KR102286411B1 - 연속 유동 시스템에서 좁은 체류 시간 분포를 유지하기 위한 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특히 단백질 정제 공정과 같은 바이러스 비활성화에 특히 적용 가능한, 연속 유동 시스템에서 좁은 체류 시간 분포를 유지하는 방법에 관한 것이다. 유체 샘플이 축 방향 유동 채널 내로 도입되어 개별 패킷들 또는 영역들에서 유동하도록 되어 체류 시간 분포 및 축 방향 분산을 최소화한다. 본 출원에 기술된 실시예는 단백질 정제 공정 동안 바이러스 비활성화를 수행하기 위해 대형 탱크 또는 저장소를 사용할 필요성을 제거하거나 최소화하고; 바이러스 비활성화에 필요한 전체 시간의 단축, 및/또는 단백질 정제 과정 동안 바이러스 비활성화 작업을 수행하는 데 필요한 전체 물리적 공간을 감소시키며, 이는 정제 프로세스의 전체 설치 공간을 감소시킨다.

Description

연속 유동 시스템에서 좁은 체류 시간 분포를 유지하기 위한 방법

본 출원은 2017년 5월 11일자로 출원된 미국 가출원 제62/504,631호의 우선권을 주장하며, 그 개시 내용은 전체적으로 본 출원에 참고로 포함된다.

치료 단백질, 특히 모노클로널 항체의 정제와 관련된 대규모 생산 및 경제학은 바이오 제약 산업에서 점점 더 중요한 문제로 되고 있다. 치료 단백질은 일반적으로 관심 단백질을 생성하도록 가공된 포유동물 세포 또는 박테리아 세포에서 생성된다. 그러나 일단 생성되면, 관심 단백질은 숙주 세포 단백질(HCP), 내독소, 바이러스, DNA 등과 같은 각종 불순물들로부터 분리될 필요가 있다.

전형적인 정제 공정에서, 세포 배양 수확물은 세포 잔해 제거를 위한 정화 단계가 적용된다. 이어서, 관심 단백질을 함유하는 정화된 세포 배양 수확물을 하나 이상의 크로마토그래피 단계들로 처리하며, 이는 친화성 크로마토그래피 단계 또는 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있다. 치료 후보의 바이러스 안전성을 보장하고 또한 규제 명령을 준수하기 위해, 바이러스 제거 유닛 동작이 정제 공정으로 구현된다.

이러한 단계들은 단백질 A 및 이온 교환 크로마토그래피, 여과 및 낮은 pH/화학적 비활성화를 포함한다. 바이러스 비활성화는 전형적으로 크로마토그래피 단계 후(예를 들어, 친화성 크로마토그래피 후 또는 양이온 교환 크로마토그래피 후) 수행된다. 전형적인 대규모 정제 공정에서, 관심 단백질을 함유하는 크로마토그래피 용리 풀(elution pool)은 대형 탱크 또는 저장소에 수집되고 혼합과 함께 오랜 시간 동안 바이러스 비활성화 단계/공정 처리되는데, 이는 용리 풀에 존재할 수 있는 바이러스의 완전한 비활성화를 달성하기 위해 수 시간 내지 하루 또는 그보다 긴 시간이 소요될 수 있다.

예를 들어, 모노클로널 항체(mAb) 처리에 있어서, 독립적인 단위 동작의 순서는 일괄 모드(batch mode)로 수행되는데, 이때 보유 탱크는 단위 동작들 사이에 물질을 저장하고 단계들 사이에 임의의 필요한 용액 조정을 용이하게 하기 위해 사용된다.

일반적으로, 물질은 목표 비활성화 조건을 달성하도록 물질이 조정되는 하나의 탱크 내에 수집된다. 이는 낮은 pH 목표 레벨을 달성하기 위해 산을 첨가하거나 또는 세제-기반 비활성화 공정에서 세제를 첨가하는 것일 수 있다. 다음에, 재료는 제2 탱크로 옮겨져서 지정된 배양 시간동안 비활성화 상태로 유지된다. 이송의 목적은 목표 비활성화 조건에 도달하지 않았을 수 있고 바이러스 입자를 함유할 수 있는 제1 탱크의 벽에 있는 물방울의 위험을 제거하는 것이다. 물질을 다른 탱크로 옮김으로써, 이 위험은 감소된다.

단백질 용액을 임의의 온도, pH 또는 방사선에 노출시키거나, 세제 및/또는 염과 같은 임의의 화학 제제에 노출시키는 것을 포함하여 몇몇 바이러스 비활성화 기술이 당 업계에 공지되어 있다. 하나의 바이러스 비활성화 공정은, 물질이 낮은 pH 및/또는 60분 동안 세제에 대한 노출과 같은 비활성화 상태로 유지되는 대형 보유 탱크를 수반한다. 이 정적 홀드 단계는 연속 처리를 향한 움직임에서의 병목 현상이다.

그러나, 바이러스 사멸 동역학은 비활성화 시간이 60분보다 상당히 짧을 수 있다는 것을 나타내는데, 이는 처리 시간이 현저히 단축될 수 있고, 바이러스 비활성화를 위한 정적 홀드 탱크가 제거될 수 있으며, 또한 그 방법이 보다 연속적 처리 및/또는 흐름 비활성화를 더욱 가능하게할 수 있음을 제시한다..

최근에, 단위 동작들이 서로 연결되고 수동 솔루션 조정이 최소화되는 연속적인 프로세스를 갖도록 하는 요망사항이 존재하고 있다. 이를 용이하게 하기 위해 인라인 바이러스 비활성화는 물론 다른 인라인 솔루션 조정을 가능하게 하는 인라인 처리 방법을 개발하기 위한 노력이 진행되고 있다. 연속 처리에서의 문제는 지점 A에서 지점 B로 유체를 효율적으로 이동시키는 것이다. 예를 들어 튜브의 길이를 통한 유체의 플러그 흐름 이동이 있다. mAb 처리와 관련된 흐름은 일반적으로 층류 지침(2100 미만의 레이놀즈 수) 내에 들어간다. 이 지침에서, 분자는 방사형 확산으로 인해 분산되고, 결과적으로 용질 펄스는 유동 방향을 따라 축 방향으로 분산한다.

이것은 테일러 분산액으로 알려져 있으며, 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. 층류(laminar flow)에 대한 포이쉴리 흐름(Poiseuille flow)은 포물선 속도 프로파일로 이어진다. 펄스의 리딩 및 트레일링 단부들은 샤프한 인터페이스로 시작하나 유체의 층류로 인해 형상이 포물선 모양으로 된다. 축 방향 확산이 시간의 경과에 따라 계속되며, 분자는 튜브의 길이를 따라 더욱 분산된다. 축 방향 분산의 의미는 도 2에 도시된 바와 같이 튜브 출구에서 마커 종(marker species)들의 펄스 주입에 대해 얻어진 결과적인 농도 프로파일에서 관찰된다. 상기 농도 프로파일은 마커 종의 체류 시간의 광범위한 분포를 반영한다.

이러한 가변적인 다양한 체류 시간은 모든 유체가 바이러스 비활성화 환경에서 충분한 체류 시간을 가졌는지에 대한 불확실성으로 되거나 또는 분자가 예상보다 빨리 빠져나가지 않도록 하기 위해 시스템의 크기를 크게 하는 것을 초래할 수도 있다. 바이러스 비활성화를 위해 충분히 긴 체류 시간을 보장한 결과로서, 단백질(생성물)은 과도하게 긴 체류 시간 동안 비활성화 상태에 노출되며, 이는 잠재적 열화 및 응집과 같은 바람직하지 않은 결과를 갖는다.

연속 또는 반(semi) 연속 유동 시스템에서, 좁은 체류 시간 분포를 유지하는 방법을 제공하는 것이 바람직할 것이다.

또한, 생체 분자 정제, 특히 단백질 정제를 위한 연속 또는 반 연속 유동 시스템을 제공하는 것이 바람직할 것이다.

본 출원에 개시된 실시예들은, 특히 단백질 정제 공정과 같은 바이러스 비활성화에 특히 적용 가능한, 연속 유동 시스템에서 좁은 체류 시간 분포를 유지하는 방법을 제공한다.

본 출원에 기술된 실시예들은 단백질 정제 공정 동안 바이러스 비활성화를 수행하기 위해 대형 탱크 또는 저장소를 사용할 필요성을 없애거나 최소화하고, 바이러스 비활성화에 필요한 전체 시간을 감소시키고, 및/또는 단백질 정제 공정 동안 바이러스 비활성화 작업을 수행하는 데 필요한 전체 물리적 공간을 감소시키며, 이는 요컨대 정제 공정의 전체 점유공간(footprint)을 감소시킨다.

또한, 이것은 모든 분자가 연장 유지를 최소화하면서 비활성화 보장을 위한 어떤 안전 계수를 제공하는 최소 체류 시간으로 되었다는 확실성을 증가시킨다.

어떤 실시 예에서, 정제 공정에서 샘플에 존재할 수 있는 하나 이상의 바이러스들을 비활성화하는 방법이 제공되며, 이 방법은 유체가 튜브와 같은 유동 채널의 축 방향으로 흐를 때 유체를 개별 영역들 또는 패킷들로 분리함으로써 연속 유동 시스템에 있어서 좁은 체류 분포를 유지하는 단계를 포함한다.

상기 유동 채널은 인큐베이션 챔버로서 기능할 수 있다.

이는 유체의 모든 종들(species)에 대해 유동 채널에서 충분한 체류 시간을 허용하며, 이는 다시 말해 유체가 유동 채널에서 흐르고 하나 이상의 바이러스 비활성 제제와 혼합될 때 바이러스가 비활성화되도록 한다. 유동 채널은 다양한 물질과 형상으로 제조될 수 있고, 이는 원형 플라스틱 튜브 및 두 개의 플라스틱 시트를 패턴으로 함께 용착하여 채널을 생성하여 형성되는 "Smart FLEXWARE^®" 거대 유체 흐름 경로 어셈블리를 포함하며, 밀리포어시그마(MilliporeSigma)로부터 상업적으로 입수할 수 있다(미국 특허 제9,181,942 B2, 미국 특허 제9,051,929 B2).

어떤 실시 예에서, 인큐베이션 챔버, 유동 채널 또는 튜브는 체류 시간 분포를 좁게 하거나 감소시키는 효율적인 방사상 혼합 및 최소 축방향 혼합을 제공하도록 구성되며, 챔버 또는 튜브의 부피는 압력 및 온도로 인해 변동되지 않는다.

어떤 실시 예에서, 인큐베이션 챔버, 유동 채널 또는 튜브는 일회용 챔버 또는 튜브이며 살균 가능하다.

어떤 실시 예에서, 표적(target, 타겟) 분자를 함유하는 유체 샘플 (예를 들어, 항체 또는 단백질을 함유하는 Fc 영역)에 존재할 수 있는 하나 이상의 바이러스를 비활성화시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은, 용리 액을 얻기 위해 유체 샘플을 단백질 A 친화성 크로마토그래피 공정 또는 이온 교환 크로마토그래피 공정 처리하는 단계; 유동 채널에서 용리액과 하나 이상의 바이러스 비활성화제 제제들을 혼합하기 위해 용리액을 축방향 유동 채널로 연속적으로 도입하는 단계; 및 용리 액이 바이러스를 비활성화시키기에 충분한 시간 동안 개별 패킷들에 있어서 축방향 유동 채널에서 유동하도록 하는 단계를 포함한다.

어떤 실시 예에서, 크로마토그래피 공정은 연속적 모드로 수행된다. 친화성 크로마토그래피 공정으로부터의 용리액은 pH, 전도도, 농도 등의 모든 구배를 갖는 시스템으로 들어가는 칼럼으로부터의 실시간 용리일 수 있거나, 또는 이후 균질화 후 비활성화되도록 처리되는 용리의 풀일 수 있다.

어떤 실시 예에서, 인라인 인큐베이션 챔버, 유동 채널 또는 튜브는, 보유 풀 또는 탱크가 챔버, 채널 또는 튜브의 직 상류, 하류 또는 둘 다에 위치하는 공정에서 구현될 수 있다.

어떤 실시 예에서, 인라인 인큐베이션 챔버, 유동 채널 또는 튜브는, 챔버, 채널 또는 튜브가 2개의 단위 동작들, 예컨대 상류 단백질 A 크로마토그래피 동작 및 하류 양이온 교환 동작을 직접 연결하는 공정에서 구현될 수 있다.

도 1은 채널에서의 유체 흐름의 개략도이다.
도 2는 종래 기술에 따른, 채널에서 마커 종의 펄스 입력(단계 변화에 접근하는 플러그의 각 단부에서 농도 프로파일을 갖는 마커 종들의 균질한 플러그를 생성하기 위해 신속하게 메인 스트림으로 주입되는 마커 종들의 유한 부피)으로부터 비롯되는 농도 프로파일의 도면이다;
도 3은 각종 유동 채널들에 대한 UV 흡수 대 시간의 그래프이다.
도 4는 각종 유동 채널들에 대한 UV 흡수 대 부피의 그래프이다.
도 5는 정적의 낮은 pH 비활성화 실험들 및 인라인 비활성화에 대한 Phi6 비활성화 데이터의 도면이다.
도 6은 정적의 낮은 pH 비활성화 실험들에 대한 XMuLV 비활성화 데이터 대 시간의 도면이다.
도 7은 정적 세제 비활성화 실험에 대한 Phi6 비활성화 데이터 대 시간의 도면이다.
도 8은 마커 종들의 상이한 주입 부피들에 대한 UV 흡수 대 시간의 도면이다.
도 9는 인라인 시스템을 통한 펄스 주입을 위한 시간의 함수로서 Phi6 역가의 도면이다.
도 10은 2개의 상이한 용액들 사이의 단계 변화에 대한 UV 흡수 대 V/V50(최대 흡수의 50%에서 부피로 정형화된 부피)의 도면이다.
도 11은 어떤 실시 예에 따른 인라인 연속 비활성화 프로세스의 개략도이다.
도 12는 어떤 실시 예에 따른 유동 채널의 개략도이다.
도 13은 실시 예 6에 대한 실험 설정의 개략도이다.

용어 "인라인(in-line)" 또는 "인라인 동작"은 용기에 저장하지 않고 튜브 또는 어떤 다른 도관 또는 유동 채널을 통해 액체 샘플을 이동시키는 프로세스를 지칭한다. 용어 "바이러스 비활성화" 또는 "바이러스성(viral) 비활성화"는 하나 이상의 바이러스가 더 이상 복제할 수 없거나 비활성화되도록 하는 방식으로 하나 이상의 바이러스들을 함유하는 샘플의 처리를 지칭한다. 본 출원에 기재된 방법에 있어서, 용어 "바이러스" 및 "바이러스성"은 서로 호환적으로 사용될 수 있다. 바이러스 비활성화는 예를 들어 열, 자외선, 초음파 진동과 같은 물리적 수단에 의해 또는 예를 들어 pH 변화 또는 화학 물질 첨가(예를 들어, 세제)와 같은 화학적 수단에 의해 달성될 수 있다.

바이러스 비활성화는 전형적으로, 특히 포유동물 유래 발현 시스템으로부터 치료 단백질을 정제하는 경우에, 대부분의 포유동물 단백질 정제 공정 동안 사용되는 공정 단계이다. 본 출원에 기재된 방법에서, 바이러스 비활성화는 샘플이 개별 구역 또는 패킷에서 주행하도록 야기되는 유체 유동 채널에서 수행된다. 당 업계에 공지된 표준 분석법 및 본 출원에 기술된 것들을 사용하여 샘플에서 하나 이상의 바이러스를 검출하지 못하는 것은, 하나 이상의 바이러스 비활성화 제제로 샘플을 처리한 후 하나 이상의 바이러스가 완전히 비활성화되는 것을 나타내는 것으로 이해된다.

용어 "개별 영역(또는 구역)(discrete zone)" 또는 "패킷(packet)"은 개재된 배리어에 의해 인접하는 볼륨들로부터 분리된 개별적으로 한정된 볼륨을 지칭한다.

본 출원에 사용된 용어 "비혼합성 유체(immiscible fluid)"는 균일한 물질을 형성하기 위해 혼합될 수 있는 능력이 제한되거나 또는 유체들 사이의 개별적 경계를 형성하는 능력을 갖도록 불용성 또는 드물게 용해성으로 되는 유체들을 지칭한다.

본 출원에 기술된 방법에 사용되는 비혼합성 유체들은, 액체-기체, 고체-액체, 기체-고체 및 액체-액체 혼합물을 포함한다. 적절한 액체의 예로는 물 또는 완충 용액을 포함한다. 적합한 가스의 예로는 공기, 산소, 질소 및 아르곤을 포함한다. 적합한 고체의 예로는 금속 또는 플라스틱 구체를 포함한다.

용어 "바이러스 비활성화 제제" 또는 "바이러스 비활성화제" 또는 "바이러스 제거제"는 하나 이상의 바이러스를 비활성화시키거나 복제하는 것이 불가능한 임의의 물리적 또는 화학적 수단을 지칭한다.

본 출원에 기술된 방법에 사용된 바와 같이, 바이러스 비활성화 제제는, 용액 상태 변화(예를 들어, pH, 전도도, 온도, 등) 또는 세제, 염, 산(예를 들어, 3.6 또는 3.7의 pH를 달성하기 위한 몰 농도를 갖는 아세트산)의 첨가, 샘플에서 하나 이상의 바이러스들과 상호 작용하는, 중합체, 용매, 소 분자, 약물 분자 또는 임의의 다른 적합한 개체, 등 또는 이들의 임의의 조합, 또는 물리적 수단(예를 들어, UV 광에 대한 노출, 진동, 등)을 포함할 수 있으며, 이에 따라 하나 이상의 바이러스들이 비활성화되거나 또는 복제가 불가능하게 된다.

특정 실시 예에서, 바이러스 비활성화 제제는 pH 변화이며, 이때 상기 바이러스 비활성화 제제는, 샘플이 개별 영역들 또는 패킷들에서 흐르도록 야기되는 유동 채널에서 타겟 분자(예를 들어, 단백질 A 결합 및 용리 크로마토그래피 단계로부터의 용리액)를 함유하는 샘플과 혼합된다.

본 출원에 사용되는 용어 "연속 공정"은 타겟 분자를 정제하는 공정을 포함하며, 이는 중단없이, 하나의 공정 단계로부터의 출력이 상기 공정에서 다음 공정 단계로 직접 흐르도록 2개 이상의 공정 단계들(또는 단위 동작들)를 포함하고, 이때 상기 둘 이상의 공정 단계들은 그들의 지속 기간의 적어도 일부 동안 동시에 수행될 수 있다.

다시 말해서, 연속 공정의 경우에, 샘플의 일부가 항상 공정 단계들을 통해 이동하는 한, 다음 공정 단계가 시작되기 전에 공정 단계를 완료할 필요는 없다.

상기와 유사하게, "반 연속 프로세스(semi-continuous process)"는 하나 이상의 단위 동작들의 주기적 중단과 함께 설정된 시간 주기 동안 연속 모드에서 수행되는 동작을 포함할 수 있다. 예를 들어, 연속 포획 동작 중에 다른 속도 제한 단계들을 완료할 수 있도록 공급(feed)의 장전을 중지하는 것이다.

단백질 정제를 위한 통상적인 방법은, 전형적으로 세포 배양 방법들을 수반하는 데, 이는 예를 들어, 관심 단백질(예를 들어, 모노클로널 항체)을 생성하도록 재조합으로 조작된 포유동물 또는 박테리아 세포주를 사용한 후 세포 배양 브로스(broth)로부터 세포 및 세포 잔해를 제거하기 위해 세포 수확 단계를 사용한다.

세포 수확 단계에는 일반적으로 폴리싱 단계라고도 지칭되는 포획 단계가 뒤따르는데, 이는 통상적으로 하나 이상의 양이온 교환 크로마토그래피 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호 작용 크로마토그래피 및/또는 혼합 모드 크로마토그래피 및/또는 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 심층 여과 또는 활성탄의 사용을 포함한다. 바이러스 비활성화 단계는 또한 포획 단계 후에 포함될 수도 있다. 폴리싱 단계 후에는 통상적으로 바이러스 여과 및 한외여과(또는 초미세여과; ultrafiltration)/다이아필트레이션 (diafiltration)이 이어지며, 이에 따라 정제 과정을 완료한다

바이오 의약품 제조는 약물 안전성을 위해 또한 식품의약국(FDA)과 같은 규제 기관이 정한 표준을 충족하도록 (포유류 세포를 포함한 동물 유래 성분에서 비롯되는) 바이러스의 비활성화 또는 제거를 필요로 한다.

전형적인 프로세스는 필요한 보호 기능을 누적 상태로 제공하는 다수의 바이러스 제거 단계들을 수반한다.

어떤 공정은 임의의 외피 바이러스들 및 바이러스 성분들의 파괴를 유발하기 위해 낮은 pH로 타겟 단백질을 함유하는 용액의 적정을 수반한다. 통상적으로, 타겟 단백질을 함유하는 샘플은, 바이러스 비활성화에 시간이 필요할 뿐만 아니라 특히 더욱 중요하게는 효과적인 바이러스 비활성화를 위한 균질한 혼합을 보장하기 위해 이들 조건에서 연장된 기간동안 유지된다.

따라서, 대규모 공정의 경우, 타겟 단백질을 함유하는 샘플은 종종 혼합에 의해, 효과적인 바이러스 비활성화를 촉진하기 위해 낮은 pH에서 연장된 시간 주기 동안 배양된다. 두 개의 별도 탱크들이 종종 사용되는데, 제1 탱크는 pH를 조정하는 데 사용되고 제2 탱크는 실제 배양 유지에 사용된다.

pH 조건들은 비활성화를 유발하기에 충분한 낮은 pH 값과 타겟 단백질의 변성을 피하거나 생성물 열화의 정도를 제한하기에 충분한 높은 값 사이의 균형으로서 설정된다.

이에 부가하여, 통상적으로 2 ~ 6 LRV (로그 감소 값)와 같이 바이러스 활동 값들에 있어서의 상당한 감소를 유발하기 위해 일정한 시간 양 동안 샘플을 노출시켜야 한다.

바이러스 비활성화 공정에 중요한 것으로 고려되는 파라미터들은, 균질한 혼합이 존재한다고 가정할 때, pH 값, 노출 시간, 백그라운드 용액 조건(예를 들어, 완충액 유형, 완충액 농도)의 정체성, mAb 농도 및 온도가 고려된다. 대규모 공정들의 경우에, 혼합은 큰 볼륨과 혼합 속도 및 물질 전달과 같은 부가적 파라미터들로 인해 문제가 된다.

(예를 들어 모노클로널 항체와 같은) 단백질을 함유하는 Fc 영역의 경우에, 용리 풀의 pH가 바이러스 비활성화를 위한 바람직한 pH에 보다 가깝기 때문에 바이러스 비활성화는 일반적으로 결합(bind) 및 용리(elute) 크로마토그래피 공정 단계(예를 들어, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피)로부터 용리 후에 수행된다.

예를 들어, 오늘날 산업계에서 사용되는 공정들에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피 용리 풀은 전형적으로 3.5 내지 4.0 범위의 pH를 가지며 양이온 교환 결합 및 용리 크로마토그래피 용리 풀은 전형적으로 약 5.0의 pH를 갖는다.

오늘날 산업계에서 사용되는 대부분의 공정들에 있어서, 타겟 단백질을 함유하는 용리 풀은 바이러스 비활성화를 위해 바람직한 pH로 조정되고 일정한 시간 길이 동안 그곳에 유지되며, pH와 시간의 조합은 바이러스 비활성화의 결과를 나타내었다.

특히 대규모 공정의 경우에, 바이러스 비활성화를 위해서는 보다 긴 시간이 더욱 효과적이나, 보다 긴 시간은 단백질 손상 및 단백질 변성을 유발하여 단백질 응집체(면역원성; immunogenic)로 이어질 수 있는 것으로도 알려져 있다.

낮은 pH에 장시간 노출되면 응집물이 침전 및 형성될 수 있으며, 이는 바람직하지 않으며 종종 이러한 침전물 및 응집물을 제거하기 위해 심층 필터 및/또는 멸균 필터를 사용할 필요가 있다.

본 출원에 기술된 방법들은 연속 또는 반 연속 방식으로 바이러스 비활성화를 달성할 수 있으며, 이는 대부분의 통상적인 공정에 비해 바이러스 비활성화와 관련된 시간을 상당히 감소시킬 수 있고, 결과적으로 전체 정제 공정에 대한 시간을 감소시킬 수 있다.

어떤 실시 예에서, 다른 공정 단계들이 연속 또는 반 연속 방식으로 동작되도록 연결된다.

어떤 실시 예에서, 본 출원에 기술된 바이러스 비활성화 방법은, 연속 또는 반 연속 정제 공정에서의 한 공정 단계를 구성하며, 여기에서 샘플은 예를 들어 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계 또는 이온 교환 크로마토그래피 단계로부터 상기 공정에 있어서의 다음 단계에 대한 바이러스 비활성화 단계로 연속적으로 유동하며, 이는 전형적으로 통과액(flow-through) 정제 공정 단계이다.

인라인 pH 비활성화는 종래 기술((예를 들어, 클루츠 에스.(Klutz S.) 등, 항체 제조, 화학 공학 및 처리(antibody manufacturing, Chemical Engineering and Processing) 102 (2016) 88-101))에서 낮은 pH 값에서 연속 바이러스 비활성화)가 제안되었으나, 좁은 체류 시간 분포를 갖는 적절한 인큐베이션 챔버의 개발은 이들 챔버들의 크기가 너무 크고 입증하기가 더욱 어려울 수 있다는 것을 의미했다.

어떤 실시 예에서, 바이러스 비활성화 공정 단계는 연속적으로 또는 반 연속적으로 수행되는데, 즉 이전 결합 및 용리 크로마토그래피 단계 (예를 들어, 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 도 11)와 같은 이전 공정 단계로부터의 용리 액은 바이러스 비활성화 단계로 연속적으로 흐르며 이는 용리 액이 개별 영역 또는 패킷들에서 흐르도록 되는 하나 이상의 유체 채널을 채용하며, 그 후 어떤 실시 예에서 바이러스 비활성화된 용리 액은 다음 공정 단계가 수행될 때까지 저장 용기에 수집 될 수 있고, 또는 어떤 실시 예에서, 다음 하류 공정 단계로 직접적이고 연속적으로 공급될 수 있다.

예를 들어, 도 11에 도시된 바와 같이, 어떤 실시 예에서, 단백질 A mAb 용리액은 정확한 주사기 펌프 및 정적 혼합기로 인라인 산 첨가를 사용하여 균일한 낮은 pH로 빠르게 제공된다. 1M 아세트산 농축물을 사용하여 가변 단백질 공급 농도에 대해 견고하게 낮은 pH가 유지된다. 상기 pH는 샘플링 및 오프라인 센서를 사용하여 확인될 수 있다.

연장된 수일 작동에 걸친 강력한 pH 제어는 복잡한 연속 피드백 제어 루프 및 신뢰할 수 없는 pH 센서 없이 달성할 수 있다. 비활성화 또는 인큐베이션 챔버는 강력한 LRV를 위한 안정적인 유지 시간을 제공하고 후속 단계에 필요한 pH (예를 들어, 5-7.5)로 신속하고 일관된 ??칭(quench)을 제공한다.

어떤 실시 예에 따르면, 좁은 체류 시간 분포는 연속 또는 반 연속 유동 시스템에서 유지된다. 체류 시간 분포들은 시스템에서 주행하는 유체 샘플의 효과적인 바이러스 비활성화를 달성하기에 충분히 좁다(또한 종래의 디자인들에 비해 감소됨). 적절한 좁은 체류 시간 분포는 통상적인 디자인들로부터 얻은 결과와의 비교에 기초하여 정량화될 수 있다.

다른 설계들(디자인들)로부터의 펄스 데이터(예를 들어, UV 흡수 피크들)는 통계적 정량화 메트릭스를 사용하여 비교될 수 있다. 예를 들어, 유동 채널을 빠져 나가기 위한 유체의 중간 80%에 필요한 시간 양의 비교가 행해질 수 있다. 즉, 10%와 90% 영역 값들 사이의 확산(spread)이 이루어질 수 있다 (여기에서 t_10%는 유체의 10%가 채널을 빠져나간 시간을 나타내고 t_90%는 유체의 90%가 채널을 빠져나간 시간을 나타낸다).

이 비교는 도 3에 도시된 피크들에 대해 수행되었고 하기 표 1에 명시되었으며, 50 mL의 시스템 부피(홀드 업 부피)와 동일하게 되도록 1/8 인치의 ID와 250 인치의 길이를 갖는 튜브를 사용한다.

통상의 지식을 가진자에 의해 적용되는 것과 같은 피크 특성을 분석하는 다른 방법들, 예를 들어 모멘트 분석도 이용될 수 있다.

표 1

각종 설계들을 다른 시스템 볼륨들과 비교하기 위해, 이들 데이터는 또한 정규화된 볼륨(시스템 볼륨으로 정규화된)으로 표시할 수도 있다. 이것은 도 4에 도시되어있고 아래 표 2에 예시되어 있다:

표 2

이들 분석 예에서, 본 출원에 개시된 실시예에 대한 10-90% 확산은 종래의 설계에 대한 값보다 상당히 작고, 본 출원에 개시된 실시예에 따라 좁은 체류 시간 분포를 구성하며, 이는 종래의 설계의 분포로부터 감소된다. 플러그 흐름에 이상적인 경우에, 이 10-90% 확산은 제로(0)로 된다.

어떤 실시 예에서, 샘플이 이동(주행)하는 유체 유동 채널의 축 방향을 따라 유체를 다른 또는 개별적 영역들 또는 패킷들로 분리함으로써 좁은 체류 시간 분포가 생성되고 유지된다. 개별 패킷은 인터페이스에 의해 다른 패킷 또는 영역과 분리된 패킷 또는 영역이다; 공정 유체의 한 볼륨과 공정 유체의 인접한 볼륨 또는 볼륨들 사이의 인터페이스를 형성하는 임의의 분리의 정도(degree of separation)는 개별적 영역 또는 패킷이다.

상기 인터페이스는 개재되는 비혼합성 유체(예를 들어, 가스 또는 다른 액체) 또는 고체에 의해 생성될 수 있다. 적절한 비혼합성 유체는, 후속 공정들에서의 제거의 용이성 등과 같이, 단백질 생성물 및 다른 공정 고려 사항들과 호환가능한 것들이고, 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜들을 포함한다. 적절한 가스는 공기, 산소, 질소 및 아르곤을 포함한다.

어떤 실시 예에서, 비수성상(non-aqueous phase)의 물질 또는 불용성 고상(insoluble solid phase) 물질이 유체 채널로 도입되어 인터페이스를 형성한다. 적절한 고체들로서는, 유체 및 용질, 예를 들어 폴리올레핀 플라스틱, 스테인리스 스틸, 티타늄, 금 등과 같은 유체들 및 용질들과 호환가능한 플라스틱 및 금속 구체(sphere)들을 포함한다. 상기 구체들은 직경이 충분히 크거나 한 유체 볼륨을 다른 유체 볼륨으로부터 효과적으로 분리하기 위해 튜브의 내측 직경(내경)과 일치하도록 하는 직경을 가져야 한다.

어떤 실시예에서, 비혼합성 유체 또는 고체는 예를 들어 주사기 등으로 주입함으로써, 채널 내로 수동으로 도입되거나, 또는 예를 들어 솔레노이드 펌프 등으로 자동으로 주입되며, 이는 미리 정해진 시간 간격으로 유체를 채널로 전달하도록 설정될 수 있다..

유체를 개별 영역들 또는 패킷들로 분리함으로써 상 분리에 의해 생성된 인터페이스 너머의 채널에 있는 유체의 축 방향 분산 및 혼합을 최소화한다. 체류 시간의 축 방향 분산은 입자가 경험할 수 있는 체류 시간의 범위에 영향을 준다. 낮은 pH에 있는 동안 바이러스 입자를 비활성화시키기 위해서는 체류 시간이 더 길어질 수 있다. 그러나, 낮은 pH에서 체류 시간이 지나치게 길게 처리되는 동일한 용액에서의 단백질 입자는 열화될 수 있으며, 이는 바람직하지 않다. 분산 체류 시간의 최소화의 정도는 가공되는 생성물 (예를 들어, 단백질)의 민감성에 의존하지만, 어떠한 경우에도 낮을수록 유리하다.

따라서, 허용될 수 있는 분산의 양은 특정 적용예에 따라 달라진다. 바이러스 제거 애플리케이션에 대해, 축방향 분산을 최소화하면 처리 시간 단축 측면에서 상당한 이점을 제공할 수 있는데, 그 이유는 짧은 시간 내에 바이러스 비활성화에 대한 신뢰도가 높아지기 때문이다.

패킷 분리의 길이는 중요하지 않다; 패킷이 채널의 전체 단면에 걸쳐 완료된 가스 또는 개재된 액체로 깨끗하고 완전한 인터페이스를 갖는 한, 패킷들은 매우 작은 길이(예를 들어, 1mm) 또는 그보다 매우 긴 길이로 분리될 수 있다.

각각의 개별 패킷은 다른 개별 패킷과 동일하거나 상이한 축 방향 길이를 가질 수 있다.

어떤 실시예에서, 유체의 개별 패킷들 또는 영역들의 형성은 유체 종이 유동 채널의 길이를 따라 축 방향으로 병진운동(translated)되도록 하여 채널 입구의 프로파일이 채널 출구의 프로파일과 일치하거나 실질적으로 일치하도록 함으로써, 채널에서 유체 종들의 체류 시간에 대한 일관성 및 확실성을 증가시킨다.

유동 채널의 일단에 펄스로서 도입된 샘플은 공지된 시간에 선명하고 명확한 피크로 유동 채널을 유출한다. 이는 시스템을 통해 유동하는 종들의 목표 최소 체류 시간을 달성하기에 필요한 인라인 연속 바이러스 비활성화 애플리케이션에 대한 이점을 갖는다.

이는 또한, 이동 국면(예를 들어, 완충액) 조건들이 변경되거나 완충액 희석이 발생하는 시스템에서도 구현될 수 있다.

이는 전형적인 mAb 정제 공정 내 여러 곳에서 발생할 수 있다. 하나의 예는 결합-및-용리 양이온 교환 단계와 통과액(flow-through) 음이온 교환 단계 사이에서 종종 요구되는 조정이다. 양이온 교환 단계로부터의 용리 풀은 종종 음이온 교환 단계의 목표 값보다 낮은 pH 및 높은 전도도에 있다. 연속 유동 시스템에서 양이온 교환 용리 풀을 적절한 조건으로 효율적으로 조정하기 위해, 새로운 조건으로 효율적으로 천이할 수 있도록 개별 패킷들이 형성될 수 있다. 다른 버퍼 형태들 사이의 가파른 천이 구역이 제공될 수 있으며, 이에 의해 필요한 시간 및 버퍼의 양을 최소화하고, 인라인 버퍼 희석 또는 인라인 컨디셔닝 응용을 가능하게 한다.

유량 및 튜브 길이는 특정 체류 시간을 목표로 하도록 선택될 수 있다. 바이러스 비활성화 애플리케이션의 경우, 체류 시간은, 바람직하게는 어떤 안전 계수와 함께, 유동 채널 내에서 바이러스 비활성화를 달성하기에 충분한 시간으로서 선택된다. 예를 들어, 30분의 비활성화 시간이 요구되는 경우, 안전 계수 2가 사용될 수 있으며, 이때 유동 채널에서 목표 체류 시간은 60분으로 된다. 바이러스 비활 화가 1-2 분 미만에 발생하는 다른 실시예에서, 안전 계수가 채용될 수 있고 유동 채널에서 4분 또는 5분의 목표 체류 시간이 사용될 수 있다. 최소 체류 시간 역시 바이러스 비활성화에 대한 허용가능한 안전 계수 측면에서 규정 가이드라인에 따라 달라질 수 있다.

적절한 명목 체류 시간은 1-2분, 2-4분, 4-6분, 6-8분 8-10분, 10-15분 및 15-30분을 포함한다.

좁은 체류 시간 분포를 유지하는 능력은, 낮은 pH, 세제에 대한 노출 등과 같은 특정 비활성화 조건에서 바이러스가 최소 시간 양을 소비해야 하는 mAb 처리와 같은 바이러스 비활성화 프로세스에 유리하다. 좁은 체류 시간 분포를 유지함으로써, 바이러스 비활성화에 대한 최소 시간 요건을 충족시키면서 생성물(예를 들어, 단백질/mAb)이 거친 비활성화 조건에 노출되는 것을 최소화 할 수 있다.

낮은 pH 비활성화의 경우, 예를 들어, 산과 같은 바이러스 비활성화 제제가 주 공급 유동 채널에 측부 스트림으로서 첨가될 수 있다.

어떤 실시 예에서, 원하는 양의 바이러스 비활성화 제제를 첨가하기 위해 소프트웨어 프로그램에 의해 제어되는 주사기 펌프가 사용될 수 있다.

어떤 실시 예들에서, 펌프에 대한 제어기가 제공될 수 있으며, 상기 제어기는 처리 장치 및 저장 요소를 갖는다.

상기 처리 장치는 마이크로프로세서와 같은 범용 컴퓨팅 장치일 수 있다. 대안적으로, 그것은 PLC(programmable logic controller)와 같은 특수 처리 장치 일 수 있다. 저장 요소는 RAM, DRAM, ROM, 플래시 ROM, EEROM, NVRAM, 자기 매체, 또는 컴퓨터 판독 가능 데이터 및 명령을 유지하기에 적합한 임의의 다른 매체와 같은 임의의 메모리 기술을 이용할 수 있다. 펌프를 동작시키기 위해 명령들이 필요할 수 있다.

상기 제어기는 또한, 터치 스크린, 키보드, 또는 운영자가 제어기에 의해 사용될 파라미터 세트를 입력할 수 있게 하는 다른 적절한 장치와 같은 입력 장치를 포함할 수 있다. 이 입력 장치는 휴먼 머신 인터페이스 또는 HMI라고도 지칭한다. 상기 제어기는 펌프를 제어하도록 구성된 출력을 가질 수 있다. 이들 출력은 본질적으로 아날로그 또는 디지털일 수 있고, 2진 출력(즉, 온 또는 오프)을 제공할 수 있으며, 또는 아날로그 신호 또는 멀티 비트 디지털 출력과 같은 가능한 범위의 출력을 제공할 수 있다.

제제가 첨가되고 혼합된 후(예를 들어, 인라인 정적 혼합기를 통해), 인큐베이션 챔버 유동 채널로 들어가서 타겟 비활성화 시간 동안 그를 통해 흐른다. 제제 첨가량은 공급 용액의 산 형태, 산 강도 및 버퍼링 용량에 의존한다. 공급 용액 버퍼링 용량은 완충제 종들, 완충제 농도 및 mAb 농도를 포함하는 많은 팩터들에 의존한다.

낮은 pH 비활성화 대신 상기와 유사한 프로세스를 세제 비활성화에 대해 사용할 수 있다.

본 명세서에 개시된 실시 예들에 따르면, 유체 채널로 도입된 유체 샘플은 최소 피크 확장으로 유체 채널을 빠져 나간다. 본 출원에 개시된 방법이 적용될 때 관찰되는 피크 확장의 양은 종래의 바이러스 비활성화 방법이 사용될 때보다 현저히 적다.

도 4는 본 명세서에 개시된 방법으로부터 생성된 피크 확대와 종래의 방법의 비교를 도시한다.

직선형 튜브, 코일형 튜브 (직경 3/8 인치의 로드 주위를 감싸는 튜브) 및 본 명세서에 개시된 실시 예에 따라 개별 유체 패킷들이 유도되는 튜브에 주입되는 샘플에 의한 피크 확장이 도 4에 도시되어 있다. 모든 튜브들은 50 mL 이론적 홀드업 볼륨에 대응하는 길이 및 내경을 가졌다. 초기에 물을 함유하는 튜브에 0.5mL 샘플을 주입하고 샘플 주입 후, 물을 (5분의 명목 체류 시간에 해당하는) 10mL/분으로 각 튜브에 통과시켰다. 결과적인 UV 트레이스를 튜브 출구에서 수집하였다. 볼륨들은 시스템 볼륨으로 정규화되었다.

문헌에서, 코일형 튜브는 2차 유동 특성((예를 들어, 딘 보르틱스(Dean vortices), 미국 특허 제5,203,002호 "곡선 채널 멤브레인 여과(curved channel membrane filtration)"))으로 인해 직선형 튜브에 비해 이점을 제공하는 것으로 나타났다. 딘 보르틱스 특허는 지속적인 바이러스 비활성화를 위해 특별히 구현되었다(WO2015/135844 A1 "연속적인 바이러스 비활성화를 위한 장치 및 방법(Device and method for continuous inactivation)". 본 출원에 개시된 방법을 사용하여 수득된 피크는 직선형 튜브 및 코일형 튜브 둘 다의 것보다 훨씬 좁으며, 이는 개별 패킷 또는 구역에서의 유동 채널에서 이동하는 유체 종이 시스템에서 더욱 좁은 체류 시간 분포를 가지는 것을 나타낸다.

도 12는, 예를 들어, 채널을 생성하기 위해 패턴에 함께 2개의 플라스틱 시트를 용착함으로써 형성된 거대 유체 유동 경로 어셈블리를 포함하는 Smart FLEXWARE^® 설계의 일례이다. 공기와 같은 비혼합성 유체는 유동 채널의 입구에 주입될 수 있고 유동 채널의 출구에서 제거될 수 있다(도 12에서 "거품 제거기(de-bubber)"로 표시).

본원에 기술된 방법은 또한 예를 들어 바이러스 비활성화를 위해 풀 탱크(pool tank)를 사용할 필요성을 제거하거나 또는 적절한 안전 계수로 바이러스를 비활성화 시키는데 필요한 인큐베이션 챔버의 크기를 최소화함으로써 공정의 물리적 점유공간(footprint)을 더 적게 하는 결과로 된다. 일반적으로, 공정의 전체 물리적 점유공간 (즉, 바닥 공간)을 감소시킴으로써 효율성을 향상시키는 보다 유연한 제조 공정들에 대한 수요가 증가하고 있다.

본 출원에 기술된 방법은 바이러스 비활성화에 전형적으로 사용되는 대형 풀 탱크를 제거함으로써 정제 공정의 전체 점유공간을 감소시킬 수 있다.

실시예

실시예 1. 박테리오파지 바이러스를 갖는 정적의 낮은 pH 바이러스 비활성화.

이 대표 실험에서, 그 목적은 낮은 pH 조건에서 외피 박테리오파지 바이러스 (Phi6)의 비활성화 동역학을 평가하는 것이다. 상기 목적은 완전한 비활성화에 필요한 노출 시간을 결정하는 것이다.

모노클로널 항체(mAb)를 표준 단백질 A 크로마토그래피로 정제하고 5 mg/ mL의 농도로 제조하였다. 8.7 M 아세트산을 사용하여 pH를 pH 6.3에서 pH 3.6으로 조정하였다. 인간 혈청 알부민 (HSA) (0.25% v/v)을 Phi6 안정성을 위해 첨가하였다. pH 확인 후, 바이러스 스파이크를 mAb를 함유하는 샘플 저장소에 첨가하고 볼텍싱(vortexed)하여 잘 혼합된 시스템을 보장하였다.

Phi6 타겟 스파이크 레벨은 1x10⁷ pfu (플라크 형성 단위)/mL 이었다. 바이러스 첨가 후 0.3분 이내에, 1mL 샘플을 제거하고, 미리 결정된 부피의 2M 트리스 염기, pH 10을 함유하는 튜브로 옮기고 샘플을 중화시키고(pH 6-8) 비활성화 단계를 ??칭(quenching)하였다. 염기 첨가 후 튜브를 볼텍싱하였다. 샘플을 제거하고 중화하는 이 과정을 각 시점마다 반복했다. 이들 실험은 22-25℃의 실온에서 수행되었다. 초기 및 최종 시점에서의 콘트롤 샘플도 분석하였다. 콘트롤 샘플의 경우, pH를 공급 pH 수준 (pH 6.3)으로 유지했지만, 샘플을 pH 6.3의 백그라운드 완충제를 사용하여 실제 샘플과 유사하게 희석시켰다.

플라크 분석법을 사용하여 중화된 샘플들을 감염성에 대해 분석하였고 그 결과들을 표 3에 나타내었다. 대응하는 Phi6 역가는 "정적"값들로서 도 5에 도시되어 있다.

표 3

이들 결과는 pH 3.6 조건들이 Phi6을 빠르게 비활성화시키며, 이는 1분 이내에 완전한 비활성화가 발생함을 나타낸다. 0분 및 15분에서의 콘트롤 샘플들은 원래 역가 수준을 유지하였다.

실시예 2. XMuLV 레트로바이러스를 갖는 정적의 낮은 pH 바이러스 비활성화.

이 연구의 목적은 낮은 pH 조건 하에, 모노클로널 항체 생성물들의 제거를 위한 연구에 일반적으로 사용되는 외피보유 바이러스(enveloped virus), XMuLV (xenotropic murine leukemia virus)의 바이러스 비활성화 동역학을 평가하는 것이었다. 그 목적은 완전한 비활성화에 필요한 노출 시간을 결정하는 것이었다.

모노클로널 항체를 표준 단백질 A 크로마토그래피로 정제하고 18 g/L의 농도로 제조하였다. 8.7M 아세트산을 사용하여 pH 3.5, pH 3.7, pH 4.0 또는 pH 4.2의 목표 수준으로 pH를 조정하였다. pH의 확인 후, 바이러스 스파이크를 mAb를 함유하는 샘플 저장소에 첨가하고 볼텍싱하여 잘 혼합된 시스템을 보장하였다. XMuLV 타겟 스파이크 레벨은 1x10⁷ TCID₅₀/mL (TCID₅₀ = 조직 배양 감염 도스) (4% 스파이크 v/v) 이었다.

바이러스 첨가 후 0.3 분 이내에, 1mL 샘플을 제거하고, 미리 결정된 부피의 2M 트리스 염기를 함유하는 튜브로 옮기고 샘플을 중화시키고 (pH 6-8) 비활성화 단계를 ??칭했다. 베이스 첨가 후 튜브를 볼텍싱 하였다. 샘플을 제거하고 중화하는 이 공정을 각 시점마다 반복했다. 이들 실험은 22-25℃의 실온에서 수행되었다. 초기 및 최종 시점에서의 콘트롤 샘플도 분석하였다.

콘트롤 샘플의 경우, pH는 공급 pH 수준으로 유지되었지만 샘플은 백그라운드 버퍼를 사용하여 실제 샘플과 유사하게 희석되었다.

중화된 샘플들은 PG4 지표 세포 (Bolton G, Cabatingan M, Rubino M 등, 정상 흐름 바이러스 여과: 바이오-프로세싱에서 엔드포인트의 검출 및 평가. Biotechnol Appl Biochem 2005; 42 : 133-42)를 이용한 세포-기반 TCID₅₀ 감염성 분석법(assay; 어세이)을 사용하여 감염성에 대해 분석하였다.

세포 독성을 완화하고 바이러스 비활성화를 ??칭하기 위해, 세포 배양 매질에서 10배 연속 희석으로 샘플을 1:50으로 희석한 다음, 각 희석액의 100㎕ 분취량을 96-웰(well) 플레이트에 첨가하였다. 7일 동안 5% CO₂에서 37℃로 배양한 후, 감염된 웰을 CPE(cytopathic effect)에 대해 시각적으로 분석하였다.

역가 및 LRV들은 표준 방법들(ICH. Guidance on Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell lines of Human or Animal Origin. In: Use ICoHoTRfRoPfH, ed. 제네바, 스위스: ICH, 1998)를 사용하여 계산했다.

각각의 시점(time point)에서 LRV를 결정하기 위해, 시점의 역가를 가장 가까운 제어 시점의 역가로부터 차감하였다. 로그 감소 값은 표 4에 나와 있다. 대응하는 역가는 도 6에 도시되어 있다.

표 4

이들 결과는 pH 3.5 및 pH 3.7 조건이 XMuLV를 빠르게 비활성화시키며, 이는 1분 이내에 완전히 비활성화가 발생함을 나타낸다. 0 및 60분의 콘트롤 샘플은 원래 역가 수준을 유지하였다.

실시예 3. Phi6 박테리오파지 바이러스를 갖는 정적 세제-기반 바이러스 비활성화.

이 연구의 목적은 세제 기반 바이러스 비활성화 동역학을 조사하는 것이었다. 이 대표 실험에서, 2가지 상이한 농도 (0.1% 및 1.0% v/v)의 세제 Triton X-100을 사용하여 박테리오파지 바이러스, Phi6를 비활성화시켰다. 목적은 완전한 비활성화에 필요한 노출 시간을 결정하는 것이었다.

모노클로널 항체를 표준 단백질 A 크로마토그래피로 정제하고 15 mg/mL의 농도로 제조하였다. 바이러스 스파이크를 부가하고 볼텍싱하여 잘 혼합된 시스템을 보장하였다. Phi6 타겟 스파이크 레벨은 1x10⁸ pfu/mL이었다.

0.1% 및 1.0% v/v의 원하는 농도에 도달하도록 세제를 첨가하였다. 각종 시점(time point)에서, 샘플을 1 : 1000 희석 비율로 완충액에 첨가함으로써 샘플을 제거하고 급냉(quench)시켰다. 세제 첨가 후 튜브를 볼텍싱하였다. 이들 실험은 22-25℃의 실온에서 수행되었다. 초기 및 최종 시점에서의 콘트롤 샘플도 분석하였다. 콘트롤 샘플을 백그라운드 완충액을 사용하여 실제 샘플과 유사하게 희석시켰다.

플라크 분석법을 사용하여 중화된 샘플들을 감염성에 대해 분석하였고, 로그 감소 값들을 표 5에 나타내었다. 대응하는 Phi6 역가는 도 7에 도시되어 있다.

표 5

이들 결과는 0.1 % 및 1.0 % Triton X-100 조건들이 Phi6을 빠르게 비활성화하며 1분 이내에 완전히 비활성화됨을 나타낸다. 0분 및 30분에서의 콘트롤 샘플은 원래 역가 수준을 유지하였다.

실시예 4. 패킷들을 생성하기 위한 방법.

이 대표 실험은 유체 채널을 따라 패킷들을 생성하기 위한 방법의 사용을 설명한다.

튜브의 길이를 따라 한정된 위치에 비혼합성 유체의 주입을 제공하기 위해 장치가 조립되었다.

이 예에서, 마이크로펌프는 시스템 내로 기포의 주입을 배출하기 위해 사용되었다. 상기 시스템은 샘플 주입 포트에 연결된 연동 펌프 및 타겟 인큐베이션 챔버 볼륨이 제공된 튜브 길이로 구성되었다. 상기 시스템은 초기에 완충액으로 채워졌다. 마이크로펌프는 샘플 주입 포트의 시작 부분에 에어 포켓을 생성하는 데 사용되었다. 주사기를 사용하여 샘플을 샘플 포트에 첨가하였다.

상기 마이크로펌프는 또한, 샘플 주입 포트의 일단에 에어 포켓을 생성하기 위해 사용되었다. 육안으로 이들 에어 포켓이, 유체 경로가 다른 영역들로 분리되는 것을 확인하였다. 튜브 치수는 특정 유량 (즉, 10 mL/분)으로 특정 체류 시간을 달성하는 데 필요한 볼륨에 기초하여 선택되었다. 1/8 인치 ID 및 3/8 인치 OD를 갖는 중합체 튜브를 사용하였다.

실시예 5. 체류 시간 결정.

이 대표 예는 체류 시간 분포를 결정하기 위해 사용되는 방법을 제공한다.

연동(peristaltic) 펌프를 사용하여 실시예 4에 기재된 시스템을 통해 완충액을 펌핑하였다.

상기 시스템은 초기에 완충액으로 충전되었다. 에어 포켓을 샘플 주입구에 주입하였다. 이어서, 샘플 포트를 마커 종(리보플라빈, 0.2 mg/mL)으로 채웠다. 샘플 포트의 단부에 에어 포켓이 주입되었다. 샘플 볼륨은 샘플 포트의 크기에 따라 0.5 내지 60 mL의 범위이었다. 연동 펌프를 사용하여 시스템을 통해 버퍼를 펌핑하고, 튜브를 통해 마커 종을 튜브의 일단에서 연결된 UV 검출기 내로 밀어 넣었다. 공급 유량은 10 mL/분이었다. 인큐베이션 챔버는 250 인치의 폴리머 튜브 (1/8 인치 ID)로 구성되었다.

시간의 함수로서의 UV 검출기로부터의 신호는 시스템에서 마커 종의 체류 시간을 결정하는데 사용되었다. 결과는 도 8에 도시되어 있으며, 이 방법이 유동 채널을 따라 축 방향으로 상이한 체적의 유체를 효율적으로 이동시키기 위해 사용될 수 있음을 나타냈다.

실시 예 6. 바이러스 체류 시간 분포.

이 대표 예는 인큐베이션 챔버를 통한 바이러스의 체류 시간 분포를 예시한다. 시스템은 실시 예 5에 기술되고 도 13에 도시된 바와 같이 설정되었으며, 인큐베이션 챔버 내에 유체 패킷들을 생성하기 위해 에어 포켓들이 구현되었다.

Phi6 바이러스가 마커 종으로 사용되었다. Phi6 타겟 스파이크 레벨은 완충액에서 1x10⁷ pfu/mL이었다. 상기 시스템은 튜브 입구의 완충액 저장소, 샘플 주입 포트, 및 UV 검출기에 연결된 튜브 길이로 구성되었다.

시스템은 초기에 완충액으로 충전되었다. 이어서, 5 mL의 Phi6 바이러스 샘플을 시스템에 주입하였다. 유속을 10 mL/분으로 설정하고 완충제를 사용하여 마커 종을 시스템을 통해 밀어 넣었다. 튜브 출구에서 샘플을 수집하고 플라크 분석을 사용하여 감염성을 분석하였다. 그 결과들은 도 9에 도시되어 있으며, 이때, Phi6 역가는 정규화된 볼륨의 함수로서 도시된다. 볼륨은 시스템 볼륨으로 정규화되었다. 이들 실험은 22-25 ℃의 실온에서 수행되었다.

도 9에 도시된 바와 같이. 버블 포켓을 갖는 현재 유동 채널에 대한 결과적인 피크 프로파일은 전형적인 직선 튜브에 대해 얻어진 프로파일보다 상당히 좁다.

실시예 7. 연속 흐름 시스템을 사용한 바이러스 비활성화.

이 대표 예는 낮은 pH 바이러스 비활성화를 수행하기 위한 연속 유동 시스템의 사용을 기술한다.

연속 공급 조건 하에서 바이러스를 비활성화시키기 위해 주 공급 펌프, 산 첨가 펌프 및 염기 첨가 펌프로 구성된 시스템이 사용되었다. mAb 용액을 Phi6으로 스파이킹하고 주 공급 펌프 입구에 연결하였다. Phi6 타겟 스파이크 레벨은 1x10⁸ pfu/mL 이었다.

산은 1M 아세트산이고 염기는 2M 트리스 염기 용액이었다. 공급 유량은 1 mL/분으로 설정되었다. 산을 주 스트림에 0.75 mL/분의 유속으로 첨가하였다. 이어서, 유체는 정적 혼합기 및 특정 볼륨을 포함하도록 설계된 길이의 튜브 (원하는 체류 시간을 목표로 함)를 통과하였다. 인큐베이션 챔버의 출구에서, 0.4 mL/분의 유속으로 메인 라인에 염기를 첨가함으로써 물질을 중화시켰다. 유체는 또 다른 정적 혼합기를 통과한 후 중화된 샘플을 출구에서 수집하고 플라크 분석을 사용하여 감염성에 대해 분석하였다.

로그 감소 값들이 표 6에 제시되어 있다. 이들 실험은 22-25℃의 실온에서 수행되었다. 콘트롤 샘플 및 시점들도 분석하였다. 콘트롤 샘플에 대해서는, pH는 공급 pH 수준으로 유지되었지만 샘플은 백그라운드 버퍼를 사용하여 실제 샘플과 유사하게 희석되었다.

대응하는 Phi6 역가는 "인라인"값으로서 도 5에 도시되어있다.

표 6

이들 결과는 인라인 연속 비활성화 시스템을 사용하여 1분 이내에 바이러스 비활성화가 발생했음을 나타낸다. 0분 및 15분의 콘트롤 샘플들은 원래 역가 수준을 유지하였다.

인라인 시스템으로부터의 이들 데이터는 Phi6 바이러스에 대한 정적의 낮은 pH 비활성화 조건을 사용하여 실시 예 1에서 얻은 데이터와 동일하며, 두 접근법들 사이의 동등성을 나타낸다.

실시예 8. 연속 흐름 시스템을 사용한 인라인 솔루션 조정.

이 실시예에서, 연속적인 인라인 솔루션 컨디셔닝을 위해 패킷들을 생성하는 방법(실시 예 4)이 사용되었다.

실험 설정은 연동 펌프와 UV 검출기에 연결된 폴리머 튜브 길이 (1/8 인치ID, 250 인치 길이)로 구성되었다.

초기에 튜브에 물이 채워진다. 이어서, 2.5mL 에어 포켓을 샘플 루프에 주입 하였다. 마커 종(리보플라빈, 0.2 mg/mL)을 10 mL/분의 유속으로 시스템에 펌핑하였다. 튜브 배출구의 단부에서, 유체는 거품 제거기와 UV 검출기를 통과했다. 결과적인 UV 흡수 프로파일이 도 10에 도시되어 있다.

실험이 동일한 설정으로 기포 주입없이 반복되나 기포 주입이 없도록 하는 제어가 도시되어 있다. 결과적인 UV 프로파일에서 관찰된 바와 같이, 본 출원에 기술된 방법은 하나의 용액에서 다른 용액으로 전환할 때, 즉 단계 변화로 급격한 반응 곡선을 생성할 수 있다.

Claims (22)

1. 축 방향 길이를 갖는 유체 채널에서 유동하는 유체 샘플의 좁은 체류 시간 분포를 유지하는 방법으로서, 상기 방법은,
   유체에서 불용성인 고상 물질을 갖는 개별 패킷들 사이에 인터페이스를 형성함으로써 상기 유체 채널 내에 축 방향 길이를 따라 개별 패킷들에서 상기 유체 샘플이 유동하도록 하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 유체 샘플은 상기 유체 채널에서 1분 내지 2분의 명목 체류 시간을 갖는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 유체 샘플은 상기 유체 채널에서 2분 내지 4분의 명목 체류 시간을 갖는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 유체 샘플은 상기 유체 채널에서 4분 내지 6분의 명목 체류 시간을 갖는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 유체 샘플은 상기 유체 채널에서 6분 내지 8분의 명목 체류 시간을 갖는 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 유체 샘플은 상기 유체 채널에서 8분 내지 10분의 명목 체류 시간을 갖는 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 유체 샘플은 상기 유체 채널에서 10분 내지 15분의 명목 체류 시간을 갖는 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 유체 샘플은 상기 유체 채널에서 15분 내지 30분의 명목 체류 시간을 갖는 방법.
9. 타겟 분자를 함유하는 샘플에서 하나 이상의 바이러스들을 비활성화시키는 방법으로서, 상기 방법은,
   상기 타겟 분자를 정제하기 위한 공정 동안 상기 샘플을 하나 이상의 바이러스 비활성화 제제들과 연속적으로 혼합하면서 상기 샘플이 비혼합성 유체 (immiscible fluid)에 의해 분리되는 개별 패킷들에서의 유동 채널에서 유동하도록 하는 단계를 포함하는 방법.
10. 타겟 분자를 포함하는 유체 샘플에서 하나 이상의 바이러스들을 비활성화하는 방법으로서,
    상기 유체 샘플을 단백질 A 친화성 크로마토그래피 공정으로 처리하여 용리액을 얻는 단계;
    하나 이상의 바이러스 비활성화 제제들을 상기 용리액과 혼합하기 위해 상기 용리액을 축방향 유동 채널로 연속적으로 이송시키는 단계; 및
    상기 바이러스를 비활성화하기에 충분한 시간 동안 비혼합성 유체에 의해 분리되는 개별 패킷들에서의 상기 축 방향 채널에서 상기 용리액이 유동하도록 하는 단계를 포함하는 방법.
11. 타겟 분자를 포함하는 유체 샘플에서 하나 이상의 바이러스들을 비활성화하는 방법으로서,
    상기 유체 샘플을 이온 교환 크로마토그래피 공정으로 처리하여 용리액을 얻는 단계;
    하나 이상의 바이러스 비활성화 제제들을 상기 용리액과 혼합하기 위해 상기 용리액을 축방향 유동 채널로 연속적으로 이송시키는 단계; 및
    상기 바이러스를 비활성화시키기에 충분한 시간동안 비혼합성 유체에 의해 분리되는 개별 패킷들에서의 상기 축 방향 채널에서 상기 용리액이 유동하도록 하는 단계를 포함하는 방법.
12. 제10항에 있어서, 상기 유체 샘플은 상기 유체 채널에서 1분 내지 2분의 명목 체류 시간을 갖는 방법.
13. 제10항에 있어서, 상기 유체 샘플은 상기 유체 채널에서 2분 내지 4분의 명목 체류 시간을 갖는 방법.
14. 제10항에 있어서, 상기 유체 샘플은 상기 유체 채널에서 4분 내지 6분의 명목 체류 시간을 갖는 방법.
15. 제10항에 있어서, 상기 유체 샘플은 상기 유체 채널에서 6분 내지 8분의 명목 체류 시간을 갖는 방법.
16. 제10항에 있어서, 상기 유체 샘플이 상기 유체 채널에서 8분 내지 10분의 명목 체류 시간을 갖는 방법.
17. 제10항에 있어서, 상기 유체 샘플은 상기 유체 채널에서 10분 내지 15분의 명목 체류 시간을 갖는 방법.
18. 제10항에 있어서, 상기 유체 샘플은 상기 유체 채널에서 15분 내지 30분의 명목 체류 시간을 갖는 방법.
19. 제10항에 있어서, 타겟은 단백질을 함유하는 Fc 영역 또는 항체인 방법.
20. 축 방향 길이를 갖는 유체 채널로서,
    상기 유체 채널은 비혼합성 유체에 의해 분리된 유체 샘플의 복수의 개별 패킷들을 함유하고 타겟 분자 및 하나 이상의 바이러스들을 함유하며 하나 이상의 바이러스 비활성화 제제들을 함유하는 유체 채널.
21. 제1항에 있어서, 상기 고상 물질은 플라스틱 또는 금속 구체인 방법.
22. 제1항에 있어서, 상기 고상 물질은 폴리올레핀, 스테인리스 스틸, 티타늄 및 금으로부터 선택되는 방법.

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