KR100449639B1 - 피스 결합 부위와 업 엘레멘트 및 코어 프로모터로이루어진 프로모터를 포함하는 발현 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 FIS 단백질의 결합 부위와 업 엘레멘트 및 코어 프로모터로 이루어진 프로모터를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

또한 본 발명의 발현 벡터는 유도성 프로모터의 조절을 받는 FIS 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는 외래에서 도입한 목적 단백질의 발현율을 극대화할 수 있으며, 균주의 유전적 특징에 관계없이 광범위한 대장균 균주를 숙주 세포로 사용할 수 있으므로, 다양한 단백질의 생산을 필요로 하는 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

피스 결합 부위와 업 엘레멘트 및 코어 프로모터로 이루어진 프로모터를 포함하는 발현 벡터 {Expression vector containing the promoter comprised of FIS binding sites, UP element and core promoter}

본 발명은 재조합 단백질의 생산에 사용되는 발현 벡터에 관한 것이다.

최근 들어 분자 생물학과 유전공학 분야의 기술이 급속도로 발달하면서, 재조합 단백질의 발현 기술을 이용하여 단백질들을 대량 생산할 수 있게 하는 효율적인 발현 체계에 대한 관심이 더욱 증대되고 있다.

재조합 단백질을 얻는 과정은, 먼저 유전자의 발현을 조절하는 신호를 포함하는 발현 벡터에 원하는 단백질을 암호화하는 유전자를 연결시키고, 이 플라스미드를 숙주 세포에 도입하여 형질 전환시킨 후, 단백질의 발현에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하여 발현된 단백질을 추출하는 과정으로 이루어진다.

특히 의약품을 비롯한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있는 발현 벡터는, 광범위한 숙주 세포에서 사용가능하면서도, 강력한 활성을 지닌 프로모터와 함께 엄격한 조절 능력을 갖춘 전사 조절 체계를 갖추고 있어야 한다.

발현 벡터를 도입하여 단백질의 대량 생산에 이용될 숙주 세포로는, 대장균을 비롯한 박테리아 세포, 진균류 세포, 포유류 세포 및 곤충류 세포 등을 이용할 수 있다. 그러나 그 중에서도 대장균은 증식 속도가 매우 빠르며, 그 게놈 서열이 다 밝혀졌기 때문에 유전 정보를 취득하는 것이 용이하고, 그간 많은 분자생물학적 연구에 의해 증식 조절 기작이 밝혀져 있다는 점에서, 광범위한 재조합 단백질 생산의 숙주 세포로 널리 이용되고 있다.

프로모터는 구조 유전자의 상위(upstream)에 위치하는 DNA 상의 영역으로, 이 프로모터 영역을 RNA 중합효소가 인식하여 결합함으로써 전사(transcription) 가 개시된다. 프로모터의 강도에 따라, 즉 RNA 중합효소가 프로모터를 얼마나 효율적으로 인식하여 결합할 수 있는가에 따라 단백질 발현을 위해 생성될 mRNA 양이 결정된다. 즉, 강력한 프로모터를 지닌 발현 벡터일수록 세포당 단백질 생성량이 증가하기 때문에, 정해진 양의 단백질을 수득하기 위해 배양해야 할 세포의 부피가 그만큼 감소되어 생산 비용이 줄어들게 된다. 또한 강력한 프로모터를 지닌 발현 벡터일수록 숙주 세포에 의해 생산된 총 단백질 중 목적 단백질이 많은 부분을 차지하게 되므로, 목적 단백질의 분리 ·정제 과정이 용이해진다. 따라서 효율적인발현 벡터는 강력한 활성을 가진 프로모터를 지녀야 한다.

전사 조절 체계는 mRNA가 생성되어야 할 시기에는 전사를 활성화하고, mRNA의 생성이 중지되어야 할 시기에는 전사를 억제하는 역할을 담당한다. 대장균의 전사 조절 체계인 오페론(operon)은 유도물질(inducer)의 존재 여부에 따라 전사를 조절하게 된다. 전사 조절 능력이 뛰어난 발현 벡터를 사용하면, 적은 양의 유도물질을 사용하고도 손쉽게 생산자의 의도대로 단백질 생성량을 조절할 수 있으므로, 원하는 단백질을 효율적으로 수득할 수 있다. 따라서, 효율적인 발현 벡터는 전사를 엄격하게 조절할 수 있는 오페론 등의 전사 조절 체계를 지녀야 한다.

현재까지 개발된 발현 벡터는 대장균에서 우수한 전사 개시 강도 및 조절 능력을 갖춘 것으로 알려진 lac, trp 프로모터나 또는 이들의 합성형인 tac 또는 trc 프로모터 등을 삽입하여 제조한 것이다.

그러나 이들 프로모터들은 실제로 발현 벡터에 삽입된 후에는, 원래 생물체 내에 존재할 때보다 그 전사 효율이 훨씬 낮은 수준에 그치는 실정이다. 그러므로, 기존의 발현 벡터들이 산업적 측면에서 효율적으로 사용되기 위해서는, 원래의 프로모터만큼 전사 효율을 높일 수 있거나 전사를 조절할 수 있는 인자들을 찾아 추가로 도입해야 하는 등 개선되어야 할 점이 많다.

여러 대장균 중에서 특히 바이러스에 대한 용원성(lysogenicity)을 지니는 균주들에 사용가능한 발현 벡터들도 개발된 바 있다. B. Moss 및 Novagen 사 등에서개발한 pET 계열의 발현 벡터들은 박테리오파지 T7의 프로모터를 이용한 것으로, 일반적인 대장균 프로모터를 이용하는 발현 벡터들에 비해 높은 발현율을 나타낸다.

그러나 이러한 발현 벡터들은 T7 박테리오파지에 대해 원래 용원성을 갖는 균주나, 유전적 변형을 통해 박테리오파지의 단백질 발현에 관여하는 유전자가 삽입된 특정 균주만을 숙주 세포로 사용해야 하므로, 사용할 수 있는 숙주 세포의 범위가 좁아진다.

이러한 문제점을 극복할 수 있는 방법으로, 대장균 세포 내에서 가장 많은 양의 mRNA를 만들어내는 프로모터를 이용하는 방법을 생각할 수 있다.

대장균 내에 존재하는 전체 RNA 중 가장 많은 양을 차지하는 것은 리보좀(ribosome)을 구성하는 rRNA로, 전체 RNA 중 95 % 이상을 차지하고 있다. 대장균이 활발하게 증식하고 있는 대수증식기에서 rRNA 유전자는 전체 전사량의 60 % 이상을 차지할 정도이다. 게다가, 원핵생물인 대장균은 한 종류의 RNA 중합효소가 세포 내 모든 RNA의 전사를 담당하기 때문에, rRNA 프로모터를 이용하여 만든 발현 벡터는 대장균 내에서 높은 효율로 재조합 단백질을 생산할 수 있을 것이다.

이러한 원리를 바탕으로 하여 rRNA 프로모터를 가진 발현 벡터가 이미 개발된 바 있으나, 당초 기대와는 달리 그 발현율이 기존의 발현 벡터에 비해 특별히 월등하지 못했다. 이후 rRNA 프로모터의 자세한 구조가 알려짐에 따라, 이러한 결과에 대한 이유 또한 밝혀지게 되었는데, 이들 발현 벡터에는 rRNA 프로모터의 전사 효율 증대에 실질적으로 필수적인 역할을 하는 인자들이 포함되지 않았기 때문이다 .

rRNA는 rrnA부터 rrnH까지 7개의 rrn 오페론에 의해 합성되는데, 각 오페론마다 P1 프로모터와 P2 프로모터의 이중 프로모터 구조를 가진다. 이들 프로모터 중 가장 강력한 활성과 조절력을 지닌 것은 rrnB 프로모터이며, 특히 rrnB P1이 rrn P2보다 활성이 큰 것으로 밝혀졌다.

rrnB P1 프로모터는 코어 프로모터(core promoter), 업 엘레멘트(UP element) 및 FIS 단백질의 결합 부위(binding site for FIS; 이하 'FIS 결합 부위'라고 한다)의 세 요소로 구성된다.

RNA 중합효소가 결합하여 전사가 일어날 수 있게 하는 부위는 코어 프로모터이나, 실제로 rrnB P1의 활성과 조절에 큰 영향을 미치는 요소는 업 엘레멘트와 FIS 결합 부위이다. 전사 효율은 업 엘레멘트에 의해 증대되며, 또한 전사활성인자 (transcriptional factor)인 FIS 단백질(Factor for Inversion Stimulation)이 FIS 결합 부위에 결합할 때에도 증대된다. 이들이 함께 작용하여 일으키는 상승효과에 의해, rrnB P1에 의한 전사 효율은 300배 이상이나 증가된다.

특히, FIS 단백질의 발현량은 대장균의 성장 단계에 맞추어 조절되며, rRNA의 전사량 역시 대장균의 성장 단계에 따라 변화하므로, FIS가 rRNA의 전사 활성 뿐 아니라 조절에 있어서도 매우 중요한 역할을 담당할 것으로 생각되어지고 있다.

따라서 대장균 내에서 전사 활성이 제일 뛰어난 것으로 알려진 rrnB 프로모터의 구조를 이용함으로써, 광범위한 대장균 균주에 사용가능하며 대장균에 도입되었을 때 실제로 높은 발현율과 조절력을 나타내는 발현 벡터의 개발에 대한 필요성이 절실히 요구되어지고 있다.

본 발명에서는 대장균 내에서 재조합 단백질의 발현을 극대화할 수 있도록,적절한 인자들이 삽입된 발현 벡터를 제공하고자 한다.

도 1은 본 발명의 발현 벡터 pFRPT의 프로모터 및 작동인자 부위의 구조를 나타낸 도이다.

도 2는 본 발명의 발현 벡터 pERP의 구조를 나타낸 도이다.

도 3은 본 발명의 발현 벡터 pERPT의 구조를 나타낸 도이다.

도 4는 본 발명의 발현 벡터 pFRPT의 구조를 나타낸 도이다.

본 발명은 대장균을 이용한 재조합 단백질의 생산에 사용되는 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 발현 벡터는 FIS 결합 부위와 업 엘레멘트 및 코어 프로모터로 이루어진 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 발현 벡터는 유도성 프로모터의 조절을 받는 FIS 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 발현 벡터에서, FIS 결합 부위와 업 엘레멘트 부분은 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진다. 서열번호 1은 rrnB P1 프로모터의 염기 서열을 검색하여 이들의 발현에 필요한 최소 서열을 확인한 후 최소 크기를 가지도록 재구성한 서열로, 상기 서열에 포함된 인자들의 특징은 다음과 같다.

FIS 결합 부위는 rrnB P1 프로모터 중 FIS 단백질이 인식하여 결합하는 부위로, rrnBP1 유전자의 -71, -102, -143의 세 부분에 존재한다(전사 시작 부위의 염기쌍을 +1로 하여, 그 하위(downstream)의 염기쌍을 +2, +3, 그리고 그 상위의 염기쌍을 -1, -2로 표시함). FIS 단백질은 이들 FIS 결합 부위에 이합체(dimer) 상태로 결합하여, RNA 중합효소의 알파 구성단위(alpha subunit)와 반응함으로써, 코어 프로모터에 의한 전사 효율을 크게 증가시킨다.

업 엘레멘트는 rrnB 유전자의 -40에서 -60에 걸치는 부위이다. 이 업 엘레멘트는 FIS 단백질과 마찬가지로, RNA 중합효소의 알파 구성단위와 반응하여 RNA 중합효소가 코어 프로모터 부위를 더욱 용이하게 인식할 수 있도록 함으로써, 코어 프로모터에 의한 전사 효율을 크게 증가시킨다.

따라서 이들 인자들이 포함된 프로모터를 갖춘 발현 벡터는 그 전사 효율이 극대화될 수 있다.

코어 프로모터는 rrnB 유전자의 -10과 -35에 각각 존재하는 헥사머(hexamer)들을 포함하는 영역으로, 목적 단백질의 유전자의 전사가 개시되도록 하는 부분이다. 이 코어 프로모터 영역을 RNA 중합효소의 시그마 70 구성단위(sigma 70 subunit)가 인식하고 결합함으로써, 전사가 개시된다. 본 발명의 발현 벡터에서 사용가능한 코어 프로모터는 기존에 사용되어 온 rrnB의 프로모터를 비롯하여, tac, trc, lac 및 trp 등 대장균의 재조합 단백질 생산에 널리 사용되어 온 프로모터는 모두 가능하다.

유도성 프로모터는 유도물질의 존재 여부에 따라 그 전사 활성이 조절되는 프로모터로, FIS 유전자의 발현을 조절할 부분이다. 유도성 프로모터의 조절을 받는 유전자는 환경의 변화에 따라서, 즉 배지의 조성에 따라 그 발현 여부를 조절할 수 있다. 본 발명에서 사용가능한 유도성 프로모터는 유도물질(inducer)인 IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalacto pyranoside)의 존재 여부에 따라 전사 활성이 조절되는 lac, tac 및 trc 프로모터 등 기존에 널리 사용되어 온 유도성 프로모터를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 lac 프로모터와 trp 프로모터의 합성형으로서 강력한 유도 능력을 나타내는 tac 프로모터를 사용한다.

본 발명의 발현 벡터는 이들 구성 요소 외에도, 목적 유전자의 발현 조절 및 클로닝의 유용성을 높이기 위해 프로모터의 하위에 작동인자(operator)를 가지며, 다중 클로닝 부위의 3' 쪽에 전사종결인자(terminator)를 가진다.

작동인자는 오페론의 한 구성요소로서, 주로 유전자 내의 프로모터와 구조 유전자(structural gene) 사이에 위치하는 부위다. 작동인자는 적절한 발현 유도에 있어 필수적인 요소로, 유도물질의 존재 여부에 따라 전사 활성을 조절한다. 본 발명에서는 IPTG의 존재 여부에 따라 전사 활성이 엄격하게 조절되는 lac 작동인자를 사용한다.

lac 오페론의 경우, 유도물질인 IPTG가 존재하지 않을 때에는, lac I로부터 발현되는 억제인자(repressor)가 유전자의 lac 작동인자 부위에 결합하여, 근처의 프로모터에 RNA 중합효소가 결합하는 것을 구조적으로 방해하기 때문에 전사가 일어나지 못한다. 그러나 IPTG가 세포 내로 유입되어 억제인자와 결합하게 되면, 억제인자의 구조에 변화가 일어나 lac 작동인자에 대한 친화력이 떨어지면서 유전자로부터 분리된다. 따라서 IPTG 존재시에는 프로모터에 RNA 중합효소가 결합하는 것이 용이해지므로 전사가 개시될 수 있다.

전사종결인자는 RNA 중합효소가 전사를 종료하도록 하는 서열이다. 이 전사종결인자를 다중 클로닝 부위의 3' 쪽에 가지고 있는 벡터는, 전사종결인자를 별도로 가지고 있지 않은 유전자도 발현시킬 수 있다. 본 발명에서는 공지된 전사종결인자들 중 어느 것을 사용해도 무방하나, 바람직하게는 pKK223-3 벡터의 T1/T2 전사종결인자를 사용한다.

본 발명의 발현 벡터를 제조하는 방법으로서, 본 발명의 대표적 발현 벡터인 pFRPT의 경우를 들어 구체적으로 설명한다.

본 발명의 발현 벡터 pFRPT는, FIS 결합 부위와 업 엘레멘트, rrnB P1의 코어 프로모터 및 lac 작동인자의 발현에 각각 필요한 최소 서열들을 연결한 DNA 절편을 얻어, 프로모터 부위를 제거한 pET29(c) 벡터의 다중 클로닝 부위의 5' 쪽에 삽입한다. 그리고 다중 클로닝 부위의 3' 쪽에 pKK223-3 벡터의 T1 전사종결인자와 T2 전사종결인자 부위를 포함하는 최소 서열을 얻어 추가로 삽입하고, pKK223-3 벡터의 tac 프로모터의 3' 쪽에 FIS 단백질의 발현에 필요한 최소 서열을 연결한 DNA 절편을 얻어 추가로 삽입함으로써 얻는다.

본 발명의 발현 벡터 pFRPT 제조시, 우선 대장균의 rrnB 유전자(GenBank 등록번호 J01695, 서열번호 2)와 lac 작동인자(p471, Molecular Biology of the Gene, Watson et al., 4th Edition, 서열번호 3)의 염기 서열을 검색한다. 이중 FIS 결합 부위와 업 엘레멘트, rrnB P1의 코어 프로모터 및 lac 작동인자의 발현에 필요한 최소 염기 서열을 확인하고, 이들 염기 서열을 도 1의 구조가 되도록 재배열하여, 본 발명의 발현 벡터에 삽입될 245 bp의 프로모터 및 작동인자 서열을 고안한다(서열번호 4).

상기 염기 서열을 얻기 위해, 이들 서열들을 포함하는 적절한 크기의 올리고머(oligomer)들을 각각 합성한다. 올리고머 제작시, 이들 올리고머들을 모두 연결하였을 때 고안된 프로모터의 구조를 가진 DNA 단편을 얻을 수 있도록, 연결되어야 할 올리고머들의 양 말단 부위에 상보적으로 결합할 수 있는 적절한 제한 효소부위를 삽입한다.

합성된 올리고머들을 올리고머 연쇄중합합성법(recursive PCR)을 이용하여 서로 연결시킨 후, 다시 양 말단의 염기 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머를 이용하여 증폭한다. PCR 결과 얻은 DNA 단편을 프로모터를 제거한 pET29(c) 벡터에 삽입함으로써, FIS 결합 부위와 업 엘레멘트, rrnB P1의 코어 프로모터 및 lac 작동인자를 포함하는 발현 벡터 pERP를 얻는다(도 2).

그런데, 발현 벡터 pERP는 다중 클로닝 부위의 3' 쪽에 별도의 전사종결인자가 없기 때문에, 전사종결인자를 지닌 유전자를 클로닝할 때만 사용가능하다. 따라서 pKK223-3 벡터로부터 T1 종결인자와 T2 종결인자를 포함하는 부위를 얻어, 발현 벡터 pERP의 다중 클로닝 부위의 3' 쪽에 추가로 삽입함으로써, 발현 벡터 pERPT를 얻는다(도 3).

상기 발현 벡터들은 대장균 내에서 원래부터 만들어지고 있는 내생적인 (endogenous) FIS 단백질에 의해 그 프로모터의 전사 활성이 증가될 수 있다. 그러나 발현 벡터 자체적으로 FIS 단백질을 발현시킬 수 있고 그 발현을 조절할 수 있는 체계를 갖게 된다면, 프로모터의 전사 활성이 더욱 증가되는 동시에 단백질 발현의 조절이 용이해질 것이므로, 발현 벡터 pERPT에 FIS 단백질의 유도성 발현 체계를 추가로 삽입한다.

우선 대장균의 FIS 유전자의 염기 서열을 검색하고(GenBank 등록번호 J03816, 서열번호 5), 이를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행한다. 이렇게 하여 얻은 FIS 유전자를, tac 프로모터를 가진 pKK223-3 벡터의 다중클로닝 부위에 삽입한다. 상기 플라스미드로부터 다시 PCR을 수행하여 tac 프로모터에서 FIS 유전자까지 이르는 부분을 얻고, 발현 벡터 pERPT의 복제개시점의 3' 쪽에 추가로 삽입함으로써, 본 발명의 발현 벡터 pFRPT를 얻는다(도 4).

본 발명의 발현 벡터 pFRPT는 JM109 세포에 도입되어, 2001년 9월 28일 한국미생물보존센터(Korea culture center of microorganisms, KCCM)에 기탁번호 KCCM-10320으로 기탁되었다.

본 발명의 발현 벡터에 다중 클로닝 부위에 발현시키고자 하는 목적 단백질의 유전자를 삽입한 후, 이 벡터로 대장균을 형질 전환하고 유도 물질을 첨가함으로써, 원하는 목적 단백질을 발현시킬 수 있다. 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 얻을 수 있는 단백질은, 생체 구성 성분, 효소, 신호 전달, 호르몬, 면역 체계 구성 및 생체 방어 등의 기능을 담당하는 단백질을 비롯하여, 임의의 원하는 단백질은 모두 가능하다.

본 발명의 발현 벡터는 코어 프로모터에 의한 전사 개시 능력을 크게 향상시키는 FIS 결합 부위와 업 엘레멘트를 포함하기 때문에, 코어 프로모터만을 가지는 기존의 발현 벡터에 비해, 목적 단백질의 발현율을 크게 증대시킬 수 있다.

본 발명의 발현 벡터 중 엄격하게 조절되는 FIS 단백질의 유도성 발현 체계를 추가로 포함하는 벡터는, 유도물질을 사용하여 FIS 단백질의 발현을 용이하게 조절함으로써 벡터 자체적으로 FIS 단백질을 생산할 수 있다. 따라서 대장균 내에서 유래한 내생적 FIS 단백질 외에도 FIS 결합 부위에 결합할 수 있는 FIS 단백질의 수량이 증가하게 되면서, rrnB P1 프로모터에 의한 전사 효율을 높여 결과적으로 목적 단백질의 생산 효율을 극대화할 수 있다.

또한 FIS 단백질의 유도성 발현 체계로 인해 리보좀을 구성하는 RNA의 전사량이 증가하면서, 발현 숙주 내의 리보좀 증가도 유도한다. 원래 단백질의 발현이 일단 일어난 숙주 세포는 일반적으로 시간이 경과함에 따라 성장이 억제되는 경향이 있어, 목적 단백질의 대량 수확에 많은 어려움이 있어 왔다. 그러나 FIS 단백질의 유도성 발현 체계에 의해 발현 기구인 리보좀의 양이 증대됨에 따라, 숙주 세포의 증식에 필요한 여러 단백질들의 발현율이 높아져 성장이 지속되므로, 결과적으로 목적 단백질의 발현율이 더욱 높아질 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는 다중 클로닝 부위 뒤쪽에 전사종결인자가 별도로 존재하기 때문에, 다중 클로닝 부위에 삽입되는 재조합 단백질의 유전자가 안정적으로 발현될 수 있다.

또한 본 발명의 발현 벡터는, 광범위한 균주에 사용되어 온 기존의 프로모터를 사용할 수 있기 때문에 숙주 세포로 사용될 균주의 유전적 특징에 관계없이 사용할 수 있다. 따라서, 박테리오파지 발현 체계를 이용한 기존의 발현 벡터를 사용하는 경우에 비해 별도의 유전적 변형을 필요로 하지 않으며, 목적 단백질의 특성에 따라 발현 숙주를 선택할 수 있기 때문에, 다양한 단백질의 생산을 필요로 하는 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하며, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1] 본 발명의 발현 벡터 pERP의 제조

프로모터의 구성 요소로서 FIS 결합 부위와 업 엘레멘트 및 rrnB P1의 코어 프로모터를 포함하고, 그 3' 쪽에 lac 작동인자를 포함하는 발현 벡터를 제조하였다.

우선, 대장균의 rrnB 유전자(서열번호 2)과 lac 작동인자(서열번호 3)의 염기 서열을 검색하였다. 이중 FIS 결합 부위와 업 엘레멘트, rrnB P1의 코어 프로모터 및 lac 작동인자의 발현에 필요한 최소 염기 서열을 확인한 후, 이들 서열들을 포함하는 적절한 크기의 올리고머들을 각각 제작하였다. 올리고머 제작시, 이들 올리고머들이 모두 연결된 후 도 1과 같은 구조의 프로모터를 구성할 수 있도록, 연결되어야 할 올리고머들의 양 말단 부위에 상보적으로 결합할 수 있는 적절한 제한 효소 부위를 삽입하였다. 사용된 올리고머들의 염기 서열은 다음과 같다.

올리고머	염기 서열	비고
rrn 1	ATCGATCTCGATCCCGCGAAATAAATGCTGAACAATTATTGCCCGTTTTA	서열번호 6
rrn 2	GCCAGTTTTTCGAGCGTTTCGAAGCCGTAACGCTGTAAAACGGGCAATAA	서열번호 7
rrn 3	GCTCGAAAAACTGGCAGTTTTAGGCTGATTTGGTTGAATGTTGCGCGGTC	서열번호 8
rrn 4	ATTAATTGACAAGAGGAAATTTAAAATAATTTTCTGACCGCGCAACATTC	서열번호 9
rrn 5	CTCTTGTCAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGCGCGGAATTGTGTGAGC	서열번호 10
rrn 6	TATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAATGGTGGGAATTGTTATCCGCTCACACAATTCCG	서열번호 11

상기 올리고머들에 대해, 다음과 같이 올리고머 연쇄중합합성법(recursive PCR)을 수행하였다. 20 pmole의 각 올리고머와 200 μM dNTP를 함유하는 1 ×Pfu 완충액(Stratagene 사) 50 ㎕를 준비하여, 95 ℃에서 1분, 42 ℃에서 1분 동안 4회 반복하여 반응시켰다. 상기 반응액에 2.5 U Pfu 효소(Stratagene 사)를 첨가한 후,94 ℃에서 1분, 42℃에서 1분, 68℃에서 1분 동안 5회 반복하여 반응시킴으로써, rrn1, rrn 2, …, rrn 6의 순서대로 올리고머들을 연결하였다.

연결된 올리고머의 양을 증폭하기 위해, 연결된 올리고머액 2 ㎕를 200 μM dNTP, 20 pmole rrn ClaⅠ 프라이머와 20 pmole rrn NdeⅠ 프라이머, 2.5 U의 Pfu 효소를 함유한 1X Pfu 완충액 48 ㎕에 첨가하여, 94 ℃에서 1분, 52 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분 동안 25회 반복하여 반응시켰다. 이때 사용된 프라이머의 염기 서열은 다음과 같다.

rrn ClaⅠ: AGATCGATCTCGATCCCGCGAA (서열번호 12)

rrn NdeⅠ: TTCTTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG (서열번호 13)

그 결과 증폭된 245 bp의 PCR 산물을 아가로스 젤 전기영동법(agarose gel electorphoresis)으로 확인하고, 이를 젤 추출 키트(gel extraction kit, Qiagen 사)를 이용하여 정제하였다. 정제한 DNA 절편을 50 U의 Nde I으로 6시간 동안 처리한 후, 페놀:클로로포름을 1:1(v/v)로 혼합한 용매를 사용하여 추출하고, 3배 분량의 에탄올로 침전하여 정제하였다(이하 '에탄올 정제'라고 한다).

상기 DNA 절편을 삽입할 벡터로, 발현 벡터 pET29(c)(Novagen 사)를 택하고, 이 벡터 10 ㎍을 37 ℃에서 2시간 동안 Sph I으로 절단하였다. 절단 후 에탄올 정제한 플라스미드를 30 μM의 dNTP, 3 U의 T4 중합효소, 1X T4 중합효소 완충액이 포함된 반응액 30 ㎕에 첨가하여, 20 ℃에서 10분간 반응시켜 3' 쪽의 돌출부분(overhang)을 제거한 후 에탄올 정제하였다. 정제 후 50 U의 NdeI를 사용하여 37 ℃에서 3시간 동안 반응시킴으로써, pET 벡터의 원래 프로모터인 T7 프로모터 부위를 제거하였다. 아가로즈 젤 전기영동법을 사용하여 원하는 크기로 절단된 벡터 DNA를 얻고, 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다.

상기 방법을 통해 얻은 두 DNA 절편을 3 U의 리가아제(ligase, Promega 사)와 1X 리가아제 완충액이 포함된 반응액 20 ㎕에 첨가하여 20 ℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 상기 반응액으로 JM109 대장균 세포를 형질전환시킨 후 얻은 대장균 집락 중, 원하는 플라스미드를 함유하는 클론을 선별하였다.

이렇게 하여 얻은 발현 벡터는 다중 클로닝 부위의 5' 쪽에 FIS 결합 부위와 업 엘레멘트, rrnB P1의 코어 프로모터 및 lac 작동인자를 포함하며, 이를 pERP로 명명하였다.

[실시예 2] 본 발명의 발현 벡터 pERPT의 제조

본 발명의 발현 벡터에 삽입될 유전자가 안정적으로 발현될 수 있도록, 상기 발현 벡터 pERP에 전사종결인자를 추가로 삽입하였다.

전사종결인자로 pKK223-3(Phamacia 사)의 T1 종결인자와 T2 종결인자를 선택하였다. pKK223-3로부터 전사종결인자 부위를 얻기 위해, 10 ㎍의 pKK223-3를 10 U의 Hind III와 10 U의 Hinc II가 함유된 반응액 50㎕에서 절단하였다. 절단된 플라스미드를 아가로즈 젤 전기영동법으로 분석하여, 전사종결인자가 포함된 767 bp의 절편을 얻고, 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다.

한편, 벡터 pERP 10 ㎍을 1 U의 AvaI가 함유된 반응액 50 ㎕에 첨가하여 37 ℃에서 15분간 부분절단한 후, 60 ℃에서 30분간 처리하여 효소를 비활성화시켰다.상기 반응액에 33 μM dNTP와 10 U의 클레노우(Klenow) 효소를 첨가하고, 20 ℃에서 15분간 반응시켜 절단된 벡터의 양 끝을 평활 말단으로 만들었다. 반응이 끝난 벡터를 아가로즈 젤 전기영동법과 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 벡터를 30 U의 Hind III가 함유된 30 ㎕의 반응액에서 절단한 후, 아가로즈 젤 전기영동법과 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다.

상기 방법을 통해 얻은 두 DNA 절편을 3 U의 리가아제와 1X 리가아제 완충액이 함유된 반응액에 첨가하여 16 ℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 상기 반응액으로 JM109 대장균 세포를 형질전환시킨 후 얻은 대장균 집락 중, 원하는 플라스미드를 함유하는 클론을 선별하였다.

이렇게 하여 얻은 발현 벡터는 다중 클로닝 부위의 5' 쪽에 FIS 결합 부위와 업 엘레멘트, rrnB P1의 코어 프로모터 및 lac 작동인자를 포함하고, 다중 클로닝 부위의 3' 쪽에는 전사종결인자를 포함하며, 이를 pERPT로 명명하였다.

[실시예 3] 본 발명의 발현 벡터 pFRPT의 제조

본 발명의 발현 벡터가 자체적으로 FIS 단백질을 발현시킬 수 있고 그 발현을 조절할 수 있도록, 상기 발현 벡터 pERPT에 FIS 단백질의 유도성 발현 체계를 삽입하였다.

LB 배지 3 ㎖에 JM109 세포를 접종하여 37 ℃에서 진탕배양하였다. 배양액의 흡광도가 0.7이 되었을 때, 배양액을 원심분리하여 세포들을 수확한 후, 트리졸(Trizol, Gibco BRL 사)을 이용하여 전체 RNA를 분리하고, 50 ㎕의 증류수에녹인후 70oC에서 10분간 가열 후 얼음에서 급속 냉각하였다.

상기에서 얻어진 RNA 5 ㎕를 FIS down 프라이머(서열번호 14)와 FIS up 프라이머(서열번호 15) 각 10pmole, 200 μM의 dNTP, 1×역전사효소 완충액 및 2 ㎕의 역전사효소(Gibco BRL사)이 함유된 반응액 50 ㎕에 첨가하여, 42 ℃에서 90분간, 90 ℃에서 15분간 반응시킴으로써 역전사(reverse transcriptation) 반응을 수행하였다. 프라이머의 염기 서열은 다음과 같다.

FIS down 프라이머: TTCAAGCTTAGTTCATGCCGTATTTTTTCAA (서열번호 14)

FIS up 프라이머: GGAATTCATGTTCGAACAACGCGTAAATT (서열번호 15)

상기 반응액을 주형으로 하여, 200 uM의 dNTP, 20 pmol의 프라이머, 1×Pfu 완충액 및 2.5 U의 Pfu 중합효소가 존재하는 조건에서, 94 ℃에서 1분, 52 ℃에서 1분, 68 ℃에서 1분의 조건을 28회 반복하여 반응시켰다. 반응이 끝난 PCR 산물을 상기의 아가로즈 젤 전기영동법으로 분석하여 얻은 후, 30 U의 EcoRI과 Hind III 제한효소가 함유된 반응액 30 ㎕ 에서 절단하였다.

상기 DNA 절편에 tac 프로모터를 연결시키기 위해, 상기 절편을 마찬가지로 EcoRI과 Hind III로 절단한 pKK223-3 플라스미드에 연결하였다. 이 반응액 3 ㎕를 다시 tac 프라이머와 FIS down 프라이머를 이용하여 상기와 같은 조건으로 PCR함으로써, tac 프로모터와 그 3' 쪽의 FIS 유전자가 포함된 부분을 얻었다. 이때 사용된 tac 프라이머는 다음과 같다.

tac 프라이머: ctgaaatgagctgttgacaattaatcatc (서열번호 16)

이렇게 하여 얻은 PCR 산물을 20 U의 Hind III로 절단하고, 클레노우 효소를이용하여 평활 말단을 만든 후, 아가로즈 젤 전기영동법과 젤 추출 키트를 사용하여 정제하였다.

한편 pERPT 5 ㎍을 AviII로 절단한 후, 아가로즈 젤 전기영동법과 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다.

상기 방법을 통해 얻은 두 DNA 절편을 3 U의 리가아제와 1X 리가아제 완충액이 함유된 반응액에 첨가하여 16 ℃에서 18시간 동안 반응시킴으로써, 벡터의 복제개시점의 3' 쪽에 FIS 단백질의 유도성 발현 체계를 삽입하였다. 상기 반응액으로 JM109 대장균 세포를 형질전환시킨 후 얻은 대장균 집락 중, 원하는 플라스미드를 함유하는 클론을 선별하였다.

이렇게 하여 얻은 본 발명의 발현 벡터는 다중 클로닝 부위의 5' 쪽에 다중 클로닝 부위의 5' 쪽에 FIS 결합 부위와 업 엘레멘트, rrnB P1의 코어 프로모터 및 lac 작동인자를 포함하고, 다중 클로닝 부위의 3' 쪽에는 전사종결인자를 포함하며, 복제개시점의 3' 쪽에는 FIS 단백질의 유도성 발현 체계를 포함한다.

본 발명의 발현 벡터를 pFRPT로 명명하고, JM109 세포에 도입하여 2001년 9월 28일 한국미생물보존센터(Korea culture center of microorganisms, KCCM)에 기탁번호 KCCM-10320으로 기탁하였다.

[실험예 1] 본 발명의 발현 벡터 pFRPT와 기존의 발현 벡터를 이용한 인간성장인자(hGH)의 발현

본 발명의 발현 벡터 pFRPT와 기존의 발현 벡터를 이용하여 인간성장인자(human growth hormone; 이하 hGH)를 발현시키고, 각 경우의 발현량을 비교하였다.

본 발명의 발현 벡터 pFRPT와 그 발현량을 비교할 기존의 발현 벡터로, T7 발현 체계를 이용하는 pET 계열의 발현 벡터 pEThink를 택하였다. 또한 발현 숙주에 따른 발현율을 확인하기 위해, 다양한 종류의 균주를 숙주 세포로 사용하였다. 이때 사용된 균주는 DH5, JM109, TOP10, NovaBlue(DE3) 등 재조합 단백질의 발현에 널리 사용되어 온 균주들을 택하였다.

우선, hGH 유전자가 클로닝된 기탁번호 ATCC-31389 플라스미드를 주형으로 하여, PCR을 수행하였다. 이때 사용된 프라이머는 다음과 같다.

hGH 정방향 프라이머: ttttcatatgttcccaaccattccct (서열번호 17)

hGH 역방향 프라이머: gcggtaccctagaagccacagctgcc (서열번호 18)

기존의 발현 벡터 pEThink에 hGH 유전자를 삽입하기 위해, PCR 반응으로 얻은 hGH 유전자와 pEThink를 둘 다 NdeI과 HindIII로 절단하였다. 이들을 연결시켜 각 숙주 세포에 도입한 후 원하는 클론을 얻음으로써, hGH 유전자가 pEThink에 의해 발현되는 클론을 얻었다.

한편 본 발명의 발현 벡터 pFRPT에 hGH 유전자를 삽입하기 위해, pFRPT를 NdeI과 HindIII로 절단하고, hGH 유전자가 삽입된 pEThink를 NdeI과 HindIII로 절단하여 hGH 유전자를 얻었다. 이들을 연결시켜 각 숙주 세포에 도입함으로써, hGH 유전자가 pFRPT에 의해 발현되는 클론을 얻었다.

각 균을 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양한 후, 1:100의 비율로 새 배지에 희석하여 37 ℃에서 배양하였다. 흡광도가 0.8이 되었을 때, 발현 유도물질로 0.4 mM의IPTG를 첨가하였다. 3시간 동안 추가로 진탕배양한 후 다시 흡광도를 측정하고, 세포를 수확하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질에 대해 SDS-PAGE 분석을 수행한 후, 분석이 끝난 젤을 쿠마시 염색(Coomasie staining)한 후, Gel Doc 기를 이용하여 NIH 이미지를 통해 전체 단백질과 hGH의 흡광도를 측정하였다. 발현 벡터와 발현 숙주 별로, 전체 단백질에 대한 hGH의 발현율을 계산하여 표 2에 나타내었다.

발현 플라스미드	pFRPT-hGH	pEThink-hGH
발현숙주	DH5	TOP10	NovaBlue(DE3)	DH5	TOP10	NovaBlue(DE3)
전체 단백질 중hGH의 발현율	65.2 %	52 %	45 %	0 %	0 %	21 %

표 2에 나타난 바와 같이, 기존의 pET 계열 발현 벡터 pEThink를 사용한 경우 hGH는 T7 발현 체계가 잘 구축되어 있는 DE3 상태의 NovaBlue 균주에서만 어느 정도의 발현율을 나타내었다. 반면 본 발명의 발현 벡터 pFRPT를 사용한 경우에는 모든 균주에서 hGH의 발현율이 전체 단백질의 반 이상을 차지하였다.

또한 본 실험예에서 사용한 IPTG의 양은 기존에 사용하던 양에 비해 매우 적은 것으로, 본 발명의 발현 벡터 pFRPT는 적은 양의 유도물질로도 우수하게 단백질 발현을 유도함을 알 수 있다.

한편, 일단 목적 단백질의 발현이 일어난 후에도 숙주 세포가 지속적으로 증식하는가를 확인하기 위해, IPTG 첨가 전과 첨가 후에 측정한 흡광도를 비교함으로써 발현 숙주 별로 숙주 세포의 증식률의 변화를 측정하고, 그 결과를 표 3에 나타내었다.

발현 플라스미드	pFRPT-hGH	pEThink-hGH
발현 숙주	DH5	TOP10	JM 109	NovaBlue(DE3)	DH5	TOP10	JM 109	NovaBlue(DE3)
유도 전 흡광도	1.32	1.05	1.31	0.64	1.21	1.10	1.30	0.66
유도 후 흡광도	2.34	2.19	2.27	1.53	2.11	2.01	2.20	0.82
증식률	1.77	2.00	1.70	2.40	1.74	1.80	1.70	1.20
발현율	65.2%	52%	58%	45%	0%	0%	0%	21%

표 3에 나타난 바와 같이, 기존의 pET 계열 발현 벡터 pEThink를 사용한 경우에 비해 본 발명의 발현 벡터 pFRPT를 사용한 경우, 숙주 세포의 증식률이 더 높았다.

이처럼 본 발명의 발현 벡터는 기존의 발현 벡터와는 달리, 일단 목적 단백질의 발현 유도가 일어난 후에도 숙주 세포가 지속적으로 증식하기 때문에, 단위 발효당 총 생산에 있어서 훨씬 높은 발현율을 나타낼 수 있다.

따라서 본 발명의 발현 벡터는 기존의 발현 벡터에 비해 적은 양의 유도물질을 사용하고도 목적 단백질을 고수율로 발현할 수 있으며, 숙주 세포의 성장을 지속시켜 발현율을 더욱 극대화시킬 수 있음을 알 수 있다.

[실험예 2] FIS 결합 부위와 FIS 단백질의 유도성 발현 체계에 의한 기존 프로모터의 전사 능력 증가 확인

FIS 결합 부위와 함께, FIS 단백질의 유도성 발현 체계를 함께 지닌 본 발명의 발현 벡터의 프로모터로서, rrnB promotor 이외의 다른 프로모터를 이용할 수 있는가를 확인하기 위해, 기존에 널리 사용되는 tac promoter를 이용한 벡터에,FIS 결합 부위와 함께 FIS 단백질의 유도성 발현 체계를 삽입하기로 하였다.

pFRPT로부터 rrnB 프로모터를 제외한 부위를 얻기 위해, Quick change^TM(Stratagene 사) 방법을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이때 사용된 프라이머의 염기 서열은 다음과 같다.

rrnBP 제외 정방향 프라이머: gaggaaatttaaaataattttctga (서열번호 19)

rrnBP 제외 역방향 프라이머: gcgcggaattgtgtgagcggataaca (서열번호 20)

rrnB 프라이머 대신 삽입할 tac 프로모터 부위를 얻기 위해 다음의 염기 서열을 갖는 올리고머를 제작하였다.

oligo tac 1: ttgacaattaatcatcggctcgtataatg (서열번호 21)

oligo tac 2: cattatacgagccgatgattaattgtcaa (서열번호 22)

200 pmole의 각 올리고머를 혼합하여 100 ℃에서 끓인 후, 서서히 냉각시켜 이중가닥이 되도록 한 후(annealing), T4 DNA 인산화효소(kinase) 10 U와 1 mM ATP를 첨가하여 인산화하였다. 이렇게 하여 준비한 tac 프로모터 DNA와, rrnBP1을 제거한 pFRPT를 연결하여 새로운 발현 벡터를 얻고 이를 pFTAC이라 명명하였다.

본 발명의 발현 벡터 pFTAC와 tac 프로모터를 이용한 기존의 발현 벡터의 목적 단백질 발현율을 비교하기 위해, 실험예 1과 마찬가지로 각 발현 벡터에 hGH 유전자를 삽입하여 숙주 세포에 도입한 후 그 발현율을 확인하였다. 이때 pFTAC와 비교할 기존의 벡터로 pKK223-3을 사용하였다.

실험예 1에서 얻은 pFRPT-hGH 플라스미드를 NdeI/HindIII로 절단하여 hGH 유전자를 얻고, NdeI/HindIII로 절단한 각 벡터에 삽입하였다. 이후 실험예 1과 마찬가지의 방법으로 hGH의 플라스미드의 발현율을 확인하였다

그 결과, pKK223-3를 사용하였을 때는 전체 단백질에 비해 hGH의 양이 매우 미미하였으나, pFTAC를 사용한 경우에는 그 발현량이 3 ∼ 5 배 이상 증가하였다.

따라서 FIS 결합 부위와 함께, FIS 단백질의 유도성 발현 체계를 기존의 발현 벡터에 추가로 삽입함으로써, 기존의 발현 벡터보다 훨씬 높은 효율로 목적 단백질을 발현시킬 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는 기존의 발현 벡터가 코어 프로모터 자체만을 함유하는 것에 비해, 그 프로모터 부위에 코어 프로모터 뿐 아니라 프로모터에 의한 전사 개시 능력을 크게 향상시키는 FIS 결합 부위와 업 엘레멘트를 포함하기 때문에, 외래에서 도입한 목적 단백질을 대량으로 발현시키는 효과가 있다.

본 발명의 발현 벡터에 강력한 조절력을 가진 유도성 프로모터의 조절을 받는 FIS 유전자를 추가로 삽입하면, FIS 단백질의 발현을 용이하게 조절하여 FIS 단백질의 발현량을 증가시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 발현 벡터는 FIS 단백질의 유도성 발현 체계를 추가로 삽입함으로써, 코어 프로모터의 전사 효율을 더욱 높여 목적 단백질의 발현율을 극대화할 수 있기 때문에, 기존의 발현 벡터에 비하여 훨씬 적은 양의 유도물질을 사용하고도 다량의 단백질을 생산하는 효과가 있다.

이러한 FIS 단백질의 유도성 발현 체계는 발현 기구인 리보좀의 양 또한 증대시키므로, 숙주 세포의 증식에 필요한 여러 단백질들의 발현율을 증대시켜 결과적으로 목적 단백질의 발현율을 더욱 극대화하는 효과가 있다.

본 발명의 발현 벡터는 균주의 유전적 특징에 관계없이 광범위한 대장균 균주를 숙주 세포로 사용할 수 있어, 목적 단백질의 특성에 따라 선택할 수 있는 발현 숙주의 범위가 넓어지므로, 다양한 단백질의 생산을 필요로 하는 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

<110> CHUNG, Dong Hoon <120> Expression vector containing the promoter comprised of FIS binding sites, UP element and core promoter <130> 01P-84 <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> essential sequnece for FIS binding sites and UP element <400> 1 gctgaacaat tattgcccgt tttacagcgt tacggcttcg aaacgctcga aaaactggca 60 gttttaggct gatttggttg aatgttgcgc ggtcagaaaa ttattttaaa tttcctc 117 <210> 2 <211> 7508 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> mRNA <222> (1)..(7508) <223> E.coli rRNA operon (rrnB) coding for Glu-tRNA-2, 5S, 16S and 23S rRNA <300> <303> GenBank <308> J01695 <309> 1994-04-15 <313> 1-7508 <400> 2 ggatccgcct acctttcacg agttgcgcag tttgtctgca agactctatg agaagcagat 60 aagcgataag tttgctcaac atcttctcgg gcataagtcg gacaccatgg catcacagta 120 tcgtgatgac agaggcaggg agtgggacaa aattgaaatc aaataatgat tttattttga 180 ctgatagtga cctgttcgtt gcaacaaatt gataagcaat gcttttttat aatgccaact 240 tagtataaaa tagccaacct gttcgacaaa gattatgaga cagtctatgg ctaccaaact 300 gcaggacggg aatacacctt gtctggcagc tacaccttct gaaccacgtc ccaccgtgct 360 ggtgtttgac tccggcgtcg gtgggttgtc ggtctatgac gagatccggc atctcttacc 420 ggatctccat tacatttatg ctttcgataa cgtcgctttc ccgtatggcg aaaaaagcga 480 agcgtttatt gttgagcgag tggtggcaat tgtcaccgcg gtgcaagaac gttatcccct 540 tgcgctggct gtggtcgctt gcaacactgc cagtaccgtt tcacttcctg cattacgcga 600 aaagttcgac ttcccggttg ttggtgtcgt gccggcgatt aaacctgctg cacgtctgac 660 ggcaaatggc attgtcggat tactggcaac ccgcggaaca gttaaacgtt cttatactca 720 tgagctgatc gcgcgtttcg ctaatgaatg ccagatagaa atgctgggct cggcagagat 780 ggttgagttg gctgaagcga agctacatgg cgaagatgtt tctctggatg cactaaaacg 840 tatcctacgc ccgtggttaa gaatgaaaga gccgccagat accgttgtat tgggttgcac 900 ccatttccct ctactacaag aagaactgtt acaagtgctg ccagagggaa cccggctggt 960 ggattctggc gcagcgattg ctcgccgaac ggcctggttg ttagaacatg aagccccgga 1020 tgcaaaatct gccgatgcga atattgcctt ttgtatggca atgacgccag gagctgaaca 1080 attattgccc gttttacagc gttacggctt cgaaacgctc gaaaaactgg cagttttagg 1140 ctgatttggt tgaatgttgc gcggtcagaa aattatttta aatttcctct tgtcaggccg 1200 gaataactcc ctataatgcg ccaccactga cacggaacaa cggcaaacac gccgccgggt 1260 cagcggggtt ctcctgagaa ctccggcaga gaaagcaaaa ataaatgctt gactctgtag 1320 cgggaaggcg tattatgcac accccgcgcc gctgagaaaa agcgaagcgg cactgctctt 1380 taacaattta tcagacaatc tgtgtgggca ctcgaagata cggattctta acgtcgcaag 1440 acgaaaaatg aataccaagt ctcaagagtg aacacgtaat tcattacgaa gtttaattct 1500 ttgagcgtca aacttttaaa ttgaagagtt tgatcatggc tcagattgaa cgctggcggc 1560 aggcctaaca catgcaagtc gaacggtaac aggaagaagc ttgcttcttt gctgacgagt 1620 ggcggacggg tgagtaatgt ctgggaaact gcctgatgga gggggataac tactggaaac 1680 ggtagctaat accgcataac gtcgcaagac caaagagggg gaccttcggg cctcttgcca 1740 tcggatgtgc ccagatggga ttagctagta ggtggggtaa cggctcacct aggcgacgat 1800 ccctagctgg tctgagagga tgaccagcca cactggaact gagacacggt ccagactcct 1860 acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgcaa gcctgatgca gccatgccgc 1920 gtgtatgaag aaggccttcg ggttgtaaag tactttcagc ggggaggaag ggagtaaagt 1980 taataccttt gctcattgac gttacccgca gaagaagcac cggctaactc cgtgccagca 2040 gccgcggtaa tacggagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgcacgca 2100 ggcggtttgt taagtcagat gtgaaatccc cgggctcaac ctgggaactg catctgatac 2160 tggcaagctt gagtctcgta gaggggggta gaattccagg tgtagcggtg aaatgcgtag 2220 agatctggag gaataccggt ggcgaaggcg gccccctgga cgaagactga cgctcaggtg 2280 cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc 2340 gacttggagg ttgtgccctt gaggcgtggc ttccggagct aacgcgttaa gtcgaccgcc 2400 tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt 2460 ggagcatgtg gtttaattcg atgcaacgcg aagaacctta cctggtcttg acatccacgg 2520 aagttttcag agatgagaat gtgccttcgg gaaccgtgag acaggtgctg catggctgtc 2580 gtcagctcgt gttgtgaaat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttatccttt 2640 gttgccagcg gtccggccgg gaactcaaag gagactgcca gtgataaact ggaggaaggt 2700 ggggatgacg tcaagtcatc atggccctta cgaccagggc tacacacgtg ctacaatggc 2760 gcatacaaag agaagcgacc tcgcgagagc aagcggacct cataaagtgc gtcgtagtcc 2820 ggattggagt ctgcaactcg actccatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg tggatcagaa 2880 tgccacggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagtggg 2940 ttgcaaaaga agtaggtagc ttaaccttcg ggagggcgct taccactttg tgattcatga 3000 ctggggtgaa gtcgtaacaa ggtaaccgta ggggaacctg cggttggatc acctccttac 3060 cttaaagaag cgtactttgt agtgctcaca cagattgtct gatagaaagt gaaaagcaag 3120 gcgtttacgc gttgggagtg aggctgaaga gaataaggcc gttcgctttc tattaatgaa 3180 agctcaccct acacgaaaat atcacgcaac gcgtgataag caattttcgt gtccccttcg 3240 tctagaggcc caggacaccg ccctttcacg gcggtaacag gggttcgaat cccctagggg 3300 acgccacttg ctggtttgtg agtgaaagtc gccgacctta atatctcaaa actcatcttc 3360 gggtgatgtt tgagattttt gctctttaaa aatctggatc aagctgaaaa ttgaaacact 3420 gaacaacgag agttgttcgt gagtctctca aattttcgca acacgatgat gaatcgaaag 3480 aaacatcttc gggttgtgag gttaagcgac taagcgtaca cggtggatgc cctggcagtc 3540 agaggcgatg aaggacgtgc taatctgcga taagcgtcgg taaggtgata tgaaccgtta 3600 taaccggcga tttccgaatg gggaaaccca gtgtgtttcg acacactatc attaactgaa 3660 tccataggtt aatgaggcga accgggggaa ctgaaacatc taagtacccc gaggaaaaga 3720 aatcaaccga gattccccca gtagcggcga gcgaacgggg agcagcccag agcctgaatc 3780 agtgtgtgtg ttagtggaag cgtctggaaa ggcgcgcgat acagggtgac agccccgtac 3840 acaaaaatgc acatgctgtg agctcgatga gtagggcggg acacgtggta tcctgtctga 3900 atatgggggg accatcctcc aaggctaaat actcctgact gaccgatagt gaaccagtac 3960 cgtgagggaa aggcgaaaag aaccccggcg aggggagtga aaaagaacct gaaaccgtgt 4020 acgtacaagc agtgggagca cgcttaggcg tgtgactgcg taccttttgt ataatgggtc 4080 agcgacttat attctgtagc aaggttaacc gaatagggga gccgaaggga aaccgagtct 4140 taactgggcg ttaagttgca gggtatagac ccgaaacccg gtgatctagc catgggcagg 4200 ttgaaggttg ggtaacacta actggaggac cgaaccgact aatgttgaaa aattagcgga 4260 tgacttgtgg ctgggggtga aaggccaatc aaaccgggag atagctggtt ctccccgaaa 4320 gctatttagg tagcgcctcg tgaattcatc tccgggggta gagcactgtt tcggcaaggg 4380 ggtcatcccg acttaccaac ccgatgcaaa ctgcgaatac cggagaatgt tatcacggga 4440 gacacacggc gggtgctaac gtccgtcgtg aagagggaaa caacccagac cgccagctaa 4500 ggtcccaaag tcatggttaa gtgggaaacg atgtgggaag gcccagacag ccaggatgtt 4560 ggcttagaag cagccatcat ttaaagaaag cgtaatagct cactggtcga gtcggcctgc 4620 gcggaagatg taacggggct aaaccatgca ccgaagctgc ggcagcgacg cttatgcgtt 4680 gttgggtagg ggagcgttct gtaagcctgc gaaggtgtgc tgtgaggcat gctggaggta 4740 tcagaagtgc gaatgctgac ataagtaacg ataaagcggg tgaaaagccc gctcgccgga 4800 agaccaaggg ttcctgtcca acgttaatcg gggcagggtg agtcgacccc taaggcgagg 4860 ccgaaaggcg tagtcgatgg gaaacaggtt aatattcctg tacttggtgt tactgcgaag 4920 gggggacgga gaaggctatg ttggccgggc gacggttgtc ccggtttaag cgtgtaggct 4980 ggttttccag gcaaatccgg aaaatcaagg ctgaggcgtg atgacgaggc actacggtgc 5040 tgaagcaaca aatgccctgc ttccaggaaa agcctctaag catcaggtaa catcaaatcg 5100 taccccaaac cgacacaggt ggtcaggtag agaataccaa ggcgcttgag agaactcggg 5160 tgaaggaact aggcaaaatg gtgccgtaac ttcgggagaa ggcacgctga tatgtaggtg 5220 aggtccctcg cggatggagc tgaaatcagt cgaagatacc agctggctgc aactgtttat 5280 taaaaacaca gcactgtgca aacacgaaag tggacgtata cggtgtgacg cctgcccggt 5340 gccggaaggt taattgatgg ggttagcgca agcgaagctc ttgatcgaag ccccggtaaa 5400 cggcggccgt aactataacg gtcctaaggt agcgaaattc cttgtcgggt aagttccgac 5460 ctgcacgaat ggcgtaatga tggccaggct gtctccaccc gagactcagt gaaattgaac 5520 tcgctgtgaa gatgcagtgt acccgcggca agacggaaag accccgtgaa cctttactat 5580 agcttgacac tgaacattga gccttgatgt gtaggatagg tgggaggctt tgaagtgtgg 5640 acgccagtct gcatggagcc gaccttgaaa taccaccctt taatgtttga tgttctaacg 5700 ttgacccgta atccgggttg cggacagtgt ctggtgggta gtttgactgg ggcggtctcc 5760 tcctaaagag taacggagga gcacgaaggt tggctaatcc tggtcggaca tcaggaggtt 5820 agtgcaatgg cataagccag cttgactgcg agcgtgacgg cgcgagcagg tgcgaaagca 5880 ggtcatagtg atccggtggt tctgaatgga agggccatcg ctcaacggat aaaaggtact 5940 ccggggataa caggctgata ccgcccaaga gttcatatcg acggcggtgt ttggcacctc 6000 gatgtcggct catcacatcc tggggctgaa gtaggtccca agggtatggc tgttcgccat 6060 ttaaagtggt acgcgagctg ggtttagaac gtcgtgagac agttcggtcc ctatctgccg 6120 tgggcgctgg agaactgagg ggggctgctc ctagtacgag aggaccggag tggacgcatc 6180 actggtgttc gggttgtcat gccaatggca ctgcccggta gctaaatgcg gaagagataa 6240 gtgctgaaag catctaagca cgaaacttgc cccgagatga gttctccctg accctttaag 6300 ggtcctgaag gaacgttgaa gacgacgacg ttgataggcc gggtgtgtaa gcgcagcgat 6360 gcgttgagct aaccggtact aatgaaccgt gaggcttaac cttacaacgc cgaagctgtt 6420 ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc 6480 tgataaaaca gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga 6540 actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag 6600 ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt 6660 atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg 6720 aacgttgcga agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg 6780 catcaaatta agcagaaggc catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct acaaactctt 6840 cctgtcgtca tatctacaag ccatcccccc acagatacgg taaactagcc tcgtttttgc 6900 atcaggaaag cagctatgaa ccactcctta aaaccctgga acacatttgg cattgatcat 6960 aatgctcagc acattgtatg tgccgaagac gaacaacaat tactcaatgc ctggcagtat 7020 gcaaccgcag aaggacaacc cgttcttatt ctgggtgaag gaagtaatgt actttttctg 7080 gaggactatc gcggcacggt gatcatcaac cggatcaaag gtatcgaaat tcatgatgaa 7140 cctgatgcgt ggtatttaca tgtaggagcc ggagaaaact ggcatcgtct ggtaaaatac 7200 actttgcagg aaggtatgcc tggtctggaa aatctggcat taattcctgg ttgtgtcggc 7260 tcatcaccta tccagaatat tggtgcttat ggcgtagaat tacagcgagt ttgcgcttat 7320 gttgattctg ttgaactggc gacaggcaag caagtgcgct taactgccaa agagtgccgt 7380 tttggctatc gcgacagtat ttttaaacat gaataccagg accgcttcgc tattgtagcc 7440 gtaggtctgc gtctgccaaa agagtggcaa cctgtactaa cgtatggtga cttaactcgt 7500 ctggatcc 7508 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> mRNA <222> (1)..(21) <223> sequence for lac operator <400> 3 aattgtgagc ggataacaat t 21 <210> 4 <211> 245 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter sequence for pFRPT, including FIS binding sites, UP element and rrnB P1 core promoter <400> 4 agatcgatct cgatcccgcg aaataaatgc tgaacaatta ttgcccgttt tacagcgtta 60 cggcttcgaa acgctcgaaa aactggcagt tttaggctga tttggttgaa tgttgcgcgg 120 tcagaaaatt attttaaatt tcctcttgtc aattaatcat ccggctcgta taatgcgcgg 180 aattgtgtga gcggataaca attcccacca tttaacttta agaaggagat atacatatga 240 aagaa 245 <210> 5 <211> 536 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> mRNA <222> (1)..(536) <223> E.coli factor-for-inversion stimulation protein (fis) gene, complete cds <300> <303> GenBank <308> J03816 <309> 1996-05-03 <400> 5 ggtaccgaat tgcacgtaaa cacgtttcct ggtatctcca ggaacacgct ccaaatgacc 60 agtttcggcg cacattcaac gccattgagg atgccagcga acagctggag gcgttggagg 120 catacttcga aaattttgcg taaacagaaa taaagagctg acagaactat gttcgaacaa 180 cgcgtaaatt ctgacgtact gaccgtttct accgttaact ctcaggatca ggtaacccaa 240 aaacccctgc gtgactcggt taaacaggca ctgaagaact attttgctca actgaatggt 300 caggatgtga atgacctcta tgagctggta ctggctgaag tagaacagcc cctgttggac 360 atggtgatgc aatacacccg tggtaaccag acccgtgctg cgctgatgat gggcatcaac 420 cgtggtacgc tgcgtaaaaa attgaaaaaa tacggcatga actaattcag gttagctaaa 480 tgcttgatta aaaaggcgct actcggcatg gggaagcgcc ttttttatag gtgtca 536 <210> 6 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rrn 1 oligomer : 1st oligomer for obtaining the sequence of FIS binding sites, UP element, rrnB P1 core promoter, and lac operator <400> 6 atcgatctcg atcccgcgaa ataaatgctg aacaattatt gcccgtttta 50 <210> 7 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rrn 2 oligomer : 2nd oligomer for obtaining the sequence of FIS binding sites, UP element, rrnB P1 core promoter, and lac operator <400> 7 gccagttttt cgagcgtttc gaagccgtaa cgctgtaaaa cgggcaataa 50 <210> 8 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rrn 3 oligomer : 3rd oligomer for obtaining the sequence of FIS binding sites, UP element, rrnB P1 core promoter, and lac operator <400> 8 gctcgaaaaa ctggcagttt taggctgatt tggttgaatg ttgcgcggtc 50 <210> 9 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rrn 4 oligomer : 4th oligomer for obtaining the sequence of FIS binding sites, UP element, rrnB P1 core promoter, and lac operator <400> 9 attaattgac aagaggaaat ttaaaataat tttctgaccg cgcaacattc 50 <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rrn 5 oligomer : 5th oligomer for obtaining the sequence of FIS binding sites, UP element, rrnB P1 core promoter, and lac operator <400> 10 ctcttgtcaa ttaatcatcc ggctcgtata atgcgcggaa ttgtgtgagc 50 <210> 11 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rrn 6 oligomer : 6th oligomer for obtaining the sequence of FIS binding sites, UP element, rrnB P1 core promoter, and lac operator <400> 11 tatgtatatc tccttcttaa agttaaatgg tgggaattgt tatccgctca cacaattccg 60 60 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rrn Cla1 primer : forward primer for amplifying the sequence of FIS binding sites, UP element, rrnB P1 core promoter, and lac operator <400> 12 agatcgatct cgatcccgcg aa 22 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rrn Nde1 primer : reverse primer for amplifying the sequence of FIS binding sites, UP element, rrnB P1 core promoter, and lac operator <400> 13 ttctttcata tgtatatctc cttcttaaag 30 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying FIS gene <400> 14 ttcaagctta gttcatgccg tattttttca a 31 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying FIS gene <400> 15 ggaattcatg ttcgaacaac gcgtaaatt 29 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplifying tac promoter sequence <400> 16 ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatc 29 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying human growth hormone gene <400> 17 ttttcatatg ttcccaacca ttccct 26 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying human growth hormone gene <400> 18 gcggtaccct agaagccaca gctgcc 26 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying pFRPT sequence excluding rrnB P1 core promoter <400> 19 gaggaaattt aaaataattt tctga 25 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying pFRPT sequence excluding rrnB P1 core promoter <400> 20 gcgcggaatt gtgtgagcgg ataaca 26 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying tac core promoter <400> 21 ttgacaatta atcatcggct cgtataatg 29 <210> 22 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying tac core promoter <400> 22 cattatacga gccgatgatt aattgtcaa 29

Claims (16)

1. 5'쪽으로부터 FIS(factor for inversion stimulation) 결합 부위, 업 엘레멘트, 코어 프로모터, 작동인자를 순차적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
2. 제1항에 있어서, 상기 코어 프로모터는 rrnB P1 코어 프로모터이고, 작동인자는 lac 작동인자인 발현벡터.
3. 제2항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 2에 기재된 발현벡터 pERP인 발현벡터.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현벡터는 다중 클로닝 부위의 3'쪽에 전사종결인자를 추가로 포함하는 것인 발현벡터.
5. 제4항에 있어서, 상기 전사종결인자는 T1 종결인자 및 T2 종결인자인 발현벡터.
6. 제5항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 3에 기재된 발현벡터 pERPT인 발현벡터.
7. 제4항에 있어서, 상기 발현벡터에 FIS 단백질의 유도성 발현 체계를 추가로 포함하는 발현벡터.
8. 제7항에 있어서, 상기 발현벡터에서 전사종결인자는 T1 종결인자 및 T2 종결인자이고, 유도성 발현 체계는 tac 프로모터 및 FIS 유전자로 이루어진 것임을 특징으로 하는 발현벡터.
9. 제8항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 4에 기재된 발현벡터 pFRPT인 발현벡터.
10. 제9항에 있어서, 상기 발현벡터는 기탁번호 KCCM 10320으로 기탁되어 있는 pFRPT인 발현 벡터.
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 발현 벡터를 도입시킨 대장균.
15. 삭제
16. 1) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 발현벡터에 목적유전자를 삽입하는 제1단계, 2) 상기 제1단계에서 제조된 목적유전자가 삽입된 발현벡터를 대장균에 도입하는 제2단계, 3) 상기 제2단계의 발현벡터가 도입된 대장균을 단백질 발현을 유도하면서 배양하는 제3단계를 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 목적 단백질의 발현을 증가시키는 방법.