CN101023174B

CN101023174B - 在原核生物中制备活性的和可溶的蛋白的方法及多顺反子载体

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Publication number: CN101023174B
Application number: CN200480043539XA
Authority: CN
Inventors: 李峰镛; 朴胜国; 朴信惠; 权五炳; 尹彩夏; 金英珠; 金宋泳; 闵庚铉; 李允硕; 李太喜; 具兑营
Original assignee: Daewoong Co Ltd
Current assignee: Daewoong Co Ltd
Priority date: 2004-05-06
Filing date: 2004-06-11
Publication date: 2011-03-02
Anticipated expiration: 2024-06-11
Also published as: KR100484653B1; WO2005108585A1; JP4510884B2; US7811786B1; JP2007535923A; EP1747274A1; EP1747274B9; DE602004027310D1; CN101023174A; EP1747274B1; ATE468398T1; EP1747274A4

Abstract

本发明涉及一种在原核细胞中生产生物活性的、可溶形式的目标蛋白的方法及多顺反子载体。

Description

在原核生物中制备活性的和可溶的蛋白的方法及多顺反子载体

技术领域

本发明涉及一种在原核生物中生产生物活性的、可溶的目标蛋白的方法及用于该方法的多顺反子载体。

背景技术

与其它生物体相比，使用重组E.coli的异源蛋白生产系统使用廉价培养基就能实现细胞的快速生长和培养物的高密度，且与使用其他微生物时相比，该生产系统使用易于鉴别基因，因此可以设计出各种利于异源蛋白的高表达和提纯的载体系统(Jeffrey G.T.and Amanda A.et al，(1997)，Applied Biochemistryand Biotechnology 66，197-238)。

然而，当使用E.coli作为宿主细胞生产真核生物蛋白的时候，E.coli没有表现出如糖基化的翻译后修饰，因为它不具有蛋白成熟所需的细胞内因子。而且，当异源蛋白高水平表达时，经常以包涵体的形式堆积，其中包涵体是非溶解的沉淀物。

包涵体主要是由于目标蛋白的产生速度和折叠速度不平衡导致目标蛋白的可折叠中间体的疏水表面间相互作用而形成的。此时，包涵体容易被分离，受蛋白酶的影响较小并且在细胞内以高浓度累积，这样确保了目标蛋白的高产量和便利分离。由于这些优点，蛋白作为包涵体的表达方案有利于体内折叠不好的蛋白的生产。作为包涵体表达的目标蛋白需要另外的重折叠步骤以恢复其生物活性。目标蛋白重折叠成活性形式依赖于经验，因此经常不成功并且难于扩大重组蛋白的工业生产规模。另外，高分子量抗体蛋白、组织纤溶酶原活化剂(tPA)和VIII因子很难通过重折叠方法生产出活性形式。

如上所述，既然包涵体蛋白应该被重折叠成具有完整的结构和生物活性(Andrew D.Guise，Shauna M.West，and Julian B.Chaudhuri(1996)，MolecularBiotechnology 6，53-64)，那么就使用所谓的“体内蛋白折叠技术”将目标蛋白在体内表达为具有正确的三维结构形式的可溶蛋白。因为这项技术改善了当异源蛋白表达为包涵体时所引起的问题，因此在E.coli中生产异源蛋白具有工业价值。

下面三个方案一般用于体内蛋白折叠。

第一个方案包括蛋白表达位点和培养环境的控制。当目标蛋白被设计成在细胞质内表达时，虽然目标蛋白对细胞有害，但是细胞并没有被损坏并且蛋白大部分以高水平表达。还有，这种方法有利于表达载体的制备。相对于细胞质内表达蛋白的方法，另一种将目标蛋白分泌到外周胞质的方法有益于简化蛋白纯化，减少蛋白酶的降解和由相关的氧化环境导致适当的二硫键形成。进一步的优点包括除去N-端的分泌信号获得真正(authentic)蛋白。然而，分泌蛋白可能聚集导致包涵体的形成，而且可减少的折叠发生。在另一个方法中，向培养基中分泌目标蛋白能够解决蛋白折叠和蛋白酶降解相关的问题。可是，E.coli很少向培养基中分泌蛋白，而且，即使蛋白被分泌到培养基中时也被很大程度地稀释了，因此很难纯化。这种方法仅对部分蛋白有效，因此不能作为抑制包涵体产生的常规方法。还有，发酵控制经常用于增加可溶蛋白，并且在大部分情况下发酵控制是最经济的方法(韩国专利申请号：1997-50023)。降低培养温度不能应用于所有的蛋白，但是在很多情况下是非常有效的，因为降温通常能够使得蛋白的产生速度低于折叠速度从而使得彼此之间具有强粘附力的折叠中间体的累积无法形成(Schein，C.H.and M.H.M.Noteborn(1988)，Biotechnology 6，291-294；More，J.T.，Uppal，F.Maley and G.F.Maley(1993)，Protein.Expr.Purif.4，160-163)。

第二个方案包括多个伴侣分子(chaperone)和多个蛋白折叠酶的共表达。伴侣分子是指帮助蛋白三维结构形成和抑制非必需分子间或分子内相互作用的蛋白。

源于E.coli的伴侣蛋白包括GroEL、GroES、DnaK、HtpG、SecB和PapD，它们能保护折叠中间体并抑制聚集，而且除了PapD(存在于近原生质膜)外所有的E.coli伴侣蛋白存在于细胞质中(韩国专利申请号：2003-7008657；Hartl，F.U.，R.Holdan and T.Langer(1994)，Trends Biochem.Sci.19，20-25；Bernadea-Clark，E.and G.Georgiou(1994)，American Chem.Soc.Symp.Ser.Vol.470，ACS)。折叠酶是指折叠中适于促进共价结合或异构化作用的辅助蛋白家族。促进蛋白二硫键形成的酶包括DsbA、DsbB、DsbC和DsbD(Creighton，T.E.，A.Zapun and N.J.Darby(1995)，TIBTECH.13，18-27；Gottesman，M.E.and W.A.Hendrickson(2000.Curr.Opin.Microbial.3，197-202)。

第三个方案包括融合蛋白的使用。许多蛋白作为融合蛋白已经被揭露，它们包括谷胱甘肽-S-转移酶，麦芽糖结合蛋白，蛋白A，肿瘤坏死因子-α和赖氨酰-tRNA合成酶(Smith，D.B.and Johnson，K.S.(1988)，Gene 67，31-40.；Bedouelle，H.and Duplay，P.(1988)，Euro.J.Biochem.171，541-549.；Nisson，B.etal.(1987)，Proto.Eng.1，107-113；Korean Pat.Application No.1996-44010)。还有，如US6,027,888中所述，具有二硫键的可溶真核生物蛋白通过与二硫化物异构酶融合形式来表达生产。另外，如在韩国专利申请号2002-0040497所述，H-链人铁蛋白可以与在E.coli中不溶形式表达的L-链人铁蛋白一起通过表达可溶的形式来生产。如上所述，已经做了以可溶的融合蛋白形式表达异源蛋白的各种尝试。但是，融合效果根据如下所述的融合蛋白的类型而变化：表达为包涵体的融合蛋白；它们中的部分以可溶形式表达融合蛋白；和有助于目标蛋白折叠且被目标蛋白融合的蛋白(Savvas C.Makrides(1996)，MicrobiologicalReview，512-538)。

因此目前急需一种能够大规模生产高效和高浓度的生物活性的、可溶的重组蛋白的技术。

发明内容

基于上述背景技术，本发明的发明者试图开发一种新的载体系统，其能够在原核生物中大规模生产以生物活性形式(表达的异源蛋白包涵体，而不是企图发现用于通过重组DNA技术生产蛋白质的融合蛋白。

结果，本发明的发明者发现了基于编码目标蛋白的基因和在原核生物中的β-内酰胺酶基因的多顺反子表达的表达载体，其同时高度表达目标蛋白和β-内酰胺酶，使得可溶形式的目标蛋白以更高比例表达并且在蛋白的大规模生产中效果显著。本发明的发明者使用已经建立的蛋白表达系统开发了大规模生产具有生物活性的目标蛋白的方法，由此产生了本发明。

本发明的发明目的是提供一种在原核细胞中生产生物活性的、可溶的，且以包涵体的形式表达的目标蛋白的方法。

本发明的另一个目的是提供一种生产上述生物活性的上述目标蛋白的多顺反子载体系统。

附图简述

本发明的上述的和其它的目的、技术特征和其它的有益效果能够从下面的结合附图的详细说明中更清楚地得到理解，其中：

图1表示具有人生长激素基因的表达载体，即pTT191的制备过程？？？。

图2是显示用pTT191表达载体转化E.coli BL21(DE3)后人生长激素的表达在SDS-PAGE凝胶上的分析结果的照片(条带1：蛋白大小标记；条带2：人生长激素对照；条带3：破碎诱导表达的转化株获得的上清液；和条带4：破碎诱导表达的转化株获得的团粒)。

图3表示具有人生长激素(hGH)基因和人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)基因的pT0191和pT0-CSF表达载体的制备过程。

图4是显示用pT0191表达载体转化E.coli BL21(DE3)后人生长激素的表达在SDS-PAGE凝胶上的分析结果的照片(条带1：蛋白大小标记；条带2：人生长激素对照；条带3：破碎诱导表达的转化株获得的全蛋白；条带4：破碎诱导表达的转化株获得的上清液；条带5：破碎诱导表达的转化株获得的团粒)。

图5是通过在hGH基因的反方向将人生长激素(hGH)基因插入到具有β-内酰胺酶基因的表达载体制备的pTR0191的构建体。

图6是显示用pTR0191表达载体转化E.coli BL21(DE3)后人生长激素的表达在SDS-PAGE凝胶上的分析结果的照片(条带1：蛋白大小标记；条带2：人生长激素对照；条带3和4：破碎诱导表达的转化株获得的团粒；条带5和6：破碎诱导表达的转化株获得的上清液)。

图7是显示用pT0-CSF表达载体转化E.coli BL21Star(DE3)pLysS后人G-CSF的表达在SDS-PAGE凝胶上的分析结果的照片(条带1：蛋白大小标记；条带2：诱导表达前破碎转化株获得的上清夜；条带3和4：破碎诱导表达的转化株获得的上清液；条带5和6：破碎诱导表达的转化株获得的团粒)。

图8是显示用pT0-IFN表达载体转化E.coli BL21(DE3)后干扰素α2b的表达在SDS-PAGE凝胶上的分析结果的照片(条带1：蛋白大小标记；条带2：破碎诱导表达的转化株获得的团粒；和条带3：破碎诱导表达的转化株获得的上清液)。

图9是显示用pT0-bFGF表达载体转化E.coli BL21(DE3)后，基础成纤细胞(basic fibroblast)生长因子的表达在SDS-PAGE凝胶上的分析结果的照片(条带1：蛋白大小标记；条带2：破碎诱导表达的转化株获得的团粒；和条带3：破碎诱导表达的转化株获得的上清液)。

图10是显示用pT0-IGF1表达载体转化E.coli BL21(DE3)后胰岛素样生长因子-1的表达在SDS-PAGE凝胶上的分析结果的照片(条带1：蛋白大小标记；条带2：破碎诱导表达的转化株获得的团粒；和条带3：破碎诱导表达的转化株获得的上清液)；

图11是显示用pT0-IGF2表达载体转化E.coli BL21(DE3)后胰岛素样生长因子-2的表达在SDS-PAGE凝胶上的分析结果的照片(条带1：蛋白大小标记；条带2：破碎诱导表达的转化株获得的团粒；和条带3：破碎诱导表达的转化株获得的上清液)；

图12是显示在SDS-PAGE凝胶上用pT0-KGF表达载体转化E.coliBL21(DE3)后角质化细胞生长因子的表达在SDS-PAGE凝胶上的分析结果的照片(条带1：蛋白大小标记；条带2：破碎诱导表达的转化株获得的团粒；和条带3：破碎诱导表达的转化株获得的上清液)；

图13是显示在SDS-PAGE凝胶上用pT0N-KGF表达载体转化E.coliBL21(DE3)后的角质化细胞生长因子的表达在SDS-PAGE凝胶上的分析结果的照片(条带1：蛋白大小标记；条带2：破碎诱导表达的转化株获得的团粒；和条带3：破碎诱导表达的转化株获得的上清液)；

本发明的最佳实施方式

本发明的一个方面涉及一种在原核细胞内制备活性的可溶的目标蛋白的方法，该方法基于在多顺反子中第一顺反子和第二顺反子分别表达目标蛋白和β-内酰胺酶。

本发明的发明者发现，当人生长激素在原核细胞中作为包涵体表达和β-内酰胺酶以多顺反子方式表达时，人生长激素和β-内酰胺酶均以高浓度产生，并且表达的人生长激素以活性的、可溶的形式存在。在相同条件下，当用卡那霉素替代β-内酰胺酶表达基础成纤维细胞生长因子和角质化细胞生长因子时，目标蛋白主要表达为包涵体的形式。基于此发现，本发明的发明者用β-内酰胺酶多顺反子方式表达了许多目标蛋白，这些蛋白在原核细胞中以包涵体形式表达且具有医药用途。结果，所述目标蛋白以活性的、可溶的形式产生。

因此本发明的另一个方面涉及生产活性的、可溶的异源蛋白的多顺反子载体。

在本发明的一个实施方案中，本发明涉及在原核细胞中表达活性的、可溶的目标蛋白的多顺反子载体，该载体包含：(i)原核细胞中可操作的启动子，(ii)包括编码目标蛋白的DNA序列的第一顺反子，和(iii)包括编码β-内酰胺酶的DNA序列的第二顺反子。

这里所用的术语“多顺反子”是指一种系统，其中单链mRNA由相同的启动子合成，顺反子彼此之间被终止密码子和起始密码子分离，每个顺反子存在一个核糖体结合位点，相应于每个顺反子的蛋白由单个启动子转录的单个mRNA表达。此处“顺反子”含义是编码单个蛋白和多肽的核酸序列，并且包含5’起始密码子和3’终止密码子。此外，第一和第二顺反子不是指DNA序列中的序列而是指独立的顺反子。

在一个优选的方面，在本发明的多顺反子中，包含编码目标蛋白的DNA序列的第一顺反子可以在5’至3’方向可操作地连接包含编码β-内酰胺酶的DNA序列的第二顺反子，或者，包含编码β-内酰胺酶的DNA序列的第二顺反子可以在5’至3’方向可操作地连接包含编码目标蛋白的DNA序列的第一顺反子。

本文中的术语“载体”是指DNA构建体，其包含可操作地连接于能够使DNA在宿主中表达的调节序列的DNA序列，和，详细地，其可以构建成含启动子序列、终止子序列、标记基因和其它包含适当的调节序列的合适序列。这样的载体可以是质粒，pharge，粘粒，等(Molecular Cloning：Laboratory Mannualsecond edition，Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。载体的制备、诱变、序列分析、DNA向细胞的导入、基因表达和蛋白分析被详细地描述于Current Protocols in Molecular Biology，edited by Ausubel et al.，JohnWiley&Sons(1992)。当载体被导入到适当的宿主时，其可以独立于宿主基因组复制或起作用，或者，在某些情况下，其被整合入宿主基因组。质粒是目前载体的常规形式，在本发明中，术语“质粒”和“载体”可以交替使用。考虑到本发明的目的，载体是适于原核细胞中蛋白表达的载体，并且其是以多顺反子方式(polycistronically)表达异源目标蛋白和β-内酰胺酶的多顺反子载体。

本文中的术语“可操作地连接”的含义是表达调节序列以以调节编码目标蛋白的多核苷酸的转录和翻译的方式连接，该术语也包括以某种方式维持精确的翻译体系以使得当多肽序列在调节序列(包括启动子)的控制下表达时产生多核苷酸序列编码的目标蛋白的多肽。

本文中的术语“启动子”的含义为足以启动转录的最小序列。考虑到本发明的目的，可以使用由外部信号或效应物(effector)诱导的启动子。有利于在原核生物细胞中表达目标蛋白的启动子包括T7、tac、trc、lac、lpp、phoA、recA、araBAD、proU、cst-1、tetA、cadA、nar、lpp-lac、饥饿(starvation)启动子、cspA、T7-lac操纵序列、T3-lac操纵序列、T5-lac操纵序列、T4基因32、和nprM-lac操纵序列。优选T7、tac、lac、T7-lac操纵序列、T3-lac操纵序列、T5-lac操纵序列和T4基因32，更优选T7、tac和T7-lac操纵序列。最优选启动子为T7启动子。T7启动子由T7 RNA聚合酶控制，而T7 RNA聚合酶由IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)控制。使用IPTG时T7启动子能够诱导目标蛋白在所需时间表达。这是因为原核宿主细胞如E.coli在目标蛋白不表达的时候其细胞数目处于增长阶段，而E.coli充分增长后，目标蛋白的表达被诱导。

核糖体结合位点通常位于起始密码子的上游约10bp位置，并且其在噬菌体和本发明的原核生物的多顺反子操纵子中精确有效地作用于mRNA转录的起始。

使用本发明的多顺反子载体表达的目标蛋白可包含所有的具有医药用途的蛋白。尤其是具有医药目的需求、但已知通过遗传工程在宿主细胞中大规模表达时以包涵体的形式出现的蛋白适于作为本发明的目标蛋白。目标蛋白的实例包括人生长激素(gGH)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素类(IFN)、基础成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、角质化细胞生长因子(KGF)、红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、人表皮生长因子(EGF)、血小板来源的生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)、转化生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、血管生成素、血管紧张素、白细胞介素(IL)、和组织纤维酶原激活物(tPA)。更优选为hGH、G-CSF、IFN-α2b、bFGF、IGF-1、IGF-2、KGF、EPO、IL-7和TPO。这些目标蛋白可以是天然形式或是改良形式，并且包括它们的全序列或其片段的缺失、取代或添加的变体。在本发明的另一个实施方案中，hGH、G-CSF、IFN-α2b、bFGF、IGF-1、IGF-2、KGF被表达。

本发明中被表达的目标蛋白可以是其本身，或者是融合蛋白形式，如以与具有增长溶解性的序列的融合形式，从而有利于纯化，通过与抗体或酶融合提供各种功能或增加溶解性。当目标蛋白包含利于如纯化的序列时，目标蛋白可以表达为具有这一序列的融合蛋白形式。这一目融合的标蛋白可以是“融合伴侣-连接肽-目标蛋白”的组织形式，但是根据目标蛋白和融合伴侣的类型可以不同组织形式进行制备。更优选地，融合伴侣利于产品蛋白的纯化，具体的例子为组氨酸标签(histidine-tag)、谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、蛋白A、蛋白G、标记肽(flag peptide)、硫氧还蛋白、S-肽、抗生素蛋白、抗生物素蛋白链菌素(streptavidin)、半乳糖结合蛋白、纤维素结合域、壳多糖结合域、聚精氨酸(polyarginine)、聚半胱氨酸(polycysteine)和聚苯丙氨酸(polyphenylalanine)。在本发明的另一个实施方案中，使用包含十个组氨酸的组氨酸标签。连接目标蛋白到融合伴侣的连接肽包含蛋白酶识别的序列，其例子为肠激酶、凝血酶、Xa因子、尿激酶、TEV蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶，它们具有高序列特异性。

本文所用的术语“活性的”是指可溶蛋白通过在重组载体转化株中的稳定表达和被折叠成不经附加的变性和重折叠的天然形式而具有生物活性。

本文所用的术语“可溶的”含义为蛋白具有的性质是在水溶液中不易沉淀和不易形成包涵体和其它聚集体。

本发明中所用的β-内酰胺酶(bla)是一种提供氨苄表霉素抗性的蛋白，其作为选择被表达载体转化的宿主细胞的因子。在本发明的多顺反子载体中，编码目标蛋白的顺反子和编码β-内酰胺酶的另一个顺反子的排列可以根据某些目而进行改变，但是编码β-内酰胺酶的顺反子优选位于编码目标蛋白的顺反子的下游区域。

本发明实施方案中所用的PT0表达载体是如下所述的载体：该载体中融合的目标蛋白基因(融合伴侣-连接肽-目标蛋白)或目标蛋白基因本身可操作地连接于pET3a的T7启动子的下游区域，而且该载体在融合的目标蛋白基因或目标蛋白和β-内酰胺酶基因在同一个启动子的调控下过表达融合的目标蛋白和β-内酰胺酶。本发明制备的PT0表达载体包括pT0191、pT0-CSF、pT0-IFN、pT0-bFGF、pT0-IGF1、pT0-IGF2、pT0-KGF和pT0N-KGF，每个载体具有融合的hGH、G-CSF、IFN-α2b、bFGF、IGF-1、IGF-2和KGF基因，和非融合的KGF基因。当这些载体被表达的时候，大部分目标蛋白相对于对照是以可溶的、活性形式的。

另一方面，本发明实施方案中所用的pTT对照表达载体中融合的目标蛋白基因(融合伴侣肽连接子的目标蛋白基因)可操作地连接于pET3a的T7启动子的下游区域，但是目标融合蛋白基因和β-内酰胺酶基因是在不同的启动子控制下表达。这样载体转化的E.coli在体内过表达融合目标蛋白，但是大量的融合蛋白表达为包涵体(实施例2)。另一个对照载体pTR0191是质粒，其通过将β-内酰胺酶基因转化到pT0191表达载体的反向而制备的，同时将融合的人生长激素基因可操作地连接于T7启动子的下游区域，其中目标蛋白和β-内酰胺酶基因不受相同的启动子控制。当pTR0191在宿主细胞中表达时，融合蛋白大部分作为包涵体表达，并且β-内酰胺酶以低水平表达(实施例5)。

这样，详细地说，为同时过表达β-内酰胺酶和目标蛋白本身或融合目标蛋白和以高百分率表达活性形式的目标蛋白，本发明提供了多顺反子表达载体pT0191、pT0-CSF、pT0-IFN、pT0-bFGF、pT0-IGF1、pT0-IGF2、pT0-KGF和pT0N-KGF，每个载体分别具有编码hGH(SEQ ID NO.5)、G-CSF(SEQ ID NO.7)、IFN-α2b(SEQ ID NO.9)、bFGF(SEQ ID NO.11)、IGF-1(SEQ ID NO.13)、IGF-2(SEQ ID NO.15)和KGF(SEQ ID NO.23)的基因，它们被融合到源于pET3a表达载体的pT0表达载体，和编码非融合的KGF(SEQ ID NO.25)基因。在这些载体中，pT0191和pT0-IFN被导入到E.coli BL21(DE3)中，pT0-CSF被导入到E.coli BL21 Star(DE3)pLysS中。产生的转化体于2004年3月11日保藏于KCTC(韩国典型培养物保藏中心地址：KCTC，KRIBB，52，Oun-dong，Yusong-ku Taejon韩国)，保藏号分别为KCTC-10610BP、KCTC-10612BP和KCTC-10611BP。

本发明的多顺反子表达载体被导入到宿主细胞中以通过本领域已知的方法转化宿主细胞，这些方法包括使用CaCl₂的化学方法和电穿孔。

本文所用的术语“转化的”是指向原核生物的导入，以允许多顺反子载体中携载的基因被表达。

如果融合蛋白的重组核酸序列在细胞中被适当地转录为mRNA，并且该细胞能够表达蛋白，那么可以使用某些原核细胞，并且优选革兰氏阴性细菌、E.coli，和革兰氏阳性细菌，芽孢杆菌。更优选E.coli，最优选E.coli BL21(DE3)，E.coli BL21 Star(DE3)pLysS，E.coli HMS(DE3)和E.coli AD494(DE3)。上述宿主细胞具有噬菌体T7 RNA聚合酶，并且本发明不限于这些实例。用噬菌体T₇ RNA聚合酶比用E.coli RNA聚合酶使本发明的源于噬菌体T₇启动子更有效地表达(Studier FW et al.(1990)，MethodEnzymol.185，60-89)。因此优选将pT0表达载体导入具有T₇ RNA聚合酶基因的E.coli BL21(DE3)或E.coli BL21Star(DE3)pLysS中而进行表达。当本发明的pT0-CSF表达载体被导入到E.coliBL21(DE3)、BL21 Star(DE3)pLysS、HMS(DE3)或AD494(DE3)时，目标融合蛋白可以以70％或更高的活性形式表达。

因此，在另一个实施方案中，本发明提供了上述多顺反子表达载体转化的转化体。具体地，转化体包括用pT0191、pT0-CSF、pT0-IFN、pT0-bFGF、pT0-IGF1、pT0-IGF2、pT0-KGF或者pT0N-KGF转化的E.coli。

适当的培养基中、适当的条件下以允许编码目标蛋白的DNA序列表达的方式培养本发明的表达载体转化的转化体。培养转化体表达重组蛋白的方法在本领域是公知的。例如，将转化体接种于适当地培养基进行种子培养，然后将种子培养接种于生产培养基并在适当的条件下生长，然后诱导蛋白表达。在生产培养中，使微生物生长，然后诱导重组蛋白的表达，从而增长重组蛋白的产量。

因此，在另一个方方面，本发明提供一种生产活性的、可溶的蛋白的方法，该方法包括培养转化体和从培养基中回收可溶目标蛋白。

从培养转化体获得的培养基中回收的目标蛋白是基本纯的，并且可以用于医药用途。重组蛋白的回收可以通过各种本领域已知的分离和纯化方法完成。为除去细胞碎片，一般将细胞溶解产物离心，然后对上清液实施沉淀处理、透析和进行各种柱层析。柱层析的实例包括离子交换柱层析、凝胶过滤层析、HPLC、反向HPLC、预备SDS-PAGE，和亲和柱层析。

本发明的可溶的、活性的蛋白的纯化可以通过一般纯化方法完成，例如细胞破碎和离心后不经过重折叠过程而进行超滤和离子交换层析，这样利于活性目标蛋白的分离。

通过下面解释性的实施例可以更好地理解本发明，但是它们不能构成对本发明的限制。

实施例

实施例1：pTT191表达载体的构建

制备对照表达载体pTT191，使其高产量表达为以包涵体的形式包含人生长激素的融合蛋白。

通过PCR连接方法(PCR ligation method，Willem P.C.Stemmer，andHerbert L.Heyneker(1995)Gene 164，49-53；Scott W.Altmann，and Robert A.Kastelein(1995)Protein Expression and Purification 6，722-726；Ana Paula deMattos Areas，and Paulo Lee Ho(2002)Protein Expression and Purification25，481-487)制备编码含人生长激素的融合蛋白(SEQ ID NO.5)的融合基因，该基因与组氨酸标签和肠激酶识别序列连接。PCR连接方法如下述进行。将含20个互补重叠碱基的合成寡核苷酸对中的每个50pmol，2.5U(1μl)的pfuDNA聚合酶(Stratagene，USA)，2L的2.5mM的dNTPs(Takara，Japan)，和2μl的10×Pfu聚合酶缓冲液按次序加入到PCR管中，然后加入无菌蒸馏水到终体积20μl。用PCR机进行PCR(MJ research，USA)，此处每个寡核苷酸既作为模板又作为引物。PCR的条件为94℃变性5分钟，然后进行20个循环，循环条件为：96℃变性1分钟，52℃退火30秒，然后72℃延长30秒，接着在72℃进行10分钟的终延长。末端具有互补核苷酸序列(20bp)的两个PCR产品得到扩增。将5μl的每个PCR产品、2.5U的(1μl)的Pfu DNA聚合酶(Stratagene，USA)，2μl的2.5mM的dNTPs(Takara，Japan)，和2μl的10×Pfu聚合酶缓冲液依次加入到PCR管中，然后加入无菌蒸馏水到终体积20μl。用PCR机进行PCR(MJ research，USA)。PCR的条件为94℃变性5分钟，然后进行20个循环，循环条件为：95℃下变性1分钟，52℃退火30秒，然后72℃延长30秒，接着在72℃进行10分钟的终延长。重复进行这个过程，在最后步骤具有30循环的PCR，这样产生合成基因。合成基因在1％琼脂糖凝胶上电泳然后用QIAQuick凝胶提取试剂盒(Qiagen，USA)从凝胶中分离基因。结果，获得了融合人生长激素(生长抑素)基因(SEQ ID NO.5)，该基因包括组氨酸标签(SEQ ID NO.1)和肠激酶识别序列(SEQ ID NO.3)和在两端的NdeI识别序列。然后，如图1所示构建pTT191表达载体，用NdeI消化合成的融合基因，在1％琼脂糖凝胶上电泳并从凝胶上分离基因。将线性融合基因连接到NdeI消化的被CIAP(calf intestine alkaline phosphatase；NEB，USA)预处理的pET3a(Novagen，USA)上。CIAP处理在37℃进行1小时以防止NdeI消化的pET3a自身产生连接。用T4 DNA(NEB，USA)连接酶在16℃进行18小时的连接，产生pTT191。然后用pTT191转化E.coli TOP10(Invitrogen，USA)。由产生的转化体制备质粒DNA并导入E.coli BL21(DE3)(Novagen，USA)。pTT191转化产生的E.coli BL21(DE3)用含有氨苄青霉素的LB平板筛选，将其称为“E.coli BL21(DE3)/pTT191”。通过限制酶AlwNI和HindIII消化及DNA测序确定含人生长激素基因的融合基因在pTT191表达载体中的正确插入。

实施例2：具有人生长激素的融合蛋白在E.coli BL21(DE3)/pTT191转化体中的表达

在对照表达载体pTT191转化的E.coli中检测具有人生长激素的融合蛋白表达模式。pTT191表达载体转化的E.coli BL21(DE3)/pTT191在LB培养基中、30℃培养12小时，然后用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导融合蛋白的表达。IPTG诱导后，离心和破碎收集的细胞，离心后的上清液用于研究融合蛋白的表达。结果如图2所示，含人生长激素的融合蛋白具有约24kDa的预测分子量，但是主要作为包涵体表达。

实施例3：pT0191表达载体的构建

制备pT0191表达载体以表达更高比率的可溶形式的含人生长激素的融合蛋白。

将编码具有人生长激素的融和蛋白的基因插入到pET3a载体，用pTT191作为模板进行PCR，然后在编码融合蛋白的核苷酸序列的每一端提供一个NdeI识别位点和一个HindIII识别位点。将100ng作为模板的pTT191质粒(实施例1)、2.5U(1μl)的Pfu DNA聚合酶(Stratagene，USA)，30pmol的引物A(5′AAACATATGGGCCATCATCATCATCATCATCATCATC ATCAC-3′：SEQID NO.19)，30pmol的引物B(5′-AAAAAGCTTTTACTAGAAGCCACAGCTGCC-3′：SEQ ID NO.20)，2μl的2.5mM的dNTPs(Takara，Japan)，和2μl的10×pfu聚合酶缓冲液相继加入到PCR管中，然后加入无菌蒸馏水到终体积20μl。用PCR机(MJ research，USA)进行PCR。PCR条件为94℃变性5分钟，然后进行30个循环，循环条件为：95℃变性1分钟，58℃退火30秒并在72℃延长2分钟，接着在72℃进行10分钟终延长。用NdeI和HindIII限制酶消化扩增的基因，在1％琼脂糖凝胶上电泳并从凝胶中纯化基因。用NdeI和HindIII消化pET3a表达载体并在1％琼脂糖凝胶上电泳，然后将4119bp的片段从凝胶中纯化。用T4 DNA连接酶在16℃将NdeI/HindIII处理的融合基因和pET3a片段互相连接18小时，这样产生了pT0191。然后用pT0191(图3)转化E.coli TOP10(Invitrogen，USA)。由得到的转化体制备质粒DNA然后将其导入E.coli BL21(DE3)。在含氨苄青霉素的LB板上筛选pT0191表达载体转化产生的E.coli BL21(DE3)转化体，将其称作“E.coli BL21(DE3)/pT0191(KCTC10610BP)”。用限制酶NdeI和HindIII消化及DNA测序来确认含pT0191表达载体中的人生长激素基因的融合基因的正确插入。

实施例4：具有人生长激素的融合蛋白在E.coli BL21(DE3)/pT0191转化体中的表达

在具有pT0191表达载体的E.coli转化体中测试具有人生长激素的融合蛋白的表达模式。

具有pT0191表达载体的E.coli BL21(DE3)/pT0191转化体在LB培养基中、30℃下培养12小时，然后用IPTG诱导融合蛋白的表达。然后评估融合蛋白的表达。如图4所示，融合蛋白主要以活性形式表达并且存在于离心上清液中，具有约24kDa的分子量。与E.coli BL21(DE3)/pTT191转化体不同，E.coliBL21(DE3)/pT0191转化体在过表达β-内酰胺酶同时过表达目标融合蛋白。β-内酰胺酶的表达通过N端测序确认。

实施例5：pTR0191表达载体的构建及人生长激素在E.coli BL21(DE3)/pTR0191转化体中的表达

用SphI和HindIII消化实施例3中制备的pT0191质粒并纯化3812bp的片段。使用两个引物(引物1：5′-AAAAAGCTTAAGGAGATGGCGCCCA-3′(SEQID NO.21)；引物2：5-′AAAGCATGCCTAGAAGCCACAGCTG-3′(SEQ ID NO.22))进行PCR扩增pT0191质粒中的编码β-内酰胺酶的基因。这样得到其中SphI和HindIII位点的位置彼此调换的950bp片段。然后用T4 DNA连接酶将950bp的片段连接到3812bp的片段上产生PTR0191表达载体，载体中人生长激素基因的方向与β-酰胺酶基因(图5)不同。用制备的表达载体转化E.coliBL21(DE3)，然后在30℃进行蛋白表达。如图6所示，目标蛋白主要表达为包涵体，而β-内酰胺酶表达水平比用pT0191表达载体的情况低。

实施例6：pT0-CSF表达载体的构建

制备pT0-CSF表达载体以高产量表达含人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的可溶形式的融合蛋白。根据实施例1中的相同的PCR连接方法合成编码含连接到组氨酸标签和肠激酶识别序列的人G-CSF的融合蛋白的基因(SEQ IDNO.7)，然后根据实施例3(图3)相同的方法构建pT0-CSF表达载体。将pT0-CSF表达载体导入到E.coli BL21 Star(DE3)pLysS(Invitrogen，USA)中，将得到的转化体称作“E.coli BL21 Star(DE3)pLysS/pT0-CSF(KCTC10611BP)”。用限制酶NdeI和HindIII消化及DNA测序来确认含人G-CSF基因的融合基因向pT0-CSF表达载体的正确插入。

实施例7：具有人G-CSF的融合蛋白在E.coli B21 Star(DE3)pLysS/pT0-CSF转化体中的表达

在具有pT0-CSF表达载体的E.coli转化体中测试具有人G-CSF的融合蛋白的表达模式。

将pT0-CSF表达载体转化的E.coli B21 Star(DE3)pLysS/pT0-CSF在LB培养基中、30℃下培养12小时，然后用IPTG诱导融合蛋白的表达，如图7所示，含人G-CSF的融合蛋白主要表达为活性形式并且存在于离心的上清液中，具有约20kDa的分子量。同E.coli BL21(DE3)/pT0191转化体一样，用pT0-CSF表达载体转化的E.coli B21 Star(DE3)pLysS/pT0-CSF转化体在过表达β-内酰胺酶的同时过表达含人G-CSF的目标融合蛋白。另外将pT0-CSF表达载体导入到E.coli BL21(DE3)(Novagen，USA)，E.coli HMS(DE3)(Novagen，USA)and E.coli AD494(DE3)(Novagen，USA)中以发现含人G-CSF的融合蛋白(在此处也可称作人G-CSF融合蛋白)在E.coli菌株中的表达模式。结果列在下面的表1中，从表1中的数据可发现，融合蛋白主要表达为活性形式。

表1

^*电泳(electorphoresis)后通过密度计测量

实施例8：pT0-IFN、pT0-bFGF、pT0-IGF1、pT0-IGF2、pT0-KGF和pT0N-KGF表达载体

制备多个表达载体pT0-IFN、pT0-bFGF、pT0-IGF1、pT0-IGF2、pT0-KGF和pT0N-KGF以高产量表达各种目标蛋白本身或可溶形式的含目标蛋白的融合蛋白。根据实施例1相同的PCR方法制备连接了组氨酸标签和肠激酶识别序列的IFN-α2b融合蛋白(SEQ ID NO.9)、bFGF融合蛋白(SEQ ID NO.11)、IGF-1融合蛋白(SEQ ID NO.13)、IGF-2融合蛋白(SEQ ID NO.15)和KGF融合蛋白(SEQ ID NO.23)以及非融合的KGF本身(SEQ ID NO.25)的编码基因，其中引物被设计成在每个编码基因序列的每个末端提供NdeI位点和HindIII位点以将融合蛋白插入到pET3a载体。用NdeI和HindIII消化扩增的基因，在1％琼脂糖凝胶上电泳，然后从凝胶上纯化基因。用NdeI和HindIII消化pET3a表达载体并在1％琼脂糖凝胶上分离，然后从凝胶中纯化得到4119bp片段。用T4DNA连接酶在16℃将NdeI/HindIII处理的融合基因和pET3a片段彼此连接18小时，这样分别产生了载体pT0-IFN、pT0-bFGF、pT0-IGF1、pT0-IGF2、pT0-KGF和pT0N-KGF。然后用这些载体转化E.coliTOP10。从得到的每个转化体制备质粒DNA并将它们导入到E.coli.BL21(DE3)。用限制酶NdeI和HindIII消化及DNA测序来确认每个基因向相应的表达载体中的正确插入。

实施例9：目标蛋白在E.coli BL21(DE3)/pT0-IFN、pT0-bFGF、pT0-IGF1、pT0-IGF2、pT0-KGF和pT0N-KGF转化体中的表达

在由pT0-IFN、pT0-bFGF、pT0-IGF1、pT0-IGF2、pT0-KGF和pT0N-KGF表达载体转化的E.coli中研究每个目标蛋白的表达模式。

将上述表达载体转化的E.coli BL21(DE3)转化体分别在LB培养基中、30℃下培养12小时，然后用IPTG诱导每个目标蛋白的表达。结果列在图8-13中。如图所示，表达的目标蛋白在离心的上清液中，这说明目标蛋白是可溶的，活性形式。

工业实用性

如上文所述，本发明提供了表达β-内酰胺酶同时过表达目标蛋白的表达载体。该表达载体能够在原核细胞中生产高水平的可溶的、活性形式的异源目标蛋白，而使用其它表达载体在其中表达时，蛋白大部分表达为包涵体。

国际表恪

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依据由本页下方证明的国际保藏当局规则7.1签署

受文者：(请求保藏人)

名称：株式会社大熊

地址：韩国京畿道

国际表格

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名称：株式会社大熊

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<110>株式会社大熊(DAEWOONG CO.，LTD.)

<120>活性的和可溶的蛋白产品在原核生物中的制备方法及其多顺反子载体

<150>KR10-2004-0031977

<151>2004-05-06

<160>26

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>组氨酸标签序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(30)

<400>1

cat cat cat cat cat cat cat cat cat cac 30

His His His His His His His His His His

1 5 10

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

His His His His His His His His His His

1 5 10

<210>3

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>肠激酶识别序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(15)

<400>3

gac gac gac gac aaa 15

Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210>4

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210>5

<211>654

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>组氨酸标签和肠激酶识别序列融合的人生长激素

<220>

<221>CDS

<222>(7)..(642)

<220>

<221>source

<222>(73)..(642)

<223>人生长激素

<400>5

aaacat atg ggc cat cat cat cat cat cat cat cat cat cac agc agc 48

Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser

1 5 10

gga tcc gac gac gac gac aaa ttc cca acc att ccc tta tcc agg ctt 96

Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu

15 20 25 30

ttt gac aac gct atg ctc cgc gcc cat cgt ctg cac cag ctg gcc ttt 144

Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe

35 40 45

gac acc tac cag gag ttt gaa gaa gcc tat atc cca aag gaa cag aag 192

Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys

50 55 60

tat tca ttc ctg cag aac ccc cag acc tcc ctc tgt ttc tca gag tct 240

Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser

65 70 75

att ccg aca ccc tcc aac agg gag gaa aca caa cag aaa tcc aac cta 288

Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu

80 85 90

gag ctg ctc cgc atc tcc ctg ctg ctc atc cag tcg tgg ctg gag ccc 336

Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro

95 100 105 110

gtg cag ttc ctc agg agt gtc ttc gcc aac agc ctg gtg tac ggc gcc 384

Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala

115 120 125

tct gac agc aac gtc tat gac ctc cta aag gac cta gag gaa ggc atc 432

Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile

130 135 140

caa acg ctg atg ggg agg ctg gaa gat ggc agc ccc cgg act ggg cag 480

Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln

145 150 155

atc ttc aag cag acc tac agc aag ttc gac aca aac tca cac aac gat 528

Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp

160 165 170

gac gca cta ctc aag aac tac ggg ctg ctc tac tgc ttc agg aag gac 576

Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp

175 180 185 190

atg gac aag gtc gag aca ttc ctg cgc atc gtg cag tgc cgc tct gtg 624

Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val

195 200 205

gag ggc agc tgt ggc ttc taggtata cttt 654

Glu Gly Ser Cys Gly Phe

210

<210>6

<211>212

<212>PRT

<213>人工序列

<400>6

Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly Ser

1 5 10 15

Asp Asp Asp Asp Lys Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp

20 25 30

Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr

35 40 45

Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser

50 55 60

Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro

65 70 75 80

Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu

85 90 95

Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln

100 105 110

Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp

115 120 125

Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr

130 135 140

Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe

145 150 155 160

Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala

165 170 175

Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp

180 185 190

Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly

195 200 205

Ser Cys Gly Phe

210

<210>7

<211>588

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>组氨酸标签和肠激酶识别序列融合的人粒细胞集落刺激因子

<220>

<221>CDS

<222>(7)..(579)

<220>

<221>source

<222>(58)..(579)

<223>人粒细胞集落刺激因子

<400>7

aaacat atg ggc cat cat cat cat cat cat cat cat cat cac gac gac 48

Met Gly His His His His His His His His His His Asp Asp

1 5 10

gac gac aaa act cca tta ggt cca gcc agc tcc ctt ccc caa agc ttc 96

Asp Asp Lys Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe

15 20 25 30

ctg ctc aag tgc tta gag caa gtg agg agg atc cag ggc gat ggc gca 144

Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Arg Ile Gln Gly Asp Gly Ala

35 40 45

gcg ctc cag gag aag ctg tgt gcc acc tac aag ctg tgc cac ccc gag 192

Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu

50 55 60

gag ctg gtg ctg ctc gga cac tct ctg ggc atc ccc tgg gct ccc ctg 240

Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu

65 70 75

agc agc tgc ccc agc cag gcc ctg cag ctg gca ggc tgc ttg agc caa 288

Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln

80 85 90

ctc cat agc ggc ctt ttc ctc tac cag ggg ctc ctg cag gcc ctg gaa 336

Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu

95 100 105 110

ggg atc tcc ccc gag ttg ggt ccc acc ttg gac aca ctg cag ctg gac 384

Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp

115 120 125

gtc gcc gac ttt gcc acc acc atc tgg cag cag atg gaa gaa ctg gga 432

Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly

130 135 140

atg gcc cct gcc ctg cag ccc acc cag ggt gcc atg ccg gcc ttc gcc 480

Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala

145 150 155

tct gct ttc cag cgc cgg gca gga ggg gtc cta gtt gcc tcc cat ctg 528

Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu

160 165 170

cag agc ttc ctg gag gtg tcg tac cgc gtt cta cgc cac ctt gcg cag 576

Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln

175 180 185 190

ccc taaaagctt 588

Pro

<210>8

<211>191

<212>PRT

<213>人工序列

<400>8

Met Gly His His His His His His His His His His Asp Asp Asp Asp

1 5 10 15

Lys Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu

20 25 30

Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Arg Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu

35 40 45

Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu

50 55 60

Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser

65 70 75 80

Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His

85 90 95

Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile

100 105 110

Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala

115 120 125

Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala

130 135 140

Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala

145 150 155 160

Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser

165 170 175

Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro

180 185 190

<210>9

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>组氨酸标签和肠激酶识别序列融合的人干扰素α2b

<220>

<221>CDS

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<220>

<221>source

<222>(58)..(552)

<223>人干扰素α2b

<400>9

aaacat atg ggc cat cat cat cat cat cat cat cat cat cac gac gac 48

Met Gly His His His His His His His His His His Asp Asp

1 5 10

gac gac aaa tgt gat ctg cct caa acc cac agc ctg ggt agc agg agg 96

Asp Asp Lys Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg

15 20 25 30

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Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn

50 55 60

cag ttc caa aag gct gaa acc atc cct gtc ctc cat gag atg atc cag 240

Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln

65 70 75

cag atc ttc aat ctc ttc agc aca aag gac tca tct gct gct tgg gat 288

Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp

80 85 90

gag acc ctc cta gac aaa ttc tac act gaa ctc tac cag cag ctg aat 336

Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn

95 100 105 110

gac ctg gaa gcc tgt gtg ata cag ggg gtg ggg gtg aca gag act ccc 384

Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro

115 120 125

ctg atg aag gag gac tcc att ctg gct gtg agg aaa tac ttc caa aga 432

Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg

130 135 140

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<213>人工序列

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Met Gly His His His His His His His His His His Asp Asp Asp Asp

1 5 10 15

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85 90 95

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

100 105 110

Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met

115 120 125

Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

130 135 140

Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

145 150 155 160

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

165 170 175

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

180

<210>11

<211>531

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>组氨酸标签和肠激酶识别序列融合的人基础成纤维细胞生长因子

<220>

<221>CDS

<222>(7)..(522)

<220>

<221>source

<222>(58)..(522)

<223>人基础成纤维细胞生长因子

<400>11

aaacat atg ggc cat cat cat cat cat cat cat cat cat cac gac gac 48

Met Gly His His His His His His His His His His Asp Asp

1 5 10

gac gac aaa atg gca gcc ggt agc atc acc acg ctg ccg gcc ctg ccg 96

Asp Asp Lys Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro

15 20 25 30

gag gat ggc ggc agc ggc gcc ttc ccg ccg ggc cac ttc aag gac ccg 144

Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro

35 40 45

aag cgt ctg tac tgc aag aac ggt ggc ttc ttc ctg cgc atc cac ccg 192

Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro

50 55 60

gac ggc cgt gtt gac ggt gtc cgt gag aag agc gac cct cac atc aag 240

Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys

65 70 75

ctg caa ctg caa gca gaa gag cgt ggt gtt gtg tct atc aaa ggt gtg 288

Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val

80 85 90

tgt gct aac cgt tac ctg gct atg aag gaa gat ggt cgt ctg ctg gct 336

Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala

95 100 105 110

tct aaa tgt gtt acg gat gag tgt ttc ttc ttc gaa cgt ctg gaa tct 384

Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser

115 120 125

aat aac tac aat act tac cgt tcc cgt aaa tac acc agc tgg tat gtg 432

Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val

130 135 140

gca ctg aaa cgt act ggt cag tat aaa ctg ggt tcc aaa acc ggt cct 480

Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro

145 150 155

ggt cag aaa gct atc ctg ttt ctg cca atg tct gct aag agc taaaagct 530

Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser

160 165 170

t 531

<210>12

<211>172

<212>PRT

<213>人工序列

<400>12

Met Gly His His His His His His His His His His Asp Asp Asp Asp

1 5 10 15

Lys Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg

35 40 45

Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly

50 55 60

Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln

65 70 75 80

Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala

85 90 95

Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys

100 105 110

Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn

115 120 125

Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu

130 135 140

Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln

145 150 155 160

Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser

165 170

<210>13

<211>279

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>组氨酸标签和肠激酶识别序列融合的人胰岛素样生长因了-1

<220>

<221>CDS

<222>(7)..(267)

<220>

<221>source

<222>(58)..(267)

<223>人胰岛素样生长因子-1

<400>13

aaacat atg ggc cat cat cat cat cat cat cat cat cat cac gac gac 48

Met Gly His His His His His His His His His His Asp Asp

1 5 10

gac gac aaa ggt ccg gaa acc ctg tgc ggc gct gag ctg gtt gac gct 96

Asp Asp Lys Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala

15 20 25 30

ctg caa ttc gtt tgc ggt gac cgt ggt ttc tac ttc aac aaa ccg act 144

Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr

35 40 45

ggt tac ggt tcc tct tct cgt cgt gct ccg cag acc ggt atc gtt gac 192

Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp

50 55 60

gaa tgc tgc ttc cgt tct tgc gac ctg cgt cgt ctg gaa atg tac tgc 240

Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys

65 70 75

gct ccg ctg aaa ccg gcg aag tct gct taa tgaaagctt 279

Ala Pro Leu Lys Pro Ala Lys Ser Ala

80 85

<210>14

<211>87

<212>PRT

<213>人工序列

<400>14

Met Gly His His His His His His His His His His Asp Asp Asp Asp

1 5 10 15

Lys Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln

20 25 30

Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr

35 40 45

Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys

50 55 60

Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro

65 70 75 80

Leu Lys Pro Ala Lys Ser Ala

85

<210>15

<211>267

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>组氨酸标签和肠激酶识别序列融合的人胰岛素样生长因子-2

<220>

<221>CDS

<222>(7)..(258)

<220>

<221>source

<222>(58)..(258)

<223>人胰岛素样生长因子-2

<400>15

aaacat atg ggc cat cat cat cat cat cat cat cat cat cac gac gac 48

Met Gly His His His His His His His His His His Asp Asp

1 5 10

gac gac aaa gct tac cgc ccg agc gag acc ctg tgc ggc ggt gag ctg 96

Asp Asp Lys Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu

15 20 25 30

gtg gac acc ctc cag ttc gtc tgt ggt gac cgc ggc ttc tac ttc agc 144

Val Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser

35 40 45

cgt ccg gca agc cgt gtg agc cgt cgc agc cgt ggc atc gtt gag gag 192

Arg Pro Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu

50 55 60

tgc tgt ttc cgc agc tgt gac ctg gcc ctc ctg gag acg tac tgt gct 240

Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala

65 70 75

acc ccg gcc aag tcc gag ta aaagctt 267

Thr Pro Ala Lys Ser Glu

80

<210>16

<211>84

<212>PRT

<213>人工序列

<400>16

Met Gly His His His His His His His His His His Asp Asp Asp Asp

1 5 10 15

Lys Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp

20 25 30

Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro

35 40 45

Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys

50 55 60

Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro

65 70 75 80

Ala Lys Ser Glu

<210>17

<211>861

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>β-内酰胺酶

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(858)

<400>17

atg agt att caa cat ttc cgt gtc gcc ctt att ccc ttt ttt gcg gca 48

Met Ser Ile Gln His Phe Arg Val Ala Leu Ile Pro Phe Phe Ala Ala

1 5 10 15

ttt tgc ctt cct tgt ttt gct cac cca gaa acg ctg gtg aaa gta aaa 96

Phe Cys Leu Pro Val Phe Ala His Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys

20 25 30

gat gct gaa gat cag ttg ggt gca cga gtg ggt tac atc gaa ctg gat 144

Asp Ala Glu Asp Gln Leu Gly Ala Arg Val Gly Tyr Ile Glu Leu Asp

35 40 45

ctc aac agc ggt aag atc ctt gag agt ttt cgc ccc gaa gaa cgt ttt 192

Leu Asn Ser Gly Lys Ile Leu Glu Ser Phe Arg Pro Glu Glu Arg Phe

50 55 60

cca atg atg agc act ttt aaa gtt ctg cta tgt ggc gcg gta tta tcc 240

Pro Met Met Ser Thr Phe Lys Val Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Ser

65 70 75 80

cgt gtt gac gcc ggg caa gag caa ctc ggt cgc cgc ata cac tat tct 288

Arg Val Asp Ala Gly Gln Glu Gln Leu Gly Arg Arg Ile His Tyr Ser

85 90 95

cag aat gac ttg gtt gag tac tca cca gtc aca gaa aag cat ctt acg 336

Gln Asn Asp Leu Val Glu Tyr Ser Pro Val Thr Glu Lys His Leu Thr

100 105 110

gat ggc atg aca gta aga gaa tta tgc agt gct gcc ata acc atg agt 384

Asp Gly Met Thr Val Arg Glu Leu Cys Ser Ala Ala Ile Thr Met Ser

115 120 125

gat aac act gcg gcc aac tta ctt ctg aca acg atc gga gga ccg aag 432

Asp Asn Thr Ala Ala Asn Leu Leu Leu Thr Thr Ile Gly Gly Pro Lys

130 135 140

gag cta acc gct ttt ttg cac aac atg ggg gat cat gta act cgc ctt 480

Glu Leu Thr Ala Phe Leu His Asn Met Gly Asp His Val Thr Arg Leu

145 150 155 160

gat cgt tgg gaa ccg gag ctg aat gaa gcc ata cca aac gac gag cgt 528

Asp Arg Trp Glu Pro Glu Leu Asn Glu Ala Ile Pro Asn Asp Glu Arg

165 170 175

gac acc acg atg cct gca gca atg gca aca acg ttg cgc aaa cta tta 576

Asp Thr Thr Met Pro Ala Ala Met Ala Thr Thr Leu Arg Lys Leu Leu

180 185 190

act ggc gaa cta ctt act cta gct tcc cgg caa caa tta ata gac tgg 624

Thr Gly Glu Leu Leu Thr Leu Ala Ser Arg Gln Gln Leu Ile Asp Trp

195 200 205

atg gag gcg gat aaa gtt gca gga cca ctt ctg cgc tcg gcc ctt ccg 672

Met Glu Ala Asp Lys Val Ala Gly Pro Leu Leu Arg Ser Ala Leu Pro

210 215 220

gct ggc tgg ttt att gct gat aaa tct gga gcc ggt gag cgt ggg tct 720

Ala Gly Trp Phe Ile Ala Asp Lys Ser Gly Ala Gly Glu Arg Gly Ser

225 230 235 240

cgc ggt atc att gca gca ctg ggg cca gat ggt aag ccc tcc cgt atc 768

Arg Gly Ile Ile Ala Ala Leu Gly Pro Asp Gly Lys Pro Ser Arg Ile

245 250 255

gta gtt atc tac acg acg ggg agt cag gca act atg gat gaa cga aat 816

Val Val Ile Tyr Thr Thr Gly Ser Gln Ala Thr Met Asp Glu Arg Asn

260 265 270

aga cag atc gct gag ata ggt gcc tca ctg att aag cat tgg ta 860

Arg Gln Ile Ala Glu Ile Gly Ala Ser Leu Ile Lys His Trp

275 280 285

a 861

<210>18

<211>286

<212>PRT

<213>人工序列

<400>18

Met Ser Ile Gln His Phe Arg Val Ala Leu Ile Pro Phe Phe Ala Ala

1 5 10 15

Phe Cys Leu Pro Val Phe Ala His Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys

20 25 30

Asp Ala Glu Asp Gln Leu Gly Ala Arg Val Gly Tyr Ile Glu Leu Asp

35 40 45

Leu Asn Ser Gly Lys Ile Leu Glu Ser Phe Arg Pro Glu Glu Arg Phe

50 55 60

Pro Met Met Ser Thr Phe Lys Val Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Ser

65 70 75 80

Arg Val Asp Ala Gly Gln Glu Gln Leu Gly Arg Arg Ile His Tyr Ser

85 90 95

Gln Asn Asp Leu Val Glu Tyr Ser Pro Val Thr Glu Lys His Leu Thr

100 105 110

Asp Gly Met Thr Val Arg Glu Leu Cys Ser Ala Ala Ile Thr Met Ser

115 120 125

Asp Asn Thr Ala Ala Asn Leu Leu Leu Thr Thr Ile Gly Gly Pro Lys

130 135 140

Glu Leu Thr Ala Phe Leu His Asn Met Gly Asp His Val Thr Arg Leu

145 150 155 160

Asp Arg Trp Glu Pro Glu Leu Asn Glu Ala Ile Pro Asn Asp Glu Arg

165 170 175

Asp Thr Thr Met Pro Ala Ala Met Ala Thr Thr Leu Arg Lys Leu Leu

180 185 190

Thr Gly Glu Leu Leu Thr Leu Ala Ser Arg Gln Gln Leu Ile Asp Trp

195 200 205

Met Glu Ala Asp Lys Val Ala Gly Pro Leu Leu Arg Ser Ala Leu Pro

210 215 220

Ala Gly Trp Phe Ile Ala Asp Lys Ser Gly Ala Gly Glu Arg Gly Ser

225 230 235 240

Arg Gly Ile Ile Ala Ala Leu Gly Pro Asp Gly Lys Pro Ser Arg Ile

250 255

Val Val Ile Tyr Thr Thr Gly Ser Gln Ala Thr Met Asp Glu Arg Asn

260 265 270

Arg Gln Ile Ala Glu Ile Gly Ala Ser Leu Ile Lys His Trp

275 280 285

<210>19

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>制备pT0191的引物A

<400>19

aaacatatgg gccatcatca tcatcatcat catcatcatc ac 42

<210>20

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>制备pT0191的引物B

<400>20

aaaaagcttt tactagaagc cacagctgcc 30

<210>21

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>制备pT0191的引物1

<400>21

aaaaagctta aggagatggc gccca 25

<210>22

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>制备pT0191的引物2

<400>22

aaagcatgcc tagaagccac agctg 25

<210>23

<211>555

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>组氨酸标签和肠激酶识别序列融合的人角质化细胞生长因子

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(546)

<220>

<221>source

<222>(58)..(546)

<223>人角质化细胞生长因子

<400>23

aaa cat atg ggc cat cat cat cat cat cat cat cat cat cac gac gac 48

Lys His Met Gly His His His His His His His His His His Asp Asp

1 5 10 15

gac gac aaa tgc aat gac atg act cca gag caa atg gct acc aat gtg 96

Asp Asp Lys Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val

20 25 30

aac tgt tcc agc cct gag cgt cac acc cgt agc tat gat tac atg gaa 144

Asn Cys Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu

35 40 45

ggt ggt gat atc cgt gtg cgt cgt ctc ttc tgt cgt acc cag tgg tat 192

Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr

50 55 60

ctg cgt atc gat aaa cgt ggc aaa gta aaa ggc acc caa gag atg aag 240

Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys

65 70 75 80

aat aat tac aat atc atg gaa atc cgt acc gtg gca gtt ggt att gtg 288

Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val

85 90 95

gca atc aaa ggt gtg gaa agc gag ttc tat ctg gca atg aac aag gaa 336

Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu

100 105 110

ggt aaa ctc tat gca aag aaa gaa tgc aat gaa gat tgt aac ttc aaa 384

Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys

115 120 125

gaa ctg att ctg gaa aac cat tac aac acc tat gca tct gct aaa tgg 432

Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp

130 135 140

acc cac aac ggt ggt gaa atg ttt gtt gcc ctg aat caa aag ggt att 480

Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile

145 150 155 160

cct gta cgt ggt aag aag acg aag aaa gaa cag aaa acc gcc cac ttt 528

Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe

165 170 175

ctg cct atg gca atc act taaa agctt 555

Leu Pro Met Ala Ile Thr

180

<210>24

<211>182

<212>PRT

<213>人工序列

<400>24

Lys His Met Gly His His His His His His His His His His Asp Asp

1 5 10 15

Asp Asp Lys Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val

20 25 30

Asn Cys Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu

35 40 45

Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr

50 55 60

Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys

65 70 75 80

Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val

85 90 95

Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu

100 105 110

Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys

115 120 125

Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp

130 135 140

Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile

145 150 155 160

Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe

165 170 175

Leu Pro Met Ala Ile Thr

180

<210>25

<211>507

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(498)

<223>人角质化细胞生长因子

<400>25

aaa cat atg tgc aat gac atg act cca gag caa atg gct acc aat gtg 48

Lys His Met Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val

1 5 10 15

aac tgt tcc agc cct gag cgt cac acc cgt agc tat gat tac atg gaa 96

Asn Cys Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu

20 25 30

ggt ggt gat atc cgt gtg cgt cgt ctc ttc tgt cgt acc cag tgg tat 144

Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr

35 40 45

ctg cgt atc gat aaa cgt ggc aaa gta aaa ggc acc caa gag atg aag 192

Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys

50 55 60

aat aat tac aat atc atg gaa atc cgt acc gtg gca gtt ggt att gtg 240

Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val

65 70 75 80

gca atc aaa ggt gtg gaa agc gag ttc tat ctg gca atg aac aag gaa 288

Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu

85 90 95

ggt aaa ctc tat gca aag aaa gaa tgc aat gaa gat tgt aac ttc aaa 336

Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys

100 105 110

gaa ctg att ctg gaa aac cat tac aac acc tat gca tct gct aaa tgg 384

Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp

115 120 125

acc cac aac ggt ggt gaa atg ttt gtt gcc ctg aat caa aag ggt att 432

Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile

130 135 140

cct gta cgt ggt aag aag acg aag aaa gaa cag aaa acc gcc cac ttt 480

Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe

145 150 155 160

ctg cct atg gca atc act ta aaagctt 507

Leu Pro Met Ala Ile Thr

165

<210>26

<211>166

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>26

Lys His Met Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val

1 5 10 15

Asn Cys Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu

20 25 30

Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr

35 40 45

Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys

50 55 60

Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val

65 70 75 80

Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu

85 90 95

Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys

100 105 110

Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp

115 120 125

Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile

130 135 140

Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe

145 150 155 160

Leu Pro Met Ala Ile Thr

165

Claims

1.一种在原核细胞中生产活性的、可溶的目标蛋白的方法，其特征在于在多顺反子中第一顺反子和第二顺反子在同一启动子的控制下分别表达目标蛋白和β-内酰胺酶，其中所述目标蛋白为细胞因子。

2.根据权利要求1所述的方法，其中源于重组载体的多顺反子包含(i)原核细胞中可操作的启动子，(ii)包括编码目标蛋白的DNA序列的第一顺反子，和(iii)包括编码β-内酰胺酶的DNA序列的第二顺反子，它们以5’到3’的方向可操作地连接。

3.根据权利要求1所述的方法，其中源于重组载体的多顺反子包含(i)原核细胞中可操作的启动子，(ii)包括编码β-内酰胺酶的DNA序列的第二顺反子，和(iii)包括编码目标蛋白的DNA序列的第一顺反子，它们以5’到3’的方向可操作地连接。

4.根据权利要求1所述的方法，其中目标蛋白选自如下组成的组：人生长激素、粒细胞集落刺激因子、干扰素、基础成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、角质化细胞生长因子、红细胞生成素、血小板生成素、人表皮生长因子、血小板来源的生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子、转化生长因子、肿瘤坏死因子、血管生成素、血管紧张素和白细胞介素。

5.根据权利要求4所述的方法，其中目标蛋白选自如下组成的组：人生长激素、粒细胞集落刺激因子、干扰素-α2b、基础成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、胰岛素样生长因子-2和角质化细胞生长因子。

6.根据权利要求1所述的方法，其中原核细胞是大肠杆菌(E.coli)。

7.根据权利要求6所述的方法，其中E.coli选自如下组成的组：E.coli BL21(DE3)，E.coli BL21 Star(DE3)pLysS，E.coli HMS(DE3)和E.coli AD494(DE3)。

8.一种在原核细胞中表达活性的、可溶形式的目标蛋白的多顺反子载体，其包括：(i)原核细胞中可操作的启动子，(ii)包括编码目标蛋白的DNA序列的第一顺反子，和(iii)包括编码β-内酰胺酶的DNA序列的第二顺反子，其中，在同一启动子(i)的控制下对(ii)和(iii)进行调控，所述目标蛋白为细胞因子。

9.根据权利要求8所述的多顺反子载体，其中所述载体包括：(i)原核细胞中可操作的启动子，(ii)包括编码目标蛋白的DNA序列的第一顺反子，和(iii)包括编码β-内酰胺酶的DNA序列的第二顺反子，它们以5’到3’的方向可操作地连接。

10.根据权利要求8所述的多顺反子载体，其中所述载体包括：(i)原核细胞中可操作的启动子，(ii)包括编码β-内酰胺酶的DNA序列的第二顺反子，和(iii)包括编码目标蛋白的DNA序列的第一顺反子，它们以5’到3’的方向可操作地连接。

11.根据权利要求8所述的多顺反子载体，其中所述目标蛋白选自如下组成的组：人生长激素、粒细胞集落刺激因子、干扰素、基础成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、角质化细胞生长因子、红细胞生成素、血小板生成素、人表皮生长因子、血小板来源的生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子、转化生长因子、肿瘤坏死因子、血管生成素、血管紧张素和白细胞介素。

12.根据权利要求11所述的多顺反子载体，其中所述目标蛋白选自如下组成的组：人生长激素、粒细胞集落刺激因子、干扰素-α2b、基础成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、胰岛素样生长因子-2、和角质化细胞生长因子。

13.根据权利要求8所述的多顺反子载体，其中所述启动子选自T7、tac、trc、lac、lpp、phoA、recA、araBAD、proU、cst-1、tetA、cadA、nar、lpp-lac、饥饿启动子、cspA、T7-lac操纵序列、T3-lac操纵序列、T5-lac操纵序列、T4基因32、和nprM-lac操纵序列。

14.根据权利要求13所述的多顺反子载体，其中所述启动子选自T7启动子。

15.根据权利要求8所述的多顺反子载体，其中所述载体选自如下组成的组：pT0191、pT0-CSF、pT0-IFN、pT0-bFGF、pT0-IGF1、pT0-IGF2、pT0-KGF和pT0N-KGF，其中，所述pT0191为pET3a-T7启动子-人生长激素-β-内酰胺酶，所述pT0-CSF为pET3a-T7启动子-CSF-β-内酰胺酶，所述pT0-IFN为pET3a-T7启动子-IFN-β-内酰胺酶，所述pT0-bFGF为pET3a-T7启动子-bFGF-β-内酰胺酶，所述pT0-IGF1为pET3a-T7启动子-IGF1-β-内酰胺酶，所述pT0-IGF2为pET3a-T7启动子-IGF2-β-内酰胺酶，所述pT0-KGF为pET3a-T7启动子-KGF-β-内酰胺酶，所述pT0N-KGF为pET3a-T7启动子-N-KGF-β-内酰胺酶。

16.一种权利要求8的表达载体转化的转化体。

17.根据权利要求16所述的转化体，其中所述转化体是大肠杆菌(E.coli)。

18.一种生产活性的、可溶的目标蛋白的方法，其特征在于培养权利要求17的转化体，然后从培养基中回收表达的目标蛋白。