮糖蛋白_ng_ml 0.9254 0.8615 0.9892
1周内发展成PE-所有就诊 _sFlt_1_PlGF比值 0.9108 0.8689 0.9528
1周内发展成PE-所有就诊 _内皮糖蛋白_PlGF比值 0.8949 0.8493 0.9405
1周内发展成PE-所有就诊 tst_res_sFlt_1_pg_ml 0.9087 0.849 0.9684
1周内发展成PE-所有就诊 tst_res_PlGF_pg_ml 0.8618 0.8112 0.9124
1周内发展成PE-所有就诊 内皮糖蛋白_ng_ml 0.8928 0.8419 0.9437
2周内发展成PE _sFlt_1_PlGF比值 0.9262 0.8788 0.9735
2周内发展成PE _内皮糖蛋白_PlGF比值 0.9108 0.8487 0.9729
2周内发展成PE tst_res_sFlt_1_pg_ml 0.9438 0.9041 0.9836
2周内发展成PE tst_res_PlGF_pg_ml 0.8485 0.7681 0.9288
2周内发展成PE 内皮糖蛋白_ng_ml 0.9238 0.865 0.9827
2周内发展成PE-所有就诊 _sFlt_1_PlGF比值 0.8978 0.8566 0.939
2周内发展成PE-所有就诊 _内皮糖蛋白_PlGF比值 0.873 0.8305 0.9155
2周内发展成PE-所有就诊 tst_res_sFlt_1_pg_ml 0.8897 0.8356 0.9437
2周内发展成PE-所有就诊 tst_res_PlGF_pg_ml 0.8568 0.8116 0.9021
2周内发展成PE-所有就诊 内皮糖蛋白_ng_ml 0.8615 0.8161 0.9069
4周内发展成PE _sFlt_1_PlGF比值 0.89 0.8355 0.9445
4周内发展成PE _内皮糖蛋白_PlGF比值 0.8608 0.7977 0.9239
4周内发展成PE tst_res_sFlt_1_pg_ml 0.9034 0.8447 0.9621
4周内发展成PE tst_res_PlGF_pg_ml 0.8331 0.7663 0.8999
4周内发展成PE 内皮糖蛋白_ng_ml 0.8651 0.801 0.9293
4周内发展成PE-所有就诊 _sFlt_1_PlGF比值 0.8655 0.8261 0.9049
4周内发展成PE-所有就诊 _内皮糖蛋白_PlGF比值 0.8369 0.797 0.8768
4周内发展成PE-所有就诊 tst_res_sFlt_1_pg_ml 0.861 0.8168 0.9053
4周内发展成PE-所有就诊 tst_res_PlGF_pg_ml 0.8262 0.7806 0.8717
4周内发展成PE-所有就诊 内皮糖蛋白_ng_ml 0.8233 0.7801 0.8666
实施例3：怀孕雌性中生物标志的比值：sFlt-1/PlG和内皮糖蛋白/PlGF与多普勒超声波扫描术结果预测短时间窗口内的PE/HELLP的诊断性能的比较
如果患者在就诊后一/四周内发展成PE/HELLP综合征，那么将mPI-UtA、sFlt-1/PlGF比值和内皮糖蛋白/PlGF比值作为分类标准(使用截断值)的比较。此处的群体是具有可用的多普勒超声波扫描术结果的怀孕雌性：
表2：mPI-UtA、sFlt-1/PlGF比值和内皮糖蛋白/PlGF比值作为分类标准的比较
对两个预测任务而言，两个比值似乎都优于多普勒超声波扫描术。sFlt-1/PlGF比值似乎表现得比内皮糖蛋白/PlGF比值好(用所选择的截断值)。
如果患者在就诊后一/四周内发展成PE，则sFlt-1/PlGF比值和内皮糖蛋白/PlGF比值作为分类标准(使用截断值)。此处的群体是具有异常多普勒超声波扫描术结果的所有怀孕雌性：
表3：sFlt-1/PlGF比值和内皮糖蛋白/PlGF比值作为分类标准
尤其是在四周预测任务上，sFlt-1/PlGF比值似乎优于内皮糖蛋白/PlGF比值。
表4：图4A中所示的值的ROC相关统计
表5：图5A中所示的值的ROC相关统计
实施例4：1周内结果为先兆子痫的分析，大群组(n＝269)
在用于产生ROC曲线的表格中，可以选择具有目标NPV的截断值，并估计此截断值下的灵敏度、特异性和PPV。对于所有这些比例，置信区间可基于当前样本量获得。
对于怀孕后第24+/-0周和40+/-0周之间的患者，在首次就诊时获得的样品中测定的sFlt-1/PlGF比值方面，38的截断值产生98.9％(双侧95％置信区间的下限(LCL95)：97.3％)的NPV来预测先兆子痫，具有88.2％(LCL95：72.6％)的灵敏度估计和79.8％(LCL95：75.9％)的特异性估计。PPV估计为24.4％(LCL95：17.1％)。123：372个受试者在此截断值下测试为阳性/阴性，预期该123个测试阳性中的30个发展成PE，该372个测试阴性中有4个发展成PE。该结果还总结在下表中：
表5：AUC、LCL95和UCL95值，大群组

Claims (10)

1.怀孕受试者的样品中的生物标志sFlt-1、内皮糖蛋白和PlGF中的至少一个或与所述生物标志特异性结合的至少一种检测剂在制备用于诊断所述受试者是否在短时期内不处于发展成先兆子痫的风险的诊断实体或药物实体或组合物中的用途，其中所述诊断包括方法步骤：
a)测定所述受试者的样品中以下生物标志的量：(i)sFlt-1和PlGF，或(ii)内皮糖蛋白和PlGF；
b)计算步骤a)中测定的样品中(i)sFlt-1和PlGF的量的比值，或(ii)内皮糖蛋白和PlGF的量的比值；和
c)将所述量的比值与参考值比较，如果所述量的比值与所述参考值相比相同或减少，则由此诊断所述受试者在短时期内不处于发展成先兆子痫的风险，其中所述参考值允许作出具有至少98％的阴性预测值的诊断，其中所述短时期是少于4周。
2.权利要求1的用途，其中所述参考值是46或更小。
3.权利要求1的用途，其中所述参考值是38或更小。
4.权利要求2的用途，其中所述参考值是33。
5.权利要求1的用途，其中所述短时期是1周至2周的时期。
6.权利要求1的用途，其中所述怀孕受试者处于怀孕第20周和第40周之间。
7.权利要求1的用途，其中所述样品是血液、血浆、血清或尿样品。
8.权利要求1的用途，其中所述方法进一步包括基于所述诊断建议患者管理措施。
9.权利要求8的用途，其中(i)如果受试者未诊断为不处于发展成先兆子痫的风险，那么所述患者管理措施选自以下措施：密切监测、住院、施用降血压剂和生活方式建议；(ii)如果受试者诊断为不处于发展成先兆子痫的风险，那么所述患者管理措施为流动监测。
10.权利要求1的用途，其中已基于异常的多普勒超声波扫描术结果将所述受试者鉴定为处于发展成先兆子痫、子痫和/或HELLP综合征的风险。
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