CN101036637B - 丹参酮ⅰ磺酸钠在制备药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了丹参酮I磺酸钠在制备药物中的应用。本发明属于丹参酮I磺酸钠的新用途领域。通常丹参酮I磺酸钠是丹参酮II磺酸钠的杂质，已知具有抗菌消炎等作用。本发明提出将丹参酮I磺酸钠应用在制备治疗冠心病、抗癌药物中，可以制成口服及注射用的多种剂型的药物，发掘了丹参酮I磺酸钠的新用途，它安全有效，药理作用强，药用前景良好。

Description

丹参酮Ⅰ磺酸钠在制备药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种化合物在制药中的应用，更具体地说，本发明涉及丹参酮I磺酸钠在制药中的应用和以丹参酮I磺酸钠为组分的药物。

背景技术

丹参是具有活血化瘀作用的常用中药，系唇形科植物丹参Salviamiltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。味苦，性微寒，归心、肝二经。具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦之功效。用于月经不调、经闭痛经、癥瘕积聚、胸腹刺痛、热痹疼痛、疮疡肿痛、心烦不眠、肝脾肿大、心绞痛等。相关研究报道，丹参也具有一定的抗肿瘤作用，临床有应用于治疗肝癌、肠癌、胃癌、白血病、子宫颈癌等多种癌症。

冠心病是冠状动脉性心脏病的简称，是一种由于冠状动脉粥样硬化或动力性(即血管痉挛)狭窄或阻塞，发生冠状循环障碍，引起心肌氧供销需之间失衡而导致心肌缺血缺氧或坏死的一种心脏病，亦称缺血性心脏病。按冠状动脉病变的部位、范围和程度的不同等临床特点，一般可分为：隐匿型或无症状性冠心病、心绞痛、心肌梗塞、缺血性心肌病(包括心脏增大、心力衰竭、心律失常)、猝死等。丹参是一种传统的活血化瘀中药，在临床上常被用来治疗冠心病、心绞痛、缺血性中风等疾病，疗效较好。我国目前生产的丹参及其复方制剂品种很多。

丹参的化学成分为水溶性和脂溶性组分，其脂溶性成分包括：丹参酮II A、丹参酮II B、丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮等。丹参酮II A、丹参酮II A磺酸钠临床应用已较为广泛，疗效较好。丹参酮I磺酸钠是从丹参中提取分离出的化合物丹参酮I(Tanshinone I)经磺化而制成的一种化合物。

丹参酮IIA是中药丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)中的主要成分之一，其药材中丹参酮IIA本身含量亦较高，但由于其肠道吸收差，临床起效慢，故由钱名塑等人将其磺化成水溶性钠盐一DS一201，即丹参酮IIA磺酸钠，先后由上海制药一厂、中药三厂等制成供动物实验与临床使用的注射液。丹参酮IIA磺酸钠具有较强的抗缺氧、改善心功能、减少血栓形成等作用，能够降低缺血再灌注所产生的心肌线粒体脂质过氧化物的含量，改善心肌线粒体膜的流动性，还具有增加冠脉血流量，促进侧枝循环建立的作用。

丹参酮I磺酸钠到目前为止，其具有文献报道的药理作用主要表现为抗菌消炎与雌激素样作用，这与丹参酮IIA磺酸钠药理作用大相径庭。故丹参酮I磺酸钠作为丹参酮IIA磺酸钠合成过程所得到的一个附带产物，现有研究将其作为丹参酮II磺酸钠原料药中的主要杂质之一，需要从丹参酮II磺酸钠中除去，并严格控制其含量(见国家药品标准WS-10001-(HD-0923)-2002)。上海第一生化药业有限公司在80年代初成功合成出丹参酮I磺酸钠，主要用于丹参酮IIA磺酸钠原料药的杂质对照。

中国专利200410036053丹参酮II A磺酸钠及其制剂中丹参酮I磺酸钠的测定方法针对丹参酮I磺酸钠、丹参酮II A磺酸钠的自身理化性质特点等提出并报道了更为合适的检测方法，以更好的控制作为杂质的丹参酮I磺酸钠的含量。

中国专利200510020468一种含丹参酮II A磺酸钠的药用组合物及其质量控制方法，主要报道的同样是针对以丹参酮II A磺酸钠为主要有效成分的制剂，将丹参酮I磺酸钠作为一种杂质来控制的一种检测方法的建立。

综合以上的研究表明，丹参酮I磺酸钠仅仅是作为丹参酮IIA磺酸钠这个原料的一个杂质而被人们所认知，而其本身的药用价值并没有得到充分的开发与应用。

基于丹参酮I磺酸钠、丹参酮IIA磺酸钠均为二萜醌磺酸盐结构，且丹参酮IIA、丹参酮I作为理化性质类似、丹参药材中含量亦较高的脂溶性成分，同时丹参及丹参经提取所得有效部位或有效组分制成的制剂的临床应用效果诸因素的综合考虑，我们对丹参酮I磺酸钠进行药理及临床应用的深入研究，以更好地发挥其药用价值，找到其在制备医药中的应用。

发明内容

本发明针对目前丹参酮I磺酸钠还仅仅作为一个杂质而没有被有效利用的问题，发明人经过深入细致的研究，找到了丹参酮I磺酸钠在制备医药中的应用。

丹参酮I磺酸钠的结构式如下：

具体地说，本发明找到了丹参酮I磺酸钠的下列新用途：

丹参酮I磺酸钠在制备治疗冠心病药物中的应用。

所述冠心病包括下列病症中的至少一种：心绞痛、心肌梗死、心律失常和心肌血液供应不足。

丹参酮I磺酸钠在制备治疗抗癌药物中的应用。

所述癌包括下列癌症中的至少一种：肝癌、直肠癌、结肠癌和胃癌。

所述的以丹参酮I磺酸钠为活性组分的药物，包括治疗有效量的丹参酮I磺酸钠、添加剂、赋形剂及医学上可接受的载体。

所述以丹参酮I磺酸钠为活性组分的药物可以为口服制剂或注射制剂。

具体地说，所述药物可以制成胶囊剂、片剂、软胶囊剂、微囊剂、水针或冻干粉针。

将丹参酮I磺酸钠制成药物的方法均为常规方法，这里没有特别的限定，作为例子可以参见实施例。

丹参酮I磺酸钠的制备过程举例如下。

a、磺化：取丹参酮I放在醋酐-冰醋酸溶液中，加入浓硫酸-冰醋酸(体积比1∶1)混合溶液，在冰水浴条件下进行磺化反应，经盐析得到丹参酮I磺酸钠粗品。

b、精制：将所得粗品用乙酸乙酯除去脂溶性杂质，乙醇回流除去残存的无机盐，再经甲醇或丙酮等溶剂进行重结晶；或将所得粗品经硅胶柱层析进行分离纯化，即得目标产物丹参酮I磺酸钠。

结构式如下：

丹参酮I磺酸钠的结构确证如下。

对以上步骤合成所得丹参酮I磺酸钠进行核磁共振实验：

(1)实验内容

溶剂：DMSO-D6(氘代二甲亚砜)

实验项目：碳谱(记为：¹³C-NMR)、氢谱(记为：¹H-NMR)、同核位移相关谱(记为：COSY谱)、无畸形变的极化转移增强法(记为：DEPT谱)、单量子异核位移相关谱(记为：HSQC谱)，远程异核化学位移相关谱(记为：HMBC谱)

(2)实验数据

a、¹H-NMR(DMSO-D6)δ9.16(d，1H)，8.49(d，1H)，7.84(d，1H)，7.60(t，1H)，7.44(d，1H)，2.69(s，3H)，δ2.36(s，3H)

b、¹³C-NMR(500Hz，DMSO-D6)δ182.3，175.1，157.2，155.2，135.4，133.0，132.7，131.9，130.0，128.7，127.8，123.8，123.4，120.3，118.5，117.1，19.2，9.2

(3)结论

a、氢谱

本品¹H-NMR中除溶剂峰外，其峰积分比(由低场至高场)为1∶1∶1∶1∶1∶3∶3。总质子数为11，与丹参酮I磺酸钠结构中质子数相同，由化学位移、偶合常数值、COSY谱可知：

(1)由COSY谱可知：δ9.16，δ7.60，δ7.44为一个自旋体系，分别相当于一个质子，由化学位移，峰形及偶合常数值可以得出δ9.16，δ7.60，δ7.44为菲环上14，15，16位碳上相连的三个质子。

(2)由COSY谱可以得到另一组自旋体系的质子：δ8.49，δ7.84分别相当于1个质子，从其化学位移，偶合常数及峰形，并结合DEPT谱，可知δ8.49，δ7.84为菲环上11，10位碳上相连的二个质子。

(3)2.69，δ2.36分别相当于3个质子，结合DEPT谱化学位移可知为伯碳上的质子，所以为18位，3位质子。

b、碳谱

本品¹³C-NMR图中，除溶剂峰外共有18个峰，本品分子中含18个C，说明分子中无对称性，由DEPT谱可知：分子结构中有2种(2个)伯碳，无仲碳，5个叔碳(为sp²杂化碳)和11个季碳(sp²杂化碳)，分子中有饱和碳16个，不饱和碳2个，由化学位移，偶合常数值，HSQC谱，HMBC谱可知：

(1)由DEPT谱可知：δ19.2，δ9.2为伯碳，由HSQC谱知与δ2.69，δ2.36的质子分别相关，证实该碳为C₁₈C₃。

(2)由DEPT谱可知：δ132.7，δ130.0，δ127.8，δ123.8，δ118.5为5个叔碳，结合11，15，16，14，10位质子，由HSQC谱知，上述5碳分别为C₁₁，C₁₅，C₁₆，C₁₄，C₁₀。

(3)δ182.3，175.1：由化学位移可知为邻醌上2个羰基碳。

(4)δ157.2，155.2：为C₄和C₁，由于其与电负较大的氧原子相连，δ值向低场位移。另外由HMBC谱知分别与δ7.84，的H₁₀和δ2.36，的H₃远程相关，证实分别为C₄和C₁。

(5)δ135.4：为17位季碳。与δ8.49(H₁₁)δ7.60(H₁₅)δ2.69(H₁₈)的有远程相关关系，证实为C₁₇。

(6)δ133.0：为12位季碳，δ9.16(H₁₄)δ7.84(H₁₀)δ7.44(H₁₆)δ2.69(H₁₈)与该碳有远程相关关系。

(7)δ131.9：为13位季碳，由HMBC谱可知：δ8.49，δ7.60的质子与该碳均有远程相关关系，证实该碳为C₁₃。

(8)δ128.7：为9位季碳，由HMBC谱可知：δ8.49(H₁₁)与该碳有远程相关关系，故该碳为C₉.

(9)δ123.4：为8位季碳，由HMBC谱可知：δ9.16，7.84的两个质子与该碳均有远程相关关系，证实该碳为C₈.

(10)δ120.3：为2位季碳。由HMBC谱与δ2.36(H₃)的质子有远程相关关系，证实为C₂。

(11)δ117.1：为5位季碳。由HMBC谱与δ2.36(H₃)的质子有远程相关关系，证实为C₅。

由NMR谱可知，本品的NMR数据与丹参酮I磺酸钠一致，即本品为丹参酮I磺酸钠。

为了验证本发明提出的丹参酮I磺酸钠在制备药物中的新用途，进行了以下试验。

以丹参酮I磺酸钠制备注射用丹参酮I磺酸钠，规格为10mg/瓶，注射给药，进行以下试验。

1、急性毒性试验

受试动物：昆明种小白鼠，体重20±2克，共40只，雌雄各半。

试验方法：分别采用小鼠单次腹腔注射(ip)、静脉注射(iv)或单次肌肉注射(im)给药法。试验前，小鼠在实验室动物房饲养一周，观察健康状态良好。进行急性毒性实验给药前，小鼠禁食不禁水12小时，最大可给药量0.4g/kg。给药后，4小时内密切观察，此后每日上、下午各一次，连续观察14天，记录动物中毒症状出现时间、持续时间和恢复情况、外观体征及死亡情况。于第14天全部动物脱颈椎处死，并进行尸解，观察各主要脏器的改变。

受试动物一般指标观察：动物外观、行为、体重变化情况、对刺激的反应、分泌物、排泄物等均正常，试验期间受试鼠未有死亡，试验结束动物尸检受试鼠各脏器未出现任何异常表现。

结论：该药在0.4g/kg剂量下对小鼠无急性毒性反应，其安全性较高。

2、丹参酮I磺酸钠对心律失常的作用效果试验

丹参酮I磺酸钠对家兔短期快速心房起搏时心房单相动作电位(AMAP)和心房有效不应期(AERP)的影响实验。

实验动物与分组：健康家兔24只，体重2.0-2.5kg，雌雄不拘，随机分为对照组(n＝12)和丹参酮I磺酸钠组(n＝12)两组。

AMAP的记录：用3％戊巴比妥钠30mg/kg经兔耳缘静脉注射麻醉后静脉推注肝素1000IU抗凝，将兔仰卧位固定于兔台上，分离右股静脉，置入静脉滞留管作为给药通道顶部正中切口，分离颈内静脉分别置入两根4F双极电极接触导管至右房做起搏和记录电极轻压状态下，固定用生理记录仪同步记录右房AMAP与体表心电图，待图形稳定5-10min后开始试验。

电生理研究：基础刺激以高出窦性心律10％的频率起搏，脉宽0.1ms首先测定心房起搏阈值，以起搏阈值的2倍作为输出电压期前刺激S₂脉宽和电压与S₁相同，在连续发放8个起搏刺激后发放早搏刺激S₂，S₁S₂自短于S₁S₁50-100ms开始，步长为5ms至S₂不能引起可传播的MAP即为心房有效不应期(AERP)。各组先用心脏电生理刺激仪测基础状态下S₁S₁刺激间期为200，150和130ms时的AERP(AERP₂₀₀)。完成检查后，经耳缘静脉首剂推注(5min)阿托品0.04mg/kg和美托洛尔0.2mg/kg后，给子阿托品0.007mg kg^-1h^-1、美托洛尔0.04mg kg^-1h^-1静脉滴注维持阻断自主神经对心率的影响。丹参酮I磺酸钠组缓慢静脉推注2.6mg/kg丹参酮I磺酸钠后，用微泵经静脉给予丹参酮I磺酸钠0.26mg kg^-1h^-1，对照组给予等容量的生理盐水，30min后再重复上述的电生理检查然后以600次/分的频率起搏，脉宽0.1ms分别于起搏0.5h与8h后即刻停止起搏重复测定。

试验结果：对心房肌的影响，与起搏前相比，对照组AERP₂₀₀在起搏后0.5h缩短23.6ms，起搏后8h缩短22.4ms，且心房肌的频率适应性丧失；丹参酮I磺酸钠组的AERP₂₀₀缩短程度与对照组比较显著性减轻(P＜0.05)，起搏后0.5h缩短2.7ms，起搏后8h缩短1.6ms；对心房肌频率依赖性的影响：与对照组比较，用药组AMAPD与AERP随S₁S₁间期的缩短亦逐渐缩短，但其变化无显著性差异，起搏后心房肌频率适应性得以维持。

结论：丹参酮I磺酸钠可以减轻短期快速心房起搏所致的电重构，使心房肌的频率适应性得以维持，从而减少心律失常的发生。

3、丹参酮I磺酸钠对家兔心肌缺血的保护作用

实验动物与分组：健康家兔24只，体重2.0-2.5kg，雌雄不拘，随机分为3组，每组8只，为心肌缺血再灌注模型组(I)、缺血预处理组(II)和丹参酮I磺酸钠联合缺血预处理组(III)。1％戊巴比妥钠经静脉麻醉(5mg.kg^-1)开胸暴露心脏，一根3.0号丝线绕过左室支中下1/3交界处，丝线两端穿过聚氯乙烯管，备结扎用。氯化下苯基四氮唑(TTC)用pH7.4磷酸缓冲液配成1％溶液。

试验方法：心肌缺血再灌注模型组(I)，结扎左室支30min后再灌120min；缺血预处理组(II)结扎左室支5min后松扎5min，其它同I组；丹参酮I磺酸钠联合缺血预处理组(III)，缺血预适应前5min静脉缓注丹参酮I磺酸钠2.6mg/kg，其它同II组。

观测指标：以TTC染色法测定心肌梗死范围，HE染色进行病理组织学观察；以硝酸还原酶法检测缺血前、后血浆及心肌组织NO代谢物含量。

试验结果：(1)对心肌梗死范围的影响：I组、II组、III组心肌梗死面积区(梗死区重量/缺血区重量)分别为37.4±4.2、11.7±5.0、6.2±1.9(n＝8，x±s)，III组心肌梗死面积区显著性小于I组、II组。HE病理学检测表明：与I组、II组相比，III组组织损伤程度明显减轻。

(2)、缺血前、后三组血浆及心肌组织NO代谢物含量

结果表明：I组血浆及心肌组织NO代谢物含量显著低于缺血前，II组显著高于I组(P＜0.05)；III组显著高于II组(P＜0.05)。

以上结果说明：缺血预处理可提高心肌细胞及内皮细胞内NO的含量，丹参酮I磺酸钠能缩小缺血预处理所致的心肌梗死面积并减轻缺血预处理对心肌组织的损伤程度，丹参酮I磺酸钠能强化缺血预处理的保护作用，从而改善冠脉微循环实现心肌保护作用。

4、丹参酮I磺酸钠对异丙肾上腺素致大鼠急性心肌缺血的保护作用

试验方法：将40只Wistar大鼠(雌雄各半，体重200～220g)随机分为4组，每组10只，分别为生理盐水组、丹参酮II A磺酸钠阳性对照组和丹参酮I磺酸钠高、低2个剂量组。3％的戊巴比妥钠按40mg/kg的剂量腹腔注射将大鼠麻醉，背位固定，皮下安插心电针式电极，记录正常的ECG标II导联，V₁及V₂导联ST段的电压值，然后舌下静脉给药，生理盐水对照组给予等量的生理盐水2mL/kg，阳性对照组给予(1.3mg/kg)丹参酮II A磺酸钠，丹参酮I磺酸钠高(2.6mg/kg)、中(1.3mg/kg)、低(0.75mg/kg)剂量组，5min后舌下静脉给予2mg/kg的异丙肾上腺素以建立急性心肌缺血模型，15s注射完毕，并立即记录0.5、1、2、3、5、10、15、20和30min的心电图，记录并比较给药前后S-T段的变化。

(1)对心电图S-T段的影响

将试验结果绘于图1中。从图1可以看出，给予异丙肾上腺素后，大鼠心电图S-T段明显升高，丹参酮II A磺酸钠在30min后可显著降低大鼠心电图S-T段，而丹参酮I磺酸钠在给药1min后，即可明显降低大鼠心电图S-T段，提示丹参酮I磺酸钠高、中、低各剂量组比丹参酮II A磺酸钠阳性给药组起效更迅速。

(2)、对心率的影响

将试验结果绘于图2中。从图2可以看出，给予异丙肾上腺素引起大鼠心肌缺血后，大鼠心率明显升高，丹参酮II A磺酸钠对大鼠心率无明显改善作用，而丹参酮I磺酸钠低、中剂量组，可显著降低心肌缺血大鼠的心率，提示丹参酮I磺酸钠可通过降低心肌耗氧量达到对缺血心肌的保护作用。

(3)、对血清LDH的影响

将试验结果绘于图3中。从图3可以看出，给予异丙肾上腺素引起大鼠心肌缺血后，大鼠血清LDH酶活性明显升高，丹参酮II A磺酸钠、丹参酮I磺酸钠均可降低血清LDH活性，提示丹参酮I磺酸钠对缺血心肌的保护作用。

(4)、对血清AST的影响

将试验结果绘于图4中。从图4可以看出，给予异丙肾上腺素引起大鼠心肌缺血后，大鼠血清AST酶活性明显升高，丹参酮II A磺酸钠、丹参酮I磺酸钠均可降低血清AST活性，提示丹参酮I磺酸钠对缺血心肌的保护作用。

5、溶血、局部刺激、过敏试验

体外溶血试验：4mg/ml浓度以下均未见溶血和红细胞凝集反应。

血管刺激试验：将6只家兔随机分为药物组和生理盐水对照组。分别用0.9％氯化钠注射液和25％葡萄糖注射液为溶剂，将丹参酮I磺酸钠溶液配成4mg/ml的浓度，家兔耳缘静脉缓慢推注，每天一次，连续3天，末次给药后48-96h小时肉眼观察动物和注射局部情况，并取材进行组织病理学检查。

结果表明，末次给药48-96h后，丹参酮I磺酸钠组和对照组动物均未出见明显异常反应；组织病理学观察显示：对照组和药物组家兔耳缘静脉结构完整，管腔无明显扩张，未见血管内皮细胞肿胀、变性、坏死，静脉壁及其周围组织无明显炎细胞浸润，管腔内无明显血栓形成。以上结果显示：该试验条件下，丹参酮I磺酸钠对家兔耳缘静脉无明显刺激性。

过敏试验：制成4mg/ml浓度的溶液，豚鼠隔日连续3次腹腔注射，每次0.5ml/只致敏。于第1次致敏后的第14天、第21天、第28天，分别静脉注射1.0ml/只的剂量进行激发。致敏期间每日观察每只动物基本状况，每次激发后30分钟内观察动物有无过敏性症状。结果显示：致敏期间动物基本状况良好，每次激发后30分钟内无过敏性症状出现。在该试验条件下，丹参酮I磺酸钠对豚鼠无致敏性。

丹参酮I磺酸钠对肝、肾功能无显著损害，不良反应轻微，药源广泛，是治疗各种心脏性疾病，包括冠心病、心绞痛、心肌梗死，心律失常，心肌血液供应不足的理想的药物。

6、抗癌方面

6.1、体外实验

采用人肝癌细胞(HepG2)细胞、结肠癌细胞(HT-29)和直肠癌细胞(HRT-18)进行体外实验研究。

1)对细胞增殖率的影响。取对数生长期的细胞，接种于直径35mm的培养皿中，细胞浓度约为6.5×10³个·ml^-1。随机分为用药组和对照组.用药组分别加入用二甲亚砜溶解的丹参酮I磺酸钠溶液(含0.02％二甲亚砜)0.5μg/ml、1.0μg/ml、1.5μg/ml，对照组加入0.02％二甲亚砜。每个浓度3个重复培养皿。培养72h，每24h用细胞计数仪检测癌细胞数。设对照组癌细胞增殖率为100％。用下面公式计算各用药组癌细胞增殖率：增殖率(％)＝[(用药组各时段癌细胞数-用药组开始癌细胞数)/(对照组各时段癌细胞数-对照组开始癌细胞数)]/100。

结果：24h，0.5μg/ml、1.0μg/ml、1.5μg/ml组对HepG2细胞的增殖率分别为83.6％、67.4％、42.7％；72h时分别为71.4％、18.6％、4.3％；对结肠癌细胞(HT-29)的增殖率分别为87.6％、71.8％、46.8％；72h时分别为68.7％、21.5％、6.4％；对直肠癌细胞(HRT-18)的增殖率分别为77.9％、58.9％、38.6％；72h分别为68.4％、22.8％、8.4％。

倒置显微镜下观察，用药组HepG2、HT-29、HRT-18细胞数目明显减少、细胞变小，折光性差；对照组形态无明显变化，生长较好。

实验表明丹参酮I磺酸钠能够抑制HepG2、HT-29、HRT-18细胞的增殖。

2)对细胞周期的影响。收集对照组和加丹参酮I磺酸钠1.0μg/ml的用药组培24，48，72h的细胞.PRS洗涤后。4℃下用75％酒精固定12h以上；离心除去酒精，PRS洗涤，加入10mgμg/ml RNA酶溶液150ul。37℃水浴30min.加入碘化丙啶(PI)，300目尼龙网过滤后4℃下放置15min。用FCM测定细胞周期各时相细胞的百分比及细胞凋亡率。

结果：丹参酮I磺酸钠处理组HepG2、HT-29、HRT-18细胞在G。/G期和细胞调亡百分率随处理时间和用药浓度的增加而上升。用药24h、48h、72h HepG2凋亡率分别为18.9％、33.7％、37.4％；HT-29凋亡率分别为16.4％、31.4％、41.6％；HRT-18凋亡率分别为14.5％、30.8％、34.8％。说明丹参酮I磺酸钠可将HepG2、HT-29、HRT-18细胞周期阻滞于G。/G期，然后诱导细胞凋亡，从而抑制癌细胞的生长。

3)对增殖凋亡调控相关基因Bax，Bcl2的蛋白表达的影响。采用免疫细胞化学检测增殖凋亡调控相关基因Bax，Bcl2的蛋白表达。分别收集对照组和加丹参酮I磺酸钠1.0μg/ml的用药组培养48h的HepG2细胞。用S-P法进行染色。小鼠Bax单克隆抗体按1∶200稀释，Bcl2中单克隆抗体按1∶50稀释，阴性对照以PBS代替抗体。结果判断：细胞染色呈棕黄色为阳性。随机计数100个细胞，测定每一指标的标记指数(labeling index，L1)，重复3次，取均值。L1＝阳性细胞数/计数细胞总数×100％。

结果：丹参酮I磺酸钠作用于HepG2细胞后，对照组的Bax L1、Bcl2L1、Bax/Bcl2 L1分别为28.04％、52.91％、0.53；而给药组的Bax L1、Bcl2 L1、Bax/Bcl2 L1分别为37.46％、38.00％、0.99。本实验结果表明，丹参酮I磺酸钠作用于HepG2细胞后Bcl2基因表达减弱，Bax基因表达增强，说明其可下调Bcl2、上调Bax表达，这可能是丹参酮I磺酸钠诱导HepG2细胞凋亡的机制之一。

以上癌细胞体外实验中可得出丹参酮I磺酸钠具有抗肿瘤活性，其作用机制之一是诱导细胞调亡。

6.2、体内实验

通过丹参酮I磺酸钠用于荷瘤裸鼠肿瘤抑制的实验研究，用HepG2细胞制作Bal b/c裸鼠荷瘤模型，腹腔注射丹参酮I磺酸钠15mg/kg，1次/天，连续10天。结果：丹参酮I磺酸钠、对照组瘤重分别为0.86g、1.38g，丹参酮I磺酸钠的抑瘤率达37.6％。表明：丹参酮I磺酸钠能够抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长，表明丹参酮I磺酸钠在活体上也具有抑制肿瘤作用。

以上肿瘤细胞的体内外实验显示，丹参酮I磺酸钠具有抑制肿瘤活性作用。对肝癌细胞(HepG2)、肠癌包括结肠癌细胞(HT-29)、直肠癌细胞(HRT-18)均有良好的抑制作用。

经以丹参酮I磺酸钠进行试验，实验表明可以将丹参酮I磺酸钠单独的或与其它组分混合的制成以丹参酮I磺酸钠为活性组分的药物。所述以丹参酮I磺酸钠为活性组分的药物可以为口服制剂或注射制剂。具体地说，所述药物为胶囊剂、片剂、软胶囊剂、微囊剂、水针、冻干粉针。

1)、固体制剂

以丹参酮I磺酸钠为主要活性组分，可以制备固体制剂，如制备胶囊、普通片、分散片。常用的辅料微晶纤维素、乳糖、硬脂酸镁、交联聚维酮、羧甲基淀粉等相关可用的辅料。其主药规格为每单位制剂含主药丹参酮I磺酸钠4mg-50mg。用法用量为4～100mg/次，一日3次。

2)、注射制剂

以丹参酮I磺酸钠为主要活性组分，可以制备注射制剂，如制备水针、冻干粉针等。常用的辅料包括：pH调节剂、冻干赋形剂等相关可用的辅料。pH调节剂包括可以用于用于调节注射液之pH值的组分：碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾、、冻干赋形剂其主药规格为每单位制剂含主药丹参酮I磺酸钠4mg-50mg。给药途径可以为肌内注射、静脉注射或静脉滴注。用法用量为肌内注射4～100mg/次，一日1次；静脉注射：4～100mg/次，以25％葡萄糖注射液20ml稀释；静脉滴注：4～100mg，以5％葡萄糖注射液250～500ml稀释，一日1次。

3)、软胶囊剂

以丹参酮I磺酸钠为主要活性组分，可以制备软胶囊剂，常用的辅料有聚乙二醇400、聚乙二醇600、大豆油、明胶、尼泊金脂等制备软胶囊剂可用的相关辅料。其主药规格为每单位制剂含主药丹参酮I磺酸钠4mg-50mg。用法用量为4～100mg/次，一日3次。

本发明的优点在于：

1、本发明发掘了丹参酮I磺酸钠新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。

2、本发明的丹参酮I磺酸钠药理药效实验表明：本品安全有效，药理作用强，有很好的药用前景。

3、本发明的丹参酮I磺酸钠药理药效实验表明：丹参酮I磺酸钠可显著降低急性心肌缺血大鼠心电图S-T段，且较丹参酮II A磺酸钠阳性起效更迅速；丹参酮I磺酸钠可显著降低心肌缺血大鼠的心率，而丹参酮II A磺酸钠对心肌缺血大鼠的心率无明显改善作用。

4、本发明的丹参酮I磺酸钠为丹参药材提取物丹参酮I经磺化而制成，丹参药材是一种常用的中药材，药源广泛。

5、本发明所述的丹参酮I磺酸钠可制备成口服制剂，包括胶囊剂、片剂、软胶囊剂、微囊剂以及注射制剂，包括水针、冻干粉针等多种剂型的药物。

附图说明

图1是对急性心肌缺血大鼠心电图S-T段的影响的柱形图。

图2是对急性心肌缺血大鼠心电图S-T段的影响的折线图。

图3是对急性心肌缺血大鼠心率的影响的柱形图。

图4是对急性心肌缺血大鼠心率的影响的折线图。

图5是对急性心肌缺血大鼠血清LDH的影响的图。

图6是对急性心肌缺血大鼠血清AST的影响的图。

具体实施方式

实施例1

丹参酮I磺酸钠的合成及结构确证

1)合成：取0.2克丹参酮I投入盛有5.2ml冰醋酸，7.2ml醋酐的三颈瓶中，于冰水浴下滴加0.4ml浓硫酸-冰醋酸(V∶V＝1∶1)，室温搅拌4小时，缓慢加入20ml饱和NaCl溶液，搅拌0.5小时，抽滤，饱和NaCl溶液洗涤滤饼(10ml，两次)，用水洗涤滤饼，使滤饼pH＝5～6，低温(60℃)减压干燥。取滤饼加乙酸乙酯200ml回流6小时，除去未磺化的脂溶性杂质，过滤，取固体物溶于400ml无水乙醇，回流4小时，过滤，取滤液，减压去除溶剂，得红褐色固体，以甲醇重结晶，得目标产物丹参酮I磺酸钠。结构式如下：

2)、结构确证：

¹H-NMR(DMSO-D6)：δ9.16(d，1H)，8.49(d，1H)，7.84(d，1H)，7.60(t，1H)，7.44(d，1H)，2.69(s，3H)，δ2.36(s，3H)

¹³C-NMR(500Hz，DMSO-D6)：δ182.3，175.1，157.2，155.2，135.4，133.0，132.7，131.9，130.0，128.7，127.8，123.8，123.4，120.3，118.5，117.1，19.2，9.2

实施例2

丹参酮I磺酸钠的合成及结构确证

1)、合成：取丹参酮I原料5g，加13ml冰醋酸，再加20ml醋酐，置于三颈烧瓶中，在搅拌下于10～15℃滴加10ml浓硫酸-冰醋酸(1∶1)的混合液，滴加完毕后，在室温下搅拌1小时，然后将反应液徐徐倾倒入等体积的蒸馏水中，迅速加入100ml饱和的氯化钠水溶液，即有粗丹参酮I磺酸钠析出，离心，沉淀物用饱和氯化钠溶液洗涤两次，在用适量的水洗一次，使固体物pH＝5-6，将固体物在水浴上蒸干，即得棕红色丹参酮I磺酸钠粗品6.1g，收率：80.8％。将丹参酮I磺酸钠粗品以少量甲醇溶解，上硅胶柱进行吸附，以苯-氯仿-丙酮(8∶2∶0.5)洗脱，收集，挥干溶剂，即得丹参酮I磺酸钠精制品。

2)、结构确证：

¹H-NMR(DMSO-D6)：δ9.14(d，1H)，8.47(d，1H)，7.85(d，1H)，7.62(t，1H)，7.42(d，1H)，2.68(s，3H)，δ2.35(s，3H)

¹³C-NMR(500Hz，DMSO-D6)：δ182.1，175.0，157.2，155.3，135.5，133.0，132.8，131.8，130.0，128.7，127.8，123.8，123.4，120.3，118.5，117.3，19.1，9.1

实施例3

丹参酮I磺酸钠冻干粉针的制备

取丹参酮I磺酸钠4g、甘露醇40g，加注射用水至2000ml(1000支量)，搅拌加热至60℃使溶解，0.2％(w/v)的针用活性炭，粗滤脱炭，再用0.22um微孔滤膜精滤，检测中间体含量，灌装2ml/瓶，半压丁基橡胶塞，冻干，即得丹参酮I磺酸钠冻干粉针。

实施例4

丹参酮I磺酸钠注射液的制备

取丹参酮I磺酸钠20g，加注射用水至2000ml(1000支量)，搅拌加热至60℃使溶解，0.2％(w/v)的针用活性炭，粗滤脱炭，再用0.22um微孔滤膜精滤，检测中间体含量，灌装2ml/瓶，灭菌，即得。

实施例5

丹参酮I磺酸钠胶囊的制备

取丹参酮I磺酸钠20g、微晶纤维素50g、淀粉40g、羧甲淀粉钠10g，混合均匀，加入浓度为6％聚维酮K₃₀液50ml(溶媒：50％的乙醇)，混合均匀，过20目筛制粒，60℃干燥约1.5小时，取出，过18目筛整粒，加入硬脂酸镁0.5g，混合均匀，取样检测主药含量，灌装，制得1000粒，即得。

实施例6

丹参酮I磺酸钠片的制备

取丹参酮I磺酸钠10g，淀粉40g，微晶纤维素50g，混合均匀，加入5％聚维酮_K30液(约40ml)，搅拌、揉制使成软材，过20目筛，制湿粒，60℃干燥，过18目筛整粒，加入硬脂酸镁1g，混合均匀，检测中间体含量，压片，制得500片，即得。

实施例7

丹参酮I磺酸钠软胶囊的制备

采用压制法制备软胶囊，具体步骤如下：

①药液配制：将丹参酮I磺酸钠50g，聚乙二醇400200g，将丹参酮I磺酸钠与少量聚乙二醇400研磨充分，然后慢慢加入全量聚乙二醇400，使完全溶解，加入柠檬酸溶液调节pH值至5.0～7.0之间，备用。

②溶胶：将配比为1∶0.6∶1的明胶、甘油、纯化水置夹层锅内，水浴加热，使明胶溶解均匀后，减压浓缩，过滤，置保温桶中，备用。采用压制法制备软胶囊1000粒。

Claims (3)

1.丹参酮I磺酸钠在制备治疗冠心病药物中的应用，其特征在于所述的丹参酮I磺酸钠的制备过程如下：

a、磺化：取丹参酮I放在醋酐-冰醋酸溶液中，加入体积比1∶1的浓硫酸-冰醋酸混合溶液，在冰水浴条件下进行磺化反应，经盐析得到丹参酮I磺酸钠粗品；

b、精制：将所得粗品用乙酸乙酯除去脂溶性杂质，乙醇回流除去残存的无机盐，再经甲醇或丙酮溶剂进行重结晶；或将所得粗品经硅胶柱层析进行分离纯化，即得目标产物丹参酮I磺酸钠。

2.如权利要求1所述的丹参酮I磺酸钠在制备治疗冠心病药物中的应用，其特征在于，所述冠心病包括下列病症中的至少一种：心绞痛、心肌梗死、心律失常和心肌血液供应不足。

3.丹参酮I磺酸钠在制备治疗肝癌、直肠癌、结肠癌药物中的应用，其特征在于所述的丹参酮I磺酸钠的制备过程如下：

a、磺化：取丹参酮I放在醋酐-冰醋酸溶液中，加入体积比1∶1的浓硫酸-冰醋酸混合溶液，在冰水浴条件下进行磺化反应，经盐析得到丹参酮I磺酸钠粗品；

b、精制：将所得粗品用乙酸乙酯除去脂溶性杂质，乙醇回流除去残存的无机盐，再经甲醇或丙酮等溶剂进行重结晶；或将所得粗品经硅胶柱层析进行分离纯化，即得目标产物丹参酮I磺酸钠。

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