JP2008514631A - 妊娠合併症を診断および処置する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
一般的に、本発明は、妊娠関連高血圧性障害をもつ被検体の検出および処置に関する。
本発明は、一部、NIH認可番号DK 064255およびHL 079594による政府からの援助でなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
子癇前症は、妊娠の5〜10%を冒し、結果として、実質的な母親および胎児の罹患ならびに死亡を生じる、高血圧、浮腫およびタンパク尿の症候群である。子癇前症は、1年あたり世界中の少なくとも200,000人の妊産婦死亡を占める。子癇前症の症状は、典型的には、妊娠第20週目後に現れ、通常、女性の血圧および尿の日常的測定により検出される。しかしながら、これらのモニタリング方法は、効果的な処置が利用できる場合には、被検体または発育中の胎児へのリスクを低減させうる、初期での症候群の診断について効果がない。
本発明者らは、子癇前症および子癇を含む妊娠関連高血圧性障害を診断および処置するための方法を発見した。
本発明者らは、可溶性エンドグリンが、子癇前症または子癇のような妊娠関連高血圧性障害をもつ女性から採取された血清試料において上昇していることを発見した。可溶性エンドグリンは、タンパク分解酵素による膜結合型の細胞外部分の切断により形成されうる。過剰可溶性エンドグリンは、胎盤から、これらの必須の血管形成因子および分裂促進因子の必要な量を枯渇させている可能性がある。従って、可溶性エンドグリンは、子癇前症または子癇を含む妊娠関連高血圧性障害の優れた診断マーカーである。さらに、本発明者らは、可溶性エンドグリンの成長因子への結合に干渉する治療用作用物質、可溶性エンドグリン発現もしくは生物活性を低下させる作用物質、または成長因子のレベルを増加させる作用物質が、被検体において、子癇前症もしくは子癇のような妊娠関連高血圧性障害を処置または予防するために用いられうることを発見した。そのような作用物質は、限定されるわけではないが、可溶性エンドグリンに対する抗体、可溶性エンドグリンのレベルを低下させるアンチセンスまたはRNAiについてのオリゴヌクレオチド、成長因子のレベルを増加させる化合物、エンドグリンの膜結合型のタンパク分解性切断を阻止し、それにより可溶性エンドグリンの放出を阻止する化合物、および可溶性エンドグリンを結合し、成長因子結合部位をブロックする低分子を含む。本発明はまた、子癇前症または子癇を含む妊娠関連高血圧性障害の初期診断および管理のための検出ツールとして可溶性エンドグリンのレベルを測定するための方法を特徴とする。
本発明は、子癇前症、子癇のような妊娠関連高血圧性障害、またはそのような状態を発症する性向に関する、可溶性エンドグリンの検出に基づいたアッセイを特徴とする。本明細書に記載された方法は、具体的には、子癇前症および子癇に言及しているが、本発明の診断およびモニタリングは、限定されるわけではないが、妊娠性高血圧、胎内発育遅延(SGA)児を伴う妊娠、HELLP、慢性高血圧、子癇前症(軽度、中程度、および重度)、および子癇を含む任意の妊娠関連高血圧性障害に適用されることは理解されるべきである。
本発明はまた、診断用検査キットを提供する。例えば、診断用検査キットは、可溶性エンドグリンに対する抗体、および抗体と可溶性エンドグリンポリペプチドの間の結合を検出する、およびより好ましくは評価するための手段を含みうる。検出について、抗体かまたは可溶性エンドグリンポリペプチドのいずれかが標識され、可溶性エンドグリンポリペプチド-抗体相互作用が、抗体と可溶性エンドグリンポリペプチドの間の結合後、基質に付着した標識の量を測定することにより確立されうるように、抗体かまたは可溶性エンドグリンポリペプチドのいずれかは、基質に結合している。通常のELISAは、抗体-基質相互作用を検出するための一般的な、技術分野公知の方法であり、本発明のキットと共に提供されうる。可溶性エンドグリンポリペプチドは、限定されるわけではないが、尿、血清、血漿、唾液、羊水、または脳脊髄液を含む、事実上いかなる体液においても、検出されうる。本発明はまた、可溶性エンドグリン核酸のレベルを検出かつ測定するために用いられうる可溶性エンドグリン核酸を含む診断用検査キットを提供する。正常な対照に存在するレベルのような参照に対する、可溶性エンドグリンポリペプチドのレベルにおける変化を測定するキットは、本発明の方法において診断用キットとして有用である。
上で考察されているように、可溶性エンドグリン核酸またはポリペプチドのレベルは、子癇前症、子癇、またはそのような状態を発症する性向をもつ被検体において増加している。これらの発見に基づいて、本発明の組成物は、発現が子癇前症または子癇に罹っている被検体において変化している、可溶性エンドグリンポリペプチドまたは核酸分子の発現を調節するものを同定するための候補化合物の高処理量で低コストなスクリーニングに有用である。
一般的に、可溶性エンドグリンポリペプチドの活性を減少させる能力がある化合物は、当技術分野において公知の方法により、天然産物もしくは合成(もしくは半合成)抽出物の両方の大きなライブラリーまたは化学的ライブラリーから、またはポリペプチドもしくは核酸ライブラリーから同定される。試験抽出物または化合物の正確な源が本発明のスクリーニング手順にとって重要ではないことを、薬物発見および開発の分野における業者は理解しているものと思われる。スクリーニングにおいて用いられる化合物は、公知の化合物(例えば、他の疾患または障害に用いられる公知の治療用物質)を含みうる。または、事実上、未知の化学的抽出物または化合物のいくつでも、本明細書に記載された方法を用いてスクリーニングされうる。そのような抽出物または化合物の例は、限定されるわけではないが、植物に、真菌に、原核生物に、または動物に基づいた抽出物、発酵ブロス、および合成化合物、加えて現存の化合物の改変を含む。多数の方法もまた、限定されるわけではないが、糖に、脂質に、ペプチドに、および核酸に基づいた化合物を含む任意の数の化学化合物のランダムなまたは定方向性合成(例えば、半合成または全合成)を生じるのに有効である。合成化合物ライブラリーは、Brandon Associates(Merrimack, NH)およびAldrich Chemical(Milwaukee, WI)から市販されている。または、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形をとる天然化合物のライブラリーは、Biotics(Sussex, UK)、Xenova(Slough, UK)、Harbor Branch Oceangraphics Institute(Ft. Pierce, FL)およびPharmaMar. U.S.A.(Cambridge, MA)を含む、いくつかの供給元から市販されている。加えて、天然のおよび合成的に作製されたライブラリーは、必要に応じて、当技術分野において公知の方法に従って、例えば、標準抽出および分画方法により作製される。さらに、必要に応じて、任意のライブラリーまたは化合物は、標準の化学的、物理的、または生化学的方法を用いて容易に改変される。
本発明は、被検体において子癇前症もしくは子癇を処置または予防するための方法および組成物を特徴とする。可溶性エンドグリンのレベルが、子癇前症、子癇をもつ、またはそのような状態に対する素因をもつ被検体において増加していることを考慮すれば、可溶性エンドグリンポリペプチドもしくは核酸分子の発現レベルおよび/または生物活性を減少させる任意の作用物質が、本発明の方法において有用である。そのような作用物質は、可溶性エンドグリンのリガンドへの結合を乱すことができるTGF-β1、TGF-β3、アクチビン-A、BMP2、またはBMP7のような化合物;可溶性エンドグリンを特異的に結合する精製抗体または抗原結合断片;アンチセンス核酸塩基オリゴマー;およびRNA干渉を媒介するために用いられるdsRNAを含む。追加の有用な化合物は、例えば、血管形成アッセイにより測定されるような、可溶性エンドグリンの生物活性を変化させることができる任意の化合物を含む。例示的な処置方法は下で詳細に記載されている。これらの方法はまた、PCT公開番号WO 2004/008946およびU.S.特許公開番号20040126828に記載されているような、sFlt-1レベルを減少させるための、またはVEGFもしくはPlGFレベルを増加させる、もしくはsFlt-1レベルを減少させるための方法と組み合わせられうる。
TGF-βは、多くの細胞型において増殖、分化、運動性、組織リモデリング、神経形成、創傷修復、アポトーシス、および血管形成を制御する少なくとも25個の成長因子のファミリーの原型である。TGF-βはまた、多くの細胞型において細胞増殖を抑制し、マトリックスタンパク質の合成を刺激することができる。それが用いられている文脈から証明されない限り、本明細書全体を通して用いられる場合、TGF-βという用語は、一般的には、それぞれに見合ったTGF-βスーパーファミリーのありとあらゆるメンバーを指すと理解されるものとする。可溶性エンドグリンは、TGF-β1、TGF-β3、アクチビン、BMP-2、およびBMP-7を含むTGF-βファミリーのいくつかの特定のメンバーを結合し、発育中の胎児または胎盤からこれらの必要な分裂促進性および血管形成性因子を枯渇させるように働きうる。本発明は、可溶性エンドグリンに結合しうる、および可溶性エンドグリンの効果を中和しうるこれらのリガンドのレベルを増加させる方法を特徴とする。
本発明の好ましい態様において、限定されるわけではないが、TGF-β1、TGF-β3、アクチビン-A、BMP2、およびBMP7を含むTGF-βファミリータンパク質のような任意の可溶性エンドグリンリガンドの精製された形が、子癇前症もしくは子癇を処置または予防するために被検体に投与される。
本発明者らは、タンパク分解酵素がエンドグリンの膜結合型を切断し、可溶性型として細胞外ドメインを放出しうる、エンドグリンの細胞外ドメインにおける可能性のある切断部位を同定した。本発明者らの、切断部位の配列アラインメントは、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)が、可溶性エンドグリンの切断および放出に関与しうることを示唆している。または、カテプシンまたはエラスターゼもまた、切断事象に関与しうる。MMPはまた、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、およびストロメライシンとしても知られており、現在、26個の公知のファミリーメンバーがある(概説として、Whittaker and Ayscough, Cell Transmissions 17:1 (2001)参照)。好ましいMMPは、子癇前症患者由来の胎盤において上方制御されることが知られている、MMP9である(Lim et al., Am. J. Pathol. 151:1809-1818, 1997)。MMPの活性は、プロ酵素の活性化、およびメタロプロテイナーゼの組織インヒビター(TIMPS)のような内因性インヒビターによる抑制を通して制御される。MMPのインヒビターは、亜鉛結合タンパク質である。Whittaker et al., 前記、に概説されているが、4つの公知の内因性インヒビター(TIMP1〜4)がある。一つの好ましいMMPインヒビターは、βグリカン、エンドグリンとの類似性を有する分子を切断することが示されている膜型MMP1のインヒビターである(Velasco-Loyden et al., J. Biol. Chem. 279:7721-7733 (2004))。加えて、様々な天然に存在するおよび合成のMMPインヒビターが同定されており、またWhittaker et al., 前記、に概説されている。例は、MMPへ方向づけられた抗体、ならびにマリマスタット(marimastat)、バチマスタット(batimastat)、CT1746、BAY 12-9566、プリノマスタット(Prinomastat)、CGS-27023A、D9120、BMS275291(Bristol Myers Squibb)、およびトロケード(trocade)を含む様々な化合物を含み、それらの一部は、現在、臨床試験中である。可溶性エンドグリンレベルの放出および上方制御におけるMMP、カテプシン、またはエラスターゼの可能性のある役割を仮定すれば、本発明はまた、被検体における子癇前症もしくは子癇の処置または予防のための、可溶性エンドグリンの切断および放出に関与する任意のMMP、カテプシン、またはエラスターゼの活性を阻害することが知られている上記のもののような任意の化合物の使用を提供する。
本発明は、被検体における子癇前症の処置または予防のための、TGF-β1、TGF-β3、アクチビン-A、BMP2、およびBMP7を含む可溶性エンドグリン結合タンパク質の血清レベルを刺激するまたは増加させることが知られている任意の化合物の使用を提供する。これらの化合物は、単独で、または上記の精製タンパク質、もしくは本明細書に記載されたTGF-βファミリータンパク質のタンパク質レベルを増加させるために用いられる他の方法のいずれかと組み合わせて用いられうる。一つの例において、シクロスポリンが、1日2回、100〜200mgの用量でTGF-β1産生を刺激するために用いられる。
追加の治療用化合物は、血管形成アッセイを用いて同定されうる。例えば、可溶性エンドグリンの上昇したレベルをもつ子癇前症血清はマトリゲル管形成アッセイへ添加され、抗血管形成状態を誘導する。試験化合物は、その後、アッセイへ添加され、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%またはそれ以上の抗血管形成状態における逆転が、その化合物が可溶性エンドグリンの生物活性を低下させることができ、治療用化合物として有用であることを示している。
最近の研究は、血管傷害の部位へVEGFのような内皮細胞分裂促進因子を発現させる能力がある核酸(DNAまたはRNA)の送達が、傷害された血管の増殖および再内皮化を誘導する。本発明は血管傷害に関連していないが、核酸の内皮細胞への送達のためのこれらの一般的な技術は、TGF-β1、TGF-β3、アクチビン-A、BMP2、およびBMP7のような可溶性エンドグリン結合タンパク質をコードする核酸の送達のために本発明において用いられうる。その技術はまた、被検体における子癇前症もしくは子癇の処置または予防のための、可溶性エンドグリンの切断および放出に関与する任意のMMP、カテプシン、またはエラスターゼの活性を抑制することが知られている上記のもののようなタンパク質をコードする核酸の送達のために用いられうる。これらの一般的な技術は、米国特許第5,830,879号および第6,258,787号に記載されており、参照により本明細書に組み入れられている。
本明細書に記載された核酸のいずれかについて、核酸を投与するための標準的方法が用いられうる。例えば、可溶性エンドグリン結合タンパク質をコードする核酸の操作および取扱いを簡単にするために、核酸は、好ましくは、プロモーターへ実施可能に連結されているカセットへ挿入される。プロモーターは、所望の標的宿主細胞において可溶性エンドグリン結合タンパク質の発現を作動させることができなければならない。適切なプロモーターの選択は、容易に達成されうる。好ましくは、高発現プロモーターを用いる。適したプロモーターの例は、763塩基対サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターである。ラウス肉腫ウイルス(RSV)(Davis et al., Hum. Gene Ther. 4:151-159, 1993)およびマウス乳癌ウイルス(MMTV)プロモーターもまた用いられうる。特定のタンパク質は、それらの天然のプロモーターを用いて発現されうる。発現を増強しうる他のエレメントもまた、含まれうる(例えば、エンハンサー、または結果として、tat遺伝子およびtatエレメントのような発現の高レベルを生じる系)。組換えベクターは、pUC118、pBR322、または、例えば、大腸菌(E. coli)複製起点を含む他の公知のプラスミドベクターでありうる(Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, 1989参照)。プラスミドベクターはまた、マーカーポリペプチドが、処置されることになっている生物体の代謝に有害に影響を及ぼさないとの条件で、アンピシリン耐性についてのβラクタマーゼのような選択マーカーを含みうる。カセットはまた、PCT公開番号WO 95/22618に開示されている系のような合成送達系において核酸結合部分に結合させられうる。
本発明はまた、可溶性エンドグリンmRNAの発現を直接的に下方制御するためにアンチセンス核酸塩基オリゴマーの使用を特徴とする。相補的核酸配列(センス鎖またはコード鎖)への結合により、アンチセンス核酸塩基オリゴマーは、おそらく、RNアーゼHによるRNA鎖の酵素的切断を通して、タンパク質発現を阻害することができる。好ましくは、アンチセンス核酸塩基オリゴマーは、可溶性エンドグリンの増加したレベルを発現させる細胞において可溶性エンドグリンタンパク質発現を低下させる能力がある。好ましくは、可溶性エンドグリンタンパク質発現における減少は、対照オリゴヌクレオチドで処理された細胞に対して少なくとも10%、好ましくは20%またはそれ以上、より好ましくは40%、50%、60%、70%、80%、90%またはそれ以上である。アンチセンス核酸塩基オリゴマーを選択し、かつ調製するための方法は、当技術分野において周知である。VEGF発現を下方制御するためのアンチセンス核酸塩基オリゴマーの使用の例として、参照により本明細書に組み入れられている、米国特許第6,410,322号を参照されたい。タンパク質発現のレベルをアッセイするための方法もまた、当技術分野において周知であり、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、およびELISAを含む。
完全長エンドグリンシグナル伝達の阻害は、絨毛外植片培養において栄養芽層侵襲性を増強することが示された(Caniggia I et al., Endocrinology, 1997, 138:4977-88)。可溶性エンドグリンは、それゆえに、初期妊娠中に栄養芽層侵襲性を増強する可能性が高い。従って、妊娠関連高血圧性障害または妊娠関連高血圧性障害を発症する性向をもたない女性において妊娠の初期に可溶性エンドグリンレベルを増加させる組成物は、胎盤形成を増強するために有益でありうる。可溶性エンドグリンレベルを増加させる組成物の例は、精製された可溶性エンドグリンポリペプチド、可溶性エンドグリンをコードする核酸分子、および可溶性エンドグリンのレベルもしくは生物活性を増加させる化合物または成長因子を含む。
以下の方法は、タンパク質または遺伝子発現を評価し、可溶性エンドグリン結合タンパク質レベルを増加させるための、または可溶性エンドグリンタンパク質レベルを減少させるための上記方法のいずれかについての効力を測定するために用いられうる。
子癇前症を患っている妊婦から採取された血清試料に見出される可溶性エンドグリンのレベルの上昇は、可溶性エンドグリンが、胎児または胎盤の適切な発育および血管形成に必要とされる機能性成長因子に結合して、栄養芽細胞および母親の内皮細胞から枯渇させる「生理学的シンク(sink)」として働いている。可溶性エンドグリンに結合し、可溶性エンドグリンの活性を中和しうる(例えば、TGF-β1、TGF-β3、アクチビン-A、BMP2、BMP7への結合)、抗体のような化合物の使用は、遊離TGF-β1、TGF-β3、アクチビン-A、BMP2、およびBMP7における増加を生じることにより、子癇前症もしくは子癇を予防または処置するのを助けうる。そのような増加は、胎盤の発育および胎児の栄養ならびに全身的な母親の内皮細胞健康に必要とされる栄養芽層増殖、遊走、および血管形成における増加を可能にする。
sFlt-1受容体へ特異的に結合するモノクローナル抗体は、当技術分野において公知の方法により産生されうる。これらの方法は、Kohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975)およびCampbell (「Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas」, Burdon et al., Eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985)により、加えてHuse et al. (Science, 246, 1275-1281, 1989)により記載された組換えDNA方法により、記載された免疫学的方法を含む。
可溶性エンドグリンは、それ自身が免疫原として用いられうる、または担体タンパク質に、もしくはセファロースビーズのような他の物体に付着しうる。可溶性エンドグリンは、ヒト臍静脈内皮細胞(栄養芽層またはHUVEC;Burrows et al., Clin. Cancer Res. 1:1623-1634, 1995; Fonsatti et al., Clin. Cancer Res. 6:2037-2043, 2000)のような内因性タンパク質を発現させることが知られている細胞から精製されうる。膜結合エンドグリンを発現させる細胞は、細胞外ドメインを切断し、それにより可溶性型を産生するために、タンパク分解酵素(例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ)で処理されうる。追加として、可溶性エンドグリンまたはその部分をコードする核酸分子が、標準的組換えDNA技術を用いて宿主細胞における発現のために公知のベクターへ挿入されうる。可溶性エンドグリン発現のための適切な宿主細胞は、バキュロウイルス細胞(例えば、Sf9細胞)、細菌細胞(例えば、大腸菌)、および哺乳動物細胞(例えば、NIH3T3細胞)を含む。
本発明はまた、本明細書に記載された抗体の機能的等価物を含む。機能的等価物は、本発明の抗体の可変または超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列をもつポリペプチドを含む。機能的等価物は、抗体の結合特性に匹敵する結合特性をもち、例えば、キメラ化、ヒト化、および一本鎖抗体、加えてそれらの断片を含む。そのような機能的等価物を作製する方法は、例えば、PCT公開番号WO 93/21319;欧州特許出願第239,400号;PCT公開番号WO 89/09622;欧州特許出願第338,745号;欧州特許出願第332424号;および米国特許第4,816,567号に開示されている;それぞれは参照により本明細書に組み入れられている。
抗体の等価物は、当技術分野において公知の方法により調製される。例えば、抗体の断片は、抗体全体から酵素的に調製されうる。好ましくは、抗体の等価物は、そのような等価物をコードするDNAから調製される。抗体の断片をコードするDNAは、完全長抗体をコードするDNAの所望の部分を除く全てを除去することにより調製されうる。
モノクローナル抗体は、標準的な技術分野公知の方法を用いて単離および精製される。例えば、抗体は、可溶性エンドグリンペプチド抗原に対するELISAまたはウェスタンブロッティング分析のような標準的な技術分野公知の方法を用いてスクリーニングされうる。そのような技術の非限定的例は、参照により本明細書に組み入れられている、米国特許第6,365,157号の実施例IIおよびIIIに記載されている。
子癇前症もしくは子癇の処置または予防のためにインビボで用いられる場合、本発明の抗体は、治療的有効量で被検体に投与される。好ましくは、抗体は、持続注入により、非経口でまたは静脈内に投与される。用量および投与計画は、疾患の重症度および被検体の全体的な健康状態に依存する。投与される抗体の量は、典型的には、被検体体重の約0.001〜約10mg/kg、好ましくは被検体体重の0.01〜約5mg/kgの範囲である。
任意で、子癇前症または子癇治療用物質は、任意の他の標準的な子癇前症または子癇治療と併用して投与されうる;そのような方法は当業者に公知であり、米国特許出願公開番号20040126828、20050025762、および2005017044、ならびにPCT公開番号WO 2004/008946およびWO 2005/077007に記載された方法を含む。
好ましくは、治療用物質は、子癇前症もしくは子癇の処置もしくは予防のために妊娠中に、または分娩後の子癇前症もしくは子癇を処置するために妊娠後に投与される。投与についての技術および用量は、化合物の型(例えば、化学化合物、精製タンパク質、抗体、アンチセンス、RNAi、または核酸ベクター)に依存して変わり、当業者に周知であるか、または容易に決定される。
子癇前症、子癇、またはそのような状態を発症する性向をもつ被検体の疾患状態または処置は、本発明の方法および組成物を用いてモニターされうる。例えば、尿、血漿、羊水、またはCSFのような体液に存在する可溶性エンドグリンポリペプチドの発現がモニターされる。可溶性エンドグリンモニタリングは、sFLt-1、VEGFまたはPlGFポリペプチドの発現をモニターするための方法と組み合わせられうる。そのようなモニタリングは、例えば、被検体において特定の薬物の効力を評価するにおいて、または疾患進行を評価するにおいて有用でありうる。可溶性エンドグリン核酸分子またはポリペプチドの発現を減少させる治療用物質は、本発明において特に有用であるとみなされる。
以下の実施例は、本発明を例証することを意図される。それらは、決して、本発明を限定することを意図されない。
子癇前症において病態的役割を果たす新規な分泌される因子を同定しようとする試みにおいて、本発明者らは、Affymetrix U95Aマイクロアレイチップを用いて、子癇前症をもつ17人の妊婦および13人の正常な妊婦からの胎盤組織の遺伝子発現プロファイリングを行った。本発明者らは、エンドグリンの遺伝子が子癇前症をもつ女性において上方制御されていることを見出した。
子癇前症の女性由来の胎盤および血清においてエンドグリンタンパク質のレベルを測定するために用いられるウェスタンブロット分析は、子癇前症の妊婦の胎盤および血清に存在するより小さいタンパク質(63kDa)の存在を示唆した。本発明者らは、このより小さい断片がエンドグリンの細胞外ドメインであることを実証した。この切り詰められたバージョンは、子癇前症をもつ患者において、胎盤のシンシチウム栄養芽層および内皮細胞から分断され、過剰量で循環される可能性が高い。このエンドグリンの可溶性型は、正常な血管健康に必要である循環リガンドに結合することにより、抗血管形成性作用物質として働きうる。
正常、軽度子癇前症、または重度子癇前症の女性の血清由来の循環している可溶性エンドグリンのレベルを比較するために、本発明者らは、これらの女性から採取された血液試料においてELISA分析を行った。患者は、腎炎性範囲タンパク尿(24時間尿収集における>3gのタンパク質、または3.0より大きい尿タンパク質/クレアチニン比率)の存在または非存在に基づいて軽度および重度の子癇前症へ分けられた。軽度子癇前症群における平均尿タンパク質/クレアチニン比率は、0.94+/-0.2であり、重度子癇前症群においては、7.8+/-2.1であった(図5)。ELISAは、以前に記載されているように(Maynard et al, J. Clin. Invest. 111:649-658, 2003)、R & D Systems, MN(カタログ# DNDG00)から市販されているELISAキットを用いて行われた。
内皮管アッセイは、血管形成のインビトロモデルに用いられうる。成長因子低減マトリゲル(Matrigel)(7mg/mL, Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA)が、あらかじめ冷却された48ウェル細胞培養プレートのウェル(100μl/ウェル)に置かれ、重合を可能にするように25〜30分間、37℃でインキュベートされる。3〜5継代におけるヒト臍静脈内皮細胞(30,000+ 300μlの無血清内皮基本培地中、Clonetics, Walkersville, MD)は、10%患者血清で処理され、マトリゲルコーティング化ウェル上へ蒔かれ、37℃で12〜16時間、インキュベートされる。管形成は、その後、4Xでの倒立位相差顕微鏡(Nikon Corporation, Tokyo, Japan)を通して評価され、Simple PCI画像化分析ソフトウェアを用いて分析される(管面積および全長)。
この研究は、可溶性エンドグリンが臨床的子癇前症中に変化するかどうか、およびそれが女性において子癇前症および子癇を予測するために用いられうるかどうかを評価するように設計された。
-70℃で保存された血漿試料は、解凍され、血漿可溶性エンドグリンレベルが、R&D systems, Minneapolis, MN(カタログ# DNDG00)から市販されているELISAキットを用いて1バッチにおいて測定された。
共分散分析が、子癇前症を発症する運命にある患者と、血液試料採取における在胎齢および試料保存の間隔について適合させた後の正常な妊娠においてとの間での可溶性エンドグリンの血漿濃度における差を評価するために用いられた。カイ二乗またはフィッシャーの直接確率検定が、割合の比較に用いられた。用いられた統計学パッケージは、SPSS V.12(SPSS Inc., Chicago, IL)。有意性は、0.05未満のp値として仮定された。
研究集団の臨床的特徴は、表1に記載されている。子癇前症をもつ群は、対照群より多くの未経産女性を含み、より早く出産した。重要なことには、胎児の出生時体重が、子癇前症群においてより小さく、胎内発育遅延(SGA)児を身ごもる女性の割合がより高かった。
pβ:子癇前症の臨床症状時点の試料と正常妊娠の間で比較される。
値は平均±sdとして表されている。
δ2人の子癇前症患者は、臨床症状時点で入手できる血液試料がなかった。
pβ:子癇前症の臨床症状時点の試料と正常妊娠の間で比較される。
値は平均±sdとして表されている。
δ:2人の子癇前症患者は、臨床症状時点で入手できる血液試料がなかった。
これらの実験の結果は、臨床的子癇前症をもつ女性が、在胎齢の一致した対照と比較した場合、非常に高いレベルの循環可溶性エンドグリンを有することを実証している。結果はまた、子癇前症を発症する運命にある女性(前臨床的子癇前症)が、正常な妊娠をしていると予想される者より高い血漿可溶性エンドグリンレベルをもつことを実証している。可溶性エンドグリンレベルにおける増加は、臨床症状の発生の少なくとも6〜10週間前に検出可能である。最後に、これらの結果は、早発性および遅発性子癇前症の両方が、上昇した循環可溶性エンドグリン濃度を有するが、変化は、早発性子癇前症においてより劇的である。
上記のように、本発明者らは、可溶性エンドグリン、血管形成促進性タンパク質TGF-βについての細胞表面受容体で、内皮およびシンシチウム栄養芽層上に発現されている、が子癇前症の胎盤において上方制御されていることを発見した。上記の実験において、本発明者らは、子癇前症において、過剰可溶性エンドグリンが、細胞外ドメインの分断を通して胎盤から循環へ放出されることを示した;可溶性エンドグリンは、その後、sFlt1、胎盤成長因子(PlGF)およびVEGFを結合する抗血管形成性因子、と協力して内皮機能障害を引き起こしうる。この仮説を試験するために、本発明者らは、子癇前症を発症した女性における、および妊娠性高血圧(GH)および胎内発育遅延(SGA)児を伴った妊娠のような他の妊娠合併症をもつ女性における、妊娠中を通して可溶性エンドグリン、sFlt1、および遊離PlGFの血清濃度を、正常血圧の対照妊娠の女性のそれらと比較した。この研究は、NIHにおけるRichard Levine博士と共同して行われた。
臨床的情報
この研究は、子癇前症予防試験のためのカルシウム(Calcium for Pre-eclampsia Prevention trial)(CPEP)に参加した4,589人の健康な未経産女性のコホート内にネストされた妊娠合併症の症例対照法(早発性子癇前症、満期子癇前症、妊娠性高血圧、SGA児を伴う妊娠、正常血圧の対照妊娠)であった。120の無作為症例が、研究群のそれぞれから選択された。研究方法は、子癇前症について最近行われたネスト化症例対照法と同一であった(Levine et al., N. Eng. J. Med. 2004, 350:672-83)。各女性からの血液検体は、研究登録(13〜21週間)の前に、26〜29週間目に、36週間目に、および高血圧またはタンパク尿の疑いで、得られた。陣痛の発生および分娩の前に妊娠中のいかなる時点でも収集されたすべての血清検体は、研究に対して適格であった。症例は、満期子癇前症、妊娠性高血圧、またはSGAを発症し、かつ既知の主要な構造的または染色体異常のない男の生産児または死産児を出産し、かつベースライン血清検体が得られた、120人の女性を含んだ。(PE<37週間)と定義される早発性子癇前症について、CPEPコホートからのすべての72人の患者が研究された。子癇前症の臨床基準は、Levine et al., (2004), 前記、に記載されている。妊娠性高血圧のすべての症例は、妊娠性高血圧の発症の1日前から次に続く7日間までの間隔内に正常な尿タンパク質測定値をもつことが必要とされた。SGAは、人種、未経産、および産児性別に特異的な在胎齢についての出生時体重のZhang & Bowesの表を用いて、<第10および<第5(重度SGA)パーセンタイルとして定義された。対照は、既知の主要な構造的奇形または染色体異常のない生産児または死産児を出産した、子癇前症または妊娠性高血圧またはSGAのない女性から無作為に選択され、臨床センターにより、第1血清検体の収集時の在胎齢(±1週間)により、フリーザー保存期間(±1年間)により、および凍結融解の数により、1つの対照対1つの症例を一致させた。合計1674個の血清検体が研究された。在胎齢による一致は、sFlt-1、VEGF、およびPlGFのレベルにおける在胎齢に関連した差について調整するために行われた。フリーザー保存期間についての一致は、フリーザー保存中の可能性のある分解による差を最小にするために行われた。臨床センターによる一致は、子癇前症率が、センター間で、おそらく疾患の病態生理学における違いにより、有意に異なるという事実について調整するために行われた。加えて、センターは、検体の収集、調製および保存することについてわずかに異なる手順を用いた可能性がある。融解の数による一致もまた、症例および対照が、等しく凍結融解分解に曝されたであろうことを保証するために行われた。
様々な抗血管形成マーカーについてのELISAは、臨床転帰に目隠しされた単一の研究助手によりKarumanchi研究所において行われた。
t検定が、有意性を決定するために、対数変換後の様々な測定値の比較について用いられた。P<0.05が統計学的有意とみなされた。
方法に記載されているような様々な在胎齢群時期中の妊娠中を通じての妊婦の5つの異なる研究群についての平均可溶性エンドグリン(図6)、sFlt1(図7)、およびPlGF(図8)濃度が、図6〜8に示されている。子癇前症群および妊娠性高血圧群について、臨床症状の発生後に採取された検体は、ここには示されていない。在胎齢を一致させた対照検体と比較して、早発性子癇前症の9〜11週間前に始まって、可溶性エンドグリンおよびsFlt1が増加し、かつ遊離PlGFが減少し、子癇前症発症後、それぞれ、5倍高い(46.4ng/ml対9.8ng/ml、P<.0001)および3倍高い(6356pg/ml対2316pg/ml、P<.0001)、ならびに4倍低い(144pg/ml対546pg/ml、P<.0001)レベルに達した。満期子癇前症について、可溶性エンドグリンは、子癇前症発症の、12〜14週間前に始まって増加し、遊離PlGFは9〜11週間前に始まって減少し、sFlt1は<5週間前に始まって増加した。sFlt1および遊離PlGFの血清濃度は、妊娠期間の10〜42週間目のSGA、または在胎齢に比して平均/不当過大(AGA/LGA)児を伴う妊娠間で有意には異ならなかった。血清可溶性エンドグリンは、17〜20週間目から始まってSGA妊娠においてやや増加し(7.2ng/ml対5.8ng/ml、P=.03)、AGA/LGA妊娠における12.9ng/mlと比較して、軽度および重度SGAについて、それぞれ、37〜42週間目に、15.7ng/mlおよび43.7ng/mlの濃度に達した(重度SGA対AGA/LGA、P=.002)。妊娠性高血圧研究において、GA一致の対照検体と比較して、可溶性エンドグリンにおける穏やかな増加が、妊娠性高血圧の<1〜5週間前に明らかになり、妊娠性高血圧の発症後、可溶性エンドグリンについて2倍高いレベル(29.7ng/ml対12.5ng/ml、P=.002)に達した。対照可溶性エンドグリン濃度の最高四分位値にある(>7.2ng/ml)21〜32週間目に得られた検体についてその後の早発性PEで調整したオッズ比は、9.8であった(95% CI 4.5〜21.5)。
この研究の結果は、妊娠33週間目の前に測定された場合の可溶性エンドグリンレベルおよび可溶性エンドグリン抗血管形成指数レベルが、正常な対照妊娠と比較した場合、早発性子癇前症を発症する運命にある女性において、および臨床的早発性子癇前症(PE<37週間)をもつ女性において、劇的に上昇したことを示している。それゆえに、可溶性エンドグリンレベルおよび可溶性エンドグリン抗血管形成指数レベル(33週間目の前)は、早発性子癇前症の診断だけでなく、子癇前症の予測にも用いられうる。可溶性エンドグリンレベルおよび可溶性エンドグリン抗血管形成指数レベルにおける上昇が、早くも子癇前症の症状の10〜12週間前に始まると思われる。
本発明者らは、血管形成促進性タンパク質TGF-βに対する細胞表面受容体で、内皮およびシンシチウム栄養芽層上に発現されたエンドグリンが、子癇前症の胎盤において上方制御されていることを示した。本発明者らはまた、子癇前症において、過剰可溶性エンドグリンが、細胞外ドメインの分断を通して、胎盤から循環へ放出されることを示した。下記の実験は、可溶性エンドグリンが、sFlt1、胎盤成長因子(PlGF)およびVEGFを結合する抗血管形成因子、と協力して、内皮機能障害を引き起こすという仮説を試験するために設計された。
試薬
組換えヒトエンドグリン、ヒトsFlt1、マウスエンドグリン、マウスsFlt1、ヒトTGF-β1、ヒトTGF-β3、マウスVEGFは、R&D systems(Minneapolis, MN)から入手された。ヒトエンドグリンのN末端領域に対するマウスモノクローナル抗体(カタログ# sc 20072)およびポリクローナル抗体(sc 20632)は、Santa Cruz Biotechnology, Inc.から入手された。ヒトsFlt1、マウスsFlt1、およびヒト可溶性エンドグリンについてのELISAキットは、R&D systems, MNから入手された。
sFlt1に対するアデノウイルスおよび対照アデノウイルス(CMV)は以前に記載されており(Maynard et al., J. Clin. Invest. 111:649:658 (2003))、Richard Mulligan博士と共同してHarvard Medical Core施設において作製された。可溶性エンドグリンアデノウイルスを作製するために、本発明者らは、Adeasy Kit(Stratagene)を用いた。簡単には、ヒト可溶性エンドグリン(Thr27〜Leu586)は、鋳型としてヒトcDNA完全長エンドグリンクローン(Invitrogen, CA)およびプライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを用いてPCR増幅された:
増幅されたPCR断片は、最初、pSecTag2-B(Invitrogen, CA)へサブクローニングされ、DNA配列は確認された。Hisタグ付きヒト可溶性エンドグリンをコードする哺乳動物の発現構築物は、鋳型としてpSecTag2 B-可溶性エンドグリンを用いてPCR増幅され、アデノウイルス作製のために、pShuttle-CMVベクター(Stratagene; Kpn1およびSca1部位)、アデノウイルス転移ベクター、へサブクローニングされた。アデノウイルス発現可溶性エンドグリン(sE)は、その後、製造会社の使用説明書による標準プロトコールを用いて産生され、ウェスタンブロッティングにより発現について確認された。確認されたクローンは、その後、293細胞において増幅され、以前に記載されているように(Kuo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:4605-4610 (2001))、CsCl2密度勾配上で精製された。最終産物は、光吸収度方法により力価測定された(Sweeney et al., Virology, 2002, 295:284-288)。力価は、標準プラーク希釈に基づいた力価アッセイキット(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, カタログ番号K1653-1)および光吸収度方法を用いて力価測定された以前のウイルスプレップに由来する式に基づいたプラーク形成単位(pfu)/mLとして表される。
この研究についてのすべての患者は、適切なIRB認可の同意を得た後に、Beth Israel Deaconess Medical Centerにおいて採用された。子癇前症は、(1)本来正常血圧の患者において妊娠20週間後の収縮期BP>140および拡張期BP>90、(2)新たに発生したタンパク尿(尿検査におけるディップスティックにより1+、または24時間尿収集における>300mgのタンパク質、またはランダム尿タンパク質/クレアチニン比率>0.3)、ならびに(3)分娩後12週間目までの高血圧およびタンパク尿の消散と定義された。ベースライン高血圧、タンパク尿、または腎疾患をもつ患者は除外された。この研究の目的のために、患者は、ネフローゼ範囲のタンパク尿(24時間尿収集における>3gのタンパク質、または3.0より高い尿のクレアチニンに対するタンパク質比率)の非存在または存在に基づいて軽度および重度子癇前症へ分けられた。HELLP症候群は、患者が血小板減少(<100000細胞/μl)、増加したLDH(>600IU/L)、および増加したAST(>70IU/L)の証拠をもつ場合と定義された。健康な妊婦は、対照として含まれた。他の医学的根拠のための早期産を伴った8人の患者は、追加の対照として含まれた。胎盤試料は、分娩後すぐに採取された。血清は、インフォームドコンセントを得た後、分娩時(胎盤娩出の0〜12時間前)に妊娠した患者から収集された。これらの実験は、Beth Israel Deaconess Medical CenterにおけるInstitutional Review Boardにより認可された。
様々なタンパク質(sFlt1、可溶性エンドグリン)についてのELISAは、R&D systems, MNからの商業的キットを用いて製造会社の使用説明書のとおり行われた。ウェスタンブロットおよびELISAは、他の所で記載されているように(Maynard et al, 前記)、ラット血漿においてアデノウイルス感染導入遺伝子の発現をチェックするために用いられた。
ウェスタンブロットに続くIPは、子癇前症をもつ患者由来の胎盤組織および血清検体において可溶性エンドグリンを同定し、かつ特徴づけるために用いられた。ヒト胎盤組織は、冷PBSで洗浄され、ホモジナイゼーション緩衝液[Roche(Indianapolis, IN)からの10mM Tris-HCl、pH7.4;15mM NaCl;60mM KCl;1mM EDTA;0.1mM EGTA;0.5% Nonidet P-40;5%スクロース;プロテアーゼ混合物]において10分間、溶解された。胎盤可溶化液は、その後、抗ヒトモノクローナルマウスエンドグリン抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)での免疫沈降にかけられた。免疫親和性カラムは、immunopure IgG orientation kit(Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA)を用いて製造会社の使用説明書に従って、3〜5mgの精製抗体を2mlプロテインA-セファロースへ方向性結合により調製された。カラムは、その後、プロテアーゼ混合物を含むRIPA緩衝液で広範に洗浄され、結合したタンパク質は、0.1mol/Lグリシン-HCl緩衝液、pH2.8で溶出された。溶離液は、1mol/L Tris-HCl緩衝液を含む0.5ml画分に収集された。タンパク質含有画分は、プールされ、CENTRICON Centrifugal Concentrator(Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA)で9〜10倍に濃縮された。免疫沈降された試料は、4〜12%勾配ゲル(Invitrogen)上で分離され、タンパク質は、ポリ二フッ化ビニリデン(PVDF)膜へ転写された。エンドグリンタンパク質は、ポリクローナル抗ヒトウサギエンドグリン一次抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)を用いるウェスタンブロットにより検出された。
成長因子低減マトリゲル(7mg/mL, Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA)を、あらかじめ冷却された48ウェル細胞培養プレートのウェル(100l/ウェル)に置き、37℃で30分間、インキュベートして、重合させておいた。HUVEC細胞(30,000+ 300μlの無血清内皮基本培地中, Clonetics, Walkersville, MD)は、組換えタンパク質の様々な組み合わせ(可溶性エンドグリン、sFlt1、または両方)で処理され、マトリゲルコーティング化ウェル上へ置かれ、37℃で12〜16時間、インキュベートされた。管形成は、その後、4Xでの倒立位相差顕微鏡(Nikon Corporation, Tokyo, Japan)を通して評価され、Simple PCI画像化分析ソフトウェアを用いて量的に分析される(管面積および全長)。
Balb-Cマウスは、GFPまたは可溶性エンドグリンまたはsFlt1または組み合わせを発現させるアデノウイルスの1×108pfuを、後眼窩静脈叢を通して注射され、微小血管透過性アッセイは、48時間後、行われた。マウスは、0.5ml AvertinのIP注射により麻酔をかけられた。100mlの1%エバンスブルー色素(PBS中)が尾静脈へ注射された。40分後、マウスは、2mM EDTAを含むPBSで20分間、心臓穿刺を通して灌流された。器官(脳、肺、肝臓、腎臓)が摘出され、エバンスブルー色素を溶出するようにホルムアミド中で3日間、インキュベートされた。ホルムアミド溶液のODは、620nm波長を用いて測定された。
微小血管反応性実験は、ラット腎臓微小血管(70〜170μm内径)を用いて以前に記載されているように(Maynard et al., 前記)行われた。すべての実験群において、腎臓微小血管の弛緩反応が、40mmHgの拡張圧力におけるそれらのベースライン直径の40〜60%へのU46619(トロンボキサンアゴニスト)での微小血管の事前収縮後、調べられた。いったん、定常状態緊張が達せられたならば、TGF-β1またはTGF-β3またはVEGFのような様々な試薬に対する応答は、標準化された順番で調べられた。すべての薬物は管腔外に適用された。
妊娠したおよび妊娠していないSprague-Dawleyラットの両方は、尾静脈注射により2×109pfuのアデノウイルス(Ad CMVまたはAd sFlt1またはAd sEまたはAd sFlt1+Ad sE)を注射された。妊娠したラットは、妊娠8〜9日目(妊娠第2期初期)に注射され、血圧は、妊娠16〜17日目(妊娠第3期初期)に測定された。血圧は、ペントバルビタールナトリウム(60mg/kg、腹腔内)での麻酔後、ラットにおいて測定された。頸動脈は単離され、血圧変換器(Millar Instruments, Houston, TX)へ接続された3-Fr高忠実度マイクロチップカテーテルでカニューレ処置された。血圧は、記録され、10分間に渡って平均された。血液、組織および尿試料は、その後、安楽死前に採取された。血漿レベルは血圧測定の日(アデノウイルスの注射後8日目)に測定され、アデノウイルス注射から7〜10日後がこれらのタンパク質の発現のピークレベルに対応すると認識された。循環sFlt-1および可溶性エンドグリンレベルは、最初、ウェスタンブロッティングにより確認され、その後、市販されているマウスELISAキット(R&D Systems, Minneapolis, MN)を用いて定量化された。尿アルブミンは、標準ディップスティックにより測定され、かつ市販されているラットアルブミンELISAキット(Nephrat kit, Exocell Inc, Philadelphia, PA)を用いる競合酵素結合免疫測定法により定量化された。尿クレアチニンは、ピクリン酸比色手順キット(Metra creatinine assay kit, Quidel Corp, San Diego, CA)により測定された。ASTおよびLDHは、市販されているキット(Thermo Electron, Louisville, CO)を用いて測定された。ラット血液からの血小板計数は、自動化血球計数器(Hemavet 850, Drew Scientific Inc, Oxford, CT)を用いて測定された。ライト(Wright)の染色での血液の末梢血液塗沫は、循環血液における分裂赤血球の検出のために行われた。血圧の測定および検体の収集後、ラットは屠殺され、器官は組織学のために摘出された。同腹仔が数えられ、個々の胎盤および胎仔の重さが計られた。摘出された腎臓は、ボーインズ溶液中に置かれ、パラフィン包埋され、切片にされ、H&E、PASまたはマッソン(Masson)の三重染色で染色された。
結果は、平均±標準誤差(SEM)として示され、複数の群間の比較は、ANOVAを用いる分散分析によりなされた。有意差は、p<0.05の場合、報告される。
子癇前症をもつ患者における可溶性エンドグリンの上昇
表7に示された患者由来の血清検体を用いて、本発明者らは、子癇前症患者および対照の妊娠した患者の様々な群において可溶性エンドグリンの循環濃度を測定した。
本発明者らは、可溶性エンドグリンの機能を理解するために血管形成のインビトロモデルを用いた。可溶性エンドグリンは、内皮管形成を穏やかに阻害し、それは、sFlt1の存在によりさらに増強される(図22)。子癇前症において、内皮機能障害に加えて、浮腫およびエバンスブルー結合アルブミンの細胞外への漏出の増強により明らかなように、微小血管透過性の増強もある。可溶性エンドグリンが微小血管漏出を引き起こすかどうかを見るために、本発明者らは、可溶性エンドグリンおよびsFltで48時間、処理されたマウスを用いた。可溶性エンドグリンおよびsFlt1の組み合わせは、エバンスブルーアッセイを用いて実証されているように、肺、肝臓および腎臓におけるアルブミン漏出における劇的な増加、ならびに脳における穏やかな漏出を引き起こした(図23)。可溶性エンドグリン単独は、肝臓において穏やかな漏出を引き起こした。これらのデータは、可溶性エンドグリンおよびsFlt1の組み合わせが、強力な抗血管形成性分子であり、有意な血管漏出を引き起こしうることを示唆している。
可溶性エンドグリンおよびsFlt1の血管性効果を評価するために、本発明者らは、妊娠したラットにおけるアデノウイルス発現系に頼った。対照遺伝子(CMV)または可溶性エンドグリンまたはsFlt1またはsFlt1+可溶性エンドグリンをコードするアデノウイルスが、Sprague Dawleyラットにおいて妊娠8日目に尾静脈を経由して注射された。17日目において、動物は、子癇前症表現型について調べられた。表8は、血行力学的および生化学的データを含む。
MAP−平均動脈圧(拡張期血圧+1/3脈圧);Alb/Creat−アルブミン/クレアチニン比率;LDH−乳酸デヒドロゲナーゼ;AST−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ。
*対照群と比較した場合、P<0.05
胎仔体重は、群あたり無作為に選択された4匹の胎仔の合計である。
sFlt1の平均循環濃度は、sFlt1群において410ng/mlであり、sFlt1+sE群において430ng/mlであった。sEの平均循環濃度は、sE群において318ng/mlであり、sFlt1+sE群において319ng/mlであった。
これらの結果は、可溶性エンドグリンが子癇前症胎盤において上方制御され、子癇前症をもつ患者において極めて高いレベルで存在することを実証している。可溶性エンドグリンの最高レベルは、HELLP症候群、子癇前症の最も重篤な型の一つをもつ患者において存在した。これらの結果はまた、可溶性エンドグリンレベルが、妊娠した患者においてsFlt1上昇と相関し、より高い循環sFlt1レベルがある患者においてより高かったことを実証している。加えて、結果は、可溶性エンドグリンが抗血管形成性分子であり、血管形成アッセイ、微小血管透過性アッセイ、および微小血管反応性実験のような複数の内皮アッセイにおいて内皮機能を乱すことを示している。重要なことには、可溶性エンドグリンは、これらのインビトロ内皮アッセイにおいてsFlt1の毒性結果を増幅することができる。さらに、インビボアッセイにおいて、可溶性エンドグリンのアデノウイルス発現は、少しの有意なタンパク尿もなく、軽度高血圧を引き起こす。しかしながら、sFlt1の存在下において、可溶性エンドグリンは、重度高血圧、タンパク尿、糸球体内皮症、HELLP症候群の発症および胎仔成長制限の存在により明らかなように、有意な血管損傷を引き起こした。これらのデータは、可溶性エンドグリンが母親の子癇前症の症候群の因果関係において重要な役割を果たしていることを示唆し、子癇前症の処置のために可溶性エンドグリンを中和する作用物質の必要性を浮き彫りにしている。
本発明の特定の態様の説明は、例証を目的として示されている。それは、網羅的であること、または本発明の範囲を本明細書に記載された特定の型に限定することを意図されない。本発明はいくつかの態様に関して記載されているが、様々な改変が、特許請求の範囲に示されているような本発明の真意および範囲から逸脱することなくなされうることは、当業者により理解されているものと思われる。本明細書に引用されたすべての特許、特許出願、および刊行物は、参照により本明細書に組み入れられている。
Claims (106)
- 可溶性エンドグリンへ特異的に結合する能力がある化合物を被検体に投与する段階を含む、被検体において妊娠関連高血圧性障害を処置または予防する方法であって、該投与段階が、被検体において該妊娠関連高血圧性障害を処置または予防するのに十分な時間および量である方法。
- 妊娠関連高血圧性障害が、子癇前症、子癇、妊娠性高血圧、慢性高血圧、HELLP症候群、および胎内発育遅延(SGA)児を伴う妊娠からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 妊娠関連高血圧性障害が子癇前症または子癇である、請求項2記載の方法。
- 前記化合物が精製された可溶性エンドグリン抗体または可溶性エンドグリン抗原結合断片である、請求項1記載の方法。
- 前記化合物が成長因子である、請求項1記載の方法。
- 前記成長因子が以下からなる群より選択される、請求項5記載の方法:トランスフォーミング成長因子(TGF)-β1またはTGF-β3、アクチビンA、骨形成タンパク質(BMP)-2またはBMP-7。
- 精製されたsFlt-1抗体、sFlt-1抗原結合断片、ニコチン、テオフィリン、アデノシン、ニフェジピン、ミノキシジル、硫酸マグネシウム、血管内皮成長因子(VEGF)、および胎盤成長因子(PlGF)からなる群より選択される化合物を投与する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- VEGFがVEGF121またはVEGF165である、請求項7記載の方法。
- 抗高血圧性化合物を被検体に投与する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 被検体が妊娠したヒトである、請求項1記載の方法。
- 被検体が分娩後のヒトである、請求項1記載の方法。
- 被検体が非ヒトである、請求項1記載の方法。
- 被検体が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、およびネコからなる群より選択される、請求項12記載の方法。
- 可溶性エンドグリンに結合する能力がある成長因子のレベルを増加させる化合物を被検体に投与する段階を含む、被検体において妊娠関連高血圧性障害を処置または予防する方法であって、該投与段階が、被検体において該妊娠関連高血圧性障害を処置または予防するのに十分な量および時間である方法。
- 前記成長因子が、TGF-β1、TGF-3β、アクチビンA、BMP-2、およびBMP-7からなる群より選択される、請求項14記載の方法。
- 前記化合物が、シクロスポリン、αトコフェロール、メチセルジド、ブロモクリプチン、およびアルドメットからなる群より選択される、請求項14記載の方法。
- 可溶性エンドグリンポリペプチドに結合する成長因子を阻害する化合物を被検体に投与する段階を含む、被検体において妊娠関連高血圧性障害を処置または予防する方法であって、該投与段階が、被検体において該妊娠関連高血圧性障害を処置または予防するのに十分である方法。
- 前記化合物が可溶性エンドグリンに結合して、成長因子の結合をブロックする、請求項17記載の方法。
- 可溶性エンドグリン発現または生物活性を低下させる能力がある化合物を被検体に投与する段階を含む、被検体において妊娠関連高血圧性障害を処置または予防する方法であって、該投与段階が、被検体において該妊娠関連高血圧性障害を処置または予防するのに十分である方法。
- 前記化合物が、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)、カテプシン、およびエラスターゼからなる群より選択されるタンパク分解酵素を阻害する化合物である、請求項19記載の方法。
- MMPがMMP9である、請求項20記載の方法。
- MMPが膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ-1である、請求項20記載の方法。
- 前記化合物が、エンドグリン核酸配列の少なくとも一部と少なくとも95%相補性であるアンチセンス核酸塩基オリゴマーを含み、前記投与段階が、被検体において妊娠関連高血圧性障害を処置または予防するのに十分である、請求項19記載の方法。
- 前記アンチセンス核酸塩基オリゴマーが8〜30ヌクレオチド長である、請求項23記載の方法。
- 前記化合物が、エンドグリン核酸配列の少なくとも一部と少なくとも95%相補性である1つの鎖を有する二本鎖RNAを含み、前記投与段階が、被検体において妊娠関連高血圧性障害を処置または予防するのに十分である、請求項19記載の方法。
- 前記二本鎖RNAが19〜25ヌクレオチド長の小分子干渉RNA(siRNA)である、請求項25記載の方法。
- 前記化合物が、可溶性エンドグリンを特異的に結合する精製された抗体または抗原結合断片を含む、請求項19記載の方法。
- 妊娠関連高血圧性障害が、子癇前症、子癇、妊娠性高血圧、慢性高血圧、HELLP症候群、および胎内発育遅延(SGA)児を伴う妊娠からなる群より選択される、請求項14、17、または19のいずれか一項記載の方法。
- 妊娠関連高血圧性障害が子癇前症または子癇である、請求項28記載の方法。
- 被検体において妊娠関連高血圧性障害をモニターする段階をさらに含み、該モニター段階が、被検体由来の試料における可溶性エンドグリンポリペプチドのレベルを測定する段階を含む、請求項1または19記載の方法。
- 試料が血清または血漿であり、25ng/ml未満の可溶性エンドグリンポリペプチドのレベルが妊娠関連高血圧性障害における改善を示している、請求項30記載の方法。
- レベルの測定段階が2回またはそれ以上の機会に行われ、測定間の該レベルにおける減少が、妊娠関連高血圧性障害における改善の指標である、請求項30記載の方法。
- レベルの測定段階が陽性参照試料と比較され、該陽性参照試料に対する可溶性エンドグリンのレベルにおける減少が、被検体における妊娠関連高血圧性障害における改善を示している、請求項30記載の方法。
- モニター段階が化合物の治療的用量を決定するために用いられる、請求項30記載の方法。
- 測定段階が免疫学的アッセイを用いて行われる、請求項30記載の方法。
- 可溶性エンドグリンのレベルが、遊離型、結合型、または全ての可溶性エンドグリンのレベルである、請求項30記載の方法。
- 可溶性エンドグリンのレベルが、分解または酵素的切断から生じるエンドグリンポリペプチドのレベルである、請求項30記載の方法。
- モニター段階が、被検体由来の試料におけるsFlt-1、VEGF、またはPlGFポリペプチドの少なくとも1つのレベルを測定する段階を含む、請求項30記載の方法。
- 計量(metric)を用いて可溶性エンドグリン、sFlt-1、VEGF、またはPlGFのレベル間の関係を計算する段階をさらに含み、参照試料に対する、被検体試料における該レベル間の関係における変化が、該被検体における妊娠関連高血圧性障害の診断指標である、請求項38記載の方法。
- 計量が子癇前症抗血管形成指数(PAAI):[sFlt-1/VEGF+PlGF]である、請求項39記載の方法。
- 20未満のPAAI値が子癇前症または子癇における改善を示している、請求項40記載の方法。
- 計量が可溶性エンドグリン抗血管形成指数:[(sFlt-1+0.25可溶性エンドグリン)/PlGF]または[(可溶性エンドグリン+sFlt-1)/PlGF]である、請求項39記載の方法。
- 計量が治療用化合物の用量を決定するために用いられる、請求項39記載の方法。
- 治療用化合物が、PAAIが20未満であるような用量で投与される、請求項43記載の方法。
- 被検体において妊娠関連高血圧性障害をモニターする段階をさらに含み、該モニター段階が、該被検体由来の試料におけるエンドグリン核酸分子のレベルを測定する段階を含む、請求項1または19記載の方法。
- 参照試料と比較した前記エンドグリン核酸のレベル、および該参照と比較した被検体試料における該レベルにおける変化が、該被検体における妊娠関連高血圧性障害の診断指標である、請求項45記載の方法。
- 可溶性エンドグリンを特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
- 成長因子の可溶性エンドグリンへの結合を阻止する、請求項47記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 成長因子が、TGF-β1、TGF-β3、アクチビンA、BMP-2、およびBMP-7からなる群より選択される、請求項48記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項47記載の抗体またはその抗原結合断片。
- ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項47記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 抗体がFc部分を欠損する、請求項47記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 抗体が、F(ab')2、Fab、またはFv構造である、請求項47記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 薬学的に許容される担体中に存在する、請求項47記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 妊娠関連高血圧性障害をもつか、またはに妊娠関連高血圧性障害に対する素因をもつと被検体を診断する方法であって、該被検体由来の試料における可溶性エンドグリンポリペプチドのレベルを測定する段階を含む方法。
- 妊娠関連高血圧性障害が、子癇前症、子癇、妊娠性高血圧、慢性高血圧、HELLP症候群、およびSGA児を伴う妊娠である、請求項55記載の方法。
- 妊娠関連高血圧性障害が子癇前症または子癇である、請求項56記載の方法。
- 可溶性エンドグリンのレベルが、遊離型、結合型、または全ての可溶性エンドグリンのレベルである、請求項55記載の方法。
- 20ng/mlより高い可溶性エンドグリンのレベルが、妊娠関連高血圧性障害または妊娠関連高血圧性障害を発症する性向の診断指標である、請求項55記載の方法。
- 測定段階が免疫学的アッセイを用いて行われる、請求項55記載の方法。
- 免疫学的アッセイがELISAである、請求項60記載の方法。
- 正常な参照に対する可溶性エンドグリンポリペプチドのレベルにおける増加が、妊娠関連高血圧性障害または妊娠関連高血圧性障害を発症する性向の診断指標である、請求項55記載の方法。
- レベルの測定段階が2回またはそれ以上の機会に行われ、測定間の該レベルにおける変化が妊娠関連高血圧性障害の診断指標である、請求項55記載の方法。
- モニター段階が、被検体由来の試料におけるsFlt-1、VEGF、またはPlGFポリペプチドの少なくとも1つのレベルを測定する段階をさらに含み、請求項55記載の方法。
- 計量を用いて可溶性エンドグリン、sFlt-1、VEGF、またはPlGFのレベル間の関係を計算する段階をさらに含み、参照試料に対する被検体試料における該レベル間の関係の変化が、該被検体における妊娠関連高血圧性障害の診断指標である、請求項64記載の方法。
- 計量が子癇前症抗血管形成指数(PAAI):[sFlt-1/VEGF+PlGF]である、請求項65記載の方法。
- 10より高いPAAI値が被検体における妊娠関連高血圧性障害の診断指標である、請求項66記載の方法。
- 計量が可溶性エンドグリン抗血管形成指数:[(sFlt-1+0.25可溶性エンドグリン)/PlGF]である、請求項65記載の方法。
- 100より高い可溶性エンドグリン抗血管形成指数値が、被検体における妊娠関連高血圧性障害の診断指標である、請求項68記載の方法。
- 計量が[(可溶性エンドグリン+sFlt-1)/PlGF]である、請求項65記載の方法。
- 計量が、母親のボディマス指数または胎児の在胎齢をさらに含む、請求項66、68、または70のいずれか一項記載の方法。
- 妊娠関連高血圧性障害をもつか、または妊娠関連高血圧性障害に対する素因をもつと被検体を診断する方法であって、該被検体由来の試料におけるエンドグリン核酸分子のレベルを測定する段階、およびそれを参照と比較する段階を含む方法であり、参照と比較した該レベルにおける変化が、妊娠関連高血圧性障害または妊娠関連高血圧性障害を発症する性向を診断する、方法。
- 妊娠関連高血圧性障害が、子癇前症、子癇、妊娠性高血圧、HELLP症候群、慢性高血圧、または胎内発育遅延児を伴う妊娠である、請求項72記載の方法。
- 妊娠関連高血圧性障害が子癇前症または子癇である、請求項73記載の方法。
- 前記レベルにおける変化が増加である、請求項72記載の方法。
- エンドグリン核酸が可溶性エンドグリン核酸である、請求項72記載の方法。
- 被検体由来の試料におけるsFlt-1、VEGF、またはPlGF核酸分子の少なくとも1つのレベルを測定する段階、およびそれを参照試料と比較する段階をさらに含む方法であって、該レベルにおける変化が、妊娠関連高血圧性障害または妊娠関連高血圧性障害を発症する性向を診断する、請求項72記載の方法。
- 妊娠関連高血圧性障害をもつか、または妊娠関連高血圧性障害に対する素因をもつと被検体を診断する方法であって、被検体由来の試料においてエンドグリン遺伝子の核酸配列を決定する段階、およびそれを参照配列と比較する段階を含む方法であり、該被検体における遺伝子産物の発現レベルを変化させる変化である、被検体の核酸配列における変化が、妊娠関連高血圧性障害または妊娠関連高血圧性障害を発症する性向を有すると被検体を診断する、方法。
- 妊娠関連高血圧性障害が、子癇前症、子癇、妊娠性高血圧、HELLP症候群、慢性高血圧、また胎内発育遅延児を伴う妊娠である、請求項78記載の方法。
- 妊娠関連高血圧性障害が子癇前症または子癇である、請求項79記載の方法。
- 前記試料が、可溶性エンドグリンが通常には検出可能である、被検体の体液である、請求項55、72、または78記載の方法。
- 前記体液が、尿、羊水、血液、血清、血漿、および脳脊髄液からなる群より選択される、請求項81記載の方法。
- 前記試料が細胞または組織である、請求項55、72、または78記載の方法。
- 細胞が、内皮細胞、白血球、単球、または胎盤由来の細胞からなる群より選択される、請求項83記載の方法。
- 組織が胎盤組織である、請求項83記載の方法。
- 被検体が、妊娠していないヒト、妊娠したヒト、分娩後のヒト、または非ヒトである方法であって、子癇前症または子癇を発症する性向を診断する、請求項55、72、または78記載の方法。
- 非ヒトが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、またはネコからなる群より選択される、請求項86記載の方法。
- レベルの測定段階が2回またはそれ以上の機会に行われ、測定間の該レベルにおける変化が、妊娠関連高血圧性障害の診断指標である、請求項72記載の方法。
- 症状の発生の少なくとも4週間前に妊娠関連高血圧性障害または妊娠関連高血圧性障害を発症する性向を診断するために用いられる、請求項55、72、または78記載の方法。
- エンドグリン核酸配列またはそれと相補的な配列、またはそれらの任意の組み合わせを有する核酸分子、および妊娠関連高血圧性障害または妊娠関連高血圧性障害を発症する性向に対して該核酸分子を用いるための使用説明書を含む、被検体において妊娠関連高血圧性障害または妊娠関連高血圧性障害を発症する性向の診断のためのキット。
- VEGF、sFlt-1、もしくはPlGFの核酸配列、またはそれらと相補的な配列、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項90記載のキット。
- エンドグリン核酸が可溶性エンドグリン核酸である、請求項90記載のキット。
- 可溶性エンドグリン結合分子、および妊娠関連高血圧性障害または妊娠関連高血圧性障害を発症する性向の診断のための該可溶性エンドグリン結合分子の使用についての使用説明書を含む、被検体における妊娠関連高血圧性障害の診断のためのキット。
- 可溶性エンドグリン結合分子が、可溶性エンドグリンを特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片である、請求項93記載のキット。
- VEGF、sFlt-1、またはPlGF結合分子をさらに含む、請求項93記載のキット。
- 妊娠関連高血圧性障害が、子癇前症、子癇、慢性高血圧、HELLP症候群、妊娠性高血圧、またSGA児を伴う妊娠である、請求項90または93記載のキット。
- 妊娠関連高血圧性障害を寛解させる化合物を同定する方法であって、エンドグリン核酸分子を発現させる細胞を候補化合物と接触させる段階、および該候補化合物に接触した該細胞における該エンドグリン核酸分子の発現のレベルを、該候補化合物に接触していない対照細胞における発現のレベルと比較する段階を含む方法であり、該エンドグリン核酸分子の発現における変化が、該候補化合物を妊娠関連高血圧性障害を寛解させる化合物と同定する、方法。
- 前記変化が可溶性エンドグリン核酸分子のレベルにおける減少である、請求項97記載の方法。
- 妊娠関連高血圧性障害を寛解させる化合物を同定する方法であって、可溶性エンドグリンポリペプチドを発現させる細胞を候補化合物と接触させる段階、および該候補化合物に接触した該細胞における該可溶性エンドグリンポリペプチドの発現のレベルを、該候補化合物に接触していない対照細胞におけるポリペプチド発現のレベルと比較する段階を含む方法であり、該エンドグリンポリペプチドの発現における変化が、該候補化合物を該妊娠関連高血圧性障害を寛解させる化合物と同定する、方法。
- 発現における変化が、免疫学的アッセイ、酵素的アッセイ、またはイムノアッセイを用いてアッセイされる、請求項99記載の方法。
- 発現における前記変化が、可溶性エンドグリンのレベルにおける減少である、請求項99記載の方法。
- 発現における前記変化が転写または翻訳における変化である、請求項99記載の方法。
- 妊娠関連高血圧性障害を寛解させる化合物を同定する方法であって、可溶性エンドグリンポリペプチドを発現させる細胞を候補化合物と接触させる段階、および該候補化合物に接触した該細胞における該ポリペプチドの生物活性を、該候補化合物に接触していない対照細胞における生物活性のレベルと比較する段階を含む方法であり、該エンドグリンポリペプチドの生物活性における変化が、該候補化合物を妊娠関連高血圧性障害を寛解させる化合物と同定する、方法。
- 妊娠関連高血圧性障害を寛解させる化合物を同定する方法であって、候補化合物の存在下において可溶性エンドグリンポリペプチドと成長因子の間の結合を検出する段階を含む方法であり、該候補化合物の非存在下における該可溶性エンドグリンポリペプチドと該成長因子の間の結合に対する、該結合における減少が、該候補化合物を妊娠関連高血圧性障害を寛解させる化合物と同定する、方法。
- 可溶性エンドグリンポリペプチドと成長因子の間の結合を阻止するポリペプチドまたはその断片を同定する方法であって、該候補ポリペプチドの存在下において可溶性エンドグリンポリペプチドと成長因子の間の結合を検出する段階を含む方法であり、該候補ポリペプチドの非存在下における該可溶性エンドグリンポリペプチドと該成長因子の間の結合に対する、該結合における減少が、該候補ポリペプチドを可溶性エンドグリンポリペプチドと成長因子の間の結合を阻止するポリペプチドと同定する、方法。
- 妊娠関連高血圧性障害を寛解させる化合物を同定する方法であって、可溶性エンドグリンポリペプチドと候補化合物の間の結合を検出する段階を含む方法であり、該可溶性エンドグリンポリペプチドを結合する化合物が該妊娠関連高血圧性障害を寛解させる、方法。
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