CN101065154A - 在生物液体中灭活微生物的方法、流通式反应器以及控制光辐照总剂量从而有效灭活间歇反应器中微生物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种确定从一个或者多个光源发出的单色光或者多色光用以灭活存在于生物体液特别是非透明液体中微生物的有效剂量的方法。另外，本发明液提供了一种灭活存在于流通式反应器中生物液体所含微生物的方法。而且，本发明有利地提供了一种具有一个或者多个热稳定光源的流通式反应器。本发明还进一步提供了一个控制从一个或多个光源发出的单色或者多色光的光辐照总剂量从而有效灭活间歇反应器中微生物的方法。

Description

在生物液体中灭活微生物的方法、流通式反应器以及控制光辐照总剂量从而有效灭活间歇反应器中微生物的方法
                      技术领域
[001]本发明涉及一种确定从一个或者多个光源发出的单色光或者多色光灭活在存在于生物体液特别是非透明体液中微生物的有效剂量的方法。本发明还提供了一种灭活存在于流通式反应器中生物液体所含微生物的方法。而且，本发明有利地提供了一种具备一个或者多个热稳定光源的流通式反应器。本发明还进一步提供了一个控制从单个或多个光源发出的单色或者多色光的光辐照总剂量(light sum dose)从而有效灭活间歇反应器中微生物的方法。
                      背景技术
[002]在诸如营养学、化妆品，医学诊断或者治疗中，通过辐射处理生物液体是一种得到广泛研究的灭活微生物的方法。眼下正在研究的辐射方法例子包括：短波紫外光、长波紫外光或者具有光敏化合物的可见光，以及光谱宽的高强闪光。
[003]例如，沙门氏细菌属(Salmonella spp.)、单核细胞增生症李斯德氏菌属(Listeriamonocytogenes)，真菌或者肠道出血性大肠杆菌属O157:H7等污染食物的细菌，可以很容易就污染牛奶，果汁，发酵饮料和其他由此制作而来的其他饮料等液体。另外一个微生物污染的例子是，存在于生物液体(如血液及其衍生制品，细胞培养液上清或裂解液)中的原虫、细菌以及病毒，一方面可以从这些液体中提取药物，但同时也存在由此而将这些微生物传播到使用这些药品的病人体内的风险。
[004]为了在一个小型实验室的规模上来灭活这些微生物，人们开发出了间歇式光灭活反应器(batch photoinactivation reactors)。这类间歇式光灭活反应器通常主要由一个被一系列灯光环绕的空腔组成，将待处理样品装在一个透光的容器内的空腔中，并曝光一定的时间；同时，也可以通过搅拌以保证样品得到均一的光照。位于美国康涅狄格州Branford的南新英格兰紫外线公司(Southern England Ultraviolet Company)制造的柱状“Rayonet”和“Rayonette”反应器，以及位于加拿大安大略省渥太华的路兹化学研究公司(Luzchem Research Inc.)生产的光室型光灭活反应器，就是这类光灭活反应器的典型例子。
[005]为了确保大容积的待处理液体完全有效地暴露于光场中以防止污染，人们设计了多种流通式反应器。这些反应器中，有的设计成将液体平铺成一层薄膜或薄层以最大限度减少由于自吸收而造成的光强度的损失；有的在纵向流动的液体中加上一个横向的混合装置，使得所有的液体组分都能够到达能被光线照射到的浅表外液体层，从而确保所有的液体得到均匀的光照。
[006]Caillet-Fauquet等在2004年描述了一类流通式UV-C(紫外光C)照射来灭活细菌和病毒方法，利用脑脊髓炎病毒掺合的样品作为生物剂量测定或者内部感光测定样品，关于这一点，没有更多的细节见诸报道。
[007]过去，以上提到的流通式照射装置一般是这样设计的：一根倾斜的管围绕着管形光源旋转，将内壁上的液体分布到一层自由流动的薄膜上(Habel & Sockrider 1947)，一个平的透明小室将液体流挤压成一个薄层；或者一个透明的螺旋状管缠绕在管形光源(Oppenheimer等，1959)。在一个直径超过光照穿透深度的流通式装置中，横向的混合可以通过一个圈中一种被称为迪恩涡流(Dean vortices)的二次涡流来实现，或者通过一个静止的位于管中的折流板来实现，或者也可以依靠位于两个逆流柱之间的立体环形泰勒涡漩(toroidal Taylorvortices)，液体在此之间的环状间隙流过。
[008]如果光照的穿透有限，那么可以将液体分布于一层薄膜上经过光源，正如美国专利5,567,616和6,540,967描述的那样。在位于深度大于光照穿透深度的液体层中，横向混合原则上可以主动或者被动地产生。
[009]一个广为人知的主动混合的原则就是，在同心逆流旋转柱的表面，诱导泰勒涡旋的产生。这些泰勒涡旋被叠加在纵向流上，造成称之为Taylor-Gortler的涡流。美国专利6,576,201介绍了一类柱状的UV-C透明流通式小室，它带有静止的透明外壁和旋转内柱。位于此间的液体层，被水泵驱动通过该流通式小室的液体依靠逆流泰勒涡流(counter-current TaylorVortices)而混合。一个连续性光波或者脉冲激光—紫外光源用来作为辐射发生装置。
[010]另外一种用于主动混合的装置就是基于阿基米德螺旋桨(Archimedean screw)的流通式反应器，泵出的液体依靠旋转的螺旋桨在流线圈得到混合(Della Contrada 2004)。
[011]被动式混合既可以通过乱流产生，也可以通过障碍物绕流(如位于液体流经通路上的静止的混合挡板)来实现。早期的灭活反应器大多设计为，液体流经位于管形辐照灯(或者其包被管envelope tube)外壁和同心辐照反应器内壁之间的角形间隙。这类的薄层辐射发生器可以从位于奥地利Seewalchen的Wedeco-Visa GmbH公司购得。
[012]另外一类被动横向混合的有效技术就是，在弧形管中(尤其是在螺旋盘绕的管中)引发一种被称为Dean Vortices的二次涡流。例如，Bayha等在1952年介绍了一个用于消毒牛奶等高吸收液体的盘管状反应器(coil reactor)，在这一装置中，一个石英玻璃盘管纵向包绕在多重低压汞灯周围；Hiatt等在1960年也介绍了一种通过光敏化灭活存在疫苗或其他生物液体中的病毒的类似的盘管反应器，在Hiatt的装置中，反应器由硼硅玻璃做成，盘管是包绕在白炽灯丝上的。盘管在透光性水夹套中被冷却。在过去，尽管硼硅玻璃和石英玻璃的特殊工艺以及他们的易碎的特性限制了它们的应用，但紫外半透性、抗紫外以及化学惰性氟多聚体的易得减少了设计和规模化使用这类流通式反应器的难度。盘管缠绕在一个同心的管状光源(通常是一个低压汞灯)上，同时依靠加在流体上的一种被称为Dean vortices的二次涡流而实现横向混合。美国专利申请2003/0049809A1就介绍了这样一类的螺旋状包绕反应器(helicalenvelope-reactor)。2004年，Wang等报道，通过草酸铁络合物感光测定法测得的灯强度、吸收值以及滞留时间，可以计算出泵过反应器的液体所接收到的光照剂量滞留。
[013]过去，有不少人试图进行精确确定在辐射过程中有效光能的尝试。光能既可以依靠光敏性电子传感器、或者也可以依靠光子激发的光化学反应来计算，或者光能也可以依靠测定生物液体中含有的或者是人为添加的的微生物被灭活的效率来计算。其他理论方法还包括数学模拟，如简单地将一个体积元的滞留时间乘以强度来计算光照剂量；也可以通过一种更为精细的计算方法，如通过流体模拟来球算出滞留时间和剂量。
[014]化学感光测定法也可以测量光照对于光化学反应性混和物的影响(Kuhn等，1989；Favaro等，1998)。总的来说，对于已知光量子产率和温度依赖性的已建立的光化测定法，其测定的稳定性和可重复性都较电子装置要好。光化学反应产物最好能便利地在线测量，如依靠光电分光法或者化学传感器(Gauglitz 1983)。
[015]另外一种更常选用的方法中，利用了在测量波长下测量感光测定溶液的阻光度，光化学反应仅仅在表面发生(Kuhn等，1989；Favaro，1998)。因此，对于这类方法，应当尽量选用较高的反应物浓度。
[016]在一种灭活流感病毒的疫苗流通式紫外反应器中，用尿苷感光计(actinometer)来测量灯光的强度(Zheleznova 1979)。
[017]泰勒涡流(Taylaor-vortex)发生装置作为一种光化学反应器，在均相和异相光化学反应过程中也得到研究(Sczechowski等，1995；Forney & Pierson，2003)。为了对这类发生器进行感光测定，通常用到了草酸铁络和物感光计或者碘化物/碘酸盐感光计。然而，还没有关于进行吸光度匹配的校正数据以确定碘化物溶液中的剂量的报道(Forney & Pierson，2003)。
[018]对于UV-C测定而言，经典的感光计是草酸铀酰感光计(Bowen 1949；Kuhn等，1989)和草酸铁络和物感光计，但是草酸铀酰感光计的应用由于其铀放射毒性而受到了限制，草酸铀酰感光计的应用由于其UV-A，UV-B，以及可见光的敏感性而受到了一定的限制(Kirk &Namasivayam，1983)。硫化氢或三苯甲烷燃料的氢化氰加成物也已知可以作为UV-C敏感的感光计。例如，溶解于乙醇中的无色的孔雀石绿无色氰(malachite green leucocyanide)并没有表现出长波紫外光或者可见光的敏感性，但是绿色的光产物在UV-C区有一定的吸收(Calvert & Rechen，1952；Fisher等，1967)。溶解于乙醇中偶氮苯(光化发色团2R 245、440)以及杂靠厄二蒽酮内过氧化物(heterocoerdianthrone endoperoxide)(光化学发色团1R248/334)(Brauer & Schmidet，1983)可以使得这种感光测定溶液能重新使用(Gauglitz &Hubig，1981，1984，1985)。尽管这些溶解在有机溶剂中的复合有机物是无害的，人们通常假定感光测定物质和溶液应当是无毒的和无危险的。
[019]在20世纪早期，在多种紫外灯源变得易得后，酸性碘化物立即成为一种感光计而得到应用(Bering & Meyer，1912)。但是，像0.05这么低的光量子产率导致了氮氧化物被用来作为一种电子清除剂(Dainton & Sills，1960；Rahn，1993)。另外一种较为最近出现的不透光UV-C感光测定法，是碘酸盐稳定化的碘化物光化学分解反应(Rahn，1997；Rahn等，1999，2003)。在253.7nm波长下碘化物光解为三碘化物，在352nm波长下或者更长波长下(375nm，400nm)对这一反应进行分光光度测定。该体系具有对超过300nm波长不敏感的优点。
[020]有人提出，可以将含有感光计溶液的流通式或者静态式探测器插入辐射发生器中，用以替代UV-传感器。将浓缩的感光计溶液，如美国专利6,596,542中的碘化物/碘酸盐感光计或者2001年Schulz等报道的尿苷溶液泵入并通过紫外通透的管子，该管子同时还接收来自光源的紫外线；或者，这些感光计溶液也可以置于带有一小窗能接收紫外灯光照的小室。在暴露在光照中一定的时间后，产生的光化学产物用光电分光光度计进行测量。然而，这些传感器仅仅能测量到他们所受到的附带辐射(radiation incident)的一部分，但是不能测量对于辐照反应器中所含待辐照液体有效的平均光通量(光剂量)。
[021]水溶性三苯基甲烷染料，4，4’，4”-三(二β羟乙基)氨基三苯乙腈(4，4’，4”-tris-di-β-hydroxyethylaminotriphenyl acetonitrile)作为另外一种感光计物质，可以应用于UV-C辐射，对存在于果汁和植物汁液中的微生物(Koutchma & Adhikari，2002)进行“冷灭菌”。实现这一过程的装置已经实现了商业化，例如由位于纽约Macedon的FPE公司(FPE Inc.)生产的“Cidersure”和“Sap Steady”薄膜辐射器，或者由位于加州Fallbrook的Salcor公司生产的“Light Processed System”环绕管状辐射器。从水果中榨取的果汁，由于含有悬浮颗粒而显示混浊状，由于含有溶解的苯酚化合物和维生素C而具有很高的UV-C吸收率，由于具有类似蛋白溶液的粘度。经过澄清处理后的苹果汁在253.7nm波长下具有9/cm的吸收系数。感光计物质被添加到具有高吸收性的果汁中而后放置于准直光装置中进行光照辐射，就如同完全用紫外光灭活动力学来确定非吸收性悬浮液中的微生物一样(Bolton &Linden，2003)。在600nm波长处，感光计光产物的光吸收增加，但实际上，添加的感光计物质仅仅吸收对应于其总吸收中吸收组分的光量子组分。通过对增加的感光计染料的降解进行测量，从而可以计算出有效光照剂量。在一个玻璃碟子的苹果果汁中，190mJ/cm2的吸收剂量相当于灭活不超过3 log10大肠杆菌K12菌落形成单位(cfu)/mL，将一种感光计物质加入到样品本身有时可能造成有效剂量结果呈明显的错误结果。在非吸收性的悬浮液中，5 Log10cfu/mL大肠杆菌在大约10mJ/cm2下被灭活(Wright & Sakamoto，1999)。然而，在溶液中发挥作用的照射剂量必须和在微生物中起作用的剂量保持一致。因此，为了实现精确的有效剂量的测量，将一种感光计物质加入到一种已经存在吸收的介质中的做法是不可取的。
[022]利用产气气杆菌(肺炎克雷伯氏菌的过时的叫法)，尽管没有能够给出生物剂量学的所有细节，利用可被光照灭活的微生物来进行生物剂量，这是第一个被用来确定血浆中的可使用的辐照剂量的方法。另外，微小噬菌体科大家族中的单链DNA噬菌体，如S13和Phi X174噬菌体随着紫外辐照剂量的增加，其滴度成线性递减。基于噬菌体(如PhiX174，或单链RNA噬菌体MS2)灭活的剂量测定法，或者基于枯草杆菌孢子灭活的生物剂量法，已经开发为用来测试流通式紫外光水消毒器的方法。在被稀释的紫外光通透性悬浮缓冲液中，在33mm的培养皿中水平搅动，并置于均一的9瓦的0.225mW/cm2的UV-C灯中，噬菌体Phi X174的随剂量的非衰减性灭活速率为-0.44(Log10pfu/mL)/(mJ/cm2)(Anderle等，2004)。
[023]已经商业化的薄层辐照器“CiderSure”(美国纽约州罗切斯特，FPE公司制造)可适用于果汁，这种装置基本构成为，围绕着管状紫外光源，同心并行设置一个外部不锈钢管和一个内部石英管，液体纵向流过这两个管的间隙区域。通过生物剂量学，对于每一类果汁，可以调整液体的流速，对于大肠杆菌O157:H7而言，以达到减少＞5log10cfu/mL的灭活效果。同时，因为为剂量H通常假定为E乘以滞留时间t，所以光强度的损失可以通过调整流速而得到补偿(FDA，2000)。不过，单纯依靠这种生物剂量学上的校正，并不能使得这种流通式反应器的滞留时间分布优化在一个比较窄的分布，从而使得避免对液体的过量照射。即便对于营养性液体来说，这一点更应该避免，因为过量的紫外光照射可以使得液体产生变味的不良效果，使得液体不那么可口。
[024]上面提到的那些流通式反应器，存在着流变学和技术的缺点等待克服。进入辐照的每一个体积元被纵向分配成：一个较快的流体组分，该流体组分由于其较短的滞留时间而受到较少的辐照剂量；一个较慢的尾随组分，该组分受到叫道的辐照剂量；和介于这连个组分之间的流体组分。图7是关于美国专利6,576,201中，在一个泰勒涡流发生室中，滞留时间的分布取决于内部柱体旋转速度的一个例子。如果辐照剂量太低则不能完全灭活存在的微生物；辐照剂量太高则可能损害流体中的有效成分，如果汁中的维生素和香料，血液衍生物中的蛋白质，或者疫苗中的抗原等。这样，最好是能够对辐照过程进行优化，使得既能足够有效地灭活靶微生物，同时又能够安全地保存其中的有效成分。对这一过程进行优化的方法是非常有用的。
[025]前面提到的流通式和间歇式反应器的另外一个技术性限制是，光源会在使用寿命期限内发生老化，从而使得使用期间内产生的发光量较刚开始时损失一部分。为了弥补这一缺陷，一种积分计数器(integrating counter)可以被用来保证稳定和可重复的光辐照剂量，但是不能兼顾到待辐照溶液的吸收(Rider & Robert，1951)。另外，在反应时，可能会由于至少一个光源的失灵而造成灭活反应的不连续发生。尽管这种失灵或者不正常关闭可以仅仅用一个电子光敏传感器来检测，但是为了确定一个有效光辐照剂量对流体的影响，需要对这一剂量进行测量以建立灯光强度、吸收、剂量衰减之间的联系，以便能够通过改变其他过程变量来补偿这种剂量衰减。这类装置同时还需要在特定的时间间隔进行校正，以保证持续有效的运行。一种用于在生物液体中微生物的光灭活期间测量、控制和补偿诸如光辐照波动的方法，优选能够兼顾到在间歇反应器中待辐照生物液体的吸收的方法是非常有用的；另外，一种用于控制灭活过程不因为光辐照而波动的方法，也是非常有用的。
[026]而且，在辐照装置如间歇式和流通式反应器运行过程中，光源还产生了相当数量的热能。来自辐照灯的热量更进一步导致了光发射产生相当大的波动。例如，对于低压汞灯而言，大部分的辐照灯的能量被转化成了热能，仅仅只有大约三分之一被转化成了光辐照发射出去。尽管低压汞灯很少发热到温度高于60℃，但适中的热量就能导致对那些温度敏感有效成分的破坏。仅仅直接对光灭活反应器中的流体管进行冷却，并不能使得辐照灯恒温和辐照强度稳定；对辐照灯电压进行调整来稳定辐照强度不能移去产生的热量或过量热量。因此，如果能开发出这样一种流通式反应器，它既能减少因灯源发热而导致的光辐照波动，同时最好还能保证辐照灯温度基本恒定或者不那么波动，那将是十分理想的。这样一种温度稳定装置在美国专利2,725,482中有描述，它使用了一个六个辐照灯的离心式膜辐照器(centrifugal filmirradiators)，每一个辐照灯都配有的一个靠水冷却的导热管可以移去过量的热量(Benesi，1956)。其他流通式反应器如Dill反应器(美国专利5,567,616)，有挡板的或者其他包含有静止混合器元件的管状辐照器(美国专利6,596,172)，螺旋管形辐照器(WO 02/38191)已经有一些尝试和披露，不过仅仅是没有直接的辐照灯温度稳定装置。在美国专利6,586,172中，设想了一种辅助空气流冷却(通风式)装置，不过这种装置较直接的液体温度稳定装置效率更低。其效率取决于环境空气温度。在自由流薄膜辐照器中，稳定的冷空气流可能会使得生物液体中的水分蒸发。液体式的辐照灯热稳定也许可以保证，在没有内燃烧时间的情况下，在最大的病原体杀灭强度下立即运行，例如，对于低压汞灯UV-C最大产率在41.5℃；或者也可以从白炽灯光源中过滤掉红外辐照，因为白光可能被生物液体吸收而被转化成过量的热能。
[027]在1960年，在UV-C辐照疫苗技术方面的权威专家认为：为了计算出用来灭活病毒这一过程本身所用到的能量绝对量，必须要对被病毒和培养基所吸收的紫外光能的相对量进行定量化，然而这一点目前还没有能够实现。更进一步，绝对的曝光取决于一系列可变的因素，如粘度、温度、表面张力和流体的摩擦阻力(Taylor，1960)。尽管蛋白溶液或病毒悬浮液经常是澄清的或者稍微有点不透明的胶体，但是其他的液体可能包含有可能过滤掉的固体颗粒。对于多种粘土类矿物在灭活水中存在的产气克雷伯菌过程中的保护作用的研究表明，这种能吸收紫外的粘土质可以对细菌有保护作用，但能发散紫外光的粘土质则没有这样的保护作用(Bitton，1972)。最近有研究表明，对于混浊的苹果汁和澄清的苹果汁，在用分光光度法进行测量时，这类悬浮溶液具有类似的表观吸收，但在混浊液中比在澄清液中微生物被灭活得更迅速(Koutchma等，2004)。完全的曝光显然取决于被颗粒散射到溶液中的一部分光。到目前为止，在科技文献或者专利中，液体样品中对微生物的有效光化学剂量的确定还没有报道。同样地，用于确定在生物液体(特别是不透明的生物液体)中灭活微生物的有效光照剂量的方法(特别是对于流通式反应器而言)也没有报道。另外，本发明的一个目的在于提供一种在保证有效的生物活性成分不受影响的同时，对于包含在生物液体，特别是不透明的生物液体中的微生物进行有效灭活的方法。
                      发明内容
[028]解决上述技术问题的方案通过权利要求限定的具体实施方式而实现，特别需要指出的是，本发明首要目的在于提供一种用于确定从一个或多个光源发出的单色光或多色光灭活生物液体中微生物的有效剂量的方法，包括测量所述单色光或多色光对于剂量测定溶液的影响，其中所述灭活在流通式反应器中进行。
[029]本发明的另一目的在于提供一种流通式反应器中灭活生物液体中微生物的方法，包括用有效辐照剂量的来自一个或者多个光源的单色光或多色光辐照生物液体，其中根据前述的方法和下面的详细描述确定有效光辐照剂量。
[030]本发明的另一目的在于提供一种用于在灭活存在于不透明的生物液体的微生物时，确定来自单个或者多个光源的单色光或多色光的有效辐照剂量的方法，包括：测量在所用光灭活波长下单色光或者多色光对于与生物液体的浊度、与生物液体的浊度和吸光度、与生物溶液的浊度和粘度、与生物液体的浊度、吸光度和粘度、与生物液体的吸光度、或与生物液体的粘度和吸光度相匹配的剂量测定溶液的影响，上述测量是基于采用下述步骤i)和ii)的光辐照剂量校正完成的：i)对薄层内的剂量测定溶液进行辐照以施加一能够导致可测量的物理量或化学量发生变化的规定通量(光辐照剂量)，所述薄层的光程长度薄到在规定时间内只能吸收预定辐照度的入射光部分，ii)在对光辐照反应器中剂量测定溶液辐照期间或之后，读取与这些测到的量的变化相应的辐照剂量，其中步骤i)可以在步骤ii)之前进行，反之亦然。
[031]本发明的另一目的在于提供一种灭活非光透性生物液体中微生物的方法，包括使用来自一个或者多个光源的单色或者多色光的有效辐照剂量来辐照生物液体，其中有效辐照剂量依据前述的方法和下面详细描述的方法进行测定。
[032]本发明的再一目的在于提供一种紫外光灭活流通式反应器，在该反应器中，封套恒温器包裹了一个或者多个光源，通过该封套恒温器，恒温并且基本透光的液体进行流动，带走灯来自辐照的热量，从而保证基本上恒定的灯发光强度。
[033]另外，本发明的另一目的在于提供一种通过控制发自单个或多个光源的单色或多色光的光辐照总剂量以有效灭活间歇式反应器中存在于生物液体中的微生物的方法，包括如下步骤：
[034]a)基于灭活生物液体中的微生物时的单色或多色光的有效辐照剂量，确定取决于吸收的辐照源靶光辐照总剂量、在间歇式反应器中有效灭活微生物所需要的光辐照剂量速率和辐照时间；
[035]b)在灭活间歇式反应器中生物液体中的微生物期间，记录光辐照剂量速率和辐照时间；
[036]c)基于步骤b)的测量计算取决于吸收的辐照源光辐照总剂量；
[037]d)将步骤c)中测得的取决于吸收的辐照源光辐照总剂量与步骤a)中得到的取决于吸收的辐照源靶光辐照总剂量进行比较；和
[038]e)一旦取决于吸收的辐照源光辐照总剂量等于或者大于取决于吸收的辐照源靶光辐照总剂量，则中断对生物液体进行曝光。
[039]本发明的其他目的、特点和优点随着以下详细的描述将会变得越来越明显。然而，应当理解，尽管给出了本发明的较佳实施例，这些详细的描述和特定的实施例仅用于阐明本发明。对于本领域的技术人员而言，在本发明精神和范围内的各种变化和改进都是显而易见的。
                                附图说明
[040]下述附图作为本说明书的一部分，说明了本发明的一个具体实施方式，连同以上的概述和后面将要给出的详细的实施例描述，可以解释本发明的原则。为了更加完全地理解本发明，包括它的目的和优点，下面结合下述附图进行描述以供参考。
[041]图1描述了吸光系数与碘化物/碘酸物浓度之间的线性相关性(参见实施例1)。
[042]图2描述了粘度的增加与聚乙烯吡咯烷酮浓度之间的非线性相关性。(参见实施例1)。
[043]图3描述了对于2.5/cm标准溶液的校正曲线。(参见实施例1)。
[044]图4描述了对于4.5/cm，7.5/cm和10/cm标准溶液的校正曲线。(参见实施例1)。
[045]图5描述了对于有限定的分子吸光度的标准溶液，以及同一种溶液里加入了2g膨润土/L以增加悬浮粒子浊度的溶液的校正曲线。(参见实施例10)。
[046]图6描述了吸光系数与浓度之间的线性关系(参见实施例10)。
[047]图7描述了粘度与聚乙烯吡咯烷酮浓度之间的非线性关系(参见实施例10)。
[048]图8描述了吸光度随着施用的表面剂量而增加，以及敏感性随着碘化钾/碘酸钾浓度而增加(参见实施例10)。
[049]图9描述了敏感性随着PVP而增加(参见实施例10)。
[050]图10描述了辐照灯强度的变化(参见实施例15)。
[051]图11描述了具有以Y轴常量表示的误差的剂量增加(参见实施例15)。
[052]图12描述了本发明的一个示范性校正装置(参见实施例17)。
[053]图13描述了一个装有光强度传感器和温度传感器的恒温辐照灯固定装置的横断面示意图(参见实施例18)。
[054]图14描述了使用恒温液体的管状辐照灯恒温设计(图14a和14b)的横断面示意图。
                               具体实施方式
[055]本发明的第一个方面提供了一种灭活生物液体中微生物时，确定所用的发自一个或多个光源的单色或多色光的有效剂量的方法，包括测量单色或多色光对生物剂量溶液的影响，其中的生物灭活反应在流通式反应器中进行。光照对剂量测定溶液的影响优选通过一种方法来测定，其包括测量在所用光灭活波长下单色或多色光对于与生物液体的吸光度、或与生物液体的吸光度和粘度相匹配的剂量测定溶液的影响，上述测量是基于采用下述步骤i)和ii)的光辐照剂量校正完成的：i)对薄层内的剂量测定溶液进行辐照以施加一能够导致可测量的物理量或化学量发生变化的规定通量(光辐照剂量)，所述薄层的光程长度薄到在规定时间内只能吸收预定辐照度的入射光部分，ii)在对光辐照反应器中剂量测定溶液辐照期间或之后，读取与这些测到的量的变化相应的辐照剂量，其中步骤i)可以在步骤ii)之前进行，反之亦然。优选的实施方式是实施例1、2和17。
[056]微生物是指任何选自原核生物界的微生物(monera kingdom)种、原核生物界的孢子、真菌生物(fungi kingdom)中的非致病性性或微生物种、真菌生物界种的孢子、古细菌(archaea)、原核生物(prokaryotes)，特别是细菌、真核微生物(eukaryotes)、可以使这些或者类似的微生物被杀死或者减少其活性的病毒、以及噬菌体。病毒优选细小病毒、细小鼠病毒(MMV)、犬细小病毒(CPV)、牛细小病毒(BPV)、猪细小病毒(PPV)、猫细小病毒(FPV)、环形病毒、圆环形病毒、小核糖核酸病毒、噬肝性病毒如甲型肝炎病毒(HAV)和脑心肌炎病毒(EMV)、Anelloviridae viruses、肠RNA病毒(Enteroviridae RNA viruses)、微小病毒DNA噬菌体、以及光滑病毒科RNA噬菌体等。优选微生物是指脂质包裹的单链或双链病毒、脂质或非脂质包裹的病毒等。
[057]生物液体是指任何一种天然的或人工的生物液体，包括乳、乳清和乳蛋白组分、血液或者血液的一部分、血液制品、血浆、血浆组分、血清、血液衍生液体、血浆衍生液体、血浆组分、血清衍生液体、包含蛋白质组分的液体、脊髓和脑髓液体、淋巴液、唾液、精液、尿液、原核细胞培养上清、真核细胞培养上清、原核细胞裂解液、真核细胞裂解液、或者任何以上这些液体的液体衍生物。
[058]特别优选本发明的生物液体是指用于内部、外部或者皮下给药方式具有治疗作用的液体，它们在光灭活波长下基本上是不透明的并且对光灭活放射能量的剂量敏感。这些液体包括血液、血液制品、血浆、血浆组分、血清、以及血、血浆和血清的衍生物等。透明或澄清的液体如水、生理盐水、林格氏(Ringer’s)乳酸盐溶液或者葡萄糖液体可以经受过量的辐照并且并不总是需要一个确切的光辐照剂量。
[059]本发明的另外一种特别优选的生物液体是化妆品液体，包括任何经肠道的液体，它们基本上不透明，即，有光吸收或者混浊，或者在光灭活波长下有光吸收或者混浊，对过量辐照剂量的光灭活辐照能敏感。透明而澄清的液体如酒精—水挥发物可以经受过量辐照而且并不总是有一个确切的光照剂量。
[060]本发明的另外一种特别优选的生物液体是营养液，包括任何口服或经鼻给药的液体，特别优选为了营养或者解渴目的的液体。它们基本上不透明，即它们有光吸收或者混浊，或者在光灭活波长下有光吸收或者混浊，对过量剂量的光灭活辐照能敏感。这些液体包括乳、乳清、乳制品、乳衍生产品、果汁、水果衍生制品、蔬菜汁、蔬菜衍生产品、原生树汁、转基因树汁、人工合成饮料、加工的饮料、发酵饮料以及酒精饮料等。透明液体如自来水、瓶装矿泉水、或者添加有柠檬酸的柠檬汁、溶解在水中的二氧化碳和糖类等饮料一般要经受过量辐照而且并不总是有一个确切的光照剂量。
[061]本发明的再一种特别优选的生物液体是液体诊断试剂、或者其衍生液体，即诊断试剂或者诊断试剂盒的液体，如抗体溶液或者含有抗体的溶液等。透明的诊断试剂，如蒸馏水、无机盐缓冲液、或者凝聚前的氯化钙溶液可以经受过量辐照而且并不总是有一个确切的光照剂量。
[062]本发明的生物液体优选是这样的生物液体：它们能在病原体光灭活反应器中沿着光程方向很大程度地轻易减弱辐照光对病原体杀灭作用。这种减弱作用要么是由于生物液体中含有分子发色基团导致的，如氨基酸、蛋白质、核苷、核苷酸、染料、或者来自于添加物质如光活化剂或者光保护剂的分子发色基团引起，要么是由于散光性和有光吸收的生物大分子引起的混浊导致的，要么是由于以上原因综合引起的。这种减弱作用取决于光程的长度。一种十进制吸收系数为1/cm的液体呈0.5mm液体层时，仅仅能吸收5.5％的入射光，因而可以认为是透明的。而在10cm深液体层时，可以吸收95.7％的入射光。优选地，如果沿着反应器的光程方向，任何可以使得入射光减弱达到5％以上，更优选10％以上，进一步优选20％更好的生物液体，通常就需要对发明进行化学剂量测定测定来确定有效辐照剂量。根据指数的光减弱原理，在10倍于半光程长度时，光强递减为开始时的1024分之一，而该长度下，光强减弱为起始强度值的50％。优选地，用于紫外光灭活病原体的生物液体在253.7nm波长下是高度不透明的，例如疫苗的无血清细胞培养上清(a253.7＝5/cm，d1/2＝0.06cm)、凝血酶原复合物洗脱液(a253.7＝7.5/cm，d1/2＝0.04cm)(Brummelhuis，1980)，苹果汁(a253.7＝10/cm，d1/2＝0.03cm)或者血清(a253.7＝25/cm，d1/2＝0.012cm)。这意味着，在6mm后、优选4mm、更优选3mm、更优选1.2mm后，入射紫外光的能量将被基本上完全消耗完毕，使得该生物液体变得很不透明。
[063]生物液体可以含有天然的或者人工添加的物质，这些物质不会引起或抑制微生物核酸的光损伤，但通过作为活性氧自由基的淬灭剂，可以对有效成分提供一种对抗光辐照有利的保护作用，其中特别是显著对抗紫外光辐照，例如芦丁所含类黄酮(Erdmann，1956)、维他命如抗坏血栓(Erdmann 1956)、肌酸酐(JP 11286453-A)。但是，如果这些添加剂在使用的波长处增加了附加的吸光度，同时没有对施用的这一附加光吸收的光强进行补偿的话，可能只有很少的病原体杀灭光能可以实际到达微生物。因此，要求的足够灭活微生物的紫外光或者可见光剂量强度必须不能过量，并且一定要尽可能计算精确，地如同实施例1、2、11、12和15到17的描述。
[064]光、单色光、或者多色光是指电磁波形式的能量，优选波长和频率在紫外或者可见光区内。
[065]根据本发明，用于灭活微生物的光化学方法包括使用以下光波辐照：
[066]波长为200到280nm范围内的UV-C区域的短波长紫外光，优选接近核酸最敏感的有杀菌作用的265nm波长；
[067]波长范围在约280到约320nm之间的UV-B区的中波长紫外光；
[068]波长范围在约320到约400nm之间的UV-A区的长波长紫外光，或者在有至少一种天然或人工添加的光增敏剂存在的情况下，波长范围在约400到约700nm之间的可见光；
[069]脉冲单色相干光或非相干光，或者前面提到波长范围内的脉冲宽谱光，优选是连续发射的光。
[070]根据一种用于确定灭活生物液体中微生物的有效光辐照剂量的方法的优选具体实施方式，沿着光程长度，大约有100％，更优选80％，更优选60％，更优选50％，更优选30％或者以下的入射光辐照被吸收掉。
[071]被生物液体吸收的光数量是通过限定的波长1和通常为1cm的光程长度d下的透光率和吸光度表示的。从不能超过100％的透光率T出发，由公式A＝-log10T计算出十进制吸光率A，对于d＝1cm，A就变成十进制吸光系数al，单位为1/cm。对于大多数264nm波长附近的杀菌短波紫外光，光的吸收可以降低最大穿透深度至小于1mm。
[072]根据本发明的方法和反应器，使用的光源通常为管状的金属气体蒸汽放电灯。低压金属蒸汽灯，由于仅仅产生适度的热量，适用于对热敏感的生物液体，其特别是对过量的热量敏感。从这种灯发出的光线最好为单色的，如，在低压钠蒸汽灯发出589nm的橘色光；低压汞蒸汽灯发出的253.7nmUV-C区光。后一种辐照灯可以在内层涂上一层磷，以获得白色荧光，光化蓝+UV-A，黑光UV-A，或者UV-B的宽谱或者窄谱发射光谱。其他适用本发明的杀灭病原体的光源有中压和高压金属蒸汽灯，闪烁放电灯，潜水式电弧，激光，激发态灯，发光二极管，白炽灯，等等。
[073]分光光度计测量的生物液体的总吸收在模糊云状或者添加混浊液体而混浊情况下可以包括因分子发色团而产生的分子吸收，即由于胶体样分散的大分子和悬浮颗粒而成光散射和减弱。对于有悬浮颗粒(例如细胞碎片)吸光溶液例如没有经过过滤的混浊的果汁而言，浊度可以这样求得：未经过滤的果汁的吸光率减去过滤澄清的果汁的吸光率(参见实施例10)。
[074]光增敏剂是可以与微生物直接发生反应的物质，如补骨脂素及其衍生物；或者光增敏剂也可以从存在于溶液的另一种成分产生的反应性分子，如来自于溶解氧的单原子态氧或者来自于溶剂化的电子。后一种光增敏剂包括吩噻嗪染料、吖啶、黄素、紫质以及酞菁。
[075]微生物对于光照的敏感性取决于它的基因组大小、它的核酸类型以及它修复光损伤的能力。总的来说，真菌和细菌的孢子以及真核细胞对光的抗性最强，病毒的抗性稍弱，植物细菌抗性最强。将微生物的活性减少到所要求的水平所需要的光通量，对于不同的微生物来说，是不同的。光通量是指射入一个区域的光能，如，在暴露于光照过程中的一个微生物的横断面，该横断面仅仅吸收利用该光能一部分(Bolton，1999)。名词光辐照剂量(light dose)也经常作为光通量(fluence)的另外一种叫法。
[076]在一个非吸光性的悬浮液中，在已知的光通量速率下(单位面积上的光通量)，如果微生物被辐照一定的时间，那么施加在微生物上的光辐照剂量可以被计算出来，随剂量的灭活速率也可以被确定(Bolton & Linden，2003)。已有多种微生物的灭活速率常数已经被确定，其中一些微生物作为标志微生物被用来显示一个光化学处理过程的效率。
[077]然而生物液体可以同时伴随有一些可以吸收光的物质或者可以散射杀灭病原体作用的光的颗粒，如蛋白质、维生素、酚类化合物，或者脂质体和细胞碎片。大多数的入射光被这些伴随的物质所消耗或者被这些颗粒所阻挡，仅仅一部分入射光实际到达靶微生物而发挥效果。因此，在这类生物液中将同一种微生物的灭活到所要求的水平所需要的光辐照时间，大于在非吸收性液体悬浮液中同样的微生物灭活所需要的时间，本发明的也考虑了这一点。
[078]很多种天然筛选的化合物都可以保护生物体免受到高能量光辐照的有害作用。然而，它们不仅通过捕获或者淬灭光作用产生的自由基或激发分子，也可以仅仅通过吸收光中具有光生物活性频率部分的光。将这类保护性添加剂，例如活性氧类淬灭剂比如类黄酮和微生素C，添加到根据本发明的透明或者吸光性生物液体中，如果这些添加剂在杀菌的波长下有光吸收，那么将导致附加的光吸收和减少的光穿透。将0.1％或者0.5％的维生素C添加到苹果汁中，在Hanovia Bio-Steritron灯的辐照下，在平面的0.2mm深流通式比色杯中，较之没有添加剂的苹果汁，随滞留时间的微生物灭活速率从50％下降到20％(Mack等，1959)。
[079]在本发明的一个优选的具体实施方式中，有效辐照量通过化学剂量法测量。剂量测定溶液是指用在一定波长下发生实质性光化学反应的试剂配置而成的待测溶液，产生的光化学产物可以被测量。光化学产物可在薄层中以和溶液的吸光系数相当的灵敏度被测量，因此在这一薄层，仅仅一小部分的入射辐照被吸收，因为辐照在薄层的一定区域的光能通过实际上没有吸收的薄层，从而使得光通量能得到确定。优选的实施方式参见实施例1～6、10～13以及15～17。
[080]已知有许多化学感光计足以应用于本发明。例如，从一组碱金属盐、碱土金属盐、碘化铵和尿苷磷酸盐水溶液中，可以选出能用来作为紫外光C的辐照的剂量测定溶液。
[081]本发明的一个特点是，提供了一种评价光灭活微生物装置的方法，这一方法使得在辐照波长下，使得剂量测定溶液具有预定的光吸收；或者更优选在辐照波长下，使得剂量测定溶液具有预定的光吸收和预定的粘度，这种光吸收和粘度可以与在灭活微生物过程中将要被辐照的生物液体的吸光度相匹配或者同时与其吸光度和粘度相匹配。
[082]许多特别适于浓缩的紫外光C敏感的化学剂量测定剂，即高吸光性的生物液体可以与本发明一起使用。例如，稀释的碘化钾/碘酸钾感光计优选但不限于含有大于或等于6.69mM的KI和大于等于1.16mM的KIO3，具有和这类生物液体吸光度相应的高吸光度，例如但不限于a253.7为2/cm、高光量子产率和三碘化物的高比消光系数。这种剂量测定溶液可以用相应浓度的KI和KIO3来配制，以便于优选但不限于吸光系数a253.7至少为2/cm)的生物液体相匹配，它能用于薄层吸收池，其光程长度可为大约0.1到1mm，优选约为0.1到0.7mm，更优选约为0.1到0.5mm，更优选约为0.1到0.3mm，更优选约为0.3到1mm，更优选约为0.5到1mm，更优选约为0.7到1mm。通过添加已知能稳定三碘化物的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，可以增加碘化物/碘酸盐溶液的敏感性，并且蛋白溶液的粘度可以达到很大的精确度。
[083]另一种优选的特别适合稀释的紫外光C敏感的化学剂量测定剂，即低吸光性生物溶液是苯甲酸钠感光计，这种感光计可以在薄层荧光小室中对光反应产物进行荧光定量，并且这种感光计可以但不限于稀释到与如下吸光系数a253.7相匹配：约0.1/cm到大约2/cm更优选约0.4/cm到2/cm；更优选约0.8/cm到2/cm；更优选约1.2/cm到2/cm；更优选约1.6/cm到2/c，其中对于薄层荧光比色杯而言，优选但不限于其光程长度为至少1×10mm。
[084]另外一种更优选的而且特别适合极度稀释的紫外光C敏感的化学剂量测定剂，即始终为非吸光性的生物溶液是过二硫酸钾/叔丁醇感光计，优选这种感光计可以但不限于稀释到与a253.7为0.5/cm的吸光度相匹配。这种剂量测定溶液更优选但不限于适用光程长度为0.5到1cm的吸收池，更优选0.7到1cm的吸收池。光反应产物和氢离子可以用插入一个小型的pH电极的pH计来进行测量。
[085]在本发明的一个经优选实施方式中，剂量测定溶液可以包含从下列中选取的试剂或试剂组合：碘化碱金属盐、碘化碱土金属盐、碘化铵、尿苷磷酸水溶液、苯甲酸碱金属盐、苯甲酸碱土金属盐，苯甲酸铵、过二硫酸碱金属盐、过二硫酸碱土金属盐、过二硫酸铵、叔丁醇、聚乙烯吡咯烷酮、膨润土(bentonite)、云母、蒙脱石(montmorillonite)、囊脱石(nontronite)、锂荣脱石(Hectorite)、高岭石、多水高岭石、地开石、粘土矿物、白垩、硅石、煅制二氧化硅、重晶石、石膏、滑石、氧化镁、氧化铝、氯氧化铋、氧化锌、硫酸碱土金属盐、碳酸碱土盐、磷酸碱土盐、羟基磷酸碱土盐、卤代磷酸碱土盐、不溶性硅酸盐、不溶性硅酸铝盐、不溶性碳酸盐、不溶性硫酸盐、不溶性磷酸盐、不溶性羟基磷酸盐、卤代磷酸盐、全氟烃或其衍生物、全氟醋酸或其盐、以及聚乙烯聚吡咯烷酮。
[086]更优选剂量测定剂溶液可以包含稀释的碘化钾/碘酸钾感光计、稀释的碘化钾/碘酸钾/多聚吡咯烷酮感光计；优选在光灭活反应发生的光波长下，剂量测定剂溶液吸光度应该和生物液体的吸光度相匹配，或者剂量测定剂溶液的吸光度和粘度与生物液体的相匹配。
[087]如果可能增加总吸收率的生物液体的浊度必须大于不含有限制性金属矿物的可增加浊度的添加物，这类限制性金属矿物包括：膨润土、蒙脱石、云母、蒙脱石、囊脱石、锂荣脱石、高岭石、多水高岭石、地开石、其他粘土矿物、硅石、煅制二氧化硅、白垩、石膏、重晶石等；或者多聚物如聚乙烯聚吡咯烷酮(PPVP)也可以添加到稀释的或者吸光度/粘度相匹配的碘化—碘酸钾—聚乙烯吡咯烷酮感光计中，或者添加到其他合适的感光计中。更优选剂量测定溶液可以含有稀释的苯甲酸钠感光计。更优选剂量测定溶液也可以含有稀释的吸光度相匹配的硫代硫酸钾/叔丁醇感光计。
[088]剂量测定试剂是一些过量存在的溶解的小分子，它可以很容易地扩散到被辐照区域。因此，入射光子将把这些剂量测定试剂转化成光化学反应产物。辐照灯在几乎恒定的强度下工作时，相同多的光子将照射反应容积，相同多的光子将在特定时间间隔施加几乎相同的有效辐照剂量(mJ/cm2)，产生一定的化学剂量速率((mJ/cm2)/min)。通过控制总的灯光辐照剂量可以大致考虑灯的辐照强度。对于含有噬菌体或者病毒的蛋白质溶液而言，辐照剂量最好能和一个给定的吸光度和粘度一致。
[089]生物样品溶液的的十进制吸光系数可以在一个比色杯中(用分光光度计进行测量，比色杯厚度薄到保持溶液的光吸收率在仪器的测量范围之内。吸光系数可以这样计算：仪器测得的吸光度除以光程的长度(一般以厘米cm计)；Napierian吸光系数这样计算：十进制吸光系数的Log值即为Napierian吸光系数。
[090]粘度可以用毛细管粘度计测量流动时间来确定：粘度计上的结果乘以本技术领域通常已知的毛细管粘度计常数。
[091]一般来说，使用的薄层比色杯的光程长度要和稀释后的光辐照溶液相配，而且优选要小，这样比色杯仅仅吸收一小部分的入射光。
[092]在这样的薄层中，用有部分吸收的稀释的光辐照溶液进行校正，可以尽可能精确地计算出光通量。例如，0.02cm比色杯中a253.7＝15/cm下的光通量为27.3％，0.1cm比色杯中a253.7＝2/cm下的光通量为19.9％。这表示，通过光程后的入射光辐照的有效辐照剂量分别72.7％和80.1％(Morowitz，1950)。因此，Morowit校正因子对于第一个比色杯为72.7％，对于第二个为80.1％。这样可以计算和校正自吸收误差。为了达到准确的校正，建议一般应使用低于50％的Morowitz校正因子，这就意味着比色杯的光程长度不会超过入射光强衰减为起始值25％时的距离。
[093]为了得出剂量测定校正曲线，例如可以用电子辐射计、光谱辐射计、或者带有浓缩和完全吸收的感光计溶液的化学光辐照方法，对已知辐照光源进行测量。在确定来自光源的入射辐照后，对含有稀释的吸光度匹配的或者吸光度和粘度匹配的剂量测定溶液的比色杯，以一定的方位和一定的时间，以及一定的表面剂量进行辐照，得到的光辐照信号相对于光的辐照剂量画一曲线，即为校正曲线。
[094]例如可以这样进行校正：用一个辐照灯、一个在光程长度之内用于将比色杯曝光限定的曝光时间的光阀，将比色杯和辐照灯平行安置于光路经的末端。这种光阀通常用作诸如照相机的胶片—影像平面光快门，这种光阀机构通过类似钟表的机械装置进行精确控制，或者更优选通过一个电子振荡源进行控制。振荡源驱动的光阀和位置固定的比色杯确保了重复性和对比色杯进行精确的辐照。为了实现这一目的，可以对商品35mm或者中等规格的胶片单镜头反光相机或者旁轴取景相机进行一定的改进，通过将辐照灯固定装置附着于相机镜头座，将比色杯附加安放入相机背面的一个孔径中。优选相机背面的孔应当具有一定的直径，以使比色杯的整个表面都能够得到光辐照，而孔径的边缘则可以作为一个部分瞄准器。为了提高灯光强度的稳定性和辐照光量子产率，可以用诸如风扇，环形流动液体或者Peltier元件等的装置使得辐照灯和比色杯凹槽的温度保持恒定。
[095]校正装置可以优选包含下述器件：一个光源，一个光线出口孔，以便光线能够辐射进入光瞄准器孔，一个光阀，以及安置在恒温具有光入射孔的仓室内的比色杯槽，以便光线辐照入比色杯或者是含有剂量测定溶液的光学小池中。对于辐射计传感器装置，可以提供一个较好的恒温座架，以便从光源发出的光线能够通过光阀进入比色杯的同时，还能通过相机背部的孔径进入该传感器的入射窗口，这样就能够用这种校正方法对光源进行监控，或者能够对这样的传感器进行随时间而保持不变的那些性质进行检测，即通过对同时被曝光的比色杯或者光学小池中含有的现有标准感光计溶液进行比对而进行检测。特别优选光阀由一个精确的定时器驱动以获得精确的可重复的比色杯或者光学小池曝光时间。图12显示了一种优选的校正设备。安装在一个仓室(U)中的优选管形辐照灯(T)优选恒温或者恒流，特别优选既恒温又恒流，以确保在整个校正过程中光辐照保持不变。如图12所示，可以通过一种透光性液体流经辐照灯而实现恒温。箭头所标示的光线从辐照灯发出后，通过孔(V)以及其开关时间受到控制的开放光阀辐照到比色杯上，如果该比色杯比比色杯室(holder)的最大空间更薄，其连同距离调节器一起插入到最好是恒温的比色杯室(X)内。在光阀打开期间，比色杯中的光辐照溶液或者标准剂量测定溶液就可以受到精确的光辐照。一个可选的孔(Y)位于和孔(X)不同的位置，最好能够空间相似，使得同时有部分光线从辐照灯射入孔径X和孔径Y。孔(Y)也可以设计为带有一个电子传感器(Z)，例如优选但不限于在反应器辐射器中用到的一个传感器，这样基于比色杯室(X)中光辐照方法和使用传感器(Z)的辐照测量方法同时测到的光强度的比值，提供一种可以对传感器进行重新校正的精确方法。传感器(Z)也可以用于监控和记录校正曝光期间灯光的曝光强度，以便于下一步中如果辐照灯强度发生改变的时候，用于对强度进行纠正。在实施例17中描述的这样一种校正装置的用途，并且通过在辐照灯固定装置处安装一个辐射计传感器用座架，可以用来对辐射计传感器进行检查和重新校正，这样从辐照灯发出的光线可以被感光计比色杯和辐射计传感器同时测得。
[096]根据一个确定灭活生物液体中微生物所需光辐照有效剂量的方法的优选实施方式，规定通量可以通过改变规定辐照度和/或通过改变规定时间来改变，所述规定时间由流通式反应器中生物液体的流速确定。因为微生物对于辐照灭活的敏感性也是所用的光的波长或者波长谱段的函数，因此特定的光通量也可以通过改变发出的光的波长或者波长的谱段进行调整。
[097]为了实现较高的流量，前面提到的薄层辐照器的制造商Wedeco Visa AG公司推荐：通过将多个辐射器串联或并联在一起，以增加流经容量。较低的流速下可以通过增加滞留时间而增加辐照剂量，或者在基本上恒定的流速下通过增加联在一起的辐射器的个数而增加辐照剂量。为了改进溶液流动性质，可以将一个螺旋形流动引导管插入到环形间隙中(Harrington& Hills，1968)。在美国专利6,586,172中，对于处理血液制品的设备，采用了挡板静止混合方式，这种设备用到了辅助的空气流冷却装置来移去来自紫外辐照灯的热量。
[098]在这一方面，一种更为有效的具有更高混合度的方法可以使滞留时间的分布变得狭窄，并增加灭活率。例如，这种更高程度的混合可以通过这样但不限于此的方式实现：如同用挡板稳定地施加影响，在纵向流动的液体上施加横向流，或者通过动力学原理产生泰勒涡流或者迪恩涡流。
[099]为了测量光辐照有效剂量，例如，在辐照装置中对与待测样品体积相同的剂量测定溶液进行辐照，在特定时间取出一小部分剂量测定试样溶液置于薄层比色杯中，对光化学反应产物进行测量。记录下从所用辐照的剂量测定溶液得到的信号，并与相应的校正曲线进行比较。从校正曲线上可以读出辐照剂量值。作为选择之一，至少有一种用于在反应器中测量光辐照有效剂量的手段。对流通式反应器来说，这些手段可以在辐照灭活区域之前或之后安装。
[100]可以用一种非常简单的UV-C流通式反应器，例如将一个螺旋盘绕的紫外透射管包绕在发光低压汞蒸汽灯上的反应器，通过用吸光度和粘度匹配的、或者吸光度和浊度及粘度匹配的化学剂量测定法，对UV-C辐照装置进行试验性校正。
[101]带有光辐照溶液的剂量测定化学方法能够测量薄层比色杯中装的样品体积上施用的平均光辐照剂量(光通量)。光化学反应物通常要过量存在，任何局部过量的光化学反应产物都要充分混合并稀释，反应产物的浓度随辐照所施加的光量子数的增加而增加，呈良好的线性相关性。
[102]一般来说，同样数目的光量子数可以灭活每单位体积或每升液体中残存的同样多的活性微生物，滴度在log对数上的减少呈线性。而且，局部的过量光辐照强度并不能将有活性微生物的数目减少到小于零，不过局部不足的光辐照剂量却会导致样品中活性微生物的残留。
[103]为了确定辐照剂量，优选该方法还进一步包括在监测辐照过程中一个或者多个光源的强度的方法。更优选所用的光源在紫外光区，最好在紫外光C区。对于流通式反应器，对光源进行辐照剂量的监测是一种通常的做法。辐照灯的功率可以得到持续性地监测，同时对信号进行显示或者记录。有利的是，待处理的液体没有阻挡光源和剂量测定传感器之间的光程，所以液体并没有减弱光照强度。如果确实由于设计上的限制而无法避免这种光强度上的减弱，那么最好在对液体进行辐照之前和之后，应当对灯光强度的减弱进行测量，以便于计算出平均的辐照强度。
[104]为了得出剂量测定校正曲线，将化学剂量测定溶液分布于确定厚度的薄膜层上，这样溶液就只吸收一小部分入射光。然后将薄膜层置于一定的光辐照剂量中照射，溶液发生一系列实质性的可量化的化学变化，将其中的化学物质进行转化而产生光吸收或在特定的波长处发出荧光，或造成pH值的上升等。对这些光辐照信号进行测量并以此信号值对光辐照剂量作图。
[105]在混合的批量体积内，对相应的溶液进行辐照，抽出一定体积并对光化学反应产生的产物进行测量。从受到辐照的剂量测定溶液得到的信号被记录下来并与相应的校正曲线进行比较。从而可以得到和剂量测定校正曲线上信号增加相对应的有效辐照剂量。将辐照剂量的增加除以辐照时间单位，得出辐照剂量速率。有效辐照剂量如上面所定义。
[106]剂量测定溶液和目标蛋白溶液类似，因为在特定的波长下剂量测定溶液具有和蛋白质溶液相同的吸光度，并且优选还有相同的粘度。可以用有效的UV剂量对光化学反应中的化学物质例如三碘化物的转化的测量进行纠正。化学剂量测定法保证了具有不同吸光度的蛋白质溶液可以接收到相同的有效UV剂量。具体细节请参见实施例1～56。
[107]根据在灭活生物液体中微生物时确定光有效辐照剂量的方法的一个优选实施方式，该方法进一步还包括有，在对辐照之前或期间、或者之前及期间掺合了存活微生物的生物液体进行辐照之前和之后、或者之前、期间和之后，通过滴定存活微生物的数量来确定剂量分布。在另一个实施方式中，生物学上有效的光辐照剂量(光通量)可以通过生物剂量测定方法来确定，这是指通过对微生物的光灭活进行确定。生物剂量测定可以通过流通式或者间歇式反应器装置来实现，并且这一方法已经被用来作为测量滞留时间分布(Qualls & Johnson，1983)以及光辐照剂量分布(Cabaj & Sommer，2000)的常规方法。优选的实施方式参见实施例3至6，以及12至17。
[108]在一个优选实施方式中，生物剂量测定方法可以和化学剂量测定法联合使用来确定混合效率(参见实施例3到6，以及12到17)。
[109]优选根据本发明的生物液体中可以包含选自如下微生物种类：原核生物界、原核生物界的孢子、真菌界的非致病性细菌或微生物、真菌界的孢子、原虫类、原核细胞、细菌、真核细胞、病毒等，以确保这些或者类似的微生物可以被杀灭或者降低活性，以及噬菌体。
[110]优选病毒选自如下病毒种类：微小病毒(Parvoviridae viruses)、微小鼠病毒(MinuteMurine Virus，MMV)、犬微小病毒(Canine Parvovirus，CPV)、牛微小病毒(Bovine Parvovirus，BPV)、猪微小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)、猫微小病毒(Feline Parvovirus，FPV)、环形病毒(Circoviridae Viruses)、圆环形病毒(Circinoviridae Viruses)、微小RNA病毒(Picornaviridae viruses)，优选噬肝性病毒甲型肝炎病毒(Hepatitis A Virus，HAV)和脑脊髓炎病毒(Encephalomyocarditis Virus，EMC)、阿内罗病毒(Anelloviridae Viruse)、肠道RNA病毒(Enteroviridae RNA viruses)、微小病毒DNA噬菌体(Microviridae DNA bacteriophages)，以及光滑病毒RNA噬菌体(Leviviridae RNA bacteriophages)。
[111]为了确保在进行根据本发明的光灭活处理过程中，生物液体中的有效生物成分如蛋白质或其他重要成分得到良好保存，可以用本技术领域内常用的功能分析对其中的蛋白质或维生素的生物学活性进行测定，例如实施例4中描述的弹性蛋白酶抑制分析，或者实施例13和16中描述的酰胺水解FX反应等。这些活性分析物最好也能包含在剂量测定溶液中。优选地，可以对剂量测定溶液的吸光度、粘度或者浊度进行调整，以使得加有活性分析物的剂量测定溶液的吸光度、粘度或者浊度与将活性分析物加入后测试的生物液体的吸光度、粘度或者浊度相匹配。这种测定方法可以确保，在有效灭活污染性微生物的同时，生物液体和/或其中的有效组分仍然保持其生物活性。
[112]微生物，例如噬菌体、病毒和细菌最好能在存活能力上表现出呈指数减少。这意味着，一个给定的辐照剂量能够灭活同样数量的存活的微生物，例如，如果1mJ/cm2将微生物的滴度灭活到开始时的1/10，那么2mJ/cm2应当能够灭活到开始时的1/100，3mJ/cm2可以灭活到1/1000，如此类推。如果通过使所有的微生物仅仅通过辐射区一次以保证所有的微生物得到同等的辐照，那么所有的微生物受到一个灭活击(inactivatinghit)。然而，和蛋白质相比，即便是最小的微生物，如单链DNA噬菌体，也可以看作大颗粒(～25nm)，从而在蛋白溶液对流和流动的过程中被除去。在一个反应器中，有些微生物在一个特定的时间间隔内被转运到辐照区域多次，而其他的微生物仅仅一次，有些可能从没有被转运到过辐射区。因此，基于化学方法确定的剂量速率的灭活速率(随着溶液的混合而增加。因此，灭活微生物的过程进行得越快，那么需要得辐照时间就越短，需要的有效辐照剂量也就越小。因此，可以通过较高的搅拌效率，来保存生物液体中的蛋白质或者其他生物活性。
[113]在紫外辐照之前、期间和/或或之后，对在辐照之前或期间、或者之前与期间掺合了存活微生物的生物液体的微生物滴度进行测定，即测量生物剂量学灭活性。例如，这一过程可以通过计数残留的活细菌的菌落数目，或者被裂解的细菌斑的数目来实现，其中细菌斑数目对应于仍然存活的噬菌体的数目。以菌落形成单位(cfu)或者斑点形成单位(pfu)表示的存活微生物的滴度，随后可以计算为：培养皿上每毫升稀释样品体积的log10(cfu×10稀释因子)/mL或log10(pfu×10稀释因子)/mL。
[114]经生物剂量测定验证，当噬菌体灭活速率(其表示为log[灭活的数目]/紫外光有效剂量)相似或者基本上相等时，在相同的混合效率下用几乎相同的有效辐照剂量对不同的蛋白质溶液进行辐照。如果样品中不含任何对微生物或其宿主有害的或有抑制性作用的成分，那么生物剂量测定特别适合于验证不同的样品。同样地，生物剂量测定几乎可以适用于任何生物液体。
[115]在本发明的另外一个优选实施方式，生物剂量测定用上面提到的方法得到了应用。
[116]例如，生物液体可以在薄膜或者横向混合管形反应器中接收辐照。如果光线没有直接辐射到液体表面，那么光辐照灭活区里含液体管道的材料必须在所用的灭活光的波长下是基本上透明的。对于小于350nm的紫外光，硼硅玻璃可以认为是透光的；对于小于300nm的紫外光，其他特殊玻璃如无铁硼硅玻璃、磷酸盐玻璃、高硅玻璃，或者熔融石英玻璃可以认为是足够透光的，以及其他特殊的塑料如氟聚合物也特别适用。许多微生物光灭活反应器可以这样设计，以便在不同的流速下处理不同的不透明液体。这些液体可以含有至少一种添加剂以减少液体中有效成分的破坏和丧失。
[117]在本发明的测定有效辐照剂量的方法的一个优选实施方式中，该方法可以和至少一种其他的灭菌或者微生物灭活方法联合起来使用。已知有多种灭活、灭菌、消毒或者保存方法，例如有但不限于热法或者非热法，或者添加化学防腐剂等。不同种类的微生物对不同的处理方法有不同的敏感性，因此，用不同类型灭菌方法的组合来确保对不同的病毒进行灭活通常是很必要的。本发明中，辐照处理的一个特别的优点是，特定类型的对其他常采用的处理方法有抗性的病毒对这种辐照方法敏感。
[118]在另外一个实施方式中，本发明中用来确定有效辐照剂量的方法，连同其他已知用于对生物液体进行灭菌或灭病毒的方法被联合使用。在本技术领域已知有多种方法，如传统的湿热灭菌法或者常用于对白蛋白进行灭菌的巴斯德氏灭菌法，其中巴斯德氏灭菌法包含在有或没有稳定剂存在的条件下，在一个给定的时间内，对样品溶液进行程序性升温的保温过程。另外一种是干热灭菌法，适用于对诸如凝血因子VIII等成分的灭菌，其包括液体被冻干后在给定时间内对其程序性升温的保温过程。另外一种灭菌方法则包括对样品进行超滤或者液体去垢剂处理，在这种灭菌方法种，溶液与液体去垢剂系统充分混合后，在一定时间内孵育，然后用疏水层析的方法去掉液体去垢剂成分，其中去垢剂系统例如是1％的磷酸三丁酯，1％的曲通X-100或土温-80。在WO 94/28120，美国专利Nos.4,946,648，；4,481,189和4,540,573中，对液体去垢剂处理方法有详细描述。
[119]在另一个本发明具体实施方式中，用来确定有效辐照剂量的方法与液体去垢剂系统联合使用，该液体去垢剂系统的一个特点是，它能造成样品溶液的吸光度显著上升。因此，本发明具有以相对较高的吸光度来达到有效灭活液体中病毒的能力是一个特别优点。
[120]在本发明的另一个具体实施方式中，根据本发明确定有效辐照剂量的方法，生物液体中至少要加入至少一种添加剂以减少对液体中生物活性的损伤或者丢失。已知的多种保护性添加剂包括，维生素E可以保护细胞不收损害，抗坏血酸可以防止血浆不致丢失功能活性，自由基以及活性氧的淬灭剂如组氨酸、芦丁、槲皮素或其他类黄酮，其他稳定剂如包括甘露糖醇在内的糖醇和氨基酸用于减少血液组分活性的丧失。因为单原子态氧的生成需要溶解氧的存在，所以移除溶解在溶液中的氧，例如在进行辐照之前或期间用一种诸如氮气的惰性气体来驱除空气也能对于样品中的有效成分产生保护作用。如果这些保护性添加剂能够影响到到微生物对辐照的敏感性，为了考虑到这些保护性添加剂对于灭活微生物所需的有效辐照剂量的影响，可以依据实施例16的方案对剂量测定方法进行调整。
[121]根据本发明的一个方法，有效辐照剂量是指能够灭活所有的，或者至少99.9％、优选99.99％、进一步优选99.999％的生物液体中微生物所需的辐照剂量。更优选该方法在流通式反应器中进行。在实施例2、5、6、11、15和17中，提供了该方法的优选实施方式。
[122]本发明的另外一个方面是，提供了一种用于确定从一个或者多个光源发出的单色或多色光用以灭活非透明生物液体中微生物的有效剂量的方法，包括测量在所用光灭活波长下单色或多色光对于与生物溶液的浊度、与生物溶液的浊度和粘度、与生物溶液的浊度和吸光度以及粘度、与生物溶液的吸光度、或与生物溶液的粘度和吸光度相匹配的剂量测定溶液的影响，上述测量是基于采用下述步骤i)和ii)的光辐照剂量校正完成的：i)对薄层内的剂量测定溶液进行辐照以施加一能够导致可测量的物理量或化学量发生变化的规定通量(光辐照剂量)，所述薄层的光程长度薄到在规定时间内只能吸收预定辐照度的入射光部分，ii)在对光辐照反应器中剂量测定溶液辐照期间或之后，读取与这些测到的量的变化相应的辐照剂量，其中步骤i)可以在步骤ii)之前进行，反之亦然。
[123]在一个优选实施方式中，生物溶液是指如上所定义的溶液。
[124]根据本发明的一种非透明生物溶液涉及到胶体生物溶液，其看起来可能澄清或者呈烟雾状，但沿着光程方向，具有光散射的性质。更优选该胶体生物溶液含有的颗粒大小在分散体系中为0.1nm到100nm之间，优选在1nm到100nm之间，最好是在10nm到50nm之间。更优选地，在一种胶体生物溶液中所含胶体中分散的大分子的最大分子光吸收附近，其光散射增强，这样散射光将可以有助于对病原体进行光灭活。对于优选的胶体生物溶液例如蛋白质溶液，有可能可以通过估算在非吸收波长和吸收波长下的浊度测量，估算出整个光吸收度中溶液浊度的贡献部分。然后分子吸光度可以通过从分光光度法测得的总吸光度中减去估算的浊度而计算出来。为了模仿一种胶体生物溶液中胶体分散体系的光散射特点，可以用沉淀的方法分出溶液中造成混浊的物质如上述描述的诸如粘土矿物，并且用含有预期大小的颗粒组分去与剂量测定标准溶液的浊度相匹配。
[125]更优选地，非透明生物溶液是一种含有悬浮的粒经至少为约100nm的颗粒的生物液体，该大小在本技术领域是公知的并且在上面进行了详细描述。可以通过测量在通过如过滤或者离心的方法移除这些悬浮颗粒之前和之后的吸光度，而确定这种生物溶液如苹果汁、橘子汁或者蔬菜汁的浊度。经过澄清处理后的没有悬浮颗粒的溶液的吸光度是由分子发色基团引起的。测得的混浊液和澄清液体之间吸光度的差异即为浊度。
[126]还优选这种不透明生物溶液是一种乳化液例如乳，它是一种水包油的乳化液，并且其光散射作用引起的混浊导致了对整个光的减弱。对于包含有上述成分的紫外光剂量测定标准乳化液，需要化学惰性的和紫外透光的乳化剂和乳化的液体，特别是多氟羧酸盐类和多氟烃类或者它们的衍生物。
[127]为了调整剂量测定溶液以便与不透明生物溶液的吸光度和浊度相匹配，首先，在灭活时所用的光波长下测量这种不透明生物液体的吸光度(也即是它的浊度值)。然后，最好用过滤的方法除去这种生物溶液中的混浊组分，再在灭活时所用的光波长下测量这时的吸光度(也即非浊性吸光度)。制备出在光灭活时所用波长下其吸光度与非浊性吸光度相匹配的剂量测定溶液。优选这种剂量测定溶液的粘度值也和已经去掉其混浊组分的生物溶液的粘度值相匹配。这种剂量测定溶液的配制方法在前面已有详细描述。随后，如前述部分所描述的那样，将一种引起混浊的组分加入到溶液中，以使得在所用的灭活波长下这种剂量测定溶液的吸光度和浊度相匹配。更进一步的对这样的剂量测定溶液进行校正的细节，以及本发明的优选实施方式，请参见实施例4和实施例10。
[128]根据一种确定灭活不透明生物溶液中微生物所需要的有效光辐照剂量的方法的优选实施方式，大约100％，优选80％，更优选60％，更优选50％，更优选30％或更少的入射辐照在沿着光程的方向被吸收掉。
[129]根据另外一个优选的实施方式，规定通量可按照上面的描述进行调整。优选该方法进一步包括有，在确定辐照剂量测定时，监测发自一个或者多个光源的光强度。更优选所用的光源在紫外光范围之内。在上面的描述中对该监测装置也有介绍。
[130]优选在一种确定灭活不透明生物液体中的微生物所需的有效光辐照剂量的方法中进一步包括，如前所述，在对辐照之前或期间、或者之前及期间掺合了存活微生物的生物液体进行辐照之前和之后、或者之前、期间和之后，通过滴定所述存活微生物的数量来确定剂量分布。在另一个优选实施方式中，生物学上的有效辐照剂量(光通量)可以用生物剂量测定的方法进行测定，最好是用如前所述的化学剂量测定方法和生物剂量测定方法的组合进行测定。更优选这种方法还包括，为了确定如前所述的辐照剂量，对在辐照过程中发自一个或者多个光源的光强度进行监测；更优选辐照光在紫外光区，最好是在紫外光C区。
[131]优选剂量测定溶液是指前面详细描述的溶液。
[132]更优选地，这种剂量测定溶液含有稀释后的碘化钾/碘酸钾感光计，或含有稀释后的碘化钾/碘酸钾聚乙烯吡咯烷酮感光计，或者含有稀释的过二硫酸钾/叔丁醇感光计。
[133]进一步优选这种剂量测定溶液中还可以含有前述的可以引起混浊的物质。这种剂量测定溶液最好被调整到在光灭活波长下其吸光度，或者吸光度和浊度，或者吸光度和粘度以及浊度与生物液体相同，如同前述的和实施例4和10中所描述的那样。
[134]可以用于本发明的方法的微生物如前面部分所描述。
[135]优选确定灭活不透明生物溶液中微生物所需有效光辐照剂量的方法与前面介绍的至少一种消毒或灭菌方法联合起来进行。更优选这种生物液体如上所述含有至少一种添加剂以减少液体中生物活性成分的破坏和丧失。更优选该方法如前所述在有液体去垢剂处理的情况下进行。
[136]根据本发明的方法，有效辐照剂量是指前面所定义的辐照剂量。
[137]更优选该方法在流通式反应器中进行，优选在流通式反应器中，包括用来自单个或者多个光源的有效辐照剂量的单色或多色光对生物液体进行辐照；其中有效辐照剂量依据上述方法和实施例3、5、16和17所详述的方法进行确定。
[138]另外，本发明的另外一个方面是，提供了一种灭活不透明生物溶液中微生物的方法，包括，用发自单个或者多个光源的单色或多色光以有效光辐照剂量对生物溶液进行辐照，其中有效光辐照剂量根据前述的方法进行测定。这种方法可以在任何一种类型的辐照反应器中进行，优选在间歇式或者流通式反应器中进行(参见实施例3至6、12、13以及15至17)。
[139]优选在确定光辐照有效剂量和灭活方法中，用到了一种带有封套恒温器包裹的一个或者多个光源的紫外光灭活流通式反应器，通过该封套恒温器包层，一种恒温并基本透明的液体通过流动来移去来自辐照灯的热量，从而保证几乎不变的灯光强度。优选这种流通式反应器选自下面这些重力驱动的产薄膜型(gravity-driven thin＝film-generating type)、涡流主动混合流型(turbulent actively mixed flow type)、离心驱动的产薄膜型(centrifugally driven thin-film-generating type)、盘管型(coiled tube type)、挡板管状型(baffled tube type)、静止混合管状型(motionless mixer tube type)、涡流静止性混合流管型(turbulent statically mixed flow-tube type)、层叠管型(laminar-tube type)，涡流管型(turbulent flow-tube type)。所有这些将在下面详细描述。
[140]本发明的另外一个方面还提供了紫外光灭活流通式反应器，在这种反应器中，一个或者多个光源被封套恒温器所包裹，通过该封套恒温器中的恒温的基本透明液体的流通移除辐照灯发热所产生的热量，优选过量的热量，从而确保一种基本上不变的光强度优选该液体薄膜应当是一种生物液体薄膜。更优选从一个或者多个光源发出的光线用来灭活这种生物液体。优选该封套恒温器是包含或者由紫外半透光的、抗紫外线的、基本上化学惰性石英玻璃组成，更优选硼硅玻璃，以及半透明、抗紫外线并且基本上化学惰性的聚合物如含氟聚合物。
[141]本发明中所提到的过量发热优选是在反应器中尤其是反应器光路经上，任何足以将生物液体加热到一定温度的热能或者红外能量，该温度对生物液体中的有效生物活性产生不良作用或者生物活性丧失以及使其中的组分产生不可逆变性失活。该温度可以取决于液体的组成和是否存在稳定剂。对大多数酶和凝结蛋白质来说，将生物液体加热到大约37℃的最佳生理温度，就有可能产生不利变化和损失。更优选过量发热是指反应器中的生物溶液的温度，在该温度下大部分的未经稳定化的血浆蛋白会发生聚集，也就是说大约55到60℃或者更高的温度。过热果汁等溶液会发生变味。
[142]根据本发明，这种流通式反应器最好是选自下面这些如上所述的反应器：重力驱动产薄膜型如Dill辐照器、盘管型(Bayha 1951)，挡板型或者其他含有静止混合元件的管状型、涡流静止混合流管型、层叠管型、涡流管型。
[143]根据本发明，这种流通式反应器提供了一种稳定的灯光强度以确保在辐照过程中的接近恒定的辐照能，从而减少本技术领域所知的反应器的辐照波动(参见实施例7、8和13)。更进一步的稳定灯光辐照的方法包括调整电压(Cortelyou等，1954)，其可以和其他恒温方法联合使用。如同本发明的介绍，流通式反应器中引入的光源的直接恒温方案能同时保证金本上恒定的灯光强度和移除产生的热，优选移除产生的过量热量。优选使用纯水(蒸馏水或去离子水)或者任何其他透光性的、对光不敏感的、无毒、不燃的液体来实现恒温。优选依据测得的与辐照灯预期温度的偏差，对恒温器封套中的恒温溶液温度或者流速进行调整，这样，依据辐照灯实际温度和目标温度之间的差异，可以对辐照灯的冷却程度进行调节。
[144]优选光源也可以用于其液体深度大于光穿透路径深度的反应器，如搅拌间歇式反应器，或者主动或被动混合流通式反应器。
[145]根据本发明的一个流通式反应器的优选实施方式，有两种使用液体使低压金属蒸汽灯恒温的模式，图14a和14b描绘了相应设计的横断面。使用液体对整个辐射辐照灯表面进行恒温，可以最大程度避免金属蒸汽在较冷的一些点上的聚集，其使用了现有的金属热管冷却系统(Benesi，1956)，并且防止通风式冷却系统产生的灰尘在辐照灯上的留存(美国专利6,586,172)，从而可以确保辐照灯壁温度的均匀分布。
[146]在图14a中，管形辐照灯被(A)一个内置的包层管(B)和一个外部的包层管(C)所围绕，优选它们同心安装并且置于在光灭活波长下透光性足够的材料构成。在辐照灯(A)和内包层管(B)之间，有一个间隙(D)，该间隙一般充满气体或者什么都不含，可以对该间隙的宽度进行调整以优化足够透光的液体(E)的恒温效率。液体通过流经内包层管(B)和外包层管(C)之间的间隙，避免对生物溶液的过度加热。可以对包含液体(E)的间隙的宽度进行调整，以确保依据需要对产生的热量进行最有效的移除。这样的设计对于美国专利申请2003/0049809 A1描述的螺旋管流通式反应器来说更为适用，在这种反应器中，优选同心管形流体管直接或者非常接近地和辐照灯包层贴附。这种设计也适用于高光强度汞合金灯，这种灯能产生三倍于平常的低压汞灯的UV-C(a253.7nm)表面辐照。然而，在大约灯壁最佳温度的80℃附近，需要对生物液体在这么高的变性温度下提供一定的保护，这种保护可以通过优化间隙(D)宽度而实现，此宽度可以决定热量被转移到恒温液体(E)中的效率。
[147]在另一项优选实施方式中，图14b所示，提供了一种去掉内包层管和空气间隙的简化设计，这样就可以依靠在辐照灯(A)和外包层管(C)之间流动的液体(E)，而实现对辐照灯(A)的恒温效果。如果对辐照反应器的足够绝热距离能避免对待处理的生物液体进行过度加热，这种设计对于在辐照灯壁温度40℃下发射最大UV-C区(253.7nm)表面辐照的低压汞灯来说尤为适合。
[148]更优选地，如果用一种流动的液体来对用于反应器的光源进行恒温，那么在几乎不变的灯光强度并且不对样品进行过度加热的条件下，可以安全而温和地操作重力驱动产薄膜型反应器如Dill辐照器及其衍生类型、螺旋管式或者螺旋管包层辐照器。更优选这种对光源的流动液体式恒温方案也可以用于其他液体深度大于光穿透深度的反应器，如搅拌间歇式反应器，或者主动或被动搅拌流通式反应器。
[149]任何给定的紫外辐照剂量可以测量为用mJ/cm2。辐照剂量是指在整个过程中总的辐照灯功率。然而，总的辐照剂量中只有一部分是有效辐照，有效辐照可以用化学剂量测定法或者通过对噬菌体的灭活试验而得出。例如，一个30升的间歇式反应器需要的辐照灯剂量比有效靶辐照剂量高1000倍。如前所示，用化学剂量测定法对有效辐照剂量进行确定也可以得出辐照时间。在辐照灯功率发生微小变化的情况下，辐照剂量可以取代辐照时间。这可以通过记录在对标准剂量测定溶液进行辐照试验的过程中辐照灯强度而测定。杀灭病毒的有效靶辐照剂量确定后，将在整个辐照过程中强度计数累计起来，可以得出对应于有效靶剂量的辐照剂量靶辐照灯剂量。通过控制辐照灯剂量这一过程，可以对辐照灯功率的变化进行补偿，并且提高该方法的准确度。
[150]本发明的另外一个方面是提供了一种通过控制发自单个或多个光源的单色或多色光的辐照总剂量以有效灭活间歇式反应器中存在于生物液体中的微生物的方法，包括如下步骤：
[151]a)基于灭活生物液体中的微生物时的单色或多色光的有效辐照剂量，确定取决于吸收的辐照源靶光辐照总剂量、在间歇式反应器中有效灭活微生物所需要的光辐照剂量速率和辐照时间；
[152]b)在灭活间歇式反应器中生物液体中的微生物期间，记录光辐照剂量速率和辐照时间；
[153]c)基于步骤b)的测量，计算取决于吸收的辐照源光辐照总剂量；
[154]d)将步骤c)中测得的取决于吸收的辐照源光辐照总剂量与步骤a)中得到的取决于吸收的辐照源靶光辐照总剂量进行比较；和
[155]e)一旦步骤c)中测得的取决于吸收的辐照源光辐照总剂量等于或大于取决于吸收的辐照源靶光辐照总剂量，则中断对生物液体进行曝光。优选继续进行该方法，直到取决于吸收的辐照源光辐照总剂量基本上等于取决于吸收的辐照源靶光辐照总剂量，而不管辐照光剂量速率的变化和/或中间至少一个或者多个光源的突然关闭。更优选用以上详述的方法确定有效辐照剂量。进一步优选用至少一种电子辐射计、至少一种图表记录器和/或至少一种计数器(sum counter)来记录辐照光剂量速率和辐照时间。
[156]实施例7，8和15描述了这种方法的一个优选实施方式。优选该方法还考虑到了辐照波动。
[157]优选靶光辐照总剂量可以按如下方法确定：首先，用具有不同的吸光系数的不同标准剂量测定溶液对间歇式反应器进行验证，以测定有效辐照剂量速率(以mJ/cm2/min计)、辐照光剂量速率(以mJ/cm2/min计)、达到给定有效辐照剂量所需要的辐照时间。如前所述，优选用化学剂量测定法来确定灭活生物液体中的微生物时，所用的单色或多色光的有效辐照剂量。然后，如同下一段详细描述的那样，对光辐照剂量速率和辐照时间进行监测。当整个辐照过程中的辐射计总信号的增加时，计算取决于吸收的辐照源光辐照总剂量。总的说来，因为辐射计传感器所接收到的紫外光实际上不因任何介质吸收而减弱，因此光辐照剂量速率要在数量级上大于化学剂量速率。对于给定的在生物液体中取决于吸收的辐照源靶光辐照总剂量来说，其辐照时间乘以取决于吸收的辐照源光辐照剂量速率，即得出作为辐照参数的取决于吸收的辐照源靶光辐照总剂量。
[158]优选使用标准仪器如至少一种电子辐射计、至少一种图表记录器、以及至少一种计数器，按照如上所述以及实施例7和8所述的方法，来记录光辐照剂量速率和辐照时间。辐照灯功率(光辐照剂量速率)可以连续性地监测，并且对信号进行显示或者记录。待处理液体最好不要阻挡光源和辐射计传感器之间的通光程，如此，则液体不会减弱光的强度。如果由于设计上的局限性而不能避免这种对光强度的减弱，则优选需要在液体被辐照之前和之后，对没有减弱的辐照灯的光强度进行测量，以便能计算出平均光强度。电子辐射计优选含有一个对位移不敏感(drift-insensitive)的光电辐射计传感器。这种记录使得在辐照时间的过程中，以光辐照剂量速率的测量为基础，而计算出取决于吸收的辐照源光辐照总剂量。即便辐照发生波动或临时被打断，这样的设计也仍然可以对生物溶液所接受到的取决于吸收的辐照源光辐照总剂量进行计算。在一个优选的实施方式中，通过对取决于吸收的辐照源光辐照总剂量和取决于吸收的辐照源靶光辐照总剂量进行比较，从而可能确定或者甚至期望在哪个时间点终止辐照灭活反应，以便确保生物液体基本上接受到有效辐照剂量而灭活其中的微生物，与此同时，优选本方法还可以确保这种生物液体基本上不会因为受到过度辐照而受到影响。为了实现这一目的，行使对取决于吸收的辐照源光辐照总剂量和取决于吸收的辐照源靶光辐照总剂量进行比较的功能的手段，可以和一个开关相联接，该开关可以关掉用来辐照生物溶液的光源。除此之外，在本技术领域内也有其他有效地中断对生物溶液进行辐照的合适的方式。
[159]优选该方法持续进行，直至取决于吸收的辐照源光辐照总剂量基本等于相应的取决于吸收的辐照源靶光辐照总剂量，即便光辐照剂量速率发生变化并且/或者至少一个或多个光源其间发生关闭。这种取决于吸收的辐照源靶光辐照总剂量也可以由在通过多种不同物质测定的取决于吸收的辐照源靶光辐照总剂量之间进行内插法而推导出来。这一方法在实施例6和7中有详细描述。
[160]和流通式辐照方法相比，间歇式辐照有这样的优点，即其整个间歇体积在搅拌下受到平均光强的辐照，一直到所有的微生物都被有效地灭活。(Brooks，1920)
[161]间歇式辐照反应器可以包含一个待处理溶液用容器，该容器可以是至少一部分使用在光灭活致病微生物波长下基本上足够透光的材料制成，并且用设置在外面的光源对该容器进行辐照。或者该容器所装液体可以用安装在该液体表面之上的光源照射，也可以用浸入该液体的光源进行照射。整搅拌个体积的溶液，从而保证所有的溶液组分暴露于基本上有效并且均一的光灭活致病微生物的辐照光下。由于没有合适的验证和控制方法，直到现在这类装置还没有得到实际应用。
[162]优选外部光源将光线辐照到辐照容器内，以便待处理吸光性溶液不会阻挡辐照灯传感器，并且传感器受到基本上不衰减的光的辐照，辐照灯的灯强度测量最好是连续进行。辐照剂量测定靶灯辐照剂量(the radiometric target lamp dose)随着蛋白溶液的吸光度以线性比率增加。在较低光强度下工作的辐照灯需要更多的辐照时间来达到辐照剂量测定靶灯辐照剂量。
[163]下述实施例阐明了本发明的具体实施方式，但不以任何方式限制本发明的保护范围。
实施例1：高度稀释的碘化物/碘酸盐感光计溶液的吸光系数和碘化物/碘酸盐感光计溶液的剂量测定响应
[164]将含有0.24M KI和0.04M KIO3的0.01M，pH 9.25的硼酸缓冲溶液，用0.01M硼酸缓冲溶液分别稀释至0.2、0.4、0.6和0.8倍，并且在0.1mm比色杯中测量吸光度。图1显示吸光系数与浓度成线性比(a253.7＝69/cm×稀释因子)关系。
[165]将1升含有10g聚乙烯吡咯烷酮K90(PVP K90；平均摩尔量360000Da)的0.01M硼酸缓冲溶液和1升含有50g PVP K25(平均摩尔量29000Da)的0.1M硼酸缓冲溶液用相对应的硼酸缓冲溶液稀释至0.2、0.4、0.6、0.8倍，并且在Schott 0.40mm Ubbelohde毛细管粘度计中于22.8℃下热态测量稀释液和缓冲液粘度。从图2可以看出，粘度随浓度以非线性比增加。
[166]在0.1M，pH＝9.25的硼酸缓冲溶液中，分别制备出十进制吸光系数a253.7＝2.5/cm且粘度为1cp的剂量测定溶液(0.00852M KI+0.00142M KIO3+1.543g PVP K25/L)、a253.7＝4.5/cm且粘度为1cp的剂量测定溶液(0.01548M KI+0.00258M KIO3+1.543g PVP K25/L)、a253.7＝7.5/cm且粘度为1cp的剂量测定溶液(0.02591M KI+0.00432 M KIO3+1.543gPVP K25/L)，以及a253.7＝10/cm且粘度为1.25cp的剂量测定溶液(0.03478M KI+0.00580M KIO3+1.916g PVP K90/L)，使用如在实施例18中和以上描述的方法，通过在校准器中用薄层比色杯(0.5mm相当于2.5/cm；0.2mm相当于4.5/cm，7.5/cm和10/cm)中的曝光增量记录校准曲线。使用Morowitz校正因子(Morowitz 1950)来校正含有样品溶液的薄层比色杯的自吸收。图3描述了2.5/cm样品溶液的校准曲线，而图4描述了4.5/cm、7.5/cm和10/cm样品溶液的校准曲线。
实施例2：在螺旋流通式反应器(helical flow-through-reactor)中的辐照有效剂量确定
[167]将装配了在23mm直径套筒内11W的UV-C灯的水箱紫外线消毒用浮动浸泡灯(微浮沉子1/0，Aqua Concept有限公司，卡尔斯鲁厄，德国)倒置安装，并且将一个带卷直径7/8英寸(2.22cm)、17.5cm长、5mm筒径和0.63mm壁厚的含氟聚合物盘管，(美国宾夕法尼亚州普利茅斯米挺市Markel公司制造，材料为意大利Bollate市Solvay Solexis S.p.A.公司生产的Hyflon MFA)紧紧缠绕在灯的周围，使得15cm照射长度被盘管完全利用。当在剂量测定测量开始以前和结束后用去离子水冲洗掉盘管时，使用安装在盘管中段的带有日光遮蔽UVC-TLB探测器的Dr.Groebel UV-Elektronik RM-12辐射计核对灯强度。使用一个具有ISM719三滚子泵头部和壁厚5mm ID×1.5mm壁厚硅橡胶管的Ismatec BVP蠕动泵，以100、200、300、400、500和600ml/min的流量将样品溶液经由盘管反应器(coiled tube reactor)泵出，并且由367nm处0.2mm比色杯吸光度得到的校准曲线读出剂量。
                            表1
 mL/min  UV剂量2.5/cmmJ/cm2  UV剂量4.5/cmmJ/cm2  UV剂量7.5/cmmJ/cm2  UV剂量10/cmmJ/cm2
 600  27.37  16.27  9.27  未进行
 500  35.02  20.84  11.51  未进行
 400  41.34  23.82  13.57  未进行
 300  55.49  31.74  18.01  14.57
 200  82.32  47.49  27.53  22.10
 100  158.90  90.25  53.06  43.07
 RM-12读取(mW/cm2)  开始10.16结束9.81平均9.99  开始10.70结束10.78平均10.74  开始11.07结束11.15平均11.11  开始11.28结束11.30平均11.29
[168]UV剂量对回流速率的相关性(＝驻留时间，min/ml)呈线性关系，相关系数R2＞0.999。
实施例3：对人血清白蛋白和a1-抗胰蛋白酶进行辐照以用于MFA盘管内基于化学剂量测定和生物剂量测定的病毒灭活
[169]用20mM磷酸盐缓冲的0.15M NaCl溶液(磷酸盐缓冲盐水，PBS)稀释人血清白蛋白(20％)，并且噬菌体Phi-X174溶菌液(～1×109噬菌斑形成单位(PFU)/ml)以1∶100(V/V)的掺入比率添加，得到吸光系数a253.7＝7.5/cm且粘度为1.05cp的蛋白质溶液。该溶液经由如在实施例2中描述的MFA盘管泵出。按照实施例2的方法测量辐照强度(平均强度为11.40mW/cm2)。通过滴定寄主细菌进行连续的十进制稀释后，确定0.9mL样品溶液的Phi-X174滴度。从具有至少10个高达200个溶解噬菌斑的陪氏培养皿上计算出灭活率。矫正施用剂量用于辐照强度(辐照度/剂量测定)比率。
                     表2
 mL/min  log10pfu Phi-X 174/mL  UV剂量(mJ/cm2)
 未辐照  7.36  0.00
 200  (0.05＝1pfu/0.9mL)  28.25
 300  1.05  18.48
 400  2.90  13.92
 500  3.42  11.81
[170]从相应的噬菌体滴度可以看出，随剂量的灭活率达到-0.3369 log10pfu/(mJ/cm2)。
[171]从血浆纯化得到人a1抗胰蛋白酶(a1蛋白酶抑制因子，ARALAST)，并且稀释至吸光系数a253.7＝4.5/cm。噬菌体掺入比率是1∶100(V/V)。平均辐照强度是11.45mW/cm2。矫正施用剂量用于辐照强度(辐照度/剂量测定)比率。抗胰蛋白酶活性通过嗜中性弹性蛋白酶抑制试验确定。
                              表3
mL/min  log10pfu Phi-X174/mL  Δlog10pfu/mL  UV剂量(mJ/cm2)  弹性蛋白酶抑制(未辐照％)
未辐照  6.66  0.00  0.00  100.00％
600  1.12  -5.53  17.34  94.31％
500  0.82  -5.83  22.21  93.09％
400  0.00  -6.66  25.39  97.74％
300  0.00  -6.66  33.83  89.02％
200  0.00  -6.66  50.62  98.37％
100  0.00  -6.66  96.20  90.36％
[172]可见，通过应用流通式(flow-through)辐照工艺用化学剂量测定和生物剂量测定，可以确定完全灭活靶微生物的最低剂量。
实施例4：对苹果汁进行辐照以用于在MFA盘管内基于化学剂量测定的UV巴氏消毒
[173]购买巴氏灭菌的苹果汁(a253.7＝10.1/cm，η＝1.25cp)。面包酵母(Saccharomycescerevisiae酿酒酵母)是新购买的食品级，并且用100mg新鲜的面包酵母接种50mL苹果汁，于37℃下培养3h。该巴氏灭菌苹果汁中掺入酵母悬浮液(9.5ml悬浮液掺入950mL汁中)，并且以100、150和200ml/min的流速辐照。平均辐照强度是11.46mW/cm2。由实施例2得到的结果插入用于150ml/min的剂量。矫正施用的剂量用于辐照强度(如同实施例2中的辐照度/剂量测定)比率。在环境光下滴定橙色血清琼脂中的酵母细胞，并且通过50ml未受辐照与辐照汁液37℃下培养72h的发酵试验测定残余的感染性。评价未受辐照的和辐照样品的香味(中性＝巴氏灭菌苹果汁)。
                                表4
mL/min  log10cfuS.cerevisiae/mL  UV剂量(mJ/cm2)  在37℃下50mL中经过下列时间后检测发酵 气味
未辐照  5.60  0.00  16h 中性
200  3.40  22.60  24h 轻微烟味
150  3.35  29.60  40h 轻微烟味
100  0.52  44.08  64h 烟味
[174]从结果可见，通过化学剂量测定可以精确地评价出大于40mJ/cm2的较高剂量对于使对UV-C高度吸收的苹果汁中大于5log10cfu/ml面包酵母失去活性来说是必需的。
实施例5：使用剂量测定和生物剂量测定用于评价产生泰勒涡流(Taylor vortex)的流通式反应器(flow-through-reactor)流动。
[175]用多至六个低压水银灯从侧面照射装配有外石英管(7cm内径，2.7mM壁厚，13.2cm高)和旋转的同心内不锈钢圆柱(直径54.85mm)、总容量196.1ml的泰勒旋涡反应器(Taylorvortex reactor)，每个低压水银灯安装在浸没于同心环形水浴中的石英套筒内，该水浴具有同心内石英窗，并且后面装配有不锈钢反射镜。向上经过垂直安装的槽的液体流速可以通过Watson-Marlow 505 U蠕动泵调节。圆柱转速也可调整。来自恒温器的冷却水经由辐照灯封套水浴泵出，以保持灯温和UV-C输出基本上恒定。每次改变实验参数之后，在抽出样品之前经由槽泵出5个槽体积。
[176]改变流速，同时保持转速恒定在60rpm。通过实施例2给出的样品溶液测量UV剂量。在60rpm下，用6个辐照灯测量表5中显示的下述剂量：
           表5
 mL/min  UV剂量2.5/cmmJ/cm2  UV剂量4.5/cmmJ/cm2
 288.0  24.51  未进行
 230.4  29.83  17.07
 172.8  38.49  20.79
 115.2  55.27  30.60
 86.4  70.25  41.58
 57.6  100.28  58.57
 36.8  138.31  71.97
[177]在驻留时间(＝1/流速)和剂量之间的相关性是非线性的，表明低流量和高转速下主动增加的驻留时间分散(如同美国专利6,576,201中的描述，图7)。
[178]实施例2的样品溶液(a253.7＝10/cm，h＝1.25cp)是经由槽泵出，并且用6只辐照灯照射，流速保持恒定，同时改变内圆筒转速。其结果显示于表6中。
                    表6
 泰勒槽rpm  48mL/min下UV剂量(mJ/cm2)  67.2mL/min下UV剂量(mJ/cm2)
 45  29.51  23.47
 60  32.09  23.67
 75  31.69  22.47
 90  31.41  25.72
 105  31.59  未进行
[179]实施例2的样品溶液(a253.7＝7.5/cm，η＝1.25cp)是经由槽泵出，并且用6只辐照灯照射，保持流量恒定在192ml/min，同时改变转速。然后辐照如在实施例3中描述的掺入细菌-噬菌体的白蛋白溶液，并且测定噬菌体滴度。其结果显示于表7中。
                          表7
 泰勒槽rpm  UV剂量(mJ/cm2)  log10pfu Phi-X 174/mL
 未辐照  0.00  6.85
 30  10.41  未进行
 60  11.12  4.60
 90  11.12  4.48
 120  10.98  4.89
 150  11.25  4.94
 180  10.90  4.84
 240  10.89  4.98
 300  10.90  5.08
[180]在改变流量并恒定转速在60rpm情况下，经由泰勒槽泵出相同的样品溶液。测量剂量，得出剂量与驻留时间成线性相关。然后辐照如在实施例3中描述的掺入细菌-噬菌体的白蛋白溶液，并且测定噬菌体滴度。在剂量测定和噬菌体辐照期间，测量这6只辐照灯的平均辐照强度，计算辐照校正因子。其结果显示于表8中。
                                      表8
 mW/cm2 灯1  灯2  灯3  灯4 灯5  灯6  平均
 放射量测定 12.96  10.42  10.95  14.85 11.59  13.30  12.35
 噬菌体 13.20  10.73  11.05  15.18 11.70  13.03  12.48
[181]在辐照噬菌体期间测定剂量时，需要通过辐照校正因子乘以测定的剂量以计算有效剂量，该辐照校正因子确定是1.011。
                                       表9
 流量(mL/min)  驻留时间(min/mL)  UV剂量(mJ/cm2)放射量测定  UV剂量(mJ/cm2)噬菌体  log10pfuPhi-X 174/mL 灭活Δlog10pfu/mL
 未辐照  0.00  0.00  7.29 0.00
 153.6  0.00651  12.75  12.89  4.65 -2.64
 192  0.00521  10.24  10.36  5.05 -2.24
 259.2  0.00386  7.65  7.73  5.35 -1.93
 384  0.00260  5.11  5.17  5.86 -1.43
 768  0.00130  2.28  2.31  6.51 -0.78
[182]从显示于表9中相应的噬菌体滴度可以看出，得到了-0.2(log10pfu/mL)/(mJ/cm2)的随剂量的灭活率。
[183]用样品溶液(a253.7＝2.6/cm，η＝1cp)和仅2只辐照灯进行类似的实验。然后辐照相同吸光度和粘度的掺入噬菌体的白蛋白溶液。该辐照校正因子(噬菌体溶液/剂量测定)是0.988。其结果显示于表10中。
                                        表10
 流量(mL/min)  驻留时间(min/mL)  UV剂量(mJ/cm2)放射量测定  UV剂量(mJ/cm2)噬菌体  log10pfuPhi-X 174/mL 灭活Dlog10pfu/mL
 未辐照  0.00  0.00  7.00 0.00
 153.6  0.00651  14.68  14.50  3.46 -3.54
 192  0.00521  11.90  11.75  3.79 -3.21
 259.2  0.00386  8.83  8.72  4.45 -2.55
 384  0.00260  6.06  5.99  5.11 -1.89
 768  0.00130  3.06  3.02  5.90 -1.10
[184]基于相应样品溶液的剂量测定，用掺入噬菌体的白蛋白溶液(a253.7＝4.5/cm，η＝1.05cp)，在恒定流量192ml/min并且内圆筒转速可变的情况下进行类似的实验。在此，从离开槽(由于驻留时间较短，该槽具有较低的剂量)的前面体积中抽出附加的样品。其结果显示于表11中。
                                   表11
 泰勒槽rpm  UV剂量(mJ/cm2)  log10pfu Phi-X 174/mL 灭活Dlog10pfu/mL
 未辐照  0.00  6.82 0.00
 60(起始)  16.79  2.98 -3.84
 60  18.40  2.55 -4.27
 90  18.22  3.03 -3.80
 120  18.06  3.64 -3.19
 150  17.99  3.74 -3.08
 180  18.22  3.91 -2.91
 240  18.10  未进行
 300  18.24  未进行
 30  18.70  未进行
[185]从通过化学和生物学的剂量测定组合得到的结果可见，可以组合应用这些方法测量出驻留时间分散(如同美国专利6,576,201中的描述，图7)。
实施例6：使用化学剂量测定、生物剂量测定和辐照测量的间歇反应器的有效性
[186]一种大规模微生物灭活用光照灭活反应器，其具有一圆柱形石英管(25cm内径，5mm壁厚，75cm长度)、一平顶盖和一不锈钢滚花的凸出底部，并且装配有装填和取样阀，一套包含三个三桨叶叶轮的堆叠式叶轮搅拌器，并且每个外桨叶边缘有一刮水片。该反应器四周环绕着10盏水恒温的UV-C辐照灯(Philips TUV 55W HO)，辐照灯安装在如在实施例18中描述的辐照灯箱内，每个辐照灯都用Dr.Groebel UVC-SE辐射计传感器监控。此反应器最大容量是30L。使用辐射计传感器将每个辐照灯的辐照功率记录在图表记录器上，并且将首次使用的相对辐照功率归一化地设定为100％。
[187]在30L光照灭活反应器中，在用吸光度和粘度相同的样品溶液校准剂量测定后，辐照掺入噬菌体Phi X 174的白蛋白溶液(a253.7＝7.1/cm，η＝1.05cp)。搅拌的速度设定为90rpm。如此确定了1.1634mJ/cm2的剂量率，并且每隔2min 8s抽出噬菌体灭活样品，直到17min 4s，即，剂量增加量为2.48mJ/cm2，直到大约20mJ/cm2的靶剂量。同时地从底部和顶部取样阀抽出样品以研究混合的均一性。其结果显示于表12中。
                           表12
 UV剂量(mJ/cm2)    log10pfu/mL(顶部)  log10pfu/mL(底部)
 0.00    7.84  7.87
 2.48    6.85  6.69
 4.96    5.91  5.79
 7.45    4.61  4.79
 9.93    3.51  3.82
 12.41    2.98  2.98
 14.89    2.09  1.93
 17.38   (1.00)  (1.19)
 19.86   (0.05)  (0.35)
[188]由大于10pfu/0.9ml_的噬菌体滴度，确定了-0.3940log10pfu/ml)/(mJ/cm2)的最高灭活率和-0.3912log10(pfu/mL)/(mJ/cm2)。-0.3926log10(pfu/ml)/(mJ/cm2)的平均随剂量的灭活率显示出优良均一性和有效的混合，并且显示出与实施例3的-0.3369 log10pfu/(mJ/cm2)以及实施例4的大约-0.2log10pfu/(mJ/cm2)流通式灭活率相比较较窄的剂量分布。相比未衰减的-0.44log10pfu/(mJ/cm2)噬菌体灭活率，由于混合最有效，分批辐照显示最均一和均匀的微生物UV-C灯曝光。
[189]一种实验室规模的微生物灭活用光照灭活反应器，其基本上由一具有平面塑料顶盖的圆柱形石英容器(7cm内径，3mm壁厚，13cm高)和一凸出的塑料底部组成，该塑料顶盖上有取样阀，并且反应器装配有具有近壁刮水片(2个叶轮，搅拌速度可调)的堆叠式叶轮搅拌器，用两个10W低压水银灯从侧面照射该反应器。该反应器最大容量是450ml。用数字式双重传感器-辐射计(Dr.Groebel UV-Elektronik RM21，具有UVC-SE传感器)将照明强度记录在计算机上。由生物剂量测定取样时间间隔乘以化学剂量测定剂量率而得到的辐照剂量增量，再除以在剂量测定校准期间得到的辐照剂量率，计算出在生物剂量测定辐照期间的剂量增量。
[190]在450mL的光照灭活反应器中，按照实施例2的做法，在用相同的样品溶液进行剂量测定校准后，辐照与实施例3相同的掺入噬菌体的抗胰蛋白酶溶液。剂量率是2.5989(mJ/cm2)/min，并且每隔1min 1s抽出样品，直到17min 4s。在20mJ/cm2的剂量下，弹性蛋白酶抑制的活性是未辐照溶液的97％。其结果显示于表13中。
                                   表13
 UV剂量(mJ/cm2)   log10pfu Phi-X 174/mL Δlog10pfu Phi-X 174/mL
 0.00   7.28 0.00
 1.83   6.11 -1.17
 4.45   5.02 -2.26
 7.02   4.01 -3.27
 9.65   2.80 -4.48
 12.24   1.75 -5.53
 14.87   (0.82) -6.46
 17.46   (0.00) -7.28
 20.05   (0.00) -7.28
[191]-0.4406log10(pfu/ml)/(mJ/cm2)的随剂量的灭活率显示出优良的均一性和有效的混合，并且狭窄的剂量分布显然引起了与实施例3中描述的直流法的17.34mJ/cm2相比较的下降，下降了-5.53log10pfu/ml，甚至为12.24mJ/cm2。
实施例7：通过组合使用化学剂量测定和辐照测量确定30反应器的取决于吸收的辐照源靶光总剂量以确保灯故障下安全可靠的工艺
[192]对实施例5中描述的30L反应器(只是装配了9个带有反射镜的可分别地换向恒温辐照灯)用10种不同的样品剂量试液和4个辐照灯(a253.7＝3/cm至12/cm，以1/cm增加，η＝1.15cp)验证，以确定有效剂量率((mJ/cm2)/min)、光辐照剂量率((mJ/cm2)/min)和有效剂量20mJ/cm2必需的照射时间。用电子辐射计监控辐照灯辐照强度并且用图表记录器做记录，并且安装计数器用来计算在辐照期间来自所有辐射计的信号的总数。当辐射计相加信号随照射时间增加时，计算出取决于吸收的辐照源光总剂量。辐照光剂量率呈数量级地高于化学剂量率，因为辐射计传感器接受到实际上未被任何吸收介质衰减的紫外线。用于溶液中有效的给定靶剂量的照射时间例如20mJ/cm2，乘以辐照光剂量率，以计算出取决于吸收的辐照源靶光总剂量，作为辐照参数。其结果显示于表14中。
                                  表14
 吸光系数α253.7(l/cm)  达到20mJ/cm2时取决于吸收的辐照源光总剂量Hlamp
 3  13393
 4  18204
 5  25230
 6  29942
 7  33770
 8  38310
 9  43704
 10  48085
 11  54620
 12  60027
[193]由表14可见，辐照灯的取决于吸收的辐照源光总剂量与吸光度线性相关，可用公式Hlamp＝5058.9×a253.7-1413表示，相关系数接近于1，R2＝0.9972。取决于吸收的辐照源靶光总剂量，其本身与强度的任何变化无关，所以对于可靠的辐照工艺来讲是理想参数，保证了施用合适的靶剂量。该辐照工艺通过取决于吸收的辐照源光总剂量控制，控制方式是一达到预定的取决于吸收的辐照源靶光总剂量，就关掉辐照灯以终止辐照，其中将靶光总剂量增加至每次吸收都在有效范围内。
实施例8：模拟辐照在取决于吸收的辐照源靶光总剂量控制的辐照工艺期间灯关闭以及正确的在溶液中有效的靶剂量的验证
[194]按照在实施例5中描述的方法辐照30L反应器的样品溶液(a253.7＝8/cm，η＝1.15cp)。在四个辐照灯之一关掉10min后，并且辐照灯要么被打开不同的灯替代、要么不持续辐照并且仅用3只辐照灯，进行两次实验。通过化学剂量测定，测定辐照光剂量率，并且一达到由实施例6中描述的有效性公式计算出的取决于吸收的辐照源靶光总剂量Hlamp＝39058mJ/cm2，就关掉辐照灯，并且抽出样品以测定溶液中有效的剂量。
[195]在用另一个灯替代辐照灯10min后做的第一次试验，16min 43s后达到取决于吸收的辐照源光总剂量，并且样品溶液中测得的剂量是19.7mJ/cm2量。第二实验没有辐照灯替代物，19min 55s后达到取决于吸收的辐照源光总剂量，并且样品溶液中测量的剂量是19.9mJ/cm2。
[196]以达到预定的取决于吸收的辐照源靶光总剂量所需的时间作为照射时间，从该照射时间后测量的有效剂量可见，取决于吸收的辐照源靶光总剂量控制的工艺甚至不灵敏，并且在辐照期间对灯关闭有强烈抵制，因为取决于吸收的辐照源靶光总剂量确保了应用恰当的有效剂量。
实施例9：调整样品溶液以与具有高分子和低分子吸光度的混浊流体的吸光度和浊度相匹配
[197]将自然混浊的苹果汁滤过0.22μm注射滤过器。在253.7nm处未过滤的苹果汁吸光度是18/cm，而过滤的澄清苹果汁仅为10.4/cm，二者粘度皆为1.25cp。
[198]在与过滤苹果汁吸光度和粘度(a253.7＝10.4/cm，η＝1.25cp)匹配的碘化物/碘酸盐/PVP样品溶液中，添加膨润土以匹配混浊苹果汁的混浊度。浓度2g膨润土发现增加混浊度7.6/cm。其结果显示于表15中。
                           表15
 膨润土g/L  a253.7/cm  膨润土g/L  a253.7/cm  膨润土g/L  a253.7/cm
 0  10.4  0.4  12.3  1.5  17.0
 0.1  11.0  0.5  12.5  2.0  18.0
 0.2  11.5  0.75  13.3  2.5  18.4
 0.3  11.9  1.0  15.6
[199]如同图5中描述的校准曲线表明，混浊溶液的灵敏度仅有轻微降低，这里吸光度和混浊度使用的都是Morowitz校正因子(Morowitz1950)。对于吸光系数2.6/cm并且粘度1cp(＝1.543g PVP K25/L)的溶液，添加2g膨润土/L达到总吸光度9.3/cm。如图5所示，校准曲线中还没有相应的差异。将100ml澄清和混浊的样品溶液在一个搅拌的4cm石英试管中进行辐照，该试管插入如在实施例5中描述的相同的中相同灯罩内，用2只相面对的辐照灯或者1只辐照灯照射。在40min照射时间期间每4分钟抽出1ml试样。在每次辐照期间记录辐照灯强度，18/cm溶液的第二次辐照照明强度是10.4/cm溶液的第一次辐照的1.0416倍，并且9.3/cm溶液的第二次辐照照明强度是2.6/cm溶液的第一次辐照的0.9928倍。理论上取决于吸光系数倒数1/a的剂量率未显示出如下预期差异：100％对应于10.4/cm并且57％对应于18.0/cm，或者100％对应于2,6/cm并且28％对应于9.3/cm，但替代的差异是(用2只辐照灯)1.748(mJ/cm2)/min对应于10.4/cm并且1.603(mJ/cm2)/min除以1.0416等于1.539(mJ/cm2)/min，对应于18.0/cm，即，88％对应于具有高分子吸光度的混浊溶液，而(有1只辐照灯)3.415(mJ/cm2)/min对应于2.6/cm并且1.854(mJ/cm2)/min除以0.9928等于1.868(mJ/cm2)/min，即55％对应于有低分子吸光度的混浊溶液。这表明附加的混浊度使光散射入溶液，可通过化学剂量测定测量。
实施例10：高度稀释的碘化物/碘酸盐感光计溶液的吸光系数、碘化物/碘酸盐感光计溶液的剂量测定响应以及通过聚乙烯吡咯烷酮由UV-C产生的三碘化物的稳定性。
[200]将含有0.24M KI和0.04M KIO3的0.01M，pH 9.25的硼酸盐缓冲液，用0.01M硼酸盐缓冲液分别稀释至0.2、0.4、0.6和0.8倍，并且在0.1mm比色杯中测量吸光度。图6显示吸光系数与浓度成线性比(a253.7＝69/cm×稀释因子)关系。
[201]将1升0.01M硼酸盐缓冲液中含有10g聚乙烯吡咯烷酮K90(PVP K90；平均摩尔量360000Da)的溶液稀释至0.2、0.4、0.6、0.8倍，并且在Schott 0.40mm Ubbelohde毛细管粘度计中于22.8℃下热态测量稀释液和缓冲液粘度。从图7可以看出，粘度随浓度以非线性比率增加。
[202]制备0.01M，pH 9.25的硼酸盐缓冲液中含有0.24M KI和0.04M KIO3的储备溶液的稀释液，使其在253.7nm处的吸光度为6.1/cm(0.0212M KI+0.0035M KIO3+0.95g PVP K90/L；用于从DEAE葡聚糖凝胶阴离子交换凝胶(Brummelhuis 1980)的凝血酶原复合物洗出液)，和16/cm(0.06M KI+0.01M KIO3+6.25g PVP K90/L；用于2.5％(W/V)的纤维蛋白原溶液)，并且装入0.2mm比色杯。通过将装满测定溶液的比色杯放置在比色杯位置，保持限定的时间，在具有已知发光辐照度的CAMAG TLC灯(Rahn光度计测量)下，进行薄层校准。于367nm下测量吸光度。由图8可见，吸光度随使用的表面剂量而增加，并且灵敏度随KI/KIO3浓度而增加。
[203]在0.01M，pH 9.25的硼酸盐缓冲液中含有0.06M KI和0.01M KIO3的剂量测定溶液，吸光系数a253.7＝16/cm，并且制备出“相同KI和KIO3”浓度和6.25g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K90/L的溶液。如上所述，通过将装满剂量测定溶液的0.2mm比色杯在CAMAG TLC灯下放置限定的时间而进行薄层校准。于352nm处(仅有KI+KIO3)或者367nm处(KI+KIO3+PVP)测量吸光度。由图9可见，PVP提高了方法的灵敏度。
实施例11：装有辐照剂量测定溶液的具有固定几何尺寸间歇式光灭活反应器中的辐照时间测定。
[204]制备出十进制吸光系数a253.7为2.1/cm(0.0072M KI+0.0012M KIO3+0.5g PVP K90/L，用于FVIII浓缩物)、6.1/cm(参见实施例10)、10/cm(0.0346M KI+0.0058M KIO3+1.21g PVP K90/L；用于2％(W/V)免疫球蛋白溶液)和16/cm(参见实施例10)的剂量测定溶液，并且如在实施例6中描述的方法记录校准曲线。直径4cm石英试管装满100mL剂量测定溶液，在磁力搅拌器上用磁力搅拌棒搅拌，并且在2只配备有抛光不锈钢反射镜的低压水银蒸汽灯之间进行辐照。在预定的间隔，抽出样品并装入0.2mm比色杯用于分光光度测定，并且从校准曲线读出剂量。然后剂量率计算为(mJ/cm2)/min，而剂量率倒数即为每单位剂量的比辐照时间min/(mJ/cm2)。其结果显示于表16中。并且可以计算出用于表示吸光系数和(具体的)辐照时间之间关系的常数k1：
t＝k1×a
                             表16
溶液a253.7＝ 2.1/cm  6.1/cm  10/cm  16/cm
剂量率((mJ/cm2)/min) 14.40  3.68  2.71  1.56
具体辐照时间(min/(mJ/cm2)) 0.0694  0.2714  0.3688  0.6410
常数k1(平均值＝0.0386) 0.0330  0.0445  0.0369  0.0401
[205]根据吸光系数对比辐照时间进行线性回归计算，得到线性相关系数R2＝0.989。结果表明，基于薄膜校准的吸光度和经薄层校正的粘度匹配样品溶液的剂量测定适合于搅拌间歇式光照灭活反应器的验证。
实施例12：在薄层和分批辐照中MWIV和Phi-X174的灭活。
[206]来自细胞培养上清液(～108组织培养感染剂量(TCID50)/mL)的MMV储备溶液，并且来自大肠杆菌(Escherichia coli)增殖的噬菌体Phi-X174溶菌液(～1×109噬菌斑形成单位(PFU)/mL)用20mM磷酸缓冲液0.15M NaCl(磷酸盐缓冲盐水，PBS)稀释，并且分别取2.5mL，放入32mm聚苯乙烯陪氏培养皿水平振荡，在CAMAG TLC灯下用不同的UV-C剂量辐照。用带有日光遮蔽UV-C传感器的Dr.Groebel RM21辐射计测定样品表面距离辐照度，并且在分光光度计上测量的溶液自身吸光度用以校正有效积分通量(UV剂量)(Morowitz1950)。通过在寄主细胞培养物和细菌寄主上滴定，分别测定MMV和Phi-X 174滴度。其结果显示于表17中。
                                    表17
    UV剂量(mJ/cm2)     log10pfu Phi-X 174/mL     UV剂量(mJ/cm2)     log10 TCID50MMV/mL
    0.00     6.41     0     6.54
    2.25     5.79     2     5.31
    4.50     4.37     4     4.42
    6.75     3.46     6     3.52
    9.00     2.36     8     2.93
    11.25     1.35     10     2.37
    12     1.44
    灭活速率     -0.468log10(pfu/mL)/(mJ/cm2)     -0.405log10(TCID50/mL)/(mJ/cm2)
[207]在100ml带有4cm搅拌棒的石英瓶中装入80ml掺入MMV或者Phi-X 174的蛋白质溶液(凝血酶原复合物DEAE葡聚糖凝胶洗脱液，a253.7＝6.9/cm)，放置于磁力搅拌器上，搅拌速度～250rpm，并且用CAMAG TLC灯从侧面辐照。按照在实施例11中描述的方法，使用样品溶液(a253.7＝6.9/cm)进行校准。在测量剂量率后计算出的时间间隔抽出病毒或者噬菌体滴定用样品，并且进行滴定以测定残存的感染性病毒或者噬菌体滴度。其结果显示于表18中。
                                      表18
    UV剂量(mJ/cm2)     log10(pfu Phi-X 174/mL)     UV剂量(mJ/cm2)     log10(TCID50MMV/mL)
    0.00     7.27     0.00     6.77
    1.69     5.96     6.86     3.46
    3.37     5.52     13.70     0.61
    5.06     4.78
    6.74     3.95
    8.42     3.11
    10.10     2.39
    11.79     1.28
    灭活速率     -0.480log10(pfu/mL)/(mJ/cm2)     -0.425log10(TCID50/mL)/(mJ/cm2)
[208]从Phi-X174和MMV灭活率可以推导出它们在253.7nm处对UV-C光的灵敏度是相仿的。因此Phi-X174被用作生物放照量物。还可以清楚地看到，由于有效的混合方法确保了微生物向辐照区域的迁移，间歇搅拌式设备中UV-C吸收液灭活率几乎是相同的。
实施例13：使用剂量测定和生物剂量测定用于搅拌间歇式反应器的优化。
[209]如在实施例6中描述的配备有堆叠式叶轮搅拌器(3个叶轮，可调整搅拌速度)的450ml间歇式反应器(7cm内径，3mm壁厚，13cm高)，用两个低压水银灯从侧面照射，每个灯安装在两个同心石英管的封套内，并且在后面配备有不锈钢反射镜。来自恒温器的冷却水经由辐照灯封套泵出，以保持灯温和UV-C输出常量。
[210]将搅拌速度调节至每分钟转60(rpm)(慢搅拌)、150rpm(中快搅拌)和240rpm(快搅拌)。按照如在实施例11中描述的方法，测定用于辐照450ml吸光度和粘度匹配的样品溶液的UV剂量率，该样品溶液用于掺入噬菌体的凝血酶原复合物(prothrombin complex)洗脱液(a253.7＝8.0/cm，η＝1.15cp，0,1M硼酸盐缓冲液中含有27.83mM KI，4.64mM KIO3，1.3g PVP K90/L，pH＝9.25)。研究发现，比在文献中给出(0.01M)的更高硼酸盐浓度(≥0.1M)会带来更高的灵敏度和更好的放射量测定溶液稳定性。辐照掺入噬菌体的凝血酶原复合物洗脱液，并且按照实施例12中描述的方法测定噬菌体灭活情况。作为附加参数，通过使用酰胺水解分析法(amidolytic assay)测量0、10、15、20、25、50、75和100mJ/cm2剂量的凝血因子X(FX)活性。结果是显示于表19中。
                              表19
搅拌速度 60rpm  150rpm  240rpm
 UV-C剂量率(剂量测定)((mJ/cm2)/min) 1.770  1.794  1.799
 Phi-X 174灭活率(生物剂量测定)(log10(pfu/mL))/(mJ/cm2) -0.277  -0.399  -0.460
灭活所需UV-C剂量5log10(pfu/mL) 18.05  12.53  10.87
FX灭活率(U FX/mL)/(mJ/cm2) -0.0054  -0.0048  -0.0051
20mJ/cm2时的FX灭活(％未受辐照) 88  88  89
[211]从该实验可见，通过样品溶液放射量测定和生物剂量测定，可以优化病毒灭活用间歇式光照灭活反应器，因为两种验证方法都给出了混合有效性的结果。也明显可以看出，在可能的对蛋白质溶液的最高搅拌速度(避免产生泡沫)下，就可以完成最快的微生物灭活。这样优化的好处是，通过最有效的混合，在靶剂量例如20mJ/cm2处的病毒灭活安全容限达到最高，或者能够将靶剂量降低为保存蛋白质的附加生物活性。
实施例14：用于使用化学剂量测定、生物剂量测定和辐照测量的凝血酶原复合物洗脱液分批辐照的验证和过程监控。
[212]如在实施例6中描述的30L病毒灭活用光照灭活反应器，其带有三个三桨叶叶轮且每个外桨叶边缘具有刮水片的堆叠式叶轮搅拌器，四周环绕着10盏水恒温的UV-C辐照灯(Philips TUV 55W HO)，安装在如在实施例18中描述的恒温器灯箱内，每个等都用Dr.Groebel UVC-SE辐射计传感器监控。使用辐射计传感器将每个辐照灯的辐照灯功率记录在图表记录器上，并且将首次使用的相对辐照灯功率归一化地设定为100％。
[213]将29.5L凝血酶原复合物洗脱液与来源于E.coli的Phi X-174溶菌液(～4×109pfu/mL)掺合。所得溶液吸光系数为a253.7＝6.0/cm。使用如在实施例11中描述的吸光度和粘度匹配的样品溶液，在病毒灭活进行试验之前，测定反应器剂量率，该样品溶液为在0.1M、pH＝9.25的硼酸缓冲溶液中含有20.87mM KI、3.48mM KIO3和1.304g PVP K90/L。在90rpm的搅拌速度下剂量率是1.3435(mJ/cm2)/min，并且辐照灯剂量率是第一次噬菌体辐照的98.5％。测定出用于靶剂量20mJ/cm2的辐照时间是14min，并且假定剂量率基本上恒定。为证实灯功率作为误差源的影响，第三次辐照采用28℃至24.5℃，使灯温较低，从而降低灯功率至大约最大功率的90％。按照实施例12中描述的方法，测定Phi-X174的灭活速率(基于假定剂量率恒定)，并且表示为(log(pfu/ml))/(mJ/cm2)。其结果显示于表20中。
                                  表20
  第1次辐照(＝100％)     第2次辐照     第3次辐照
辐照灯功率   100％     101.4％     89.3％
Phi-X 174灭活率(未校正)   -0.4272     -0.4331     -0.3742
Phi-X 174灭活率，校正灯功率   -0.4272     -0.4275     -0.4190
[214]由上表可见，灯功率是一个间歇辐照过程参数，并且要将剂量测定的剂量率和生物剂量测定的灭活率两者都归一化为灯功率。
实施例15：基于由剂量测定和辐照测定得到的辐照测量靶剂量对蛋白质溶液间歇辐照的过程设计。
[215]按照实施例6中描述的450ml光照灭活反应器用于验证剂量率和辐照时间，辐照样品溶液的吸光系数是6.0/cm、7.0/cm、8.0/cm、9.0/cm和10.0/cm。200rpm下搅拌450ml体积的样品。打开辐照灯，并且通过在3、6、9、12、15、18、21和24min时抽样样品溶液的测量而测定剂量率。通过连接到电脑上的双头辐射计监控并记录照明强度。
[216]图10显示，开灯3分钟后照明强度达到最大值，并且使用的剂量在第一个3分钟期间低于接下来的3分钟时段内使用的基本上恒定的剂量增量。图11显示了随着Y轴表示的误差恒定在零以下而相应的剂量增量。因此，将剂量率公式的Y轴常量加上靶剂量(20mJ/cm2)，得到校正的增加的靶剂量，通过增加的靶剂量除以剂量率而计算出辐照时间，并且计算在辐照时间内测量出的1秒间隔内的辐照强度(mW/cm2)总和，得到随吸光系数的靶辐照灯剂量(mJ/cm2)。其结果显示于表21中。可以计算出常量k2：
Q＝k2×a
                              表21
吸光系数a253.7 6.0/cm  7.0/cm  8.0/cm  9.0/cm  10.0/cm
靶辐照灯剂量Q(mJ/cm2) 11879  13674  16038  18660  21102
常量k2(平均值＝2024) 1980  1953  2004  2073  2110
[217]从上表可见，辐照测量的靶辐照灯剂量随着吸光系数以线性比(R2＝0.996)增加。
实施例16：用于抗坏血酸测定作为防止光变性保护剂的UV-C吸收效果的剂量测定补偿。
[218]在FEIBA DEAE葡聚糖凝胶G50洗脱物(18.2mg蛋白质/ml)中、添加抗坏血酸钠至浓度1mmol/L。添加抗坏血酸的FEIBA洗脱液的a253.7处吸光系数是16/cm，而未添加抗坏血酸的洗脱液为7.3/cm。
[219]对于化学剂量测定，制备出在0.1M、pH＝9.25的硼酸盐缓冲液中含有0.0254M KI、0.0042M KIO3和1.61g PVP K90/L的样品溶液(a253.7＝7.3cm)，以及在0.1M、pH＝9.25硼酸盐缓冲液中含有0.06M KI、0.01M KIO3和1.61g PVP K90/L的样品溶液(a253.7＝16/cm)，用0.2mm薄层比色杯记录校准曲线，并且在有1盏辐照灯(a253.7＝7.3/cm，剂量率1.41(mJ/cm2)/min)和2盏辐照灯(a253.7＝16/cm，剂量率1.33(mJ/cm2)/min)的如实施例11中描述的间歇光照灭活反应器中辐照110ml样品溶液。将110ml未添加抗坏血酸的FEIBA洗脱液和添加抗坏血酸的FEIBA洗脱液都进行各个剂量率的辐照，并且在5；10；15；20；25；30和35mJ/cm2处抽出样品。按照实施例13的方法测定凝血因子X(FX)活性。结果是显示于表22中。
                           表22
 UV剂量(mJ/cm2)  FX活性(％未辐照)  FX活性(％未辐照)
 FEIBA无添加  FEIBA+1mM抗坏血酸钠
 0(未辐照)  100  100
 5  94  101
 10  95  93
 15  86  98
 20  89  91
 25  84  85
 30  85  89
 35  84  88
 FX灭活率(U/(mJ/cm2))  -0.0045(R2＝0.7886)  -0.0043(R2＝0.7727)
[220]从上表可见，在未添加抗坏血酸和添加抗坏血酸的FEIBA洗脱液之间FX灭活速率(UFX/(mJ/cm2))没有相关差异。因此，本身为高度UV-C吸收的抗坏血酸未发挥对FX蛋白质的光保护作用。这就表明，这样的因添加物而增加的UV-C吸光度可以容易地通过所述吸光度匹配的化学剂量测定得到补偿。
实施例17：用灯强度和量子产额稳定化的以及曝光时间受控制的校准器校准辐照剂量溶液。
[221]对于薄层比色杯中辐照剂量溶液可再现和精确的曝光量，将开槽于水恒温夹套的比色杯安装到单镜头反射式照相机门枢背板上，并且在此背板内铣出一个窗口，以便透过照相机快门曝光比色杯。照相机镜头卡口安装在水恒温的石英玻璃夹套内含有低压水银蒸汽灯的灯罩法兰上。
[222]用外循环水自动调温器控制辐照灯恒温温度，在最大UV-C输出点操作辐照灯。比色杯槽温度设定在Rahn(1997)限定的所给碘化物/碘酸盐光度计量子产额范围内，并且用外循环水低温保持器控制。该照相机快门设定为1秒曝光时间，并且使用连接到电脑声卡扩音器塞子上的光电二极管，测定快门精度。结果发现快门维持1.000±0.002s的正常曝光时间。
[223]对于比色杯入射窗的有效辐照度测定，将吸收完全所有入射光的0.6M碘化物/0.1M碘酸盐的感光计溶液(Rahn 1997)装入0.2mm的比色杯中，在自动调温器比色杯槽内递增曝光1、2和3s，以确保基本上恒定的量子产额。在曝光以前，将分光光度计352nm处的吸光度设定为零，并且在每次曝光步骤以后，在分光光度计上测量352nm的吸光度增加值。从吸光度增量、三碘化物浓度、从随温度而变的量子产额、入射光子的数量，以及从光电能量和比色杯横截面积，计算出辐照度E。因此这样就能由曝光时间t(秒)时的吸光度增量Dabs、比色杯表面A(cm2)和比色杯体积V(L)、光程长度d处的消光系数e(264.5相应于0.01cm)、能量W/einstein(在253.7nm处)＝471528J、以及21℃时＝0.7545的量子产额Φ(Rahn1997)，根据公式E＝(Δabs×V×W×1000)/(e×A×Φ×t)，计算出E(mW/cm2)。因此，在1s曝光时间后，0.0392的吸光度增量对应于0.9262mW/cm2的辐照度，在累积2s以后，0.0781的累积吸光度增量对应于0.9227mW/cm2，并且在3s以后，0.1170的累积吸光度增量对应于0.9215mW/cm2。平均辐照度是0.9235mW/cm2，而标准偏差是0.0020mW/cm2，表明通过电子控制快门的校准，曝光量非常精确。
[224]将相当于UV-C吸光度a253.7＝6.5/cm并且粘度1.16cp的辐照剂量溶液装入0.2mm比色杯，并且曝光由3s增加到75s。每次曝光量增加之后，以未受辐照溶液作为空白对照读出吸光度增量。得到的校准曲线与二阶方程相关，367nm处吸光度取决于曝光量积分通量H。
其结果显示于表23中。
吸光度(367nm，0.2mm)＝A×H2+B×H+C
         表23
系数
A  -0.0000257179
B  0.0074523297
C  0.0006009852
相关性
R2  0.999986
[225]相关系数R2接近于1，显示出通过电子控制快门的方法记录的校准曲线之精确。该二阶方程具有另外的优点，即对于吸收值测定例如如同在实施例18中描述的剂量率测量，可以容易地计算出差不多符合此公式的溶液。校准曲线也可以分割，并且可以计算每个部分的二阶方程，以得到尽可能接近于1的相关系数R2。这种校准器实施例如图12所示。
实施例18：可用在实施例2、4-6、13和14中描述的反应器中的紫外灯温度稳定性
[226]将Philips TUV55 HO辐照灯(55W，直径28mm，长900mm)安装在具有不锈钢室(1)的辐照灯箱(图13)内，灯箱内含有三个同心恒温封套石英玻璃筒(3)中的辐照灯(2)，使得恒温水流入在石英玻璃套筒(3)和不锈钢壁(1)间的空隙。每个辐照灯都由Dr.GroebelUVC-SE辐射计传感器(4)监控，由PT100探针(5)测量温度。不锈钢室正视图上有石英玻璃窗，穿过该窗将UV-C灯光辐照到反应容器上。石英管内径为30mm并且壁厚为3mm。水以6L/min的流量从循环低温恒温器泵出。温度从15℃增加到30℃，并且每上升大约0.50℃间隔，测量一次光强度。其结果显示于表24中。
                           表24
 T(℃)  E(mW/cm2)  T(℃)  E(mW/cm2)  T(℃)  E(mW/cm2)
 15.1  6.585  20.2  7.235  25.6  7.470
 15.6  6.675  20.6  7.275  26.1  7.435
 16.1  6.755  21.1  7.295  26.6  7.455
 16.6  6.795  21.6  7.345  27.1  7.465
 17.1  6.905  22.1  7.385  27.6  7.450
 17.6  6.955  22.6  7.400  28.1  7.450
 18.1  7.045  23.1  7.420  28.6  7.435
 18.6  7.075  23.6  7.425  29.1  7.405
 19.1  7.120  24.1  7.435  29.6  7.390
 19.6  7.175  25.1  7.405  30  7.370
[227]在27℃时达到最大光强度，该温度作为温和的温度不会过度加热产品，与冷却水温度必须在大约40℃的直接恒温相反。通过增加在辐照灯表面和恒温封套内管之间的空隙和水流量，在保证最大辐照灯UV-C强度方面，甚至更低的温度也可以有效果。在这样一种自动调温辐照灯周围，或者紧接其后，可以操作每个类型的流通式反应器或者间歇式反应器，而没有因加热、特别是过热而损害产品的危险。
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[276]在此引用的所有参考文献，包括所有公开的内容以及所有美国和国外专利及专利申请在内，都已具体并完全地引入本发明作为参考。说明书和实施例的意图应认为仅具有示范性，本发明的真正保护范围和精神通过权利要求书的记载予以表明。

Claims (47)

1.一种用于确定从一个或多个光源发出的单色或多色光灭活生物液体中微生物的有效剂量的方法，包括测量所述单色或多色光对于剂量测定溶液的影响，其中所述灭活在流通式反应器中进行。
2.如权利要求1所述的方法，包括测量在所用光灭活波长下单色或多色光对于与生物液体的吸光度、或与生物液体的吸光度和粘度相匹配的剂量测定溶液的影响，上述测量是基于采用下述步骤i)和ii)的光辐照剂量校正完成的：i)对薄层内的剂量测定溶液进行辐照以施加一能够导致可测量的物理量或化学量发生变化的规定通量(光辐照剂量)，所述薄层的光程长度薄到在规定时间内只能吸收预定辐照度的入射光部分，ii)在对光辐照反应器中剂量测定溶液辐照期间或之后，读取与这些测到的量的变化相应的辐照剂量，其中步骤i)可以在步骤ii)之前进行，反之亦然。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，沿着所述光程长度，100％或以下的所述入射光被吸收。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，沿着所述光程长度，50％或以下的所述入射光被吸收。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述规定通量可以通过改变规定辐照度和/或通过改变规定时间来改变，所述规定时间由流通式反应器中生物液体的流速确定。
6.如权利要求1所述的方法，进一步包括，在对辐照之前或期间、或者之前及期间掺合了存活微生物的生物液体进行辐照之前和之后，或者之前、期间和之后，通过滴定所述存活微生物的数量来确定剂量分布。
7.如权利要求1所述的方法，进一步包括在辐照过程中对一个或多个光源的强度进行监测，以确定辐照剂量。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光在紫外区。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，剂量测定溶液包含从下列中选取的试剂或试剂组合：碘化碱金属盐、碘化碱土金属盐、碘化铵、尿苷磷酸水溶液、苯甲酸碱金属盐、苯甲酸碱土金属盐、苯甲酸铵、过二硫酸碱金属盐、过二硫酸碱土金属盐、过二硫酸铵、叔丁醇、聚乙烯吡咯烷酮、膨润土、云母、蒙脱石、囊脱石、锂荣脱石、高岭石、多水高岭石、地开石、粘土矿物、白垩、硅石、煅制二氧化硅、重晶石、石膏、滑石、氧化镁、氧化铝、氯氧化铋、氧化锌、硫酸碱土金属盐、碳酸碱土金属盐、磷酸碱土金属盐、羟基磷酸碱土金属盐、卤代磷酸碱土金属盐、不溶性硅酸盐、不溶性硅酸铝盐、不溶性碳酸盐、不溶性硫酸盐、不溶性磷酸盐、不溶性羟基磷酸盐、卤代磷酸盐、全氟烃或其衍生物、全氟羧酸或其盐、以及聚乙烯聚吡咯烷酮。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述剂量测定溶液包含稀释的碘化钾-碘酸钾感光计。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述剂量测定溶液包含稀释的碘化钾-碘酸钾/聚乙烯吡咯烷酮感光计。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述剂量测定溶液包含稀释的苯甲酸钠感光计。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述剂量测定溶液包含稀释的过二硫酸钾/叔丁醇感光计。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物选自下述种构成的组：原核生物界种、原核生物界种的孢子、真菌界种、真菌界种的孢子、原核细胞、真核细胞以及病毒。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒选自下述构成的组：微小病毒、微小鼠病毒、犬微小病毒、牛微小病毒、猪微小病毒、猫微小病毒、环形病毒、圆环形病毒、微小RNA病毒、噬肝性病毒甲型肝炎病毒、以及脑脊髓炎病毒、阿内罗病毒、肠道RNA病毒、微小病毒DNA噬菌体，以及光滑病毒RNA噬菌体。
16.如权利要求1所述的方法，是与至少一种其他灭菌和/或微生物灭活方法联合使用。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物液体包含至少一种添加剂，以减少对生物液体生物活性的破坏和/或丧失。
18.如权利要求1所述的方法，是与用液体去垢剂处理同时进行。
19.如权利要求6所述的方法，其特征在于，用以灭活生物液体中微生物的光的有效剂量是指灭活生物液体中至少99.9％的存活微生物的剂量。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物液体选自如下液体构成的组：乳、乳清、乳制品、来源于乳的制品、果汁、来源于果汁的制品、蔬菜汁、来源于蔬菜的制品、原生植物汁、转基因植物汁、配制饮料、加工饮料、发酵饮料、酒精饮料、血液、血浆、血浆组分、血清、来自于血液的液体、来自于血清的液体、来自于血浆的液体、包含蛋白组分的液体、脊髓液、脑液、淋巴液、唾液、精液、尿液、原核细胞培养上清、真核细胞培养上清、原核细胞裂解液、真核细胞裂解液、外用治疗性液体、经肠道治疗性液体、非肠道治疗性液体、外用美容液体、诊断用液体。
21.一种用于确定从一个或多个光源发出的单色或多色光用以灭活非透明生物液体中微生物的有效剂量的方法，包括测量在所用光灭活波长下单色或多色光对于与生物溶液的浊度、与生物溶液的浊度和吸光度、与生物溶液的浊度和粘度、与生物溶液的浊度和吸光度以及粘度、与生物溶液的吸光度、或与生物溶液的粘度和吸光度相匹配的剂量测定溶液的影响，上述测量是基于采用下述步骤i)和ii)的光辐照剂量校正完成的：i)对薄层内的剂量测定溶液进行辐照以施加一能够导致可测量的物理量或化学量发生变化的规定通量(光辐照剂量)，所述薄层的光程长度薄到在规定时间内只能吸收预定辐照度的入射光部分，ii)在对光辐照反应器中剂量测定溶液辐照期间或之后，读取与这些测到的量的变化相应的辐照剂量，其中步骤i)可以在步骤ii)之前进行，反之亦然。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，沿着所述光程长度，100％或以下的所述入射光被吸收。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，沿着所述光程长度，50％或以下的入射光被吸收。
24.如权利要求21所述的方法，其特征在于，在流通式反应器中对所述生物液体进行灭活，所述规定通量可以通过改变规定辐照度和/或通过改变规定时间来改变，所述规定时间由流通式反应器中生物液体的流速确定。
25.如权利要求21所述的方法，进一步包括，在对辐照之前或期间、或者之前及期间掺合了存活微生物的生物液体进行辐照之前和之后，或者之前、期间和之后，通过滴定所述存活微生物的数量来确定剂量分布。
26.如权利要求21所述的方法，进一步包括在辐照过程中对一个或多个光源的强度进行监测，以确定辐照剂量。
27.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述光在紫外区。
28.如权利要求21所述的方法，其特征在于，剂量测定溶液包含从下列中选取的试剂或试剂组合：碘化碱金属盐、碘化碱土金属盐、碘化铵、尿苷磷酸水溶液、苯甲酸碱金属盐、苯甲酸碱土金属盐、苯甲酸铵、过二硫酸碱金属盐、过二硫酸碱土金属盐、过二硫酸铵、叔丁醇、聚乙烯吡咯烷酮、膨润土、云母、蒙脱石、囊脱石、锂荣脱石、高岭石、多水高岭石、地开石、粘土矿物、白垩、硅石、煅制二氧化硅、重晶石、石膏、滑石、氧化镁、氧化铝、氯氧化铋、氧化锌、硫酸碱土金属盐、碳酸碱土金属盐、磷酸碱土金属盐、羟基磷酸碱土金属盐、卤代磷酸碱土金属盐、不溶性硅酸盐、不溶性硅酸铝盐、不溶性碳酸盐、不溶性硫酸盐、不溶性磷酸盐、不溶性羟基磷酸盐、卤代磷酸盐、全氟烃或其衍生物、全氟羧酸或其盐、以及聚乙烯聚吡咯烷酮。
29.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述剂量测定溶液包含稀释的碘化钾-碘酸钾感光计。
30.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述剂量测定溶液包含稀释的碘化钾-碘酸钾/聚乙烯吡咯烷酮感光计。
31.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述剂量测定溶液包含稀释的苯甲酸钠感光计。
32.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述剂量测定溶液包含稀释的过二硫酸钾/叔丁醇感光计。
33.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述剂量测定溶液包含导致混浊的试剂。
34.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述微生物选自下述种构成的组：原核生物界种、原核生物界种的孢子、真菌界种、真菌界种的孢子、原核细胞、真核细胞以及病毒。
35.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述病毒选自下述构成的组：微小病毒、微小鼠病毒、犬微小病毒、牛微小病毒、猪微小病毒、猫微小病毒、环形病毒、圆环形病毒、微小RNA病毒、噬肝性病毒甲型肝炎病毒、以及脑脊髓炎病毒、阿内罗病毒、肠道RNA病毒、微小病毒DNA噬菌体，以及光滑病毒RNA噬菌体。
36.如权利要求21所述的方法，是与至少一种其他灭菌或微生物灭活方法联合使用。
37.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述生物液体包含至少一种添加剂，以减少对生物液体生物活性的破坏和/或丧失。
38.如权利要求21所述的方法，是与用液体去垢剂处理同时进行。
39.如权利要求25所述的方法，其特征在于，用以灭活生物液体中微生物的光的有效剂量是指灭活生物液体中至少99.9％的存活微生物的剂量。
40.如权利要求21所述的方法，其特征在于，在流通式反应器中对所述生物液体进行灭活。
41.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述生物液体选自如下液体构成的组：乳、乳清、乳制品、来源于乳的制品、果汁、来源于果汁的制品、蔬菜汁、来源于蔬菜的制品、原生植物汁、转基因植物汁、配制饮料、加工饮料、发酵饮料、酒精饮料、血液、血浆、血浆组分、血清、来自于血液的液体、来自于血清的液体、来自于血浆的液体、包含蛋白组分的液体、脊髓液、脑液、淋巴液、唾液、精液、尿液、原核细胞培养上清、真核细胞培养上清、原核细胞裂解液、真核细胞裂解液、外用治疗性液体、经肠道治疗性液体、非肠道治疗性液体、外用美容液体、诊断用液体。
42.一种紫外光灭活流通式反应器，其中一个或者多个光源被封套恒温器包裹，恒温并基本透明的液体流过所述封套恒温器以移去来自辐照灯的热量，从而保证几乎不变的灯光强度。
43.如权利要求42所述的流通式反应器，其特征在于，所述流通式反应器选自下述类型构成的组：重力驱动的产薄膜型、涡流主动混合流型、离心驱动的产薄膜型、盘管型、挡板管状型、静止混合管状型、涡流静止性混合流管型、层叠管型、涡流管型。
44.一种通过控制发自单个或多个光源的单色或多色光的光辐照总剂量以有效灭活间歇式反应器中存在于生物液体中的微生物的方法，包括如下步骤：
a)基于灭活生物液体中的微生物时的单色或者多色光的有效辐照剂量，确定取决于吸收的辐照源靶光辐照总剂量、在间歇式反应器中有效灭活微生物所需要的光辐照剂量速率和辐照时间；
b)在灭活间歇式反应器中生物液体中的微生物期间，记录光辐照剂量速率和辐照时间；
c)基于步骤b)的测量计算取决于吸收的辐照源光辐照总剂量；
d)将步骤c)中测得的取决于吸收的辐照源光辐照总剂量与步骤a)中得到的取决于吸收的辐照源靶光辐照总剂量进行比较；和
e)一旦取决于吸收的辐照源光辐照总剂量等于或大于取决于吸收的辐照源靶光辐照总剂量，则中断对生物液体进行曝光。
45.如权利要求44所述的控制取决于吸收的辐照源靶光辐照总剂量的方法，其特征在于，继续进行所述方法，直到取决于吸收的辐照源光总剂量基本上等于取决于吸收的辐照源靶光总剂量，而不管辐照光剂量速率的变化和/或中间至少一个或者多个光源突然关闭。
46.如权利要求44所述的方法，其特征在于，通过测量所述单色或多色光对于剂量测定溶液的影响来确定有效剂量，包括测量在所用光灭活波长下单色或多色光对于与生物溶液的浊度、与生物溶液的浊度和吸光度、与生物溶液的浊度和粘度、与生物溶液的浊度和吸光度以及粘度、与生物溶液的吸光度、或与生物溶液的吸光度和粘度相匹配的剂量测定溶液的影响，上述测量是基于采用下述步骤i)和ii)的光辐照剂量校正完成的：i)对薄层内的剂量测定溶液进行辐照以施加一能够导致可测量的物理量或化学量发生变化的规定通量(光辐照剂量)，所述薄层的光程长度薄到在规定时间内只能吸收预定辐照度的入射光部分，ii)在对光辐照反应器中剂量测定溶液辐照期间或之后，读取与这些测到的量的变化相应的辐照剂量，其中步骤i)可以在步骤ii)之前进行，反之亦然。
47.如权利要求44所述的方法，其特征在于，使用至少一种电子辐射计、至少一种图表记录器和/或至少一种计数器来记录所述辐照光剂量速率和所述辐照时间。
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