CN101039666A - 作为酪蛋白激酶Iε抑制剂的3－芳基硫代吲哚－2－甲酰胺衍生物及其类似物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用3－芳基硫代吲哚－2－甲酰胺、5－取代的－3－芳基硫代吲哚－2－甲酰胺及相关类似物治疗患者的方法，所述的患者患有与人昼夜节律钟紊乱相关的中枢神经系统的疾病或障碍，其通过抑制酪蛋白激酶Iε的活性来改善，所述的疾病或障碍为例如心境障碍包括重症抑郁障碍、I型双相性精神障碍和II型双相性精神障碍，以及睡眠障碍包括昼夜节律睡眠障碍如轮班工作睡眠障碍、时差综合征、睡眠时相前移综合征以及睡眠时相后移综合征。

Description

作为酪蛋白激酶Iε抑制剂的3-芳基硫代吲哚-2-甲酰胺衍生物及其类似物
技术领域
本发明涉及应用3-芳基硫代吲哚-2-甲酰胺、5-取代的-3-芳基硫代吲哚-2-甲酰胺及相关类似物的方法，所述的化合物可以作为将人生物钟蛋白阶段(hPER)的人酪蛋白激酶Iε磷酸化的抑制剂，因此，这些化合物可用作药物，特别用于治疗和/或预防与中枢神经系统相关的疾病和障碍。
背景技术
从单细胞到人，许多生物的行为都显示出节律性变化。当在恒定不变的条件下该节律持续出现且具有约一天的周期并且对温度的依赖性很小时，那么该节律被称为“昼夜节律”(Konopka，R.J.和Benzer，S.(1971)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 68，2112-2116)。
昼夜节律由内源性生物起搏器(昼夜节律钟)产生，并且存在于大多数生物体包括人、真菌、昆虫和细菌中(Dunlap，J.C.(1999)Cell 96，271-290；Hastings，J.W.等人，Circadian Rhythms，The Physiology of BiologicalTiming.In：Prosser，C.L.ed.Neural and Integrative Animal Physiology，New York：Wiley-Liss(1991)435-546；Allada，R.等人(1998)Cell 93，791-804；Kondo等人(1994)Science 266，1233-1236；Crosthwaite，S.K.等人(1997)Science 276，763-769；Shearman，L.P.等人(1997)Neuron，19，1261-1269)。昼夜节律是自我维持并保持恒定，即使是在完全黑暗的条件下也是如此，但是，它也可以通过环境信号如光和温度循环被同步(被动)为新的昼夜节律(Pittendrigh，C.S.(1993)Annu.Rev.Physiol.，55，16-54；Takahashi，J.S.(1995)Annu.Rev.Neurosci.18，531-553；Albrecht，U.等人(1997)Cell，91，1055-1064)。昼夜节律钟对于以下行为是很重要的：维持生物节律并且调节多种昼夜节律行为例如每天在行为、食物摄取和睡眠/清醒周期等方面的波动，以及生理变化例如激素分泌和体温波动(Hastings，M.(1997)Trends Neurosci.20，459-464；Reppert，S.M.和Weaver，D.R.(1997)Cell 89，487-490)。
对于果蝇(黑腹果蝇(drosophila melanogaster))的遗传和分子学研究引起了对某些涉及昼夜节律的基因的阐明。这些研究引起了途径的发现，所述的途径紧密自动调节并包括基于转录/翻译的负反馈环(Dunlap，J.C.(1999)Cell，96，271-290；Dunlap，J.C.(1996)Annu.Rev.Genet.30，579-601；Hall，J.C.(1996)Neuron，17，799-802)。果蝇的昼夜节律振荡器的核心元件包括两种刺激性蛋白dCLOCK/dBMAL(CYCLE)以及两种抑制性蛋白dPERIOD(dPER)和dTIMELESS(dTIM)。dCLOCK和dBMAL发生异二聚化而形成转录因子dCLOCK/dBMAL，该转录因子促进了两种称为Drosophila Period(dper)和Drosophila Timeless(dtim)的表达。最终，来自这些基因的mRNA被转录以分别生成蛋白dPER和dTIM。在几小时内，该蛋白产物dPER和dTIM在细胞质内被合成并被磷酸化，达到临界水平并形成异二聚体，该异二聚体易位进入细胞核。一旦进入细胞核，dPER和dTIM就作为自身转录的负调节子而起作用，dPER和dTIM的累积量减少，dCLOCK/dBMAL对dper和dtim的活化再次开始(Zylka，M.J.等人(1998)Neuron 20，1103-1110；Lowrey，P.L.等人(2000)288，483-491)。dper基因是在成虫羽化(成虫从蛹中飞出)行为和运动活性方面控制昼夜节律的必需的元件(Konopka，R.J.，& Benzer，S.(1971)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，68，2112-2116)。per基因的错义突变可以缩短(perS)或延长(perL)昼夜节律的周期，而无义突变(perO)引起其行为的无节律性(Hall，J.C.(1995)TrendsNeurosci.18，230-240)。
在哺乳动物中，下丘脑前部交叉上核(SCN)是主要的生物钟位点(参阅Panda等人，(2002)Nature 417，329-335；Reppert，S.M.和Weaver，D.R.(1997)Cell，89，487-490)。由于光通过直接和间接的视网膜至SCN的路径而发生作用，SCN生物钟就被明/暗循环调节为每天24小时(Klein，D.C.等人(1991)Suprachiasmatic Nuclei：The Mind′s Clock，Oxford UniveristyPress，New York)。在啮齿动物的SCN中，已有3种Per基因被鉴定和克隆，并分别被称为小鼠Per1(mPer1)、mPer2和mPer3。这些哺乳动物基因的蛋白产物(mPER1、mPER2、mPER3)相互具有数个同源区域，并且每种哺乳动物的Per基因均编码具有蛋白二聚化区域的被称为PAS的蛋白(PER、ARNT和SIM是最早发现的具有这种在功能上重要的二聚化结构区域的三种蛋白，PAS则是这三种蛋白首字母组成的缩写词)，哺乳动物的PAS与昆虫PER的PAS区域高度同源。所有Per信使RNA(mRNA)和蛋白质的水平均在昼夜节律中呈周期性变化并密切涉及生物钟正调节和负调节，但只有mPER1和mPER2对光的响应呈周期性变化(Zylka，M.J.等人(1998)Neuron 20，1103-1110.；Albrecht，U.等人(1997)Cell 91，1055-1064；Shearman，L.P.等人(1997)Neuron 19，1261-1269)。果蝇tim基因的哺乳动物同源物已被克隆并被称为mTim。然而，尚无证据证明mPER-mTIM的相互作用与在果蝇中观察到的类似，并且表明在哺乳动物昼夜节律钟的分子作用中，PER-PER的相互作用可能已经代替了PER-TIM二聚体的功能(Zylka，M.J.等人(1998)Neuron 21，1115-1122)。另一种可能性是PER1和PER2中的节律形成了调节生物钟蛋白的转录活性的负反馈环(通过其PAS区域)，从而促进了其中一种或两种Per基因的表达(Shearman，L.P.等人(1997)Neuron 19，1261-1269)。
对3种mPer基因在哺乳动物生物钟中的作用的理解是许多研究工作的目标。由于mPER蛋白与dPER在结构上的同源性，预期mPER蛋白在哺乳动物反馈环中将作为负性元件而起作用。据认为，PER1参与了反馈环中其自身转录的负向调节，但最近有证据指出它涉及输入途径(Hastings，M.H.等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 26，15211-15216)。PER2是最具特征的蛋白，mPER2突变小鼠(mPer2BrdmI)在其PAS二聚化区域的羧基部分缺少87个残基，在正常的明暗环境中它们的昼夜节律周期缩短，但在完全黑暗的环境中则显示了无节律性。这种突变也减少了SCN中mPer1和mPer2的周期性表达，这表明mPer2在体内可能调节mPer1(Zheng，B.等人(1999)Nature 400，169-173)。已经显示PER2在中枢生物钟的“传动装置”的调节中具有双重作用(Shearman，L.P.等人(2000)Science288，1013-1018)。在该研究中，PER2显示与隐色素(CRY)蛋白结合并易位到细胞核内，在细胞核内CRY负向调节由CLOCK和BMAL1正向转录复合物驱动的转录。在进入细胞核时，PER2通过一种目前尚未明确的机理正向调节BMAL1的转录而启动生物钟的正向动作(positive arm)。目前对于PER3的功能知之甚少，然而，在mPer3基因敲除小鼠中，观察到了对于昼夜节律活动的微妙影响，因此，PER3被认为涉及了昼夜节律控制的输出途径(Shearman，L.P.等人(2000)Mol.Cell.Biol.17，6269-6275)。据报导，mPER蛋白彼此间相互作用并且mPER3可以作为mPER1和mPER2的载体将它们导入细胞核内，这对于在SCN中产生昼夜节律信号是很关键的(Kume，K.等人(1999)Cell 98，193-205；Takano，A.等人(2000)，FEBSLetters，477，106-112)。
假定通过昼夜节律钟组分的磷酸化可调节周期的长短。特异性蛋白激酶调节果蝇昼夜节律的第一个遗传学证据是新基因doubletime(dbt)的发现，该基因编码蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶(DBT)(Price J.L.等人(1998)Cell 94，83-95；Kloss B.等人(1998)Cell 94，97-107)。dbt的错义突变引起昼夜节律的改变。dbt的无效等位基因引起dPER的低度磷酸化和无节律性。
与DBT最密切相关的哺乳动物激酶是酪蛋白激酶Iε(CKIε)和酪蛋白激酶Iδ(CKIδ)。两种激酶都显示与mPER1结合，若干研究显示CKIε将小鼠的PER1和人的PER1磷酸化(Price J.L.等人(1998)Cell 94，83-95；Kloss B.等人(1998)Cell 94，97-107)。在用野生型hCKIε共转染的人胚胎肾293T细胞的研究中，hPER1显示出磷酸化的显著增加(其证据是分子的量的变化)。在该研究中，磷酸化的hPER1的半衰期约为12小时，而未磷酸化的hPER1则在细胞中保持稳定达24小时以上。这表明hPER1的磷酸化引起蛋白稳定性的降低(Kessler，G.A.等人(2000)NeuroReport，11，951-955)。另外的研究也显示PER1被hCKIε磷酸化的结果包括细胞质滞留和蛋白的不稳定性(Vielhaber，E.等人(2000)Mol.Cell.Biol.13，4888-4899；Takano，A.等人(2000)FEBS Letters 477，106-112)。
对于选择CKIε还是CKIδ作为哺乳动物可能的调节子这一问题，没有生化方面的理由，直到Lowery等人[(2000)Science 288，483-491]发现在金黄仓鼠中，CKIε的半显性突变(tau突变，Ralph，M.R.和Menaker，M.(1988)Science 241，1225-1227)引起杂合动物和纯合动物的昼夜节律周期均被缩短(分别为22小时和20小时)。在该实例中，CKIε活性水平的下降引起了PER磷酸化的下降，推测较高水平的细胞质PER蛋白引起细胞核进入的加强以及昼夜节律周期的改变。最近表明通过哺乳动物生物钟蛋白hPER1和hPER2翻译后修饰，CKIδ可能也涉及昼夜节律性的调节[Camacho，F.等人(2001)FEBS Letters 489(2，3)，159-165]。因此，哺乳动物或人CKIε和/或CKIδ的抑制剂(包括小分子抑制剂)提供了相位移动或重新形成昼夜节律钟的新手段。如下文所述，昼夜节律的改变可用于治疗睡眠或心境障碍。
美国专利6,555,328 B1公开了细胞中的筛选方法以确定改变昼夜节律的化合物，该方法基于改变人酪蛋白激酶Iε和/或人酪蛋白激酶Iδ将生物钟蛋白hPER1、hPER2和hPER3磷酸化的能力的试验化合物。例如，用hCKIε和Per1或Per2共转染HEK293T细胞。为了评价对CKIε的抑制和CKIε抑制剂与昼夜节律生物学之间的关系，开发了昼夜节律可用常规方法监控的高通量细胞试验(33rd Annual Meeting，Soc.for Neurosci.，November 8-12，2003，Abstract numbers 284.1，284.2和284.3)。该试验包括稳定表达Mper1-luc构建物的Rat-1成纤维细胞，因此能够通过对光输出进行数天的监视来反复估算萤光素酶的活性，从而测定活细胞中Mper1启动子的节律活性。该试验重复测定的方式使CKIε抑制剂对昼夜节律的浓度依赖性作用的评价精确并可重现，并提供了将CKIε抑制与昼夜节律周期改变相关联。
睡眠障碍分为四个主要类别，包括原发性睡眠障碍(睡眠障碍和深眠状态)、与内科/精神病学障碍相关的睡眠障碍以及一类由于数据不足而无法分类的臆测性睡眠障碍。原发性睡眠障碍被认为是由于负责睡眠-清醒产生的内在系统(内环境稳定系统)或负责计时的内在系统(昼夜节律系统)的异常引起的。睡眠障碍是开始或维持睡眠方面的障碍，并且包括原发性失眠、睡眠过度(过度的睡眠)、发作性睡眠、呼吸相关的睡眠障碍、昼夜节律睡眠障碍以及没有另外说明的睡眠障碍。原发性失眠的特征在于持续的(一个月以上)难以开始和维持睡眠或非恢复性睡眠。与原发性失眠相关的睡眠困难引起显著的痛苦或损伤，包括白天易激惹、注意力不集中、疲劳和不适、情绪和动力衰退。昼夜节律睡眠障碍包括时差综合征、轮班工作睡眠障碍、睡眠时相前移综合征和睡眠时相后移综合征(J.Wagner，M.L.Wagner和W.A.Hening，Annals of Pharmacotherapy(1998)32，680-691)。强制睡眠实例的个体表明在昼夜节律的某些时间内，其觉醒时间相对于睡眠时间占较高的百分比(Dijk和Lockley，J.Appl.Physiol.(2002)92，852-862)。通常可以接受的是随着年龄的增长，睡眠的昼夜节律也有所前移并且往往引起睡眠质量下降(Am J Physiol Endocrinol Metab.(2002)282，E297-E303)。因此，昼夜节律时相外的睡眠在质量和数量方面都可能受损害，这由轮班工作和时差所引起的睡眠变化进一步证明。人昼夜节律钟的紊乱可以引起睡眠障碍，而调节昼夜节律的药物，例如CKIε和/或CKIδ抑制剂，可用于治疗睡眠障碍，并且特别是昼夜节律睡眠障碍。
心境障碍可分为抑郁障碍(单相性抑郁)、双相性抑郁以及两种基于病因学的障碍(包括由普通医学病症引起的心境障碍和物质诱导的心境障碍)。抑郁障碍分为重症抑郁障碍、心境障碍以及没有另外说明的抑郁障碍。双相性精神障碍分为I型双相性精神障碍和II型双相性精神障碍。观察结果表明，“季节性模式”一词应用于反复发作的重症抑郁障碍以及应用于I型双相性精神障碍和II型双相性精神障碍中的重症忧郁发作的模式。显著的无反应性、睡眠过度、饮食过量、体重增加以及热衷于碳水化合物类食物往往是以季节性模式发作的重症抑郁障碍的特性。尚不清楚季节性模式是更多地在反复发作的重度忧郁障碍中还是在双相性精神障碍中。但是，在两种双相性精神障碍中，II型双相性精神障碍比I型双相性精神障碍似乎更可能出现季节性模式。在某些个体中，躁狂发作或轻度躁狂发作也可能与特定的季节有关。冬季型模式似乎随纬度、年龄和性别而出现不同。患病数随着纬度的增加而增加；较年轻的人冬季抑郁发作的危险较高；而女性患者则在季节性模式的人群中包括60％至90％。文献中常用的术语季节性情感障碍(SAD)是心境障碍的亚型，其在Diagnostic and StatisticalManual of Mental Disorders IV(DSM-IV)(American PsychiatricAssociation：“Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders”，Fourth Edition，Text Revision.Washington，DC，American PsychiatricAssociation，2000)中，当描述I型双相性精神障碍、II型双相性精神障碍或复发性重症抑郁障碍中的重症抑郁发作的季节性模式时，被称为“具有季节性模式”(E.M.Tam等人，Can.J.Psychiatry(1995)40，457-466)。DSM-IV中描述了抑郁障碍、重症抑郁障碍、重症抑郁发作、I型双相性精神障碍、II型双相性精神障碍以及季节作用的特性和诊断。
患有重症抑郁障碍(包括以典型地在冬季反复发作的抑郁发作为特征的SAD)的患者，对光疗法显示出正反应(Kripke，Journal of AffectiveDisorders(1998)49(2)，109-117)。强光治疗SAD和重症抑郁障碍患者的成功引起了几种假设的提出以解释光治疗作用的基本作用机理。这些假设包括“昼夜节律假设”，该假设认为可将强光的抗抑郁作用和与睡眠相关的昼夜节律起搏器的时相位移联系起来(E.M.Tam等人，Can.J.Psychiatry(1995)40，457-466)。以下事实支持光疗法和昼夜节律之间的联系：在重症抑郁障碍中，临床有效的光疗法在昼夜节律时相中引起伴随的位移，而且光疗法的临床效果似乎取决于光疗法的时相位移能力(Czeisler等人，TheJournal of Physiology(2000)526(Part 3)，683-694；Terman等人，Arch.Gen.Psychiatry(2001)58，69-75)。另外，光疗法也显示促进和加强重症抑郁障碍药物疗法的效果(Benedetti等人，J.Clin.Psychiatry(2003)64，648-653)。因此，酪蛋白激酶Iε和/或酪蛋白激酶Iδ的抑制将可预期引起昼夜节律时相的位移并且该抑制代表了潜在的临床有效的治疗心境障碍的单一疗法或组合疗法。
应该注意的是，睡眠紊乱是多种精神病障碍的标准症状(W.V.McCall，J.Clin.Psychiatry(2001)62(suppl 10)，27-32)。睡眠紊乱是抑郁障碍的共同特点并且失眠是抑郁症中经常报道的睡眠紊乱，90％以上的抑郁患者患有失眠(M.E.Thase，J.Clin.Psychiatry(1999)60(suppl 17)，28-31)。越来越多的证据证明，原发性失眠和重症抑郁障碍具有共同的发病机理。假设促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)活性过强(由于遗传素因或可能的早期紧张)和紧张引起过分和延长的睡眠紊乱，并最终引起原发性失眠。在非紧张条件下CRF分泌的昼夜节律性可能在正常的睡眠-清醒表现中起了一定的作用(G.S.Richardson和T.Roth，J.Clin Psychiatry(2001)62(suppl 10)，39-45)。因此，调节昼夜节律性的药物(例如通过抑制酪蛋白激酶Iε和/或酪蛋白激酶Iδ调节昼夜节律性的药物)可能用于治疗由影响CRF分泌而引起的抑郁障碍。
以上所涉及的所有参考文献均全部并入本文作为参考。
因此，本发明的目的是应用3-芳基硫代吲哚-2-甲酰胺、5-取代的-3-芳基硫代吲哚-2-甲酰胺及相关类似物的方法，所述的化合物作为将人生物钟蛋白阶段(hPER)人酪蛋白激酶Iε磷酸化的抑制剂，因此，这些化合物可用作药物，特别用于治疗和/或预防与中枢神经系统相关的疾病和障碍。该目的和本发明的其它目的将通过以下对本发明的详细说明而变得显而易见。
发明内容
因此，根据本发明的实践，提供了用于抑制人酪蛋白激酶Iε活性和人生物钟蛋白阶段(hPER)磷酸化用于治疗与人昼夜节律钟紊乱相关的中枢神经系统的疾病或障碍的方法，例如治疗心境障碍(包括重症抑郁障碍、I型双相性精神障碍和II型双相性精神障碍)以及治疗睡眠障碍(包括昼夜节律睡眠障碍例如轮班工作睡眠障碍、时差综合征、睡眠时相前移综合征以及睡眠时相后移综合征)的方法；该方法包括给需要该治疗的患者施用治疗有效量的式I化合物。
因此，本发明的广义的实施方案涉及治疗患有通过抑制酪蛋白激酶Iε的活性而得到改善的疾病或障碍的患者的方法，该方法包括给所述的患者施用治疗有效量的式I化合物：
Figure A20058003465200161
其中
X是H、Cl、F、Br、NO2、CN、OR2、NR2R2、HNSO2-C1-3烷基或NHCO-C1-3烷基；
Y是-S(O)n-或-O-，其中n是0、1或2；
R1是
1)未取代的或被一个或多个下列基团取代的芳基：
a)C1-5烷氧基，
b)OH，
c)卤素，
d)NR2R2，或
e)未取代的或被一个或多个下列基团取代的C1-5烷基：
i)OH或
ii)C1-5烷氧基；
2)未取代的或被一个或多个下列基团取代的杂环：
a)未取代的或被一个或多个下列基团取代的C1-5烷基：
i)OH或
ii)C1-5烷氧基，
b)C1-5烷氧基，
c)OH，
d)卤素，或
e)NR2R2；
3)未取代的或被一个或多个下列基团取代的C1-5烷基：
a)C1-5烷基，
b)C1-5烷氧基，
c)OH，或
d)未取代的或被一个或多个下列基团取代的芳基：
i)C1-5烷基，
ii)C1-5烷氧基，
iii)OH，
iv)卤素，或
v)NR2R2；
Z是
1)C(＝O)NR2R3或
2)C(＝O)R4；
R2是氢或C1-3烷基；
R3是氢、C1-5烷基或C3-6环烷基；
R4是未取代的或被一个或多个下列基团取代的1-哌啶基、1-吡咯烷基、1-哌嗪基或4-吗啉基：
1)C1-5烷基，
2)C1-5烷氧基，
3)OH，
4)卤素，或
5)NR2R2；
或上述化合物的立体异构体、对映异构体、外消旋体或互变异构体，或其药学上可接受的盐。
本发明另一个实施方案涉及在患者内抑制酪蛋白激酶Iε活性的方法，该方法包括给所述患者施用治疗有效量的式I化合物，或该化合物的立体异构体、对映异构体、外消旋体或互变异构体，或其药学上可接受的盐。
本文所用的术语“立体异构体”是通用术语，其用于仅在原子空间取向不同的各分子的所有异构体。术语立体异构体包括镜象异构体(对映异构体)、镜象异构体混合物(外消旋体、外消旋体混合物)，几何(顺式/反式或E/Z)异构体，以及具有一个以上手性中心、互为非镜象的化合物的异构体(非对映异构体)。本发明的化合物可具有不对称中心并且以外消旋体、外消旋体混合物、各自的非对映异构体或对映异构体的形式出现，或以几何异构体的形式存在，本发明包括所述化合物的所有异构形式。
如有机化学中常用的，本文所用的术语“R”和“S”是表示手性中心的特殊构型。术语“R”(右)是指当沿着指向最低的优先基团的键观察时，基团优先(从最高至次低)为顺时针关系的手性中心的构型。术语“S”(左)是指当沿着指向最低的优先基团的键观察时，基团优先(从最高至次低)为逆时针关系的手性中心的构型。基团的优先是基于顺序规则的，在该规则中优先首先基于原子序数(以原子序数递减的次序)。优先的列表和讨论可参阅Stereochemistry of Organic Compounds，Ernest L.Eliel，Samuel H.Wilen和Lewis N.Mander，editors，Wiley-Interscience，John Wiley & Sons，Inc.，New York，1994)。
除了(R)-(S)系统外，较早的D-L系统也可用于本文以表示绝对构型，特别是在涉及氨基酸时。在此系统中确定费歇尔投影式的方向以便使主链上的1号碳原子位于顶端。词头“D”用于代表官能(决定)团在手性中心碳原子右边的异构体的绝对构型，而词头“L”则用于代表官能(决定)团在手性中心碳原子左边的异构体的绝对构型。
本文所用的术语“互变异构体”或“互变异构”是指两种(或两种以上)化合物的共存，这些化合物之间的区别只在于一个(或一个以上)可移动的原子的位置和电子分布，例如酮-烯醇互变异构体或互变异构。
本文所用的术语“烷基”意为含有一至五个碳原子的直链或支链饱和脂肪烃基，包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基等。
本文所用的术语“烷氧基”意为单价的取代基，它是含有一至五个碳原子、通过醚氧原子连接并且该醚氧原子具有自由价键的直链或支链烷基，包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基等。
本文所用的术语“C3-C6环烷基”意为含有三至六个碳原子的饱和单环烃环结构，包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
本文所用的术语“芳基”或“Ar”意为任何稳定的单环、二环或三环的碳环结构，每个环至多含有七个原子，其中至少一个环是芳族的并且是未取代的或被选自以下基团的一至三个取代基取代：羟基、C1-5烷氧基、卤素、-NH2、-NH(C1-3烷基)、-N(C1-3烷基)2，以及未取代的或被一个或多个OH或C1-5烷氧基取代的C1-5烷基。“芳基”或“Ar”的实例包括苯基、萘基、四氢萘基和联苯基。术语“芳基-(C1-5烷基)”包括4-甲基苯基、2-甲基苯基、苯基甲基(苄基)、苯基乙基、对甲氧基苄基、对氟苄基以及对氯苄基。
本文所用的术语“酰基”是指与羰基(C＝O)连接的含有一至六个碳原子的支链或直链饱和脂肪烃基，且该羰基具有自由价键。术语“酰基”包括乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基等。
本文所用的术语“杂环”或“杂环的”意为稳定的5至7元的单环或稳定的8至11元的二环杂环，它可以是饱和的也可以是不饱和的，且包括碳原子和一至三个选自N、O和S的杂原子，并且其中氮和硫杂原子可以任选被氧化，氮杂原子可以任选被季铵化，并且包括任何其中以上所定义的任何杂环与苯环稠合的二环基团。该杂环可以连接在任何能够产生稳定的结构的杂原子或碳原子上。该杂环单元的实例包括哌啶基、哌嗪基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、2-氧代氮杂_基、氮杂_基、吡咯基、吡咯烷基、吡唑基、吡唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、_唑基、_唑烷基、异_唑基、异_唑烷基、吗啉基、噻唑基、噻唑烷基、异噻唑基、奎宁环基、异噻唑烷基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、噻二唑基、苯并吡喃基、苯并噻唑基、苯并_唑基、呋喃基、四氢呋喃基、苯并呋喃基、四氢吡喃基、噻吩基、苯并噻吩基、硫代吗啉基、硫代吗啉基亚砜、硫代吗啉基砜以及_二唑基。
本文所用的术语“卤素”或“卤”是指氟、氯、溴或碘家族的成员。
当任何可变基团(例如芳基、杂环、R1、R2、R3、R4、X、Y、Z等)在任何组成部分或在本发明的式(I)中出现一次以上时，它每次出现时的定义独立于其在其它出现时的定义。并且，取代基和/或可变基团的组合只有当这种组合产生稳定化合物的情况下才是允许的。
本文所用的术语“治疗”是指：
(i)预防疾病、障碍或病症在易患但尚未被诊断为已患有该疾病、障碍和/或病症的患者身上发生；
(ii)抑制疾病、障碍或病症，例如抑制其发展；或
(iii)减轻疾病、障碍或病症，例如引起疾病、障碍和/或病症的消退。
本文所用的术语“患者”是指患有特定的疾病、障碍或病症的温血动物，例如哺乳动物。应该明确地理解的是，豚鼠、狗、猫、大鼠、小鼠、马、牛、羊以及人均是该术语意思范围之内的动物实例。
本文所用的术语“疾病”是指疾病、病或身体功能、系统或器官的中断、停止或障碍。
本文所用的术语“障碍”是指由于基因或胚胎的发育不良，或由于外源因素例如中毒、受伤或疾病而引起的身体功能、结构或这两者的紊乱。
本文所用的术语“病症(condition)”是指生命(a state of being)、健康或生理状况。
本文所用的术语“预防”是指对疾病的预防。
本文所用的术语“睡眠障碍”或“睡眠紊乱”意为失眠。
本文所用的术语“失眠”意为在通常应该睡眠的时间内，在不存在外来干扰例如噪音、强光等情况下不能睡眠；并且不能睡眠的程度变化可以从得不到休息或受到干扰的睡眠至正常睡眠持续时间的缩短乃至绝对的清醒状态。术语“失眠”包括原发性失眠、与精神病有关的失眠、物质诱导的失眠以及由于正常的睡眠-清醒时间表的变化(轮班改变、轮班工作睡眠障碍、时差或时差综合征等)引起的昼夜节律失眠。
本文所用的术语“原发性失眠”意为难以入睡、难以维持睡眠或难以获得有助于恢复的睡眠，其不是由于精神病或由于摄取或戒断某些物质(物质诱导的失眠)的生理作用而产生的。
本文所用的术语“昼夜节律睡眠障碍”包括时差或时差综合征、轮班工作睡眠障碍、睡眠时相前移综合征和睡眠时相后移综合征。
本文所用的术语“有效抑制量的化合物”或“有效酪蛋白激酶Iε抑制量的化合物”意思是为了对适于该治疗的患有疾病、障碍或病症的患者进行治疗，通过适当的施用途径而使生物可利用的足够的化合物。
本文所用的术语“治疗有效量”意为有效治疗指定疾病、障碍或病症的化合物的量。
本文中所用的短语“昼夜节律周期的延长”是指在以约每24小时一次的频率规律性出现的过程中，主要行为之间时间间隔的延长。
本文中所用的短语“昼夜节律周期的缩短”是指在以约每24小时一次的频率规律性出现的过程中，主要行为之间时间间隔的缩短。
本文所用的术语“药学上可接受的盐”旨在应用于任何本领域技术人员使用的适于用作药物的无毒的有机或无机加成盐，无论是已知的或将来发现的。形成适合的盐的说明性碱包括碱金属或碱土金属的氢氧化物，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙或氢氧化镁；氨和脂肪族胺、环胺或芳族胺，例如甲胺、二甲胺、三乙胺、二乙胺、异丙基二乙胺、吡啶和甲基吡啶。形成适合的盐的说明性酸包括无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等；有机羧酸，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸和二羟基马来酸、苯甲酸、苯基乙酸、4-氨基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、邻氨基苯甲酸、肉桂酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、2-苯氧基苯甲酸、2-乙酸基苯甲酸、扁桃酸等；以及有机磺酸，例如甲磺酸、对甲苯磺酸、1-萘磺酸、2-萘磺酸等。
本文所用的术语“药用载体”或“药学上可接受的载体”是指用于配制施用的治疗活性化合物并且在使用条件下基本上无毒性和无致敏性的已知的药用赋形剂。这些赋形剂的确切比例是由活性化合物的溶解度和化学性质、施用途径的选择以及标准的药用规范确定的。尽管化合物本身是有效的且能直接使用，但在实践本发明的方法时，优选将活性成分并入含有药用载体的组合物中。即活性成分的比例可在约5％至90％(重量)变化。
另外，本申请书中可能出现的缩略语如下：
Me(甲基)、Et(乙基)、Ph(苯基)、Et3N(三乙胺)、p-TsOH(对甲苯磺酸)、TsCl(对甲苯磺酰氯)、hept(庚烷)、DMF(二甲基甲酰胺)、NMP(1-甲基-2-吡咯烷酮或N-甲基-2-吡咯烷酮)、IPA(异丙醇或异丙基醇)、TFA(三氟乙酸)、DBU(1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一-7-烯)、DBN(1，5-二氮杂二环[4.3.0]壬-5-烯)、rt或r.t.(室温或环境温度)、min或min.(分钟)、h(小时)、UV(紫外)、LCMS(液相色谱质谱)、t-Boc或Boc(叔丁氧基羰基)、Bn(苄基)、t-Bu(叔丁基)、i-Pr(异丙基)、TFA(三氟乙酸)、HOAc(乙酸)、EtOAc(乙酸乙酯)、Et2O(乙醚)、EtOH(乙醇)、g(克)、mg(毫克)、μg(微克)、ng(纳克)、mL(毫升)、μL(微升)、L(升)、HPLC(高效液相色谱)、TLC、tlc或Tlc(薄层色谱)、g/L(克/升)、SiO2(硅胶)、L/min(升/分钟)、mL/min(毫升/分钟)、mmol(毫摩尔)、M(摩尔)、mM(毫摩尔)、μM(微摩尔)、nM(纳摩尔)、μCi(微居里)、CPM(每分钟计数)、rpm(每分钟转数)、mm(毫米)、μm(微米)、μ(微)、nm(纳米)、ppm(百万分之一)、psi(磅/平方英寸)、eq.或equiv.(当量)、RT(保留时间)、℃(摄氏度)以及K(开)。
因此，本发明的广义的实施方案涉及治疗患有通过抑制酪蛋白激酶Iε的活性而得到改善的疾病或障碍的患者的方法，该方法包括给所述的患者施用治疗有效量的式I化合物，或该化合物的立体异构体、对映异构体、外消旋体或互变异构体，或其药学上可接受的盐，
Figure A20058003465200231
其中：
X是H、Cl、F、Br、NO2、CN、OR2、NR2R2、HNSO2-C1-3烷基或NHCO-C1-3烷基；
Y是-S(O)n-或-O-，其中n是0、1或2；
R1是
1)未取代的或被一个或多个下列基团取代的芳基：C1-5烷氧基、OH、卤素、NR2R2或未取代的或被一个或多个OH或C1-5烷氧基取代的C1-5烷基；
2)未取代的或被一个或多个下列基团取代的杂环：未取代的或被一个或多个OH或C1-5烷氧基取代的C1-5烷基、C1-5烷氧基、OH、卤素或NR2R2；
3)未取代的或被一个或多个下列基团取代的C1-5烷基：C1-5烷基、C1-5烷氧基、OH，或未取代的或被一个或多个下列基团取代的芳基：C1-5烷基、C1-5烷氧基、OH、卤素或NR2R2；
Z是C(＝O)NR2R3或C(＝O)R4；
R2是氢或C1-3烷基；
R3是氢、C1-5烷基或C3-6环烷基；
R4是未取代的或被一个或多个下列基团取代的1-哌啶基、1-吡咯烷基、1-哌嗪基或4-吗啉基：C1-5烷基、C1-5烷氧基、OH、卤素或NR2R2。
本发明第二个实施方案涉及治疗患有通过抑制酪蛋白激酶Iε的活性而得到改善的疾病或障碍的患者的方法，其中所述的酪蛋白激酶Iε活性的抑制引起昼夜节律周期的延长。
本发明第三个实施方案涉及治疗患有通过抑制酪蛋白激酶Iε而得到改善的疾病或障碍的患者的方法，其中疾病或障碍是心境障碍或睡眠障碍。
本发明第四个实施方案涉及治疗患有通过抑制酪蛋白激酶Iε而得到改善的疾病或障碍的患者的方法，其中障碍是心境障碍。
本发明第五个实施方案涉及治疗患有通过抑制酪蛋白激酶Iε而得到改善的疾病或障碍的患者的方法，其中疾病或障碍是心境障碍，其选自抑郁障碍和双相性精神障碍。
本发明第六个实施方案涉及治疗患有抑郁障碍的患者的方法，其中抑郁障碍是重症抑郁障碍。
本发明第七个实施方案涉及治疗患有通过抑制酪蛋白激酶Iε而得到改善的疾病或障碍的患者的方法，其中障碍选自I型双相性精神障碍和II型双相性精神障碍。
本发明第八个实施方案涉及治疗患有通过抑制酪蛋白激酶Iε而得到改善的疾病或障碍的患者的方法，其中障碍是睡眠障碍。
本发明第九个实施方案涉及治疗患有睡眠障碍的患者的方法，其中睡眠障碍是昼夜节律睡眠障碍。
本发明第十个实施方案涉及治疗患有通过抑制酪蛋白激酶Iε而得到改善的疾病或障碍的患者的方法，其中疾病或障碍是昼夜节律睡眠障碍，其选自轮班工作睡眠障碍、时差综合征、睡眠时相前移综合征以及睡眠时相后移综合征。
本发明第十一个实施方案包括治疗患有通过抑制酪蛋白激酶Iε的活性而得到改善的疾病或障碍的患者的方法，该方法包括给所述患者施用治疗有效量的式I化合物，其中Y是S(O)2，Z是C(＝O)NH2或C(＝O)NHCH3并且R1是苯基或吡啶基。
第十一个实施方案范围内的一类化合物进一步为其中Y是S(O)2、Z是C(＝O)NH2并且R1是苯基的式I化合物。下列化合物是在该实施方案范围内的代表性实例：
3-苯磺酰基-5-氯-1H-吲哚-2-甲酰胺，和
3-苯磺酰基-1H-吲哚-2-甲酰胺。
第十一个实施方案范围内的第二类化合物进一步为其中Y是S、Z是C(＝O)NHCH3并且R1是苯基或吡啶基的式I化合物。下列化合物是在该实施方案范围内的代表性实例：
3-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-甲酸甲酰胺，和
3-(吡啶-2-基硫烷基)-1H-吲哚-2-甲酸甲酰胺。
本发明第十二个实施方案包括治疗患有通过抑制酪蛋白激酶Iε的活性而得到改善的疾病或障碍的患者的方法，该方法包括给所述患者施用治疗有效量的式I化合物，其中Y是O，Z是C(＝O)NH2并且R1是苯基、取代的苯基、C1-5烷基或取代的C1-5烷基。下列化合物是在该实施方案范围内的代表性实例：
3-苯氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
3-(4-甲氧基-苯氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
3-(4-氟-苯氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
3-(2-氟-苯氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
3-(4-氯-苯氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
3-甲氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
3-乙氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
3-异丙氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
3-叔丁氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺，和
3-苄氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺。
本发明第十三个实施方案包括治疗患有通过抑制酪蛋白激酶Iε的活性而得到改善的疾病或障碍的患者的方法，该方法包括给所述患者施用治疗有效量的式I化合物，其中Y是S、S(O)或S(O)2，Z是C(＝O)R4并且R4是1-哌啶基、1-吡咯烷基、1-哌嗪基或4-吗啉基。下列化合物是在该实施方案范围内的代表性实例：
(3-苯磺酰基-5-氯-1H-吲哚-2-基)-吗啉-4-基-甲酮，
(5-氟-3-对甲苯基硫烷基-1H-吲哚-2-基)-吡咯烷-1-基-甲酮，
(3-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-基)-哌啶-1-基-甲酮，
(5-氟-3-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-基)-吡咯烷-1-基-甲酮，
[3-(2-氨基-苯基硫烷基)-1H-吲哚-2-基]-吡咯烷-1-基-甲酮，
[3-(2-氨基-苯基硫烷基)-1H-吲哚-2-基]-哌啶-1-基-甲酮，
[3-(2-氨基-苯基硫烷基)-5-氟-1H-吲哚-2-基]-哌啶-1-基-甲酮，
[5-氟-3-(对甲苯-4-亚磺酰基)-1H-吲哚-2-基]-吡咯烷-1-基-甲酮，
(3-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-基)-哌嗪-1-基-甲酮盐酸盐，
[5-氟-3-(吡啶-2-基硫烷基)-1H-吲哚-2-基]-吡咯烷-1-基-甲酮，
[3-(吡啶-2-基硫烷基)-1H-吲哚-2-基]-吡咯烷-1-基-甲酮，
哌啶-1-基-[3-(吡啶-2-基硫烷基)-1H-吲哚-2-基]-甲酮，和
[5-氟-3-(吡啶-2-基硫烷基)-1H-吲哚-2-基]-哌啶-1-基-甲酮。
本发明第十四个实施方案包括治疗患有通过抑制酪蛋白激酶Iε的活性而得到改善的疾病或障碍的患者的方法，该方法包括给所述患者施用治疗有效量的式I化合物，其中Y是S，Z是C(＝O)NH2并且R1是吡啶基。下列化合物是在该实施方案范围内的代表性实例：
3-(吡啶-2-基硫烷基)-1H-吲哚-2-甲酰胺。
本发明第十五个实施方案包括治疗患有通过抑制酪蛋白激酶Iε的活性而得到改善的疾病或障碍的患者的方法，该方法包括给所述患者施用治疗有效量的式I化合物，其中Y是S，Z是C(＝O)NH2，R1是苯基或取代的苯基。下列化合物是在该实施方案范围内的代表性实例：
3-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
5-溴-3-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
3-(2-氨基-苯基硫烷基)-5-甲氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
3-(3-氟-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
3-(2-氨基-苯基硫烷基)-5-溴-1H-吲哚-2-甲酰胺，和
3-(2-氨基-苯基硫烷基)-1H-吲哚-2-甲酰胺。
本发明第十六个实施方案涉及抑制患者的酪蛋白激酶Iε的活性的方法，该方法包括给所述患者施用治疗有效量的式I化合物或其立体异构体、对映异构体、外消旋体或互变异构体以产生昼夜节律周期的延长。
本文公开的本发明所有的多种实施方案可以作为治疗本文所述的多种疾病和障碍的方法。如本文所述，本发明的方法中所用的化合物能够抑制酪蛋白激酶Iε的作用。本领域技术人员将很容易理解，本文中所述的疾病和障碍不旨在限制、而是为了说明本发明化合物的功效。因此，应当理解本发明化合物可用于治疗任何通过抑制酪蛋白激酶Iε而得到改善的疾病或障碍。
化学合成
本发明化合物是通过本领域技术人员众所周知的方法制备的。特别的是，本发明化合物在美国专利No.5,527,819中公开并且可根据该专利所提供的方法制备，其全部并入本文作为参考。更特别的是，可用于制备本发明化合物的多种的合成过程在流程图1、2和3中说明，并且其方法通过以下实施例详细描述。
制剂
本发明的药物组合物是以药学领域众所周知的方法制备的。载体或赋形剂可以是用作活性成分的载体或媒介物的固体、半固体或液体材料。适合的载体或赋形剂是本领域众所周知的。药物组合物可适于口服、吸入、非肠道或局部使用，并可以以片剂、胶囊剂、混悬剂、糖浆剂、气雾剂、吸入剂、栓剂、药膏、散剂、溶液剂等形式给患者施用。本文所用的术语“药用载体”或“药学上可接受的载体”意为一种或多种赋形剂。
在制备本发明化合物的药物组合物或制剂中，应注意通过选择的施用途径，包括口服、非肠道和皮下途径来确保有效治疗量的活性化合物的生物利用度。例如，有效的施用途径包括皮下、静脉内、经皮、鼻内、直肠、阴道等，包括从植入剂中释放以及直接将活性成分和/或组合物直接注射进组织。
对于口服施用，本发明化合物可配制成含有或不合有惰性稀释剂或可食用载体的固体或液体制剂，例如胶囊剂，丸剂、片剂、糖锭剂、散剂、溶液剂、混悬剂或乳剂。胶囊剂、丸剂、片剂、糖锭剂等也可以含有一种或多种以下添加剂：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如海藻酸、玉米淀粉等；润滑剂，例如硬脂酸、硬脂酸镁或Sterotex_(Stokely-Van Camp Inc.，Indinapolis，Indiana)；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；以及矫味剂，例如薄荷油、水杨酸甲酯或水果矫味剂。当剂型为胶囊剂时，其也可含有液体载体，例如聚乙二醇或脂肪油。所使用的材料应该是药学纯的并且在用量范围内是无毒的。
对于非肠道施用，本发明化合物可以以化合物的溶液剂或混悬剂的可注射剂量施用，该化合物与可药用载体存在于药学上可接受的稀释剂中，其可以是无菌液体例如油包水液体或不加入表面活性剂和其它药学上可接受的赋形剂的液体。可以在制剂中使用的说明性的油是石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油和矿物油。通常，水、生理盐水、葡萄糖和相关的糖的水溶液、乙醇和二元醇(例如丙二醇)是优选的液体载体，特别是用于可注射的溶液剂。可以将非肠道制剂装入由惰性塑胶或玻璃制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
上述溶液剂或混悬剂也可含有一种或多种以下添加剂：无菌稀释剂，例如注射用水、生理盐水、非挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。
本发明化合物可以以皮肤贴剂、储库式注射剂或植入制剂的形式施用，这些形式以使活性成分缓慢释放的方法配制。可将活性成份压制成小球或小圆柱体并且将其作为储库式注射剂或植入剂皮下植入或肌内注射。植入剂可使用惰性材料，例如生物降解的聚合物和合成硅氧烷。适当的药用载体和制剂技术可在标准的教科书内查到，例如Remington：The Science andPractice of Pharmacy，19th edition，Volumes 1 and 2，1995，Mack PublishingCo.，Easton，Pennsylvania，U.S.A.，其并入本文作为参考。
在治疗本文所述的多种疾病、障碍和病症中，适合的剂量水平是每天约0.01mg/kg至约250mg/kg，优选约每天0.05mg/kg至约100mg/kg，并且特别是每天约0.05mg/kg至约40mg/kg。本发明化合物可按每天1至4次的方案施用并且可根据被所治疗疾病、障碍或病症的性质而定。
制备本发明实例化合物的流程图1至3如下。表1和表2说明了按照流程图1至3合成的化合物，并且实例化合物在体外抑制酪蛋白激酶Iε的生物数据列于表3。
具体实施方式
实施例
以下实施例旨在更详细地说明本发明，而并不以任何方式限制本发明的范围。
通用合成方法
除非另外说明，材料购自供应商并且无需进一步纯化即可使用。所有反应均使用无水试剂和溶剂在惰性气氛如氮气或氩气中进行。快速色谱使用EM Science硅胶60(40-63mm)，并使用所述的溶剂体系。薄层色谱使用0.25mm硅胶涂布的60F-254板(EM)并使用碘蒸气、紫外线或染色剂例如KMnO4溶液显色。
红外(IR)光谱是在Nexus 670 FTIR(Nicolet)光谱仪上记录的，样品按照说明制备，结果以波数(cm-1)表示。1H NMR光谱是在Varian Gemini和/或mercury 300、Unity 400或Unity plus和/或Inova 500MHz光谱仪上记录的，化学位移(δ)以ppm为单位，以四甲基硅烷(0.0ppm)或氯仿(CDCl3，7.26ppm)为参照物。除非另外说明，13C NMR光谱是在Varian Unityinstrument(100.57MHz，13C频率)上记录的，化学位移(δ)以ppm为单位，以CDCl3(77.0ppm)为参照物。质谱(MS)是在Finnigan MAT TSQ 700Mass Spectrometer System上，于120eV下应用甲烷(CI，120eV)的化学电离而获得的。液相色谱质谱(LCMS)是在与Gilson 215液体处理器连接的Micromass LCT上进行的。高分辨质谱分析(精确质谱)是在MicromassQTOF质谱仪上，以ESI方式于质量分辨率10,000进行的。为质子化分子离子(M+1)(其中M是指分子离子)确定了精确的质量值。
3-芳基硫代吲哚及其类似物
                          流程图1
Figure A20058003465200301
a)K2CO3、MeOH；b)NH4OH/LiCl或NH3/MeOH/LiCl，或Me2NH/MeOH或Me2NH/H2O；c)MeOH/H2O/NaOH，然后HCl；d)羰基二咪唑和NH4OH，或羰基二咪唑和伯胺或仲胺；e)NaH、DMF、R1-S-S-R1或Cs2CO3、DMF、R1-S-S-R1(R1＝芳基)；f)H2O2。
通用合成方法I(酯交换；流程图I，步骤a)
将K2CO3(1.20当量，50.7mmol)加至吲哚-2-甲酸乙酯1(42.3mmol)的MeOH(50mL)溶液中，边搅拌边于55℃加热该混悬液达1h。以tlc(乙醚/庚烷)监控反应，并且待反应完成后在真空中浓缩反应物，用H2O稀释并搅拌15min。通过过滤收集固体并于65℃真空干燥3h，得到吲哚-2-甲酸甲酯2。
通用合成方法II(用NH4OH进行酰胺化；流程图I，步骤b)
于室温下将1或2(40.0mmol)在NH4OH(100mL)和LiCl(1.0当量)中的混悬液搅拌16h。从反应混合物中过滤出固体，用H2O洗涤并风干，得到响应的伯酰胺4。
通用合成方法III(用NH3/MeOH进行酰胺化；流程图I，步骤b)
搅拌吲哚-2-甲酸乙酯1(X＝H，4.67mmol)的7N NH3/MeOH(20mL)溶液并且加入LiCl(1.0当量，4.67mmol)。于室温下将反应混合物搅拌5天，通过tlc(10％MeOH/CH2Cl2)监控反应。将混合物浓缩至最小体积，用H2O稀释并通过过滤收集固体。用H2O洗涤滤饼并于60℃在真空中干燥，得到伯酰胺4(X＝R2＝R3＝H)，tlc Rf(硅胶，10％MeOH/CH2Cl2)：1(X＝H)0.95，2(X＝H)0.93，4(X＝R2＝R3＝H)0.40。
通用合成方法IV(甲酯2水解为羧酸3，流程图I，步骤c)。
将NaOH(82.0mmol)加至吲哚-2-甲酸甲酯2(27.0mmol)在MeOH/H2O(3∶1，160mL)中的混悬液中。于室温下搅拌16h，浓缩并用HCl酸化。通过过滤收集沉淀物，用H2O洗涤并真空干燥，得到吲哚-2-甲酸3。
通用合成方法V(2-吲哚甲酸3的酰胺化；流程图I，步骤d)。
将羰基二咪唑(1.10当量，5.5g，34.0mmol)加至吲哚-2-甲酸3(31.0mmol)的无水THF(50mL)溶液。搅拌1h并将浓NH4OH(50mL)一次性加至该稠混悬液中。于室温下搅拌，16h后通过过滤收集固体，用H2O洗涤并于40℃真空干燥，得到吲哚-2-甲酰胺4(R2＝R3＝H)。
通用合成方法VIa(用伯胺或仲胺将2-吲哚甲酸3酰胺化；流程图I，步骤d)。
将羰基二咪唑(1.5当量，18.6mmol)加至吲哚-2-甲酸3(12.4mmol)的无水THF(30mL)溶液中并搅拌1h。然后一次性加入胺(例如甲胺、吡咯烷、哌啶、哌嗪、苄胺或吗啉，3.0当量，37.2mmol))并于室温下搅拌反应物。16h后，用水将反应猝灭，通过过滤收集沉淀物并真空干燥，得到N-取代的-吲哚-2-甲酰胺4。
通用合成方法VIb(用伯胺和仲胺将吲哚-2-甲酸乙酯或吲哚-2-甲酸甲酯酰胺化，流程图I，步骤b)
搅拌吲哚-2-甲酸乙酯1(X＝H，4.67mmol)或吲哚-2-甲酸甲酯2(X＝H，4.67mmol)的Me2NH/H2O(50mL，40％)溶液。于室温下搅拌该反应混合物16h，通过tlc(10％MeOH/CH2Cl2)监控反应。将混合物浓缩至最小体积，用H2O稀释并通过过滤收集固体。用H2O洗涤滤饼并于60℃真空干燥，得到二甲酰胺4(X＝H，R2＝R3＝Me)，tlc Rf＝0.65(硅胶，10％MeOH/CH2Cl2)。
通用合成方法VIIa(用NaH合成3-芳基硫代吲哚；流程图I，步骤e)
在N2中，将吲哚-2-甲酰胺4(8.18mmol)的DMF(5mL)溶液于室温下加至搅拌的NaH(60％油分散物，1.2当量，9.8mmol)在DMF(75mL)中的混悬液中。于5min后，一次性加入二芳基二硫化物(1.0当量，8.18mmol)并且边搅拌边将反应物加热至95℃达16h。然后取等分样品分配于EtOAc/H2O两相之间并通过薄层色谱在硅胶上(10％MeOH/CH2Cl2)分析等分的有机相。在真空中浓缩反应物，用H2O稀释并搅拌30min，过滤并风干。以色谱法在硅胶上纯化粗品固体，用9∶1CH2Cl2/MeOH洗脱，得到3-芳基硫代-取代的吲哚I。
通用合成方法VIIb(用Cs2CO3合成3-芳基硫代吲哚；流程图I，步骤e)
在吲哚-2-甲酰胺(0.418mmol)和DMF(10mL)的溶液中加入Cs2CO3(0.31mmol)，然后加入二芳基二硫化物(0.65mmol)。在氮气气氛中于100℃加热反应物约2.5h(以tlc/LC-MS监视以确定反应何时完成)。冷却至室温，浓缩至最小体积并在盐水和EtOAc(3mL)之间分配。用EtOAc再次萃取，干燥合并的萃取物(MgSO4)，过滤并浓缩滤液，得到粗品3-芳基硫代吲哚-2-甲酰胺。在ISCO(4.0g SiO2)柱上纯化粗品产物，得到3-芳基硫代吲哚-2-甲酰胺I。
通用合成方法VIIc(流程图1，任选步骤f)
用H2O2(30％w/w，2.5mmol)和Na2CO3(2.0mmol)处理3-芳基硫代吲哚-2-甲酰胺溶液(1mmol)。于室温下搅拌16h，用水将反应猝灭，用EtOAc萃取，用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩，得到3-芳基磺酰基-1H-吲哚-2-甲酰胺I。
1H-吲哚-2-甲酰胺4(X＝H)(从乙酯开始)。
按照通用合成方法II所述，处理吲哚-2-乙酸乙酯1(X＝H，2.0g，10.57mmol)，得到标题化合物(1.3g，76.9％)，为象牙色粉末：mp 233-234.5℃；1H NMR(DMSO-d6)δ11.53(brs，1H)，7.95(brs，1H)，7.60(d，1H，J＝8.1Hz)，7.42(d，1H，J＝8.0Hz)，7.36(brs，1H)，7.17(t，1H，J＝8.1Hz)，7.11(s，1H)，7.02(t，1H，J＝8.1Hz)。
1H-吲哚-2-甲酰胺4(X＝H)(从吲哚-2-甲酸开始)。
按照通用合成方法V所述，处理1H-吲哚-2-甲酸3(X＝H，1.0g，6.2mmol)，得到标题化合物(854mg，86.0％)，为黄色粉末：mp 233-234.5℃；
1H NMR(DMSO-d6)δ11.53(brs，1H)，7.95(brs，1H)，7.60(d，1H，J＝8.1Hz)，7.42(d，1H，J＝8.0Hz)，7.36(brs，1H)，7.17(t，1H，J＝8.1Hz)，7.11(s，1H)，7.02(t，1H，J＝8.1Hz)。分析：C9H8N2O计算值：C，67.50；H，5.03；N，17.50。实测值：C，67.20；H，4.95；N，17.25。
3-苯磺酰基-5-氯-1H-吲哚-2-甲酰胺(Ia)
按照通用合成方法VIIc所述，用H2O2处理3-苯基硫烷基-5-氯-1H-吲哚-2-甲酰胺(303mg，1.0mmol)，得到Ia(表1)，为白色固体；MS Obs336(M+1)。
3-苯磺酰基-1H-吲哚-2-甲酰胺(Ib)
按照通用合成方法VIIc所述，用H2O2处理3-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-甲酰胺，(Ic.268mg，1.0mmol)，得到Ib，为白色固体：mp 204℃(dec)；1H NMR(DMSO-d6)δ12.9(brs，1H)，8.5(brs，1H)，8.2(brs，1H)，8.0(m，3H)，7.6(m，4H)，7.3(m，2H)；MS Obs 301.1(M+1)；LC/MS：m/z＝301(M+H)。
3-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-甲酰胺(Ic)
按照通用合成方法VIIa所述，用二硫二苯(1.0当量，436mg)处理1H-吲哚-2-甲酰胺4(X＝H，320mg，2.0mmol)，得到标题化合物(500mg，93.3％)，为象牙色固体，mp 197-197.5℃。
分析：C15H12N2SO计算值：C，67.15；H，4.51；N，10.44。实测值：C，66.03；H，4.42；N，10.18。
5-溴-3-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-甲酰胺(Id)
按照通用合成方法III所述，用7N NH3/MeOH处理5-溴-1H-吲哚-2-甲酸乙酯1(X＝Br，4.67mmol)，得到5-溴-1H-吲哚-2-甲酰胺4(X＝Br，R2＝R3＝H)，为象牙色固体。按照通用合成方法VIIb所述，用二硫二苯(1.50当量，141mg，0.65mmol)处理5-溴-1H-吲哚-2-甲酰胺(100mg，0.41mmol)，得到标题化合物Id(85mg)，为象牙色固体。1H NMR(DMSO-d6)δ12.5(brs，1H)，8.0(brs，1H)，7.72(brs，1H)，7.59-7.08(m，8H)；LC/MS：m/z obs＝347(M+1)。
3-(2-氨基-苯基硫烷基)-5-甲氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺(Ie)
按照通用合成方法V所述，处理5-甲氧基-1H-吲哚-2-甲酸1(X＝OCH3，1.09g，5.71mmol)，得到5-甲氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺4(X＝OCH3，R2＝R3＝H；536mg，49％)，为黄色固体，mp 204-205℃；1H NMR(DMSO-d6)δ11.3(brs，1H)，7.9(brs，1H)，7.3(d，2H)，7.1(d，2H)，6.8(d，1H)，3.8(s，3H)；LC/MS：m/z obs＝191(M+1)。按照通用合成方法VIIa所述，用2-氨基二硫二苯(1.4当量，546mg，2.2mmol)处理5-甲氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺(300mg，1.6mmol)，得到标题化合物Ie(321mg，65％)，为浅绿色固体，mp 203℃(dec)；1H NMR(DMSO-d6)δ12.0(brs，1H)，8.0-7.8(2brs，2H)，7.4(d，1H)，7.1-6.9(m，4H)，6.8(m，1H)，6.6(m，1H)，5.5(m，2H)，3.8(s，3H)；LC/MS：m/z obs＝314(M+1)。
3-(3-氟-苯基硫烷基)-1H-吲哚-2-甲酰胺(If)
按照通用合成方法VIIa所述，用二-3-氟二硫二苯(1.5当量，534mg，2.1mmol)处理1H-吲哚-2-甲酰胺4(X＝R2＝R3＝H；225mg，1.4mmol)，得到标题化合物If(322mg，80％)，为白色固体：tlc(硅胶)Rf＝0.1(40％EtOAc/庚烷)。
3-(2-氨基苯基硫烷基)-5-溴-1H-吲哚-2-甲酰胺(Ig)
按照通用合成方法VIIb所述，用2-氨基二硫二苯(1.5当量，161mg，0.65mmol)处理5-溴-1H-吲哚-2-甲酰胺4(X＝Br，R2＝R3＝H；100mg，0.418mmol)，得到标题化合物Ig(113mg)，为象牙色固体。1H NMR(DMSO-d6)δ12.25(brs，1H)，8.01(brs，1H)，7.9(brs，1H)，7.7(s，1H)，7.25-6.2(m，6H)，5.45(s，2H)；LC/MS：m/z obs＝361.99(M+1)。
3-(2-氨基-苯基硫烷基)-1H-吲哚-2-甲酰胺(Ih)
按照通用合成方法VIIa所述，用2-氨基苯二硫醚(1.4当量，347mg，1.4mmol)处理1H-吲哚-2-甲酰胺4(X＝R2＝R3＝H；160mg，1.0mmol)，得到标题化合物Ih(135mg，37％)，为浅绿色固体：1H NMR(DMSO-d6)δ12.1(brs，1H)，8.0(brs，1H)，7.88(brs，1H)，7.58(d，1H，J＝7.8Hz)，7.48(d，1H，J＝8.7Hz)，7.28-7.23(m，1H)，7.12-7.10(m，1H)，6.92-6.86(m，2H)，6.70-6.67(m，1H)，6.44-6.39(m，1H)，5.45(brs，2H)；m/z obs＝284(M+1)。
3-(吡啶-2-基硫烷基)-1H-吲哚-2-甲酰胺(Ii)
按照通用合成方法VIIa所述，用2，2’-二硫代吡啶(1.0当量，0.5mmol)处理1H-吲哚-2-甲酰胺4(X＝R2＝R3＝H；80.0mg，0.5mmol)，得到标题化合物Ii(71.0mg，53％)，为褐色固体：MS Obs.270.2(M+1)。
3-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-甲酸甲酰胺(Ij)
将羰基二咪唑(1.10当量，1.1g，6.83mmol)加至1H-吲哚-2-甲酸3(X＝H，1.0g，6.21mmol)和无水THF(50mL)的溶液中。于室温下搅拌30min，然后一次性加入MeNH2·HCl(1.30当量，541mg，8.07mmol)。将DMF(10mL)加至反应物中并于室温下搅拌。2h后，将澄清的黄色反应物溶液倾倒至H2O中。通过过滤收集沉淀物并于40℃真空干燥，得到1H-吲哚-2-甲酸甲酰胺4(X＝R2＝H，R3＝CH3；860mg，80％)，为黄色固体。mp 222-223℃；1H NMR(DMSO-d6)δ11.6(brs，1H)，8.45(m，1H)，7.60(d，lH，J＝7.8Hz)，7.44(dd，1H，J＝1.05，8.25Hz)，7.20-7.14(m，1H)，7.60-7.00(m，1H)，2.82(d，3H，J＝4.2Hz)。m/z obs＝175(M+1)。按照通用合成方法VIIa所述，用二硫二苯(1.1当量，240mg，1.1mmol)处理1H-吲哚-2-甲酸甲酰胺(174mg，1.0mmol)，得到标题化合物Ij(140mg，50％)，为象牙色固体。mp 201-204℃；1H NMR(DMSO-d6)δ12.3(brs，1H)，8.3(m，1H)，7.48(d，1H)，7.42(d，1H)，7.3-7.0(m，7H)，2.9(d，3H)。
3-(吡啶-2-基硫烷基)-1H-吲哚-2-甲酸甲酰胺(Ik)
按照通用合成方法VIIa所述，用2，2’-二硫代吡啶(1.3当量，143mg)处理1H-吲哚-2-甲酸甲酰胺4(X＝R2＝H，R3＝CH3；87mg，0.5mmol)，得到标题化合物Ik(93mg，66％)，为白色固体：1H NMR(DMSO-d6)δ12.3(brs，1H)，8.4(m，1H)，8.3(m，1H)，7.6(m，2H)，7.4(m，1H)，7.3(m，1H)，7.2(m，2H)，6.7(d，1H)，2.9(d，3H)；MS obs 362(M+1)。
吲哚氧电子等排物(Il-Iu)的合成
                           流程图2
Figure A20058003465200361
a)NaNO2，HOAc，CH2Cl2，rt.  b)R1OH，Rh2(OAc)4，ClCH2CH2Cl，
c)KOH，EtOH/H2O  d)Im2CO，THF，NH4OH.
3-重氮基-3H-吲哚-2-甲酸乙酯(5)(流程图2，步骤a)
在N2气氛中，于室温下历经5min边搅拌边将冰醋酸(6mL)滴加入吲哚-2-甲酸乙酯(1，X＝H，2.0g，10.6mmol)和亚硝酸钠(7.3g，106mmol，10当量)在CH2Cl2(20mL)中的溶液中。约10min后，加入CH2Cl2(100mL)以促进搅拌生成的混悬液。于1.5h后用H2O将反应猝灭，除去有机层，用CH2Cl2萃取水相。依次用饱和NaHCO3和盐水洗涤合并的有机相，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩，纯化后得到5(1.62g，71％)，为黄色固体。(Kettle等人，Tetrahedron Lett.2000，6905-6907)。
通用合成方法VIII(重氮化合物5与醇的反应，得到吲哚乙酯6；流程图2，步骤b)。
在1，2-二氯乙烷(10mL)和催化量Rh2(OAc)4(0.08当量，0.072mmol，32mg)中，使3-重氮基-3H-吲哚-2-甲酸乙酯5(0.9mmol)与所需的芳基醇或烷基醇(1.5mmol)反应，于85℃加热3h。用CH2Cl2稀释反应混合物，经Celite_(硅藻土)过滤并浓缩，得到粗产物。通过快速色谱纯化该物质，得到所需的作为乙酯的吲哚氧电子等排物6。
通用合成方法IX(2-吲哚甲酸乙酯6l-u水解为羧酸7l-u；流程图II，步骤c)。
将KOH(5.0当量，2.5mmol，140mg)和H2O(2.0mL)的溶液加至吲哚-2-甲酸乙酯6(0.50mmol)在EtOH(10mL)中的混悬液中。于室温下搅拌16h，酸化(HCl)至pH 1并通过过滤收集沉淀物，得到相应的羧酸7。
3-苯氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺(Il)
按照通用合成方法VIII所述，使3-重氮基-3H-吲哚-2-甲酸乙酯5(300mg，1.38mmol)与苯酚(5.0当量，650mg，6.90mmol)反应。通过快速色谱纯化，得到3-苯氧基-1H-吲哚-2-甲酸乙酯6(R1＝苯基，303mg，78％)，为黄色固体。用通用合成方法IX将该酯水解为羧酸7(R1＝苯基)，然后按照通用合成方法V所述将羧酸转化为相应的伯酰胺，得到标题化合物Il，为浅紫色固体，tlc(硅胶)Rf＝0.15。
3-(4-甲氧基-苯氧基)-1H-吲哚-2-甲酰胺(Im)
按照通用合成方法VIII所述，使3-重氮基-3H-吲哚-2-甲酸乙酯5(231mg，1.10mmol)与4-甲氧基苯酚(1.4当量，186mg，1.5mmol)反应，得到3-(4-甲氧基苯氧基)-1H-吲哚-2-甲酸乙酯6(R1＝4-甲氧基苯基，169mg，51％)，为象牙色固体。用通用合成方法IX将该酯水解为羧酸7(R1＝4-甲氧基苯基)，然后按照通用合成方法V所述将羧酸转化为相应的伯酰胺，得到标题化合物Im，为无色油状物，tlc(硅胶)Rf＝0.10。
3-(4-氟-苯氧基)-1H-吲哚-2-甲酰胺(In)
按照通用合成方法VIII所述，使3-重氮基-3H-吲哚-2-甲酸乙酯5(220mg，1.0mmol)与4-氟苯酚(10.0当量，1.1g，10.0mmol)反应，得到3-(4-氟-苯氧基)-1H-吲哚-2-甲酸乙酯6(R1＝4-氟苯基，184mg)，为白色固体。用通用合成方法IX将该酯水解为羧酸7(R1＝4-氟苯基)，然后按照通用合成方法V所述将羧酸转化为相应的伯酰胺，得到标题化合物In，为白色固体(109mg)，tlc(硅胶)Rf＝0.40。
3-(2-氟-苯氧基)-1H-吲哚-2-甲酰胺(Io)
按照通用合成方法VIII所述，使3-重氮基-3H-吲哚-2-甲酸乙酯5(220mg，1.0mmol)与2-氟苯酚(10.0当量，1.1g，10.0mmol)反应，得到3-(2-氟-苯氧基)-1H-吲哚-2-甲酸乙酯6(R1＝2-氟苯基，100mg)，为象牙色固体。用通用合成方法IX将该酯水解为羧酸7(R1＝2-氟苯基)，然后按照通用合成方法V所述将羧酸转化为相应的伯酰胺，得到标题化合物Io，为白色固体(59mg)，tlc(硅胶)Rf＝0.07。
3-(4-氯-苯氧基)-1H-吲哚-2-甲酰胺(Ip)
按照通用合成方法VIII所述，使3-重氮基-3H-吲哚-2-甲酸乙酯5(220mg，1.0mmol)与4-氯苯酚(10.0当量，1.3g，10.0mmol)反应，得到3-(4-氯-苯氧基)-1H-吲哚-2-甲酸乙酯6(R1＝4-氯苯基，90mg)，为白色固体。用通用合成方法IX将该酯水解为羧酸7(R1＝4-氯苯基)，然后按照通用合成方法V所述将羧酸转化为相应的伯酰胺，得到标题化合物Ip，为象牙色固体(50mg)，tlc(硅胶)Rf＝0.09。
3-甲氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺(Iq)
按照通用合成方法VIII所述，使3-重氮基-3H-吲哚-2-甲酸乙酯5(300mg，1.38mmol)与甲醇(5.0当量，0.3mL，6.91mmol)反应，得到3-甲氧基-1H-吲哚-2-甲酸乙酯6(R1＝甲基，210mg)，为白色固体[tlc(硅胶)，Rf＝0.50]。用通用合成方法IX将该酯水解为羧酸7(R1＝甲基)，然后按照通用合成方法V所述将羧酸转化为相应的伯酰胺，得到标题化合物Iq，为褐色固体(40mg)，tlc(硅胶)Rf＝0.03。
3-乙氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺(Ir)
按照通用合成方法VIII所述，使3-重氮基-3H-吲哚-2-甲酸乙酯5(300mg，1.38mmol)与乙醇(5.0当量，0.4mL，6.90mmol)反应，得到3-乙氧基-1H-吲哚-2-甲酸乙酯6(R1＝乙基)，为白色固体。用通用合成方法IX将该酯水解为羧酸7(R1＝乙基)，然后按照通用合成方法V所述将羧酸转化为相应的伯酰胺，得到标题化合物Ir，为褐色固体(124mg)，tlc(硅胶)Rf＝0.07。
3-异丙氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺(Is)
按照通用合成方法VIII所述，使3-重氮基-3H-吲哚-2-甲酸乙酯5(300mg，1.38mmol)与异丙醇(5.0当量，0.53mg，6.90mmol)反应，得到3-异丙氧基-1H-吲哚-2-甲酸乙酯6(R1＝异丙基)，为白色固体(33mg)；tlc(硅胶)Rf＝0.45。用通用合成方法IX将该酯水解为羧酸7(R1＝异丙基)，然后按照通用合成方法V所述将羧酸转化为相应的伯酰胺，得到标题化合物Is，为褐色固体(126mg)，tlc(硅胶)Rf＝0.10。
3-叔丁氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺(It)
按照通用合成方法VIII所述，使3-重氮基-3H-吲哚-2-甲酸乙酯5(220mg，1.0mmol)与t-BuOH(10.0当量，0.95mL，10.0mmol)反应，得到3-叔丁氧基-1H-吲哚-2-甲酸乙酯6(R1＝叔丁基，149mg)为白色固体。用通用合成方法IX将该酯水解为羧酸7(R1＝叔丁基)，然后按照通用合成方法V所述将羧酸转化为相应的伯酰胺，得到标题化合物It，为浅绿色固体(39mg)，tlc(硅胶)Rf＝0.09。
3-苄氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺(Iu)
按照通用合成方法VIII所述，使3-重氮基-3H-吲哚-2-甲酸乙酯5(305mg，1.4mmol)与苄醇(5.0当量，0.73mL，7.05mmol)反应，得到3-苄氧基-1H-吲哚-2-甲酸乙酯6(R1＝苄基)，为白色固体[MS obs＝296(M+1)]。用通用合成方法IX将该酯水解为羧酸7(R1＝苄基)，然后按照通用合成方法V所述将羧酸转化为相应的伯酰胺，得到标题化合物Iu，为褐色固体(115mg)，tlc(硅胶)Rf＝0.1。
                           伯胺Iv-Iai的合成
Figure A20058003465200391
R4＝4-吗啉代、1-哌啶基、1-吡咯烷基、4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基或4-哌嗪-1-基
a)羰基二咪唑/THF和吗啉、哌啶、吡咯烷或N-(叔丁氧基羰基)哌嗪；
b)NaH/DMF/R1-S-S-R1；c)CF3CO2H/HOAC以除去叔Boc保护基(如果存在)；d)H2O2。
(3-苯磺酰基-5-氯-1H-吲哚-2-基)-吗啉-4-基-甲酮(Iv)
按照通用合成方法VIIa所述，用二硫二苯处理5-氯-(1H-吲哚-2-基)-吗啉-4-基-甲酮8(X＝Cl，R4＝吗啉-4-基)，得到(3-苯基硫烷基-5-氯-1H-吲哚-2-基)-吗啉-4-基-甲酮。按照通用合成方法VIIc所述，用H2O2(30％w/v，2.5mmol)处理(3-苯基硫烷基-5-氯-1H-吲哚-2-基)-吗啉-4-基-甲酮，得到标题化合物Iv，为白色固体。
(5-氟-3-对甲苯基硫烷基-1H-吲哚-2-基)-吡咯烷-1-基-甲酮(Iw)
按照通用合成方法VIa所述，用吡咯烷(3.0当量，0.76mL，9.0mmol)处理5-氟-1H-吲哚-2-甲酸3(X＝F，516mg，3.0mmol)，得到5-氟-1H-吲哚-2-基-吡咯烷-1-基-甲酮8(X＝F，R4＝吡咯烷-1-基；620mg，89％)，为白色固体，mp 254-255℃。1H NMR(DMSO-d6)δ11.7(brs，1H)，7.5-7.4(m，2H)，7.1(td，1H)，6.9(s，1H)，3.8(t，2H)，3.5(t，2H)，2.0-1.9(m，4H)。按照通用合成方法VIIa所述，用对甲苯基二硫化物(450mg，2.6mmol，1.3当量)处理5-氟-1H-吲哚-2-基-吡咯烷-1-基-甲酮(327mg，2.0mmol)，得到标题化合物Iw(334mg，47％)，为白色无定形固体。1H NMR(DMSO-d6)δ12.2(brs，1H)，7.5(m，1H)，7.2-7.0(m，6H)，3.5(m，2H)，2.2(s，3H)，1.9-1.7(m，4H)；m/z＝355(M+1)。
(3-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-基)-哌啶-1-基-甲酮(Ix)
按照通用合成方法VIa所述，用哌啶(3.0当量，1.4mL，13.98mmol)处理1H-吲哚-2-甲酸3(X＝H，750mg，4.66mmol)，得到1H-吲哚-2-基-哌啶-1-基-甲酮8(X＝H，R4＝哌啶-1-基；979mg，92％)，为白色固体，mp161-162℃。1H NMR(DMSO-d6)δ11.5(s，1H)，7.6(d，1H)，7.4(d，1H)，7.2(t，1H)，7.1(t，1H)，6.7(s，1H)，3.7(m，4H)，1.7-1.5(m，6H)。按照通用合成方法VIIa所述，用二硫二苯(480mg，2.2mmol)处理1H-吲哚-2-基-哌啶-1-基-甲酮(456mg，2.0mmol)，得到标题化合物Ix(440mg，65％)为不透明油状物。1H NMR(DMSO-d6)δ12.1(brs，1H)，7.5(d，1H)，7.4(d，1H)，7.3-7.1(m，3H)，7.1-7.0(m，4H)，6.7(s，1H)，3.6(m，2H)，3.4(s，8H)，3.2(m，2H)，1.8(m，4H)，1.4(m，2H)。m/z＝337(M+1)。
(5-氟-3-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-基)-吡咯烷-1-基-甲酮(Iy)
按照通用合成方法VIa所述，用吡咯烷(3.0当量，0.76mL，9.0mmol)处理5-氟-1H-吲哚-2-甲酸3(X＝F，516mg，3.0mmol)，得到5-氟-1H-吲哚-2-基-吡咯烷-1-基-甲酮8(X＝F，R4＝吡咯烷-1-基；620mg，89％)，为白色固体，mp 254-255℃。1H NMR(DMSO-d6)δ11.7(brs，1H)，7.5-7.4(m，2H)，7.1(td，1H)，6.9(s，1H)，3.8(t，2H)，3.5(t，2H)，2.0-1.9(m，4H)。按照通用合成方法VIIa所述，用二硫二苯(1.5当量，281mg，1.29mmol)处理(5-氟-1H-吲哚-2-基)-吡咯烷-1-基-甲酮(200mg，0.86mmol)，得到标题化合物Iy(220mg，75％)，为浅黄色固体，mp 184-186℃。1HNMR(DMSO-d6)δ12.3(brs，1H)，7.5(m，1H)，7.2(m，2H)，7.1-7.0(m，5H)，3.5(m，2H)，1.9-1.7(m，4H)；m/z＝341(M+1)。
[3-(2-氨基-苯基硫烷基)-1H-吲哚-2-基]-吡咯烷-1-基-甲酮(Iz)
按照通用合成方法VIa所述，用吡咯烷(3.0当量，3.1mL，37.2mmol)处理1H-吲哚-2-甲酸3(X＝H，2.0g，12.4mmol)，得到1H-吲哚-2-基-吡咯烷-1-基-甲酮8(X＝H，R4＝吡咯烷-1-基；2.46g，93％)，为白色固体，mp213-214℃。1H NMR(DMSO-d6)δ11.5(brs，1H)，7.6(d，1H，J＝8.1Hz)，7.4(d，1H，J＝8.1Hz)，7.2(m，1H)，7.1(m，1H)，6.9(m，1H)，3.8(m，2H)，3.5(m，2H)，1.9-1.8(m，4H)。按照通用合成方法VIIa所述，用2-氨基-二硫二苯(1.4当量，694mg，2.8mmol)处理1H-吲哚-2-基-吡咯烷-1-基-甲酮(428mg，2.0mmol)，得到标题化合物Iz(468mg，69％)，为白色固体。1H NMR(DMSO-d6)δ11.9(brs，1H)，7.5(d，1H)，7.4(d，1H)，7.2(m，2H)，7.1(m，1H)，7.0(m，1H)，6.9(d，1H)，6.7(m，1H)，5.5(brs，2H)，3.5(m，2H)，1.9-1.7(m，4H)；m/z＝338(M+1)。
[3-(2-氨基-苯基硫烷基)-1H-吲哚-2-基]-吡咯烷-1-基-甲酮盐酸盐(Iaa)
将[3-(2-氨基-苯基硫烷基)-1H-吲哚-2-基]-吡咯烷-1-基-甲酮(Iz，60mg)的Et2O(5mL)溶液与1N HCl(1mL)一起搅拌，并通过过滤收集沉淀物。用Et2O洗涤滤饼并干燥，得到标题化合物Iaa(48mg)，为白色固体，mp154-155℃；m/z＝338(M+1)。
[3-(2-氨基-苯基硫烷基)-1H-吲哚-2-基]-哌啶-1-基-甲酮(Iab)
按照通用合成方法VIa所述，用哌啶(3.0当量，1.4mL，13.98mmol)处理1H-吲哚-2-甲酸3(X＝H，750mg，4.66mmol)，得到1H-吲哚-2-基-哌啶-1-基-甲酮8(X＝H，R4＝哌啶-1-基；979mg，92％)，为白色固体。按照通用合成方法VIIa所述，用2-氨基二硫二苯(347mg，1.4当量)处理1H-吲哚-2-基-哌啶-1-基-甲酮(116mg，0.51mmol)，得到标题化合物Iab(103mg，29％)，为褐色固体，m/z＝352(M+1)。
[3-(2-氨基-苯基硫烷基)-5-氟-1H-吲哚-2-基]-哌啶-1-基-甲酮(Iac)
按照通用合成方法VIa所述，用哌啶处理5-氟-1H-吲哚-2-甲酸3(X＝F，1.7g，9.5mmol)，得到5-氟-1H-吲哚-2-基-哌啶-1-基-甲酮8(X＝F，R4＝哌啶-1-基；2.3g，100％)，为白色固体。1H NMR(DMSO-d6)δ11.7(brs，1H)，7.5-7.3(m，2H)，7.1-7.0(m，1H)，6.7(s，1H)，3.7(m，4H)，1.7-1.5(m，6H)。按照通用合成方法VIIa所述，用2-氨基二硫二苯(347mg，1.4当量)处理5-氟-1H-吲哚-2-基-哌啶-1-基-甲酮(125mg，0.51mmol)，得到标题化合物Iac(92mg，25％)，为象牙色固体，m/z＝369(M+1)。
[5-氟-3-(对甲苯-4-亚磺酰基)-1H-吲哚-2-基]-吡咯烷-1-基-甲酮(Iad)
用H2O2(5mL)在MeCN(5mL)和Na2CO3(50mg)中处理Iw(100mg，0.28mmol)，得到标题化合物Iad(10mg)，为白色固体。1H NMR(DMSO-d6)δ12.4(brs，1H)，7.6(d，2H)，7.5(m，1H)，7.3(d，2H)，7.1-7.0(m，2H)，3.6-3.5(m，4H)，2.3(s，3H)，1.9(m，4H)；m/z＝371(M+1)。
(3-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-基)-哌嗪-1-基-甲酮盐酸盐(Iae)
按照通用合成方法VIa所述，用N-(叔丁氧基羰基)哌嗪(1.10当量，1.3g，6.83mmol)处理1H-吲哚-2-甲酸3(X＝H，1.0mg，6.21mmol)，得到4-(1H-吲哚-2-羰基)-哌嗪-1-甲酸叔丁酯8(X＝H，R4＝哌嗪-4-基-1-甲酸叔丁酯；2.0g，99％)，为白色固体，mp 205-206℃。1H NMR(DMSO-d6)δ11.6(brs，1H)，7.6(d，1H)，7.4(d，1H)，7.2(t，1H)，7.1(t，1H)，6.8(s，1H)，3.8-3.7(m，4H)，3.5-3.4(m，4H)，1.4(s，9H)；m/z＝330(M+1)。按照通用合成方法VIIa所述，用二硫二苯(283mg，1.3当量，1.3mmol)处理4-(1H-吲哚-2-羰基)-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(329g，1.0mmol)，然后用三氟乙酸(4mL)的HOAc溶液处理，以除去Boc保护基，得到(3-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-基)-哌嗪-1-基-甲酮。将(3-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-基)-哌嗪-1-基-甲酮溶于EtOAc中，并用1N HCl/Et2O处理，得到标题化合物Iae(103mg，29％)，为褐色固体，mp 240℃(dec)；m/z＝338(M+1)。
[5-氟-3-(吡啶-2-基硫烷基)-1H-吲哚-2-基]-吡咯烷-1-基-甲酮(Iaf)
按照通用合成方法VIa所述，用吡咯烷(3.0当量，0.76mL，9.0mmol)处理5-氟-1H-吲哚-2-甲酸3(X＝F，516mg，3.0mmol)，得到5-氟-1H-吲哚-2-基-吡咯烷-1-基-甲酮8(X＝F，R4＝吡咯烷-1-基；620mg，89％)，为白色固体，mp 254-255℃。1H NMR(DMSO-d6)δ11.7(brs，1H)，7.5-7.4(m，2H)，7.1(td，1H)，6.9(s，1H)，3.8(t，2H)，3.5(t，2H)，2.0-1.9(m，4H)。按照通用合成方法VIIa所述，用2，2’-二硫代吡啶(220mg，2.6mmol，1.3当量)处理5-氟-1H-吲哚-2-基-吡咯烷-1-基-甲酮(464mg，2.0mmol)，得到标题化合物Iaf(258mg，38％)，为白色固体：mp 204-206℃。1HNMR(DMSO-d6)δ12.2(brs，1H)，7.5(m，1H)，7.2-7.0(m，6H)，3.5(m，2H)，2.2(s，3H)，1.9-1.7(m，4H)；m/z＝355(M+1)。
[3-(吡啶-2-基硫烷基)-1H-吲哚-2-基]-吡咯烷-1-基-甲酮(Iag)
按照通用合成方法VIa所述，用吡咯烷(3.0当量，3.1mL，37.2mmol)处理1H-吲哚-2-甲酸3(X＝H，2.0g，12.4mmol)，得到1H-吲哚-2-基-吡咯烷-1-基-甲酮8(X＝H，R4＝吡咯烷-1-基；2.46g，93％)，为白色固体，mp213-214℃。1H NMR(DMSO-d6)δ11.5(brs，1H)，7.6(d，1H，J＝8.1Hz)，7.4(d，1H，J＝8.1Hz)，7.2(m，1H)，7.1(m，1H)，6.9(m，1H)，3.8(m，2H)，3.5(m，2H)，1.9-1.8(m，4H)。按照通用合成方法VIIa所述，用2，2’-二硫代吡啶(1.3当量，286mg，1.3mmol)处理1H-吲哚-2-基-吡咯烷-1-基-甲酮(214mg，1.0mmol)，得到标题化合物Iag(200mg，69％)，为浅黄色固体，mp 211-213℃。1H NMR(DMSO-d6)δ12.3(brs，1H)，8.4(m，1H)，7.5(m，2H)，7.2-7.0(m，3H)，6.7(d，1H)，1.9-1.7(m，4H)；m/z＝342(M+1)。
哌啶-1-基-[3-(吡啶-2-基硫烷基)-1H-吲哚-2-基]-甲酮(Iah)
按照通用合成方法VIa所述，用哌啶(3.0当量，1.4mL，13.98mmol)处理1H-吲哚-2-甲酸3(X＝H，750mg，4.66mmol)，得到1H-吲哚-2-基-哌啶-1-基-甲酮8(X＝H，R4＝哌啶-1-基；979mg，92％)，为白色固体。按照通用合成方法VIIa所述，用2，2’-二硫代吡啶(1.3当量，143mg)处理1H-吲哚-2-基-哌啶-1-基-甲酮(114mg，0.50mmol)，得到标题化合物Iah(117mg，69％)，为浅黄色固体，m/z＝338(M+1)。
[5-氟-3-(吡啶-2-基硫烷基)-1H-吲哚-2-基]-哌啶-1-基-甲酮(Iai)
按照通用合成方法VIa所述，用哌啶处理5-氟-1H-吲哚-2-甲酸3(X＝F，1.7g，9.5mmol)，得到5-氟-1H-吲哚-2-基-哌啶-1-基-甲酮8(X＝F，R4＝哌啶-1-基；2.3g，100％)，为白色固体。1H NMR(DMSO-d6)δ11.7(brs，1H)，7.5-7.3(m，2H)，7.1-7.0(m，1H)，6.7(s，1H)，3.7(m，4H)，1.7-1.5(m，6H)。按照通用合成方法VIIa所述，用2，2’-二硫代吡啶(1.3当量，143mg)处理5-氟-1H-吲哚-2-基-哌啶-1-基-甲酮(123mg，0.50mmol)，得到标题化合物Iai(120mg，68％)，为黄色固体，m/z＝356(M+1)。
                            表1
Figure A20058003465200441
  化合物编号(盐)   X   R1   NR2R3   Y
  Ia   5-Cl   C6H5   NH2   S(O)2
  Ib   H   C6H5   NH2   S(O)2
  Ic   H   C6H5   NH2   S
  Id   5-Br   C6H5   NH2   S
  Ie   5-OCH3   2-(NH2)-C6H4   NH2   S
  If   H   3-F-C6H4   NH2   S
  Ig   5-Br   2-(NH2)-C6H4   NH2   S
  Ih   H   2-(NH2)-C6H4   NH2   S
  Ii   H   2-吡啶基   NH2   S
  Ij   H   C6H5   NHCH3   S
  Ik   H   2-吡啶基   NHCH3   S
  Il   H   C6H5   NH2   O
  Im   H   4-(CH3O)-C6H4   NH2   O
  In   H   4-F-C6H4   NH2   O
  Io   H   2-F-C6H4   NH2   O
  Ip   H   4-Cl-C6H4   NH2   O
  Iq   H   CH3   NH2   O
  Ir   H   C2H5   NH2   O
  Is   H   (CH3)2CH   NH2   O
  It   H   (CH3)3C   NH2   O
  Iu   H   C6H5CH2   NH2   O
                        表2
Figure A20058003465200451
Figure A20058003465200461
生物学方法
筛选CKIε抑制剂的酪蛋白激酶ε33P-ATP过滤板试验
目的：此试验利用体外33P-ATP过滤试验，测量化合物对于通过酪蛋白激酶Iε进行的底物酪蛋白磷酸化的抑制作用。化合物以5种浓度，一式两份进行试验，以便产生10微摩尔浓度时的IC50值或％抑制，其数据列于表4中。
材料：
仪器：
Beckman Biomek 2000 Liquid Handling Robot
Beckman Multimek 96 Automated 96 Channel Pipettor
Millipore Vacuum Manifold Basic Kit#MAVM0960R
Titertek Multidrop Liquid Dispenser
Packard TopCount NXT Liquid Scintillation Counter
培养板：
Costar EIA/RIA Plate#9018
Falcon 96 well U bottom Polystyrene Plate#353910
Millipore Multiscreen 96 well Filtration Plates#MAPHNOB50
Millipore Multiscreen TopCount Adapter Plates#SE3M203V6
化学品：
EGTA购自SIGMA#E-3889
酪蛋白(脱磷酸化)购自SIGMA#C-4032
ATP购自SIGMA#A-7699
DTT购自Fisher Biotech#BP1725
三氯乙酸购自SIGMA#T-6399
γ-33P-ATP 1mCi/37MBq购自Perkin Elmer Life Sciences#NEG-602H酶：
浓度0.58mg/mL的酪蛋白激酶Iε，通过本领域技术人员众所周知的发酵和纯化过程制备。以上以100μL等分量于-80℃储存。
化合物：
试验用化合物以冷冻的溶于100％DMSO的10mM化合物储备液的形式提供。
试验条件：
最终总的试验物体积为每孔50μL，由以下试剂组成：
5μL稀释的化合物储备液(10、1、0.1、0.01或0.001μM)，
5μL脱磷酸化酪蛋白，最终浓度0.2μg/μL，
20μL CKIε，最终浓度3ng/μL，和
20μL γ-33P-ATP，最终浓度0.02μCi/μL，与冷的ATP混合(最终10μM)。
方法：
1.制备500mL新鲜试验缓冲液：50mM Tris pH值7.5、10mMMgCl2、2mM DTT和1mM EGTA。
2.被评估的化合物是10μL溶于100％DMSO的10mM储备液。使用Biomek 2000液体处理机器人，制备系列稀释以得到10、1、0.1、0.01和0.001μM最终化合物稀释液，以5μL作为添加液加入Falcon U形底培养板中。通常，每块96孔培养板测试8种化合物，第1行和第12行作为对照孔。常规的筛选试验将包括32种化合物，相当于4块试验培养板。
3.试验培养板布置图按照以下模式 CK1ePlateMap.xls设定。
4.一旦按照说明加入5μL化合物，即于适当的孔内加入5μL脱磷酸化酪蛋白(溶于蒸馏水)(0.2μg/μL)和20μL CKIε(3ng/μL)。
5.最后，加入20μL γ-33P-ATP(0.02μCi/μL)/10μM冷的ATP(约等于每孔2×106CPM)。
6.将含有上述50μL反应体积的Falcon U形底试验培养板涡旋，然后于室温下培养2小时。
7.2小时后，通过使用Beckman Multimek向试验培养板内加入65μL冰冷的2mM ATP(用试验缓冲液制备)来终止反应。
8.同时，将以蒸馏水制备的25μL 100％冰冷TCA加至对应号的Millipore MAPH过滤板中。
9.使用手持型8通道移液器将100μL反应混合物从Falcon U形底培养板转移至预先用TCA浸泡的Millipore MAPH过滤板中。
10.轻轻地混合Millipore MAPH过滤板并将其在室温下静置至少30min以沉淀蛋白。
11.在30min之后将过滤板放在Millipore真空多通道装置上，在不超过8mm汞柱的条件下过滤，因为MAPH过滤板在较高的真空条件下容易发生“气塞(air lock)”。
12.过滤板依次用2×150μL 20％TCA、2×150μL 10％TCA和2×150μL 5％TCA洗涤并过滤(每板共洗涤6次/每孔900μL)。
13.让培养板在室温下干燥过夜。次日，用Titertek Multidrop分配器每孔加入40μL Packard Microscint-20闪烁液；将培养板密封并在PackardTopcount NXT闪烁计数器上计数，每孔2min(记录每孔CPM值)。
计算：
1.记录每分钟计数(CPM)数据，并输入专有数据计算和存档数据库(IDBS的Activity Base version 5.0)。
2.每板的行1反映在无任何抑制化合物存在的情况下酶的总磷酸化活性，因此代表了100％。行12反映了在无抑制性化合物和酶存在的情况下任何非特异性磷酸化/保留的放射活性。典型地可见到约1％总CPM的“非特异性”。
3.通过确定每板的“总的”和“非特异性”CPM能够测定每种浓度的试验化合物抑制酶的磷酸化底物的能力的％抑制。利用包含Activitybase计算规程(DG0027-CK1-D-BL)的非线性曲线拟合程序，将％抑制数据用于计算化合物的IC50值(化合物能抑制50％酶活性时的浓度)(研究：RESR0290)。
4.动力学研究确定了此试验系统中ATP的Km值为21μM。
CKIδ抑制剂的酪蛋白激酶Iδ链霉亲和素亲和膜培养板试验
目的：在链霉亲和素亲和膜(SAM)生物素捕获板上(Promega V7542)评估试验化合物的CKIδ活性
用品和试剂
HEPES SIGMA#H3375 MW＝238.3；β-甘油磷酸SIGMA#G-9891MW＝216.0；EDTA 0.5M，pH 8.0 GibcoBRL；原钒酸钠ACROS#205330500 MW＝183.9；DTT(DL-二硫苏糖醇)SIGMA #D-5545MW＝154.2；氯化镁ACROS #41341-5000 MW＝203.3；ATP SIGMA#A-7699MW＝551.1；γ33P ATP NEN#NEG602H；酪蛋白激酶IδSIGMA#C4455；酪蛋白激酶I底物新英格兰肽生物素-RRKDLHDDEEDEAMSITA MW＝2470
制备激酶缓冲液(KB，100mL)如下：
50mM HEPES，pH值8.0            5mL的1M储备液
10mM MgCl                      1mL的1M储备液
10mMβ-甘油磷酸                1mL的1M储备液
2.5mM EDTA                     500μL的500mM储备液
1mM原钒酸钠                    100μL的1M储备液
1mM DTT                        100μL的1M储备液
水                             92.3mL
制备ATP Master Mix如下：
制备1mL的1M ATP水溶液(1M ATP储备液)。
在12mL激酶缓冲液(KB)中：
加入12uL的1M ATP溶液，然后
加入12μL的33P ATP(10μCi/μL)，NEG602H，Perkin Elmer
制备反应培养板并进行试验如下：
1.在反应培养板的孔中每孔加入10μL的KB，加入或不加入试验化合物抑制剂。
2.每孔加入60μL的KB。
3.每孔加入10μL的500μM肽底物。
4.将培养板升温至37℃。
5.每孔加入10μL的CKIδ1∶10稀释液，＝0.42μg或0.68单位。
6.每孔用10μL的ATP Master Mix开始反应。
7.将反应培养板放入37℃培养箱培养10min。
8.用10μL的1M ATP终止反应。转移20μL至SAM培养板并在室温下放置10min。
9.用100μL的2M NaCl溶液洗涤3次，然后用100μL的2M NaCl和1％H3PO4溶液洗涤3次，然后再用100μL水在真空多通道装置上洗涤3次。
10.在灯下干燥过滤板30min。
11.密封培养板底部并加入20μL的MicroScint 20。
12.在TOPCOUNT上读数。
细胞昼夜节律试验方法
细胞培养：每3-4天(约10-20％汇合)将Mper1-luc大鼠-1成纤维细胞(P2C4)培养液分开并转移至150cm2排气式聚苯乙烯组织培养瓶(Falcon#35-5001)内，并于37℃和5％CO2下维持在生长培养基[EMEM(Cellgro#10-010-CV)；10％胎牛血清(FBS；Gibco#16000-044)；以及50I.U./mL青霉素-链霉素(Cellgro#30-001-C1)]中。
稳定转染：用含有用于稳定转染的Zeocin抗性可选择的标记物和mPer-1启动子驱动的萤光素酶报道基因的载体对30-50％汇合的大鼠-1成纤维细胞培养液进行共转染。在24-48小时后，将培养液分开转移至96孔培养板中，并在补充有50-100μg/mL Zeocin(Invitrogen#45-0430)的生长培养基中维持10-14天。通过用100μM萤光素(Promega#E1603)补充生长培养基并在TopCount闪烁计数器(Packard Model#C384V00)上测定萤光素酶活性来评估Zeocin抗性稳定转染子的报道基因表达。通过50％马血清[HS(Gibco#16050-122)]血清性休克对表达Zeocin抗性和mPer1-驱动的萤光素酶活性的大鼠-1克隆进行同步化，并评估了昼夜节律报道基因活性。选择Mper1-luc大鼠-1成纤维细胞克隆P2C4用于化合物试验。
同步化方法：将Mper1-luc大鼠-1成纤维细胞(P2C4)涂在(40-50％汇合)不透明96孔组织培养板(PerkinElmer#6005680)上，并维持在补充有100μg/mL Zeocin(Invitrogen#45-0430)的生长培养基中，直至培养液达到100％汇合(48-72h)。于37℃和5％CO2下，用100μL同步培养基[EMEM(Cellgro#10-010-CV)；100I.U./mL青霉素-链霉素(Cellgro#30-001-C1)；50％HS(Gibco#16050-122)]将培养液同步化2小时。在同步化后，用100μL EMEM(Cellgro#10-010-CV)在室温下冲洗培养液10分钟。冲洗后，将培养基更换为300μL CO2非依赖性培养基[CO2.I(Gibco#18045-088)；2mM L谷氨酰胺(Cellgro#25-005-C1)；100I.U./mL青霉素-链霉素(Cellgro#30-001-C1)；100μM萤光素(Promega#E1603)]。将试验昼夜节律作用的化合物加至0.3％DMSO(最终浓度)中的CO2非依赖性培养基中。立即用TopSeal-A膜(Packard#6005185)密封培养基并转移进行萤光素酶活性测定。
自动化昼夜节律报道基因测定：在同步化之后，将试验培养板保持在37℃组织培养箱(Forma Scientific Model#3914)中。通过在TopCount闪烁计数器(Packard Model#C384V00)上测定相对光输出来估计体内萤光素酶活性。使用ORCA机械手系统(Beckman Instruments)和SAMI-NT自动排期软件(Version 3.3；SAGIAN/Beckman Instruments)将培养板从培养箱转移至读数器。
数据分析：使用Microsoft Excel和XLfit(Version 2.0.9；IDBS)进行数据输入、处理和绘图。通过测定数天内相对光输出量极小值之间的间隔或通过傅立叶变换进行周期分析。两种方法在昼夜节律周期范围内产生了几乎相同的周期估计。效能被记录为ECΔτ+1h，以引起1小时延长期的有效微摩尔浓度表示。通过在XLfit中以周期改变(Y轴)相对于试验化合物浓度(X轴)所表示的数据的双曲线拟合进行了数据分析并且ECΔτ+1h则以内插法从此曲线求出。
大鼠昼夜节律周期试验
本试验提供了评价试验化合物对体内昼夜节律循环的作用的方法。应用初始体重为200-250g的雄性Wistar大鼠(Charles River)。在实验前将每个动物单独饲养在受控的环境内，在12小时/12小时的明/暗循环(于06:00时开灯)下维持热平衡环境温度为24-28℃，并不限量地喂以标准的实验室食物和水。于每个大鼠腹腔内植入生物遥测传感器(Minnimitter-VMFH，series 4000，Sunriver，OR)以监测内部体温和一般性活动。按照制造商推荐以氯胺酮/赛拉嗪(78/13mg kg-1，腹腔内注射)进行全身性麻醉后植入每一传感器并且让动物恢复7-10天。在恢复期之后，为了确定每一动物的内在昼夜节律循环，在施用试验化合物之前将这些动物置于连续黑暗的循环中(0小时/24小时的明/暗循环)并任这些动物自由活动7-10天。在给药期间，在历经48小时周期的特定的CT(昼夜节律时间)内让动物接受溶媒或化合物(腹腔内、皮下或口服)。给药方案完成后，在连续黑暗的循环中(0小时/24小时的明/暗循环)中监控动物5至7天。对于每一试验，每隔5分钟测量一次样本腹部温度和一般性活动数据。使用Minimitter提供的VitalView和Actiview软件进行分析。在水平线上绘出第一天从每只大鼠观察到的腹部温度。将该腹部温度线置于表示昼夜节律时间的横坐标(X轴)之下。以类似方式分别绘出此后每天所测得的腹部温度线以给出纵坐标(Y轴，以天计)。用直线连接每天出现的内部体温的最初上升点以便利用数天的结果来估计每只大鼠在任何给定日子的昼夜节律相。在给药前后通过应用相的直线数天估计来确定治疗对相的作用。相对于溶媒对照治疗前后的直线，活性化合物的治疗将引起化合物治疗前连接每日内部体温最初上升点的直线和化合物治疗后连接每日内部体温最初上升点的直线之间发生更大的位移。计算对治疗动物给药之前的那些计划的相之间的差异。使用ANOVA和Students T检验比较各组之间的平均体温昼夜节律变化，以分钟计。
                表3
              生物数据*
化合物编号   CKIε抑制IC50(μM) 细胞试验ECΔτ+1h(μM)
  Ia   ＞10
  Ib   2.7
  Ic   3.1
  Id   0.42
  Ie   0.18 ＞10
  If   0.43 1.6
  Ig   0.12* 1.6
  Ih   0.08*
  Ii   187(n＝2)
  Ij   ＞10*
  Ik   ＞10*
  Il   ＞10*
  Im   5.8
  In   0.89*
  Io   2.4
  Ip   2.8
  Iq   13.5
  Ir   8.7
  Is   8.9
  It   11.7
  Iu   9.9
*表示两个或两个以上测定值的平均值；
化合物Iv-Iai：CKIε抑制IC50＞10μM

Claims (25)

1.治疗患有通过抑制酪蛋白激酶Iε的活性而得到改善的疾病或障碍的患者的方法，该方法包括给所述的患者施用治疗有效量的式I化合物，或该化合物的立体异构体、对映异构体、外消旋体或互变异构体，或其药学上可接受的盐，
Figure A2005800346520002C1
其中
X是H、Cl、F、Br、NO2、CN、OR2、NR2R2、HNSO2-C1-3烷基或NHCO-C1-3烷基；
Y是-S(O)n-或-O-，其中n是0、1或2；
R1是
1)未取代的或被一个或多个下列基团取代的芳基：
a)C1-5烷氧基，
b)OH，
c)卤素，
d)NR2R2，
e)未取代的或被一个或多个下列基团取代的C1-5烷基：
i)OH或
ii)C1-5烷氧基；
2)未取代的或被一个或多个下列基团取代的杂环：
a)未取代的或被一个或多个下列基团取代的C1-5烷基：
i)OH或
ii)C1-5烷氧基，
b)C1-5烷氧基，
c)OH，
d)卤素，或
e)NR2R2；
3)未取代的或被一个或多个下列基团取代的C1-5烷基：
a)C1-5烷基，
b)C1-5烷氧基，
c)OH，或
d)未取代的或被一个或多个下列基团取代的芳基：
i)C1-5烷基，
ii)C1-5烷氧基，
iii)OH，
iv)卤素，或
v)NR2R2；
Z是
1)C(＝O)NR2R3或
2)C(＝O)R4；
R2是氢或C1-3烷基；
R3是氢、C1-5烷基或C3-6环烷基；
R4是未取代的或被一个或多个下列基团取代的1-哌啶基、1-吡咯烷基、1-哌嗪基或4-吗啉基：
1)C1-5烷基，
2)C1-5烷氧基，
3)OH，
4)卤素，或
5)NR2R2。
2.权利要求1的方法，其中所述的酪蛋白激酶Iε活性的抑制引起昼夜节律周期的延长。
3.权利要求1的方法，其中疾病或障碍是心境障碍或睡眠障碍。
4.权利要求3的方法，其中障碍是心境障碍。
5.权利要求4的方法，其中心境障碍选自抑郁障碍和双相性精神障碍。
6.权利要求5的方法，其中抑郁障碍是重症抑郁障碍。
7.权利要求5的方法，其中双相性精神障碍选自I型双相性精神障碍和II型双相性精神障碍。
8.权利要求3的方法，其中障碍是睡眠障碍。
9.权利要求8的方法，其中睡眠障碍是昼夜节律睡眠障碍。
10.权利要求9的方法，其中昼夜节律睡眠障碍选自轮班工作睡眠障碍、时差综合征、睡眠时相前移综合征和睡眠时相后移综合征。
11.权利要求1的方法，其中
Y是S(O)2，
Z是C(＝O)NH2或C(＝O)NHCH3，并且
R1是苯基或吡啶基。
12.权利要求11的方法，其中
Z是C(＝O)NH2，并且
R1是苯基。
13.权利要求12的方法，其中化合物选自：
3-苯磺酰基-5-氯-1H-吲哚-2-甲酰胺，和
3-苯磺酰基-1H-吲哚-2-甲酰胺。
14.权利要求11的方法，其中
Y是S，
Z是C(＝O)NHCH3，并且
R1是苯基或吡啶基。
15.权利要求14的方法，其中化合物选自：
3-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-甲酸甲酰胺，和
3-(吡啶-2-基硫烷基)-1H-吲哚-2-甲酸甲酰胺。
16.权利要求1的方法，其中
Y是O，
Z是C(＝O)NH2，并且
R1是苯基、取代的苯基、C1-5烷基或取代的C1-5烷基。
17.权利要求16的方法，其中化合物选自：
3-苯氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
3-(4-甲氧基-苯氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
3-(4-氟-苯氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
3-(2-氟-苯氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
3-(4-氯-苯氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
3-甲氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
3-乙氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
3-异丙氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
3-叔丁氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺，和
3-苄氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺。
18.权利要求1的方法，其中
Y是S、SO或S(O)2，
Z是C(＝O)R4，并且
R4是1-哌啶基、1-吡咯烷基、1-哌嗪基或4-吗啉基。
19.权利要求18的方法，其中化合物选自：
(3-苯磺酰基-5-氯-1H-吲哚-2-基)-吗啉-4-基-甲酮，
(5-氟-3-对甲苯基硫烷基-1H-吲哚-2-基)-吡咯烷-1-基-甲酮，
(3-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-基)-哌啶-1-基-甲酮，
(5-氟-3-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-基)-吡咯烷-1-基-甲酮，
[3-(2-氨基-苯基硫烷基)-1H-吲哚-2-基]-吡咯烷-1-基-甲酮，
[3-(2-氨基-苯基硫烷基)-1H-吲哚-2-基]-哌啶-1-基-甲酮，
[3-(2-氨基-苯基硫烷基)-5-氟-1H-吲哚-2-基]-哌啶-1-基-甲酮，
[5-氟-3-(对甲苯-4-亚磺酰基)-1H-吲哚-2-基]-吡咯烷-1-基-甲酮，
(3-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-基)-哌嗪-1-基-甲酮盐酸盐，
[5-氟-3-(吡啶-2-基硫烷基)-1H-吲哚-2-基]-吡咯烷-1-基-甲酮，
[3-(吡啶-2-基硫烷基)-1H-吲哚-2-基]-吡咯烷-1-基-甲酮，
哌啶-1-基-[3-(吡啶-2-基硫烷基)-1H-吲哚-2-基]-甲酮，和
[5-氟-3-(吡啶-2-基硫烷基)-1H-吲哚-2-基]-哌啶-1-基-甲酮。
20.权利要求1的方法，其中
Y是S，
Z是C(＝O)NH2，并且
R1是吡啶基。
21.权利要求20的方法，其中化合物是3-(吡啶-2-基硫烷基)-1H-吲哚-2-甲酰胺。
22.权利要求1的方法，其中
Y是S，
Z是C(＝O)NH2，并且
R1是苯基或取代的苯基。
23.权利要求22的方法，其中化合物选自：
3-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
5-溴-3-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
3-(2-氨基-苯基硫烷基)-5-甲氧基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
3-(3-氟-苯基硫烷基-1H-吲哚-2-甲酰胺，
3-(2-氨基-苯基硫烷基)-5-溴-1H-吲哚-2-甲酰胺，和
3-(2-氨基苯基硫烷基)-1H-吲哚-2-甲酰胺。
24.抑制患者的酪蛋白激酶Iε的活性的方法，该方法包括给所述患者施用治疗有效量的式I化合物，或该化合物的立体异构体、对映异构体、外消旋体或互变异构体，或其药学上可接受的盐，
Figure A2005800346520006C1
其中
X是H、Cl、F、Br、NO2、CN、OR2、NR2R2、HNSO2-C1-3烷基或NHCO-C1-3烷基；
Y是-S(O)n-或-O-，其中n是0、1或2；
R1是
1)未取代的或被一个或多个下列基团取代的芳基：
a)C1-5烷氧基，
b)OH，
c)卤素，
d)NR2R2，
e)未取代的或被一个或多个下列基团取代的C1-5烷基：
i)OH或
ii)C1-5烷氧基；
2)未取代的或被一个或多个下列基团取代的杂环：
a)未取代的或被一个或多个下列基团取代的C1-5烷基：
i)OH或
ii)C1-5烷氧基，
b)C1-5烷氧基，
c)OH，
d)卤素，或
e)NR2R2；
3)未取代的或被一个或多个下列基团取代的C1-5烷基：
a)C1-5烷基，
b)C1-5烷氧基，
c)OH，或
d)未取代的或被一个或多个下列基团取代的芳基：
i)C1-5烷基，
ii)C1-5烷氧基，
iii)OH，
iv)卤素，或
v)NR2R2；
Z是
1)C(＝O)NR2R3或
2)C(＝O)R4；
R2是氢或C1-3烷基；
R3是氢、C1-5烷基或C3-6环烷基；
R4是未取代的或被一个或多个下列基团取代的1-哌啶基、1-吡咯烷基、1-哌嗪基或4-吗啉基：
1)C1-5烷基，
2)C1-5烷氧基，
3)OH，
4)卤素，或
5)NR2R2。
25.权利要求24的方法，其中所述的酪蛋白激酶Iε活性的抑制引起昼夜节律周期的延长。
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