CN101018558A - 来自圭亚那苦油楝的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物组合物，其基于由圭亚那苦油楝的种子提取的油和/或基于从该油中分离出来并担负其生物活性的化合物，四降三萜类化合物，具有如下的药理学活性：抗变应性、抗炎、止痛和免疫调节，降低了副作用，并且具有较低的成本。本发明的这些药物组合物是用于通过口服或局部使用来治疗、预防或抑制人的变应性和炎性疾病。在每种情况中，该化合物可以是液体或固体的形式。局部使用的本发明的化合物是非毒性的或只具有较低的毒性，特别是以半固体形式(乳膏)提供。除了对变应源或感染源的不同炎症反应具有作用外，本发明的药物组合物还为皮肤和呼吸系统的变应性疾病提供了重要的可替代疗法。因此，这些组合物也可以用于对症治疗风湿性、炎性和变性过程、数种的创伤、疼痛和手术后炎症、急性疼痛综合征等等，它可以口服或局部施用。

Description

来自圭亚那苦油楝的药物组合物
本发明涉及药物组合物，其基于由圭亚那苦油楝(CarapaGuianensis Aublet)的种子提取的油和/或基于从该油中分离出来并担负其生物活性的化合物，四降三萜类化合物(tetranortriterpenoids)。本发明的药物组合物具有如下的药理学活性：抗变应性、抗炎、止痛和免疫调节，所述的化合物基本上降低了副作用的发生，并且具有较低的生产成本。
本发明的药物组合物是用于通过口服或局部使用来治疗，或预防，或抑制人的变应性和炎性疾病。在每种情况中，该化合物可以是液体或固体的形式。局部使用的化合物也可以是半固体的形式。局部使用的本发明的化合物是非毒性的或只具有较低的毒性，特别是以半固体形式(乳膏)提供。
除了对变应源或感染源的不同炎症反应具有作用外，本发明的药物组合物还为皮肤和呼吸系统的变应性疾病提供了重要的可替代疗法。
因此，这些化合物也可以用于对症治疗风湿性炎性和变性过程、数种的创伤、疼痛和手术后炎症、急性疼痛综合征等等，它们可以口服或局部施用。
发明背景
全世界人口的约25-30％都存在不同种类的变态反应，也就是说，在这个行星上有18亿人是抗变态反应药物的潜在使用者。最常见的变态反应是呼吸系统、食物和皮肤的变态反应。
在变态反应过程中，会释放以组胺为主要特征的血管活性胺，这是因为它是抗变态反应药物的一个治疗靶点。这些药物主要是抗组胺药，即，对组胺的H1受体的拮抗作用能够抑制它们的作用并预防变应性应答的症状。第一代抗变态反应药物在60年代发展出来，当前在药品市场上已经销售了约1.657兆个抗变态反应药品单位。
非甾体类抗炎药(AINES)占据了巴西药品工业中第四大的市场。这些在市场上存在的抗炎药存在数种副作用，其中最严重的是胃溃疡、出血和超敏反应。除此以外，它们都由国际药物企业(InternationalPharmaceutical Industry)开发并注册，而这对于发展中国家，例如巴西的人口来说价格是比较高的。因此，寻求除了价格较低以外，副作用还降低的新的抗炎药物是非常有意义的。
另一方面，由于人们认可植物物种是具有治疗活性的化合物的来源，因此它们对于这种情况也是可选择的。
在美国，在1983到1994年间批准了520种新药，其中39％是植物的天然产物或来源于从植物中提取的物质的产物。近年来，世界市场每年向植物治疗药物的生产投资达600亿美元。
世界卫生组织(OMS)也已经开始开展一项计划来鼓励使用经科学验证的药用植物。相关的数据支持了对传统医学进行鼓励的重要性，因为约三分之一的发展中国家人口没有基本药物，导致这些国家例如中国、朝鲜、韩国和越南整合传统医药来作为它们卫生系统的补充。
近来(巴西专利申请PI0108940-2001年2月23日提交)，已知了基于产品Aller-7TM的植物的抗变态反应组合物(www.InterHealthUSA.com)，这受到专利US 6.730.332的保护。它是一种基于植物的具有协同作用的抗变态反应化合物，含下列的提取物：诃子(Terminalia chebula)果实(15-0％w/w)；毛和子(Terminaliabellerica)(15-50％w/w)；阔荚合欢(Albizia lebbeck)皮(0.5-50％w/w)；Emblica officinalis果实(15-50％w/w)。它也可以包含下列的提取物：荜拔(Piperlongum)果实(0.1-5％w/w)；胡椒(Piper nigrum)果实(0.1-5％w/w)；姜(Zingiber officinale)根(0.1-5％w/w)。
根据关于产品  Aller-7TM的专利资料和信息(www.arrowroot.com/aller-7.asp)所述，在印度草药医学中已知这些植物是用于治疗变应性疾病的。
巴西专利申请PI0108940的协同性组合物的目的特别是治疗鼻炎和哮喘。它通过肥大细胞的稳定，即通过阻止会引起变应性表现的组胺的释放来发挥作用，具有如下的特征：
-强烈的抗变应活性，其不仅缓解特别是变应性鼻炎、变应性哮喘和变应性支气管炎，而且也帮助校正继发的免疫性疾病；
-控制变应性表现例如喷嚏，鼻窒息，含泪眼，咽喉、眼和鼻瘙痒、喧噪呼吸和气喘。
-与其它的抗变态反应药物相反，它不会导致瞌睡或免疫分离。它也可以作为抗炎剂发挥作用。
但是，包含该协同性抗变应化合物的植物，除了已知可以治疗变应性疾病外，在出版物Wealth of Asia中也有它们的植物学描述，因此它们是该地区的植物。当我们要进行本地化生产时，这个事实就构成了一个限制性的因素。另一方面，该专利的协同性组合物具有解痉挛的活性，但它没有止痛的活性。
考虑到巴西具有地球植物物种多样性的35％，因此，它能为用于抗变应性和抗炎性过程的现代治疗剂的开发提供决定性的贡献。除此以外，植物治疗药物或植物药的发展对稳定国家的原材料价格有很大的作用，具有社会和环境的影响。
因此，为了克服上述的现有抗变态反应和抗炎症药物的困难，本发明的目的是提供基于天然植物的新的和重要的可替代治疗剂，其具有现有技术的优点或具有更大的优点。该可替代的治疗剂是口服或局部使用的圭亚那苦油楝的植物治疗性产品。
圭亚那苦油楝是一种楝科的亚马逊河物种，通常称作苦油树(andiroba)，是雨林的典型林木，它可以是野生的，也可以是种植的。在巴西，该物种存在于托坎廷斯州，贯穿Solim
Figure A20058003019700051
es河直至大西洋海岸，被居民们以及居住在亚马逊森林附近的其他南美洲国家的居民广泛地使用。
由于其愈合和杀菌的性质，该植物物种通常用作防护剂，杀虫剂，退热药，驱虫剂，对抗皮炎、损伤和痤疮。它的皮和叶子用于治疗炎性反应例如风湿病、关节炎和疼痛，以及对抗上呼吸道感染例如肺炎，也可用于咳嗽和感冒。皮用于制备对抗发热的茶，也可以用作驱虫剂。转变成粉末后，它可以治疗伤口，对皮肤病、皮炎、继发性皮肤损伤、溃疡、表皮脱落、痤疮具有愈合效果，它也具有退热的性质。叶子具有如下的性质：抗腹泻、驱虫、滋补、在对抗疟疾时替代奎宁，此外在对抗湿疹、疹和其他皮肤疾病中也是非常有用的(Pio Correa)。
已知圭亚那苦油楝或其提取物，与或不与一种或多种植物物种联合，在外用的药物组合物中可以施用于：
1 )膜，例如皮肤、口腔、毛发等等，来预防或有效改善由于环境压力或年龄导致的身体中这些部分的功能的活力缺失(专利申请JP2001-151634)
2)头皮，来活化头发根部的黑色素细胞并刺激黑色素的产生(专利中请JP2002-020243)。
苦油树的种子提供了通常用作防护剂和杀虫剂的浅黄色的油。多年来，印第安人使用这些油和载体来用于bixa油漆和作为吸血昆虫的驱虫剂，表明它在局部应用中的毒性较低。在家庭医疗中，圭亚那苦油楝的油被大量地用于擦在疼痛的组织、肿瘤和肌肉损伤处。其特征在于如下的治疗性质：愈合，利尿，驱虫，对于湿疹非常有用，催泻，抗风湿，对抗慢性溃疡，对抗昆虫叮咬、破伤风、肝炎，对抗皮肤病，它给伤口消毒并对抗丹毒的肿胀(Pio Correa-Dicionáriodas plantas úteis do Brasil)。
这种民族性药物的用途也包括治疗疟疾、麻风病和肺炎。
苦油树的油也可以用于化妆品组合物(洗发剂、调节和增湿霜，分别参见专利申请BR PI9301949，BR PI9302004和BR PI9302006)。
从苦油树的种子的核中获得的液体的提取物传统上根据其抗炎性质用于对抗风湿性疼痛和肌肉疼痛，例如专利US 5,958,421，相关的药物或化妆品化合物用于皮肤上，并使用所涉及的提取物来调节与蜂窝织炎有关的机制。
因此，我们观察到，直到目前，苦油树是外用的，主要利用的是它的抗炎作用。
另一方面，专利US 4,603,137描述了一种从印度发现和与苦油树同科(楝科)的植物中分离的物质，其具有抗炎、止痛和免疫调节性质(第2栏，49-53行)，特别是免疫抑制性质。这些生物碱类物质，cromone，是从植物红果 木(Dysoxylum binectariferum)的数个部分中特别分离出来的(例如：来自树干的叶子、枝、皮和木材，和来自根部的皮和木材)，它尤其可以用于：
-治疗对免疫系统存在不希望的应答的患者，自身免疫性疾病的情况下，通常是由抗体和由生物体的变应性或超变应性疾病导致的，在慢性炎症应答的情况下，主要是由巨噬细胞和粒细胞引起的。
-作为免疫抑制剂用于器官移植或预防排斥反应，淋巴细胞和巨噬细胞在该预防中发挥重要的作用。
因此，各自的药物化合物也是不同的。
尽管该植物具有与苦油树的科(楝科)相同的来源，但是该专利(生物碱cromone)的药理学活性原理与本发明(苦油树的油和/或从该油中分离并担负其生物活性的化学物质，四降三萜类)不同，因为这些原理是由不同的物种获得的。因此，各自的药物化合物也是不同的。
本发明的化合物具有如下的药理学活性：抗变应性、抗炎、止痛、免疫调节并且副作用降低。除了可以作为皮肤和呼吸系统的变应性疾病的重要的可替代治疗剂，它也可以在变应源的不同炎性反应和在感染源的炎性反应中发挥作用。因此，本发明的化合物也可以用于对症治疗风湿性、炎性和变性过程、数种的创伤、疼痛和手术后炎症、急性疼痛综合征等等，它们具有口服或局部施用的可能性。
发明简述
本发明的目的是提供一种药物组合物，其特征在于包括药学有效量的从圭亚那苦油楝的种子中提取的油和/或四降三萜类化合物作为活性成分，其中四降三萜类化合物是从该油中分离并担负其生物活性的化合物，和载体和/或药学可接受的添加物，其具有抗变应性、抗炎、止痛和免疫调节活性，极大地降低了副作用并具有较低的生产成本，因为它们来自于全国性的原料。
本发明提供了这种用于口服和局部使用的药物组合物，在每种情况中，该组合物都可以是液体或固体的形式。而且局部使用的组合物也可以是半固体的形式。
局部使用的本发明的药物组合物是无毒性的，或低毒性的，其是由从圭亚那苦油楝的种子中提取的油和/或四降三萜类化合物制成的，其中四降三萜类化合物是从该油中分离并担负其生物活性的化合物，该药物组合物具有抗变应性、抗炎、止痛和免疫调节活性，其特别是以半固体的形式(乳膏)提供的。
本发明的另一个实施方案是该组合物作为抗变应性、抗炎、止痛和免疫调节药物的应用，其中该组合物是基于从圭亚那苦油楝的种子中提取的油和/或四降三萜类化合物，其中四降三萜类化合物是从该油中分离并担负其生物活性的化合物。
本发明的另一个实施方案是治疗、预防或抑制变应性疾病和炎症过程的方法，包括给需要所述治疗、预防或抑制的人施用治疗有效量的先前所述的组合物。
因此，本发明的药物组合物代表了用于皮肤和呼吸系统变应性疾病的一种重要的可替代治疗剂。
本发明的另一个重要特征是下列的事实：其不仅在变应源的不同炎性反应中，而且也在感染源的炎性反应中发挥作用。因此，这些组合物也可以用于对症治疗风湿性、炎性和变性过程、数种的创伤、疼痛和手术后炎症、急性疼痛综合征等等，它们可以口服或以局部的形式来施用。
附图简述
附图1-该附图显示的是用圭亚那苦油楝的油预治疗(1小时，经口服)小鼠脚爪的变应性水肿的结果。
附图2-该附图显示的是用圭亚那苦油楝的油预治疗(1小时，经口服)小鼠由组胺诱导的脚爪水肿的结果。
附图3-所述附图涉及用圭亚那苦油楝的油对小鼠由组胺诱导的耳部水肿的预治疗(1小时，经口服)结果。
附图4-该附图显示的是用圭亚那苦油楝的油对小鼠由组胺诱导的胸膜渗出的预治疗(1小时，经口服)结果。
附图5-所述附图涉及用圭亚那苦油楝的油对大鼠在组胺刺激后的胸膜渗出的预治疗(1小时，经口服)结果。
附图6-该附图涉及用从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物对小鼠脚爪的变应性水肿的预治疗(1小时，经口服)结果。
附图7-该附图显示的是用从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物对小鼠变应性胸膜炎中细胞动员的预治疗(1小时，经口服)结果。
附图8-该附图显示的是用从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物对小鼠(A)和大鼠(B)由组胺诱导的脚爪水肿的预治疗(1小时，经口服)结果。
附图9-所述附图显示的是用从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物对小鼠由组胺诱导的耳部水肿的预治疗(1小时，经口服)结果。
附图10-该附图涉及用从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物对小鼠由组胺诱导的胸膜渗出的预治疗(1小时，经口服)结果。
附图11-该附图显示的是用基于圭亚那苦油楝的油和从相同的油中分离的四降三萜类化合物的软膏制剂对小鼠(A)和大鼠(B)脚爪的变应性水肿的局部预治疗结果。
附图12-该附图涉及用基于圭亚那苦油楝的油和从相同的油中分离的四降三萜类化合物的软膏制剂对小鼠(A)和大鼠(B)由组胺诱导的脚爪水肿的局部预治疗结果。
附图13-该附图显示的是用圭亚那苦油楝的油对小鼠由角叉菜胶诱导的脚爪水肿的预治疗(1小时，经口服)结果。
附图14-所述附图显示的是用圭亚那苦油楝的油对小鼠由酵母聚糖(zimosan)诱导的脚爪水肿的预治疗(1小时，经口服)结果。
附图15-该附图涉及用圭亚那苦油楝的油对小鼠由角叉菜胶诱导的胸膜渗出和细胞动员性胸膜炎的预治疗(1小时，经口服)结果。
附图16-该附图显示的是用从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物对小鼠由血小板活化因子(PAF)诱导的脚爪水肿的预治疗(1小时，经口服)结果。
附图17-所述附图显示的是用从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物对大鼠由缓激肽诱导的脚爪水肿的预治疗(1小时，经口服)结果。
附图18-该附图显示的是用圭亚那苦油楝的油对先前致敏的大鼠由卵白蛋白诱导的痛觉过敏的预治疗(1小时，经口服)结果。
附图19-该附图显示的是用圭亚那苦油楝的油对大鼠由组胺诱导的痛觉过敏的预治疗(1小时，经口服)结果。
附图20-该附图显示的是用圭亚那苦油楝的油对大鼠由角叉菜胶诱导的痛觉过敏的预治疗(1小时，经口服)结果。
附图21-该附图显示的是从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物对大鼠由组胺诱导的痛觉过敏的预治疗(1小时，经口服)结果。
附图22-该附图显示的是用从圭亚那苦油楝中分离的四降三萜类化合物治疗对鼠巨噬细胞产生一氧化氮的抑制效果。
附图23-该附图显示的是用从圭亚那苦油楝中分离的四降三萜类化合物治疗对鼠脾细胞产生干扰素-γ的抑制。
附图24-该附图显示的是用从圭亚那苦油楝中分离的四降三萜类化合物治疗对鼠巨噬细胞产生TNF-α的效果。
附图25-所述附图显示的是用从圭亚那苦油楝中分离的四降三萜类化合物治疗鼠淋巴细胞增殖的结果。
附图26-该附图显示的是用从圭亚那苦油楝中分离的四降三萜类化合物治疗对鼠巨噬细胞吞噬酵母聚糖的抑制结果。
附图27-所涉及的附图显示的是口服四降三萜类化合物对C57/Bl10小鼠的胃粘膜的效果。该结果用平均损害指数(M.I.L.)来表示。
发明详述
民间药学资料说明了圭亚那苦油楝的油在不同治疗目的中的应用，如上所述，包括外部应用，例如抗炎。
但是，到目前为止，并没有描述本发明的组合物，其基于从圭亚那苦油楝的种子中提取的油和/或四降三萜类化合物，其中四降三萜类化合物是从该油中分离并担负其生物活性的化合物，和载体和/或药学可接受的添加物，其具有抗变应性、抗炎、止痛和免疫调节活性，降低了副作用并具有较低的成本，因为它们来自于全国性的原料。
本发明的药物组合物的目的是通过口服或局部使用来治疗、预防或抑制人的变应性和炎性疾病。在每种情况中，该组合物可以是液体或固体的形式。局部使用的组合物也可以是半固体的形式。本发明的局部使用的药物组合物是无毒性的或低毒性的。
本发明的药物组合物的抗变应性和抗炎性活性是由于它具有抗水肿活性。
需要注意的是，在本发明中，当口服时，显示了从圭亚那苦油楝的种子中提取的油以及四降三萜类化合物的抗水肿活性。等同地，通过局部应用，使用圭亚那苦油楝的油和/或四降三萜类化合物的制剂也能抑制变应性水肿。本发明局部使用的组合物是无毒性的，或存在较低的毒性，其特别是以半固体的形式(乳膏)提供的。
在本发明中，关于基于从圭亚那苦油楝的种子中提取的油和/或四降三萜类化合物的药物组合物，其中四降三萜类化合物是从该油中分离并担负其生物活性的化合物，其抗变应活性的特征在于这些化合物作为抗组胺药、缓激肽的拮抗剂和血小板聚集因子的拮抗剂、与炎性应答有关的介质的活性，该活性可以在体内的生物测定中观察到。
当面对促炎症反应刺激物时，来源于圭亚那苦油楝的油的本发明的药物组合物发挥抑制细胞动员、淋巴细胞增殖、吞噬作用和蛋白质溢出的作用。
本发明的药物组合物的免疫调节活性和抗炎活性的特征也在于四降三萜类化合物对γ-干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)、一氧化氮产生的抑制活性，它的免疫调节活性的特征也在于抑制T淋巴细胞的诱导性增殖和抑制鼠巨噬细胞的吞噬作用。显而易见地，从圭亚那苦油楝种子提取的油(从中分离四降三萜类)也拥有这种活性。
通过从圭亚那苦油楝种子提取的油和四降三萜类化合物的抑制作用，本发明的药物组合物对痛觉过敏也具有止痛活性。
此外，已经证明本发明的组合物降低了副作用。
除了作为皮肤变应性疾病(例如：荨麻疹)和呼吸系统变应性疾病的重要的可替代治疗剂外，本发明的药物组合物可以在变应源的不同炎症应答或者感染源的炎症应答中发挥作用。因此，这些组合物也用于对症治疗风湿性过程和变性过程，数种的创伤、疼痛和手术后炎症、急性疼痛综合征等等，它可以口服或局部施用。
四降三萜类化合物是已知的。它们是三萜类化合物，其丢失了4个碳原子(C-24，C-25，C-26和C-27)，在呋喃环中转变成为碳C-20，C-21，C-22和C-23。在分子的这些混合物中，包括下列分子：6α-乙酰氧葛杜宁，7-脱乙酰氧基-7-氧葛杜宁，andirobin，甲基angolensate，葛杜宁(gedunin)和6α-乙酰氧基环氧楝树二酮。
由于由所述化合物的混合物组成的四降三萜类化合物，如先前所知表现出抗变应性，抗炎、止痛和免疫调节活性，我们可以认为它们的各组分也存在相同的性质。
对于口服，本发明的药物组合物可以作为粉末、片剂、药丸、胶囊或作为乳剂、溶液或混悬液存在。在该情况下，非活性组分包括赋形剂、结合剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂等。
固体组合物包含混合在一起的活性成分与适用于片剂生产的非毒性赋形剂，例如酰胺、乳糖、某些种类的碳酸盐和碳酸氢盐、磷酸盐、滑石等。片剂可以包衣或不包衣，这取决于可能发生药物崩解和吸收的胃肠道。
当是混悬液、糖浆或液体溶液时，包含赋形剂例如甲基纤维素、海藻酸钠、阿拉伯胶、卵磷脂等，以及一种或多种添加剂例如防腐剂、着色剂、芳香剂、增稠剂、多元醇、蔗糖、葡萄糖等。
局部使用的本发明的药物组合物可以是乳膏、软膏、洗剂、凝胶、溶液或混悬液的形式。非活性组分是在该情况中通常使用的那些。
下面通过实施例对本发明进行详细的描述。必须要注意的是，本发明并不仅限于这些实施例，它也包括在其有效限度内的变更和改变。
实施例1：
提取物的制备
(a)圭亚那苦油楝的油
本发明使用的圭亚那苦油楝的油是由种子的机械压榨而得到的。当用于实验时，在40℃加热等份的油，直至它们完全熔化，并在无菌盐水溶液和吐温20中以1μL吐温/mg总质量的比例稀释。当制备治疗性溶液时，需要加热该油。为了保证产品的化学稳定性，将每等份的油都在40℃加热至少2次。
(b)四降三萜类化合物
本发明的四降三萜类化合物可以从苦油树的油或从苦油树的种子的渣中获得。在每种情况中使用的方法都是常规方法。
用乙腈提取苦油树的油，分为三个步骤—浓缩(minimum)，搅拌并倾倒，收集上清液。过滤上清液并在旋转蒸发器中蒸发。
在用杀虫剂级的己烷以每天8小时来提取苦油树的种子的渣约5天后，放置该物质以使固体物质沉积。然后进行过滤，将固体物质置于chantry中干燥。然后压紧(strain)并干燥。
将四降三萜类化合物以1μL吐温/mg总质量的比例溶解于无菌盐水溶液和吐温20中。
制备溶液用于按照12.5；25；50；100和200mg/Kg的剂量以200μL(用于小鼠)或400μL(用于大鼠)的体积使用。
实施例2：
溶液、药物和制剂的制备
在该实验中使用的溶液、药物和制剂是如下所述制备的。
(a)药物的制备
浸泡片剂(Aventis)中的异丙嗪的氯化物，称重并溶解于在使用前立即制备的0.9％NaCl的无菌溶液中。取赛庚啶(Sigma)溶解于水中。稀释安乃近并将双氯酚酸溶解于新鲜水中(0.22μm)。取地塞米松(Sigma)、WEB 2170(Boehringer-Ingelheim)和HOE 140(Sigma)溶解于无菌的NaCl(0.9％)溶液中。将异丙嗪乳膏(Rhodia Farma)直接涂敷于动物的脚爪上。
所有药物都是在使用前立即制备。
(b)溶液的制备
盐水
NaCl              0.9g
蒸馏水(适量至)    100.00mL
调节pH至7.2-7.4
肝素化的盐水
盐水          100.00mL
肝素          2,000UI
调节pH至7.2-7.4
磷酸盐缓冲液(PBS)
NaH2PO4.H2O      0.256g
Na2HPO4.12H2O    3.004g
NaCl             8.766g
蒸馏水(适量至)   1000mL
调节pH至7.2-7.4
肝素化的PBS
PBS              1000mL
肝素             20,000UI
调节pH至7.2-7.4
PBS/吐温
Tween 20         50.0μL
PBS              100.0mL
May-Grǖnwald
May-Grǖnwald    0.2g
甲醇             100.0mL
混合上述各项，在60℃加热2小时，并在滤纸上过滤。
姬姆萨染料
姬姆萨染料    1.0g
甘油          60.0mL
甲醇    56.0mL
混合上述各项，在60℃加热2小时，并在滤纸上过滤。当作为溶液使用时，10倍稀释该溶液。
Tǖrk的液体
冰醋酸P.A.       2.0mL
结晶紫           5.0mg
蒸馏水(适量至)   100.00mL
RPMI/庆大霉素
RPMI             10.4g
庆大霉素         25mg
去离子水(适量至) 1.00L
Greiss的试剂
溶液A             溶液B
磺胺-1.0g        α-萘二胺(Naftiletilenodiamine)100.00mg
H3PO4-5.0mL      蒸馏水(适量至)                 100.0mL
蒸馏水(适量至)100.0mL
在使用时以相同的份数(1∶1)混合溶液A和B。
XIX-PBS/乳
PBS/乳Sigma          3.0g
蒸馏水(适量至)       100mL
ELISA的暴露溶液
OPD(二盐酸邻苯二胺)  5.0g
柠檬酸盐             121.5mg
过硼酸钠          30mg
蒸馏水(适量至)    10.0mL
2M的硫酸溶液
H2SO4P.A.         166.67mL
蒸馏水(适量至)    1000.0mL
(a)局部制剂的制备
下面描述了制剂中的各个组分及其百分比。这些制剂可以作为乳膏和洗剂存在。
圭亚那苦油楝的油 5到30％
四降三萜类化合物 0到5％
乳剂形式(醇和脂肪酸和硬脂酰乳酸钠) 0.5到6％
固体凡士林 0.2到2％
防腐剂 0.05到0.1％
增湿剂 2到20％
1.8桉油酚 0.1到10％
蒸馏水适量至 100％
油性组分(乳剂基质、增湿剂和防腐剂)在75℃下加热，并加热水性组分直至温度为80℃，直至它们全部溶解。然后，将一个相加至另一个相上，并在搅拌(2,000rpm)下均匀化，直至制剂完全冷却。
实施例3：
口服的圭亚那苦油楝的油和四降三萜类化合物的抗变应活性的体内测定方法。
对于下文描述的所有体内方法，使用Swiss雄性小鼠，重量为18到25g，和/或雄性Wistar大鼠，重量为200到300g。这些动物由Central Biotery of Fundac o Oswaldo Cruz提供，并保存在Laboratóriode Farmacologia Aplicada，Far-Manguinhos的biotery中直至使用时。动物可以自由获取水和动物食物，并置于25℃和12小时的光照和黑暗的交替循环中。在3天里用驱虫剂(甲苯达唑，20mg/1000mL水)处理该动物，在间隔3天后仅用于实验。所有的实验方法都是根据Fundagao Oswaldo Cruz，RJ的动物实验伦理学进行的。
a)脚爪水肿的实验
通过在一个后爪中进行刺激物(组胺、缓激肽和PAF-血小板活化因子)的脚掌内注射来刺激动物，对于小鼠或大鼠体积分别为50μL或100μL/爪。使用的剂量是：组胺100μg/爪，缓激肽10nmol/爪和PAF 1μg/爪(我们注意到，只有缓激肽是以50μL的体积注射的)。在该爪的反侧，注射相同体积的载体(不含热原的无菌盐水)。在刺激后30分钟或1小时，根据每只脚爪插入测量盘中而产生的液体(0.5gNaCl；3mL Extran 100％/1L)的排量，通过数字体积描记器分析水肿。每个分析进行3次。
b)脚爪变应性水肿的实验
该测定是在先前通过在背侧区域皮下注射(s.c.)200μL的混悬液而致敏的动物中完成的，其中该混悬液包含在不含热原的无菌盐水(200μL/动物)中稀释的50μg的卵白蛋白+5mg(Al(OH)3)。在致敏14天后，通过在一个后爪中脚掌内注射卵白蛋白(3μg/爪，最终体积是50μL)来诱导脚爪水肿。反侧的脚爪接受相同体积的载体(盐水溶液)的注射。根据测试脚爪插入测量盘中而产生的液体(0.5g NaCl；3mL Extran 100％/1L)的排量，通过数字体积描记器分析水肿。每个分析进行3次。
c)耳部水肿的实验
在刺激前24小时，在麻醉的小鼠(戊巴比妥40mg/kg，经静脉，i.v.)中通过在眼眶血管丛中静脉注射(i.v.)伊文思蓝1％(25mg/Kg)来诱导耳部水肿。用玻璃注射器和直径30 1/2G的针头在耳朝上的一面上真皮内注射(i.d.)组胺(10μg/部位，共25μL)来刺激这些动物。在与接受刺激的耳相对的另一只耳上注射相同体积的载体(不含热原的无菌盐水)。刺激后30分钟，在CO2室中处死该动物，除下它们的耳朵，置于甲酰胺(500μL/耳)中24小时以提取伊文思蓝。用分光光度计(SpectraMax)在λ600nm处分析上清液中伊文思蓝的浓度。通过比较标准曲线(从25.6到0.2μg/mL)的光密度(D.O.)来确定伊文思蓝的浓度。
d)胸膜炎实验
通过胸腔内注射(i.t)最终体积为100μL的组胺(100μg/腔)来诱导胸膜炎。对照组接受100μL的载体(无菌盐水)。在刺激1小时后，在CO2室中处死该动物，暴露它们的胸腔并用肝素化(20UI/mL)的磷酸缓冲液(PBS)洗涤。在自动吸管的帮助下，对小鼠和大鼠分别以1mL和3mL的体积来洗涤动物的胸腔。收集胸膜洗液，离心(740g，10分钟)除去细胞，以如下所述进行下面的蛋白质渗出的评价。在用小鼠进行的实验中，它们事前在眼眶血管丛上静脉注射了伊文思蓝1％(25mg/Kg)，通过伊文思蓝的溢出，用分光光度计在λ600nm处评价蛋白的渗出。通过比较洗液的光密度(D.O.)与伊文思蓝的标准曲线(从25.6到0.2μg/mL)来确定伊文思蓝的浓度。结果用μg/mL的伊文思蓝来表示。对于大鼠的分析，在分级注射器的帮助下通过测量从腔中收集的体积来评价胸膜洗液的渗出，通过Lowry的方法(Lowry等人，1951)在上清液中定量蛋白质来评价蛋白质的溢出。一份胸膜液用裂解红细胞的Tǖrk液体稀释40倍，利用Neubauer室进行胸膜洗液中总白细胞数的计数。在光学显微镜的油浸物镜的帮助下(100×)，通过May-Grǖnwald-Giemsa法经染色细胞的拭子获得单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的不同计数。结果用每个腔中细胞的数目(×106)来表示。
e)变应性胸膜炎的实验
该测定是在先前通过在背侧区域皮下注射(s.c.)200μL的混悬液而致敏的动物中完成的，其中该混悬液包含在不含热原的无菌盐水(200μL/动物)中稀释的50μg的卵白蛋白+5mg(Al(OH)3)。在致敏14天后，通过i.t注射最终体积为100μL的卵白蛋白(12.5μg/腔)来激发该动物。对照组动物接受相同体积的无菌盐水。在用卵白蛋白激发1小时后，暴露动物的胸腔，用肝素化(20UI/mL)的PBS 1mL(小鼠)或3mL(大鼠)洗涤。收集胸膜洗液用于评价蛋白质的渗出。
f)治疗
在刺激有意识的动物前1小时，进行油或四降三萜类化合物的口服(p.o.)治疗，先前保持12小时的禁食并可自由获得水。在具有球形末端的弯曲针头的帮助下施用治疗性的溶液，对于小鼠(25g)或大鼠(200g)体积分别是200μL或400μL。所使用的剂量是小鼠200或400mg/Kg，大鼠150或300mg/Kg。以12.5；25；50；100和200mg/Kg的剂量施用四降三萜类化合物。在药铲的帮助下用基于圭亚那苦油楝的油和/或四降三萜类化合物的制剂进行局部治疗，将已处理的脚爪固定5分钟，以吸收乳膏。在刺激前30分钟进行局部治疗。在刺激前1小时口服(p.o.)下列的抑制剂：异丙嗪(受体H1的竞争性拮抗剂；10，30或60mg/Kg)，赛庚啶(受体H2的血清素能拮抗剂；30mg/Kg)，WEB 2170(PAF的拮抗剂；16mg/Kg)，安乃近(抗炎和退热药；100mg/Kg)和双氯酚酸钾(环氧合酶-1和-2的抑制剂；100mg/Kg)。在刺激前24和1小时施用地塞米松(抗炎剂；2mg/Kg，p.o.)，在刺激前立即通过脚掌内注射进行HOE 140(缓激肽的拮抗剂；1μg/爪)的施用。
实施例4：
口服圭亚那苦油楝的油的抗变应活性的体内评价
对于圭亚那苦油楝的油的抗变应活性的评价，实验的剂量为小鼠200和400mg/Kg，大鼠150和300mg/Kg，这取决于实验的模型。在刺激前1小时口服(p.o.)治疗溶液。为了比较，我们使用抗组胺的异丙嗪的氯化物-一种H1受体的竞争性抑制剂作为参照抑制剂。结果用平均值和平均值的标准误差(AND.P.M.)表示，通过方差分析(ANOVA)来进行统计学分析，然后进行Newman-Kewls多重比较检验，或者T Student检验，显著性水平为小于或等于0.05(p≤0.05)。
附图1显示的是在脚爪的变应性水肿模型中，用100，200，300和400mg/Kg剂量的圭亚那苦油楝的油对小鼠预治疗的结果。每个柱显示的是至少7只动物的平均值±AND.P.M.。空白的柱对应的是接受了卵白蛋白脚掌内刺激的动物组。黑色的柱对应的是接受了异丙嗪口服预治疗的组(阳性对照)，影线的柱显示的是用不同剂量的油预治疗的动物。在用卵白蛋白刺激前14天，所有动物都用卵白蛋白致敏。星号表明根据T Student和Newman Keuls检验，该值与阳性对照组具有统计学差异(p≤0.05)。附图1表明，根据文献报道(Sampaio和合作者，1995)在小鼠中脚掌内注射卵白蛋白(3μg/爪)能够诱导脚爪的水肿。口服异丙嗪(30mg/Kg)治疗显著地抑制了该水肿。用剂量100，200，300和400mg/Kg的圭亚那苦油楝的油预治疗能够显著抑制卵白蛋白诱导的水肿，在这些剂量中并没有显示效果的不同。
实施例5：
口服圭亚那苦油楝的油的抗组胺活性的体内评价
在具有变应原应答的介质中，组胺具有重要的作用，其会导致血管渗透性增加、蛋白质溢出和水肿(Bilici等人)。因此，分析了圭亚那苦油楝的油的抗组胺活性。附图2显示的是在小鼠中圭亚那苦油楝的油对于通过组胺(100μg/爪)的脚掌内刺激诱导的脚爪水肿的口服预治疗结果。每个柱显示的是8只动物的平均值±AND.P.M.。黑色的柱对应的是用组胺刺激的组的平均值(阳性对照)。空白的柱对应的是先前用异丙嗪(10mg/Kg，p.o.)治疗的组的平均值，影线的柱对应的是用100，200，300和400mg/Kg剂量的圭亚那苦油楝的油预治疗的组。星号表明根据T Student和Newman Keuls检验，该值与阳性对照组具有统计学差异(p≤0.05)。附图2表明，以所有实验剂量的圭亚那苦油楝的油预治疗能够显著抑制组胺诱导的脚爪水肿，与参照抑制剂(异丙嗪)的强度相等。
然后在另一个实验模型—耳部水肿中评价圭亚那苦油楝的油的抗组胺效果。附图3显示的是在致敏动物中剂量为200和400mg/Kg的油对于组胺诱导的耳部水肿的口服预治疗结果。每个柱显示的是7只动物的平均值±AND.P.M.。星号表明该值与盐水组(阴性对照)具有统计学差异，+号表明与组胺刺激的组(阳性对照组)的差异(p≤0.05)，均是根据T Student和Newman Keuls检验。附图3表明，注射组胺能够诱导小鼠耳部的蛋白质溢出(第二个柱)，口服异丙嗪(10mg/Kg，p.o.)预治疗能显著抑制组胺诱导的水肿(第三个柱)。相等地，用2种剂量的圭亚那苦油楝的油(200和400mg/Kg，p.o.)预治疗能够在30分钟的时间里显著抑制注射组胺导致的水肿，与参照抑制剂的强度相等。
通过胸膜炎模型(da Cunha和col，2001；Calheiros和合作者，2001)也能评价圭亚那苦油楝的油的抗组胺活性。附图4显示的是在Swiss小鼠中口服剂量为200和400mg/Kg的油对于组胺诱导的胸膜炎的蛋白质渗出的预治疗结果。每个柱显示的是8只动物的平均值±AND.P.M.。星号表明该值与接受胸腔内注射盐水组(阴性对照)具有统计学差异，+号表明该值与组胺刺激的组(阳性对照组)的差异(p≤0.05)，均是根据T Student和Newman Keuls检验。附图4表明注射组胺(100μg/腔)由于小鼠的胸膜活性能诱导蛋白质渗出(第二个柱)，与阴性对照组具有显著的差异。用异丙嗪(30mg/Kg，p.o.)口服预治疗(第三个柱)能够显著抑制组胺诱导的蛋白质溢出。相等地，用2种剂量的圭亚那苦油楝的油(200和400mg/Kg，p.o.)预治疗能够显著抑制注射组胺诱导的胸膜渗出，与参照抑制剂的强度相等。
在相同的实验模型中使用Wistar大鼠，如附图5所示。在所述的该附图中，每个柱对应于至少8只动物的平均值±AND.P.M.。第一个柱对应于非刺激组(接收盐水注射)的平均值，另外的组是用组胺(100μg/腔)刺激。第二个柱对应的是未治疗的动物，第三个对应的是口服参照抑制剂(异丙嗪，30mg/Kg)治疗的动物。其他的柱对应的是接受口服200和400mg/Kg剂量的圭亚那苦油楝的油预治疗的组。星号表明该值与接受盐水胸腔内注射组(阴性对照)具有统计学差异，+号表明与组胺刺激组(阳性对照)的差异(p≤0.05)，均是根据T Student和Newman Keuls检验。该附图表明，注射组胺能诱导大鼠胸腔的蛋白质溢出(第二个柱)，这与阴性对照组显著地不同。用2种剂量的圭亚那苦油楝的油(200和400mg/Kg，p.o.)口服预治疗能显著抑制组胺诱导的蛋白质溢出，与异丙嗪(30mg/Kg，p.o.)强度相同。
实施例6：
口服从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物的抗变应活性的体内评价。
通过Swiss小鼠的爪的水肿评价四降三萜类化合物的抗变应活性(附图6)。在附图6中，每个柱显示的是至少8只动物的平均值±AND.P.M.。所呈现的结果表明，在致敏的小鼠中通过注射卵白蛋白(3μg/爪)诱导了水肿(第一个柱)，口服异丙嗪(30mg/Kg，第二个柱)预治疗抑制了水肿。其他的柱对应于用四降三萜类化合物口服预治疗的组，表明50、100和200mg/Kg的剂量能够抑制变应性水肿，但是12.5和25mg/Kg的剂量则不能。星号表明根据Student NewmanKeuls多重比较检验，刺激组和非治疗组的统计学显著性差异(p≤0.05)。
也可以通过变应性胸膜炎模型(Penido和合作者，2001，Sampaio和合作者，2000)评价四降三萜类化合物的抗变应活性。附图7显示的是24小时里在Swiss小鼠中25，50，100和200mg/Kg剂量的四降三萜类化合物对于卵白蛋白诱导的胸膜炎的口服预治疗结果。每个柱显示的是至少8只动物的平均值±AND.P.M.。星号表明该值与接受盐水胸腔内注射的组(阴性对照)具有统计学差异，+号表明与卵白蛋白刺激的组(阳性对照)的差异(p≤0.05)，均是根据T Student和Newman Keuls检验。该附图表明，注射卵白蛋白(12μg/腔)能诱导小鼠胸腔的蛋白质溢出(第二个柱)，这与阴性对照组有显著性差异。地塞米松是抗炎剂，2mg/Kg(30mg/Kg，p.o.)的剂量(第三个柱)能显著抑制卵白蛋白诱导的细胞蓄积。相等地，用三种剂量的四降三萜类化合物(50，100和200mg/Kg，p.o.)预治疗能显著抑制卵白蛋白诱导的总白细胞的蓄积，这是由于对于胸腔的嗜酸性粒细胞的动员具有抑制作用，其与参照抑制剂的强度相等。
实施例7：
口服从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物的抗组胺活性的体内评价。
然后通过脚爪水肿、耳部水肿和胸膜炎的模型来评价四降三萜类化合物的抗组胺活性。附图8涉及在小鼠(a，12.5；25；50；100和200mg/Kg)和大鼠(b，12.5；25；50和100mg/Kg)中用四降三萜类化合物对组胺诱导的脚爪水肿口服预治疗的结果。在小鼠的实验中使用抗组胺的盐酸异丙嗪作为参照抑制剂，通过比较作为阳性对照。在大鼠的实验中，使用5-羟色胺(5-HT2)和组胺(H1)受体的拮抗剂赛庚啶。在附图8a中每个柱显示的是8只动物的平均值±AND.P.M.，而在附图8B中则是5只动物。空白的柱显示的是未接受治疗的用组胺刺激的动物的平均值(阳性对照)。黑色的柱对应于接受参照抑制剂(对于小鼠，异丙嗪，30mg/Kg；对于大鼠，赛庚啶，30mg/Kg)口服预治疗的用组胺刺激的组。影线的柱显示的是用组胺刺激并用不同剂量的四降三萜类化合物口服预治疗的动物组。星号显示的是相对于阳性对照组的统计学显著性差异(p≤0.05)。如前所述，该附图表明，用组胺脚掌内刺激能够在小鼠(Sampaio和合作者，1995)和大鼠(Henriques和合作者，1991)中诱导水肿，使用参照化合物抑制了这种现象。在小鼠中，试验的所有剂量的四降三萜类化合物能够显著抑制组胺诱导的脚爪水肿，而在大鼠中，只有大于12.5mg/Kg的剂量能够抑制这种反应。注意：附图8。
然后，利用小鼠的耳部水肿评价四降三萜类化合物的抗组胺活性(附图9)。在该附图中，每个柱显示的是7只动物的平均值±AND.P.M.。星号显示的是阴性对照组(注射盐水)和阳性对照组(注射组胺)之间的统计学差异(p≤0.05)。+表示相对于阳性对照组的统计学差异。该图表明，注射组胺能够在刺激后30分钟诱导小鼠的耳部血浆溢流(第二个柱)，显著不同于注射盐水的组的平均值(第一个柱)。用两种不同剂量的四降三萜类化合物(50和100mg/Kg)口服预治疗能抑制水肿的产生，其与使用参照抑制剂(异丙嗪，10mg/Kg，p.o.)的预治疗的强度相等。
附图10显示的是在小鼠的组胺诱导的胸膜炎模型中四降三萜类化合物的抗水肿作用。每个柱显示的是7只动物的平均值±AND.P.M.。星号表示阴性对照组(注射盐水)和阳性对照组(注射组胺)之间的统计学差异(p≤0.05)。+表示相对于阳性对照组的统计学差异。如该附图所示，与阴性对照组(第一个柱)相比，用组胺(100μg/腔)胸腔内刺激能在1小时里诱导胸膜的渗出(第二个柱)。其他的柱对应于用异丙嗪(30mg/Kg，第三个柱)或不同剂量的四降三萜类化合物(25，50，100和200mg/Kg，其他柱)口服预治疗并在治疗后1小时用组胺刺激的组的平均值。我们可以观测到，所有剂量的四降三萜类化合物能够抑制胸腔的血浆渗出，治疗组的平均值之间没有统计学差异。
实施例8：
局部施用的圭亚那苦油楝的油和从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物的乳膏制剂的抗变应活性的体内测定方法
通过Swiss小鼠和Wistar大鼠的脚爪变应性水肿的方法来分析局部使用的圭亚那苦油楝的油和从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物的乳膏制剂的抗变应活性。为此，应用本发明的特定制剂的局部治疗在动物的一个后爪中进行。重要的是需要注意，在研究中包括对照组，其接受“空白”(包含所有赋形剂，但不含有活性成分的制剂)。在药铲的帮助下涂敷乳膏，将后爪固定5分钟以吸收乳膏。局部治疗30分钟后，通过在先前致敏的小鼠中脚掌内注射卵白蛋白(3μg/爪)来进行刺激。水肿的分析在刺激后30分钟进行。
实施例9：
局部施用基于圭亚那苦油楝的油和从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物的乳膏制剂的抗变应活性的体内测定的评价
附图11涉及基于圭亚那苦油楝的油和从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物的乳膏制剂对于由卵白蛋白(3μg/爪)诱导的小鼠(A)或大鼠(B)的脚爪水肿的局部预治疗的结果。在两个实验中，在乳膏中使用异丙嗪作为参照抑制剂。每个柱显示的是每组7只动物的平均值±AND.P.M.。空白的柱显示的是未接受治疗的用卵白蛋白刺激的动物(阳性对照)的平均值。重要的是需要注意，用对照制剂(赋形剂)治疗不会诱导所治疗动物的脚爪体积发生任何变化。黑色的柱对应于用卵白蛋白刺激的组，其接受了异丙嗪乳膏的局部预治疗。影线的柱显示的是用卵白蛋白刺激并用基于圭亚那苦油楝的油和从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物的乳膏制剂预治疗的动物的组。星号表示相对于阳性对照组的统计学显著性差异(p≤0.05)。该附图表明，用卵白蛋白脚掌内刺激能够在小鼠中诱导水肿，异丙嗪乳膏抑制了这种现象。可以观测到，当用卵白蛋白刺激前30分钟涂敷于小鼠的脚爪上时，基于圭亚那苦油楝的油和从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物的乳膏制剂具有统计学显著的抗变应活性(制剂H和I也在大鼠中显示了良好的结果)。
实施例10：
局部施用的基于圭亚那苦油楝的油和从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物的乳膏制剂的抗组胺活性的体内测定方法
通过Swiss小鼠和Wistar大鼠的脚爪水肿的方法来分析局部使用的圭亚那苦油楝的油和从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物的乳膏制剂的抗炎活性。为此，用受试制剂对动物的后爪进行局部治疗。包含所有赋形剂，但不含有活性成分的制剂作为对照组(空白)。在药铲的帮助下涂敷乳膏，将后爪固定5分钟以吸收乳膏。局部治疗30分钟后，通过在先前致敏的小鼠中脚掌内注射组胺(100μg/爪)来进行刺激。水肿的分析在刺激后30分钟进行。
实施例11：
局部施用基于圭亚那苦油楝的油和从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物的乳膏制剂的抗组胺活性的体内测定的评价
附图12涉及基于圭亚那苦油楝的油和从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物的乳膏制剂对于由组胺诱导的小鼠(A)和大鼠(B)的脚爪水肿的局部预治疗的结果。在两个实验中，在乳膏中使用异丙嗪作为参照抑制剂(阳性对照)。在附图12(A)中每个柱显示的是8只动物的平均值±AND.P.M.，在附图12(B)中是5只。空白的柱显示的是未接受治疗的用组胺刺激的动物(阳性对照)的平均值。重要的是需要注意，用对照制剂(赋形剂)治疗不会诱导所治疗动物的脚爪体积发生任何变化。黑色的柱对应于用组胺刺激的组，其接受了异丙嗪乳膏的局部预治疗。影线的柱显示的是用组胺刺激并用基于圭亚那苦油楝的油和从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物的乳膏制剂预治疗的动物的组。星号表示相对于阳性对照组的统计学显著性差异(p≤0.05)。该附图表明，用组胺脚掌内刺激能够在小鼠和大鼠中诱导水肿，异丙嗪乳膏抑制了这种现象。可以注意到，当用组胺刺激前30分钟局部涂敷于小鼠和大鼠的脚爪上时，基于圭亚那苦油楝的油和从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物的乳膏制剂具有统计学显著的抗组胺活性[附图12只显示了小鼠(A)的结果，而未显示大鼠的结果(B)]。
实施例12：
口服圭亚那苦油楝的油的抗炎活性的体内测定方法
如下所述，在雄性Swiss小鼠中通过不同刺激物诱导的脚爪水肿和胸膜炎来评价圭亚那苦油楝的油的抗炎活性。
a)脚爪水肿实验
通过在一个后爪中以50μL/爪的体积进行刺激物(酵母聚糖或角叉菜胶)的脚掌内注射来刺激动物。使用的剂量是：酵母聚糖500μg/爪，角叉菜胶300μg/爪。在该爪的反侧，注射相同体积的载体(不含热原的无菌盐水)。在刺激4小时后，根据每只脚爪插入测量盘中而产生的液体(0.5g NaCl；3mL Extran 100％/1L)的排量，通过数字体积描记器分析水肿。每个分析进行3次。
b)胸膜炎实验
通过胸腔内注射(i.t)最终体积为100μL的角叉菜胶(300μg/腔)来诱导胸膜炎(Henriques和合作者，1991)。对照组接受100μL的载体(无菌盐水)。在刺激4小时后，在CO2室中处死该动物，暴露它们的胸膜并用肝素化(20UI/mL)的磷酸缓冲液(PBS)洗涤。在自动吸管的帮助下，以1mL的体积来洗涤动物的胸腔。收集胸膜洗液，离心(740g，10分钟)除去细胞，以如下所述进行下面的蛋白质渗出的评价。小鼠事前在眼眶血管丛静脉注射了伊文思蓝1％(25mg/Kg)，通过伊文思蓝的溢出，用分光光度计在λ600nm处评价蛋白质的渗出。通过比较洗液的光密度(D.O.)和伊文思蓝的标准曲线(从25.6到0.2μg/mL)来确定伊文思蓝的浓度。结果用μg/mL的伊文思蓝来表示。从胸膜洗液中取出一份用裂解红细胞的Tǖrk液体稀释40倍，在Neubauer室的帮助下，进行胸膜洗液中总白细胞的计数。在光学显微镜的油浸物镜的帮助下(100×)，通过May-Grǖnwald-Giemsa法经染色细胞的拭子获得单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的不同计数。结果用每个腔中细胞的数目(×106)来表示。
实施例13：
口服圭亚那苦油楝的油的抗炎活性的体内测定的评价
通过Swiss小鼠的脚爪水肿和胸膜炎评价四降三萜类化合物的抗炎活性。在附图13和14中，每个柱显示的是每组8只动物的平均值±AND.P.M.。空白的柱显示的是注射角叉菜胶(300μg/爪，附图13)和酵母聚糖(500μg/爪，附图14)刺激的动物组的脚爪体积的平均值，黑色的柱对应的是用双氯酚酸(100mg/Kg，第二个柱)口服预治疗水肿的抑制作用。其他的柱对应于用圭亚那苦油楝的油口服预治疗的组，表明100和400mg/Kg的剂量能够抑制酵母聚糖诱导的水肿，100mg/Kg的剂量能够抑制角叉菜胶诱导的水肿。星号表明根据T Student和Newman Keuls多重比较检验，与刺激而未治疗组相比具有统计学显著性差异(p≤0.05)。
也通过胸膜炎模型评价圭亚那苦油楝的油的抗炎活性。附图15显示的是在4小时的时间里，剂量为100，200，300和400mg/Kg的圭亚那苦油楝的油对于Swiss小鼠中角叉菜胶诱导的胸膜炎的口服预治疗结果。每个柱显示的是至少7只动物的平均值±AND.P.M.。星号表明该值与接受胸腔内注射盐水组(阴性对照)具有统计学差异，+号表明相对于角叉菜胶刺激的组(阳性对照)的差异(p≤0.05)，均是根据T Student和Newman Keuls检验。该附图表明注射角叉菜胶(300μg/腔)能诱导小鼠胸膜的蛋白质渗出(第二个柱)，与阴性对照组具有显著的差异。当圭亚那苦油楝的油的剂量为400mg/Kg时，用双氯酚酸(100mg/Kg，p.o.)口服预治疗(第三个柱)能够显著抑制角叉菜胶诱导的蛋白质溢出。注射角叉菜胶也能诱导炎症病灶的白细胞蓄积(B和C，第二个柱)。用400mg/Kg剂量的圭亚那苦油楝的油预治疗也能显著地抑制角叉菜胶诱导的总白细胞的蓄积，这是由于对胸腔的嗜酸性粒细胞动员的抑制作用，其与参照抑制剂具有相等强度。
实施例14：
口服四降三萜类化合物的抗炎活性的体内测定的方法
用不同的刺激物通过Swiss小鼠和Wistar大鼠的脚爪水肿来评价从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物的抗炎活性，如下所述。
a)由血小板活化因子诱导的脚爪水肿的实验
通过在一个后爪中以50μL/爪的体积脚掌内注射1μg/爪的血小板活化因子(PAF)来刺激Swiss小鼠。在该爪的反侧，注射相同体积的载体(不含热原的无菌盐水)。在非治疗的动物和用16mg/Kg的PAF拮抗剂WEB 2170(p.o.，100μL)预治疗的动物中进行刺激。在刺激30分钟后，根据每只脚爪插入测量盘中而产生的液体(0.5g NaCl；3mL Extran 100％/1L)的排量，通过数字体积描记器分析水肿。每个分析进行3次。
b)由缓激肽诱导的脚爪水肿的实验
通过在一个后爪中以50μL/爪的体积脚掌内注射10nmol/爪的缓激肽(BK)来刺激Wistar大鼠(Henriques，1991)。在该爪的反侧，注射相同体积的载体(不含热原的无菌盐水)。在非治疗的动物和以10nmol/爪脚掌内注射50μL缓激肽拮抗剂HOE 140预治疗的动物中进行刺激。在刺激30分钟后，根据每只脚爪插入测量盘中而产生的液体(0.5g NaCl；3mL Extran 100％/1L)的排量，通过数字体积描记器分析水肿。每个分析进行3次。
实施例15：
口服从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物的抗炎活性的体内测定的评价
在附图16中，每个柱显示的是7只动物的平均值±E.P.M.。结果表明，在Swiss小鼠中脚掌内注射血小板活化因子(PAF，1μg/爪)诱导了水肿(第一个柱)，通过口服PAF的拮抗剂WEB 2170(16mg/Kg，第二个柱)预治疗抑制了该水肿。其他的柱对应于口服四降三萜类化合物预治疗的组，表明25、50和100mg/Kg的剂量能抑制PAF诱导的水肿，但是12.5mg/Kg的剂量则不能。星号表示根据StudentNewman Keuls多重比较检验，与刺激而未治疗组相比具有统计学显著性差异(p≤0.05)。
在附图17中，每个柱显示的是7只动物的平均值±E.P.M.。结果表明，在Wistar大鼠中脚掌内注射缓激肽(10nmol/爪)诱导了水肿(第一个柱)，通过用缓激肽的拮抗剂HOE 140(10nmol/爪，脚掌内，第二个柱)预治疗抑制了该水肿。其他的柱对应于口服四降三萜类化合物预治疗的组，表明12.5、25、50和100mg/Kg的剂量能抑制缓激肽诱导的水肿。星号表示根据Student Newman Keuls多重比较检验，与刺激而未治疗组相比具有统计学显著性差异(p≤0.05)。
实施例16：
口服圭亚那苦油楝的油的止痛活性的体内测定的方法
用雄性Wistar大鼠，通过在加热的板(热板，Ugo Basile-Italiamodel DS-37)上进行痛觉过敏分析来评价抗变应活性。该分析通过将动物放置在热板上来进行，该热板用直径约18cm、高40cm的丙烯酸圆顶来限制。
a)变应性应答的痛觉过敏
通过在Wistar大鼠的一个后爪中以100μL/爪的终体积脚掌内注射10nmol/爪的卵白蛋白来进行痛觉过敏状态的诱导，该动物先前已致敏(12μg/爪)。在该爪的反侧，注射相同体积的载体(不含热原的无菌盐水)。在非治疗的动物和用双氯酚酸(100mg/Kg，p.o.)预治疗的动物中进行刺激。在刺激后1小时，将动物置于52.5±0.5℃的热板上，设定两个计时器以记录每只后爪回缩应答的潜伏时间。结果用右侧和左侧爪的回缩潜伏时间的差异来表示，单位是秒。
b)组胺诱导的痛觉过敏
通过在Wistar大鼠的一个后爪中以100μL/爪的终体积脚掌内注射100μg/爪的组胺来进行痛觉过敏状态的诱导。在该爪的反侧，注射相同体积的载体(不含热原的无菌盐水)。在非治疗的动物和用异丙嗪(30mg/Kg，p.o.)预治疗的动物中进行刺激。在刺激后30分钟，将动物置于52.5±0.5℃的热板上，设定两个计时器以记录每只后爪回缩应答的潜伏时间。结果用左和右侧爪的回缩潜伏时间的差异来表示，单位是秒。
c)角叉菜胶诱导的痛觉过敏
通过在Wistar大鼠的一个后爪中以100μL/爪的终体积脚掌内注射800μg/爪的角叉菜胶来进行痛觉过敏状态的诱导。在该爪的反侧，注射相同体积的载体(不含热原的无菌盐水)。在非治疗的动物和用安乃近(100mg/Kg，p.o.)预治疗的动物中进行刺激。在刺激后3小时，将动物置于52.5±0.5℃的热板上，设定两个计时器以记录每只后爪回缩应答的潜伏时间。结果用左和右侧爪的回缩潜伏时间的差异来表示，单位是秒。
实施例17：
口服圭亚那苦油楝的油的止痛活性的体内测定的评价
在附图18中，每个柱显示的是7只动物的平均值±E.P.M.。结果表明，在Wistar大鼠中脚掌内注射卵白蛋白(12μg/爪)诱导了痛觉过敏(第二个柱)，用双氯酚酸(100mg/Kg，p.o.，第三个柱)预治疗抑制了痛觉过敏。其他的柱对应于口服圭亚那苦油楝的油预治疗的组，表明100、200和400mg/Kg的剂量能抑制卵白蛋白诱导的痛觉过敏状态。星号表示相对于未刺激组的统计学显著性差异(p≤0.05)，+号显示相对于刺激而未治疗组的统计学差异，均根据StudentNewman Keuls多重比较检验。
附图19显示的是在Wistar大鼠中脚掌内注射组胺(100μg/爪)诱导的痛觉过敏。每个柱显示的是7只动物的平均值±E.P.M.。第三个柱显示的是用异丙嗪(30mg/Kg，p.o.)预治疗抑制了痛觉过敏。其他的柱对应于用圭亚那苦油楝的油(50，100，200和400mg/Kg的剂量)口服预治疗的组。仅仅400mg/Kg的剂量能够以与参照抑制剂相同的强度抑制组胺诱导的痛觉过敏状态。星号表示相对于未刺激组的统计学显著性差异(p≤0.05)，+号表示相对于刺激而未治疗组的统计学差异，均根据Student Newman Keuls多重比较检验。
在附图20中，每个柱显示的是7只动物的平均值±E.P.M.。结果表明，在Wistar大鼠中脚掌内注射角叉菜胶(800μg/爪)诱导了痛觉过敏(第二个柱)，用安乃近(100mg/Kg，p.o.，第三个柱)预治疗抑制了痛觉过敏。其他的柱对应于用圭亚那苦油楝的油(50，100，200和400mg/Kg的剂量)口服预治疗的组。100，200和400mg/Kg的剂量能抑制角叉菜胶诱导的痛觉过敏状态。星号表示相对于未刺激组的统计学显著性差异(p≤0.05)，+号表示相对于刺激而未治疗组的统计学差异，均根据Student Newman Keuls多重比较检验。
实施例18：
口服从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物的止痛活性的体内测定的方法
a)组胺诱导的痛觉过敏
通过在Wistar大鼠的一个后爪中以100μL/爪的终体积脚掌内注射100μg/爪的组胺来进行痛觉过敏状态的诱导。在该爪的反侧，注射相同体积的载体(不含热原的无菌盐水)。在非治疗的动物和用赛庚啶(30mg/Kg，p.o.)预治疗的动物中进行刺激。在刺激后30分钟，将动物置于52.5±0.5℃的热板上，设定两个计时器以记录每只后爪回缩应答的潜伏时间。结果用左和右侧爪的回缩潜伏时间的差异来表示，单位是秒。
实施例19：
口服从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物的止痛活性的体内测定的评价
在附图21中，每个柱显示的是7只动物的平均值±E.P.M.。在该附图中第一个柱显示痛觉过敏状态的诱导，第二个柱显示的是用对照抑制剂(环庚啶，30mg/Kg，p.o.)预治疗对它的抑制作用。其他的柱表明，用12.5；25；50和100mg/Kg剂量的四降三萜类化合物预治疗能够抑制由组胺诱导的痛觉过敏。
实施例20：
从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物的抗炎免疫调节活性的体外测定的方法
a)NO产生的测定
Balb/c小鼠接受3％巯基乙酸盐(1mL)的腹膜内注射，72小时后，通过用5mL的无菌RPMI1640洗涤收集腹膜巨噬细胞。从腹膜获得的细胞置于96孔板上(2.5×105个细胞/孔)，在CO2培养箱中培养1小时。在这段时间后，通过洗涤收集非粘附细胞，在富含干扰素和/或四降三萜类化合物(1，10，100μg/mL)的环境中用LPS(37.5ng/mL)刺激粘附细胞，并在CO2培养箱中培养24小时。离心(2分钟；2800rpm)后收集不含细胞的上清液部分，转移(100μL)到另一个加入了Greiss试剂(100μL)的板中。用微板读数器在540nm处测量，通过与亚硝酸钠的标准曲线比较来确定亚硝酸盐的浓度。通过ANOVA方差分析、student-Neuman-Keuls或T-student检验来分析数据。结果用平均值±平均值的标准误差(EPM)来表示。p≤0.05时认为是显著的。
b)脾细胞产生干扰素-γ
在无菌环境中取出雄性Balb-c小鼠的脾脏，置于包含含庆大霉素(25μg/mL)的3mL环境RPMI 1640的培养皿中。在层流下，分别分离这些脾脏。将细胞混悬液收集到15mL的无菌管中。混悬液沉淀5分钟，在此之后收集上清液。细胞混悬液以400g离心10分钟；用4mL RPMI 1640/庆大霉素将细胞的沉淀物再悬浮。在另一个管中，放置2ml的histopaque 1077，然后加入细胞悬液。在以400g离心30分钟后，收集在培养基和histopaque 1077之间界面处的细胞，洗涤(1500rpm，10分钟)，并补充1mL RPMI 1640再悬浮，通过台盼蓝法计算细胞的生存能力。
在获得和计算出细胞生存能力后，将细胞置于96孔板中(2.5×105/孔)，培养30分钟，在存在(1，10，100μg/mL)或不存在受试样品的条件下加入Con A(0.4μg/孔)。为确定IFN-γ的产生，在刺激后将细胞培养基24小时，离心该板(2分钟；2800rpm)，收集不含细胞的上清液，通过ELISA得到IFN-γ的量。
c)TNF-α产生的测定
Balb/c小鼠接受3％巯基乙酸盐(1mL)的腹膜内注射，72小时后，通过用5mL的无菌RPMI 1640洗涤收集腹膜巨噬细胞。从腹膜获得的细胞置于96孔的板上(2.5×105个细胞/孔)，在CO2培养箱中培养1小时。在这段时间后，通过洗涤收集非粘附细胞，用LPS(37.5ng/mL)和/或四降三萜类化合物(1，10，100μg/mL)刺激粘附细胞，并在CO2培养箱中培养24小时。在此之后，离心(2分钟；2800rpm)该板，收集不含细胞的上清液部分(100μL)，通过ELISA法得到TNF-α的量。
d)通过捕获ELISA测定TNF-α或IFN-γ的量
为得到细胞因子的量，取4μg/mL的纯化的单克隆抗体抗-TNF-α或IFN-γ在Na2HPO4(0.1M；pH 9.2)缓冲液中稀释，分布到96孔板中(50μL/孔；Maxisorp NUNC)，并在4℃下温育18小时。在此之后，用PBS吐温(0.05％)洗涤该板，在室温下与脱脂乳PBS 3％(100μL/孔)的溶液温育1小时。用PBS吐温(0.05％；PBS-T)重新洗涤后，该板与双份的上清液(100μL)在4℃下温育18小时。24小时后，用PBS-T洗涤该板，并在室温下与100μL的单克隆抗体生物素化的抗-TNF-α或IFN-γ(0.4μg/mL)温育1小时。然后用PBS-T洗涤该板，并在室温下与50μL的链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶(稀释度1∶800)温育30分钟。通过加入包含OPD(0.5mg/mL)的100μL柠檬酸钠/过硼酸钠缓冲液进行暴露。加入100μL的H2SO4 2M来停止反应，用分光光度计在490nm处读数。通过Soft Max Pro分析程序，与TNF-α或IFN-γ重组体的标准曲线相比较来确定上清液中细胞因子的浓度。通过ANOVA方差分析、student-Neuman-Keuls或T-student检验来分析数据。结果用平均值±平均值的标准误差(EPM)来表示。p≤0.05时认为是显著的。
e)淋巴细胞增殖的测定
如本实施例的b)项所述获得脾细胞。以每孔2.5×105个细胞接种到96孔板中。该板在37℃和5％CO2的培养箱中温育30分钟，在存在或不存在伴刀豆球蛋白A(A，0.4μg/孔)的情况下加入受试样品(0.1-100μg/mL)。细胞保持在培养箱中，72小时后，加入1μCi/孔的氚化胸苷。加入胸苷18小时后，在细胞采集器(Packard)的帮助下将细胞转移到膜上。根据闪烁(TopCount NXT；Packard)进行放射性读数，数据用每分钟的计数(CPM)来表示。通过ANOVA方差分析、student-Neuman-Keuls或T-student检验来分析数据。结果用平均值±平均值的标准误差(EPM)来表示。p≤0.05时认为是显著的。
f)吞噬作用的测定
当分析巨噬细胞的吞噬作用时，使用24孔板，每个孔中包含直径13mm的玻璃薄片。当使用薄片时，先在0.1％的Extran Neuter(Merck)溶液中洗涤，加热约35分钟。用蒸馏水操作2次。在温箱中干燥薄片，并浸入0.1％的硝酸溶液中18小时。在该处理后，用蒸馏水冲洗它们，在温箱中干燥并照射(2500拉德)。在IFN-γ(10单位/mL)、四降三萜类化合物(100μg/mL)的存在下以2.5×105个细胞/孔加入，或者加入RPMI 1640作为对照。在37℃(5％CO2)的培养箱中温育1小时后，加入50μl的酵母聚糖(最终浓度为106颗粒/mL)。该酵母聚糖混悬液是在无菌PBS中制备为2.5mg/mL浓度的，离心15分钟(3500rpm)，将沉淀物再悬浮于1mL的无菌PBS中。在超声处理(10分钟)后，取出一份混悬液，稀释，以便在光学显微镜(20倍物镜)下计数Neubauer室中不含酵母聚糖的颗粒数目。在加入酵母聚糖后，将培养物再置于培养箱中再培养1小时。在此之后，处理该薄片以进行吞噬作用的评价。在评价薄片时，用PBS洗涤细胞，并用2％低聚甲醛固定30分钟。再一次洗涤后，用苏木精-曙红使细胞着色。着色后，用新鲜水洗涤该薄片，置于显微镜台上，用显微镜进行细胞计数。
为了确定吞噬作用的比例，计数在200个细胞中发现的颗粒的数目。在细胞内部存在等于或大于4个酵母聚糖颗粒的细胞即被认为是吞噬作用阳性的。结果用对照组的吞噬作用的百分比来表示，公式如下：
Figure A20058003019700371
通过ANOVA方差分析、student-Neuman-Keuls或T-student检验来分析数据。结果用平均值±平均值的标准误差(EPM)来表示。p≤0.05时认为是显著的。
实施例21：
从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物的抗炎和免疫调节活性的体外测定的评价
a)从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物对一氧化氮产生的影响的评价
用于评价四降三萜类化合物的抗炎活性的第一个体外实验模型是腹膜巨噬细胞产生一氧化氮的模型。在附图22中，每个柱表示重复两次的示范实验的平均值，星号和十字符号表示当分别与非刺激组(空白柱)的值或与条件环境中LPS刺激组的值(黑色柱)相比时，p≤0.05。
我们观测了用LPS(30mg/mL)和富含干扰素的环境(黑色柱)刺激24小时而诱导的一氧化氮的产生，一氧化氮的基础产生(第一个空白柱)，和四降三萜类化合物的作用(1，10和100μg/mL；影线柱)。1μg/mL的剂量显著地抑制了一氧化氮的基础产生(第三至四个柱)，最大剂量是100μg/mL。在用LPS和富含干扰素的环境刺激的组中，观察到1和10μg/mL剂量的四降三萜类化合物不连续地抑制了一氧化氮的产生，而用100μg/mL的剂量治疗能够减少一氧化氮的产生至低于基础值的值。
b)从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物对干扰素-γ和TNF-α产生的影响的评价
通过脾细胞产生IFN-γ和鼠腹膜巨噬细胞产生TNF-α来进行抗炎和免疫调节活性的评价。在附图23和24中，每个柱表示重复的示范实验的平均值，星号和十字符号表示当分别与非刺激组(空白柱)的值或与刺激组的值(黑色柱)相比时，p≤0.05。在用Con-A(0.4μg/孔)刺激24小时后，在存在或不存在剂量逐渐增加的四降三萜类化合物(1，10，100μg/mL)的条件下，评价鼠脾细胞的IFN-γ的产生，也分析四降三萜类化合物对IFN-γ的基础产生的影响。在附图23中，我们观测到用四降三萜类化合物治疗不会改变IFN-γ的基础产生(第三到四个柱)。用Con-A刺激在24小时里诱导了IFN-γ的产生(p＜0.05)，用四降三萜类化合物治疗显著地抑制了(p＜0.05)该细胞因子的产生。在鼠巨噬细胞产生TNF-α的模型中，我们观测到用四降三萜类化合物治疗(第三到四个柱，附图24)不会改变TNF-α的基础产生(空白柱)。糖皮质激素地塞米松(0.005μM；第三个柱)显著地抑制了由LPS(30ng/mL)刺激巨噬细胞24小时引起的TNF产生(30ng/mL；黑色柱)，但是用四降三萜类化合物治疗不能改变TNF-α的基础产生，但是在0.01，0.1和10μg/mL的剂量时它能抑制(p＜0.05)由LPS诱导的该细胞因子的产生。
c)从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物对淋巴细胞增殖的影响的评价
在附图25中，每个柱表示重复的示范实验的平均值，星号和十字符号表示当分别与非刺激组(空白柱；第一个柱)的值或与用Con-A(0.4μg/孔)刺激组的值(黑色柱)相比时，p≤0.05。我们注意到，用三萜类化合物淋巴细胞与四降三萜类化合物温育不能改变体外淋巴细胞的基础增殖(第4到8个柱)，用Con-A刺激72小时诱导了淋巴细胞的增殖(黑色柱)。用0.1，10和100μg/mL剂量(柱9到13)的四降三萜类化合物预治疗抑制了(p＜0.05)由Con-A诱导的淋巴细胞增殖。用糖皮质激素地塞米松(0.005μM)治疗显著地抑制了淋巴细胞的增殖(p＜0.05)。
d)从圭亚那苦油楝的油中分离的四降三萜类化合物对鼠巨噬细胞吞噬作用的影响的评价
为了评价巨噬细胞的活性的调节，我们分析了四降三萜类化合物对鼠巨噬细胞吞噬酵母聚糖颗粒的影响。在附图26中，数据用吞噬作用的百分率表示，每个柱表示三次重复的示范实验的平均值，星号和十字符号表示当分别与仅接受酵母聚糖(106颗粒/mL；第一个柱)组或与在IFN-γ(10UI/mL；第三个柱)存在下用酵母聚糖刺激的组相比时，p≤0.05。我们观测到，用四降三萜类化合物(100μg/mL；第二个柱)处理显著抑制了腹膜巨噬细胞的基础吞噬作用。用IFN处理细胞诱导了吞噬作用比例的不连续增加，用四降三萜类化合物处理能降低吞噬作用的比例至基本值以下(第4个柱；p＜0.05)。
实施例22：
通过口服四降三萜类化合物诱导急性胃溃疡的体内测定的方法
四降三萜类化合物诱导急性胃溃疡的测定
在禁食24小时并自由饮水的C57/B110动物中进行该测定，将其保持在怀疑摄取木屑的笼子中。在具有球形末端的专用弯曲针头的帮助下，该动物口服接受100或200mg/Kg四降三萜类化合物的200uL盐水溶液。该组仅施用相同体积的盐水溶液。在口服5小时后，将小鼠在CO2室中处死，并用适当的针固定在台子上。用乙醇处理其皮毛以避免在取出胃时皮毛的影响。用扁平的镊子将小鼠的皮毛悬吊在生殖器附近的区域，从该区域至颈部区域做成切口。然后，使皮肤呈水平方向，以使腹部区域对于操作是完全可看见的。通过该区域的切口，分离胃，从腹腔中取出，在外部用PBS进行洗涤。以较小的曲率打开每个胃，洗涤，插入适当地标识并包含PBS的具有圆锥底的50ml聚丙烯管。在取出所有的胃以后，将它们小心地放在台子上，前两个针置于底部区域的末端，其他两个位于腔区。将所有的胃固定在台子上以后，在每个胃的粘膜中滴入2-3滴的PBS以保持湿度，通过立体显微镜进行胃粘膜的目视分析。在下表中，描述了所评价的参数，考虑下列的损害分级：
轻度-当受影响的面积＜25％时；
中度-当面积＝50％时；
强烈-当面积＞50％时
 胃损害组   损害的严重程度   得分 动物X
 1.粘膜的颜色   正常   1
  充血   2
  变色   3
 2.粘膜褶的损失   1
 3.瘀点   轻度   1
  中度   2
  强烈   3
 4.水肿   轻度   1
  中度   2
  强烈   3
 5.出血   轻度   1
    中度     2
    强烈     3
 6.粘膜的损失     轻度     1
    中度     2
    强烈     3
 7.溃疡性损伤     高达1mm     1
    ＞1mm     1.5×n
    穿孔     5×n
总共
平均损伤
标准偏差
平均值的标准误差
实施例23：
口服四降三萜类化合物后体内胃损害的评价
当评价四降三萜类化合物引起溃疡的活性时，在C57/Bl10小鼠中试验100和200mg/Kg的剂量。在施用四降三萜类化合物5小时后进行该分析。如Lapa和合作者(2003)所述，结果用损害率的平均值，和平均值的标准误差(E.P.M.)来表示，通过方差分析(ANOVA)来进行统计学分析，然后进行Newman-Kewls多重比较，或T Student检验，显著性水平为低于或等于0.05(p≤0.05)。
附图27显示的是小鼠用100和200mg/Kg剂量的四降三萜类化合物预治疗的结果。每个柱显示的是至少7只动物的平均值±E.P.M.。空白的柱对应的是接受了载体(盐水)的动物的组。第二个柱对应的是接受了100mg/Kg四降三萜类化合物的组，第三个柱显示的是接受了200mg/Kg剂量的组。附图27表明，根据实施例22所述的评价标准，给小鼠口服任何所试验剂量的四降三萜类化合物都不会导致胃粘膜的任何改变。

Claims (9)

1.一种药物组合物，其特征在于包括药学有效量的从圭亚那苦油楝的种子中提取的油和/或四降三萜类化合物作为活性成分，其中四降三萜类化合物是从该油中分离并担负其生物活性的化合物，和载体和/或药学上可接受的用于口服剂型的添加物。
2.根据权利要求1的药物组合物，其特征在于它是液体或固体的形式。
3.一种药物组合物，其特征在于包括药学有效量的从圭亚那苦油楝的种子中提取的油和/或四降三萜类化合物作为活性成分，其中四降三萜类化合物是从该油中分离并担负其生物活性的化合物，和载体和/或药学上可接受的用于局部使用剂型的添加物。
4.根据权利要求3的药物组合物，其特征在于它是液体、固体或半固体的形式。
5.根据权利要求3或4的药物组合物，其特征在于包含5％到30％的圭亚那苦油楝的油；0％到5％的四降三萜类化合物；0.5％到6％的乳剂基质；0.2％到2％的固体凡士林；0.05％到0.1％的防腐剂；2％到20％的增湿剂；0.1％到10％的1.8桉油酚；蒸馏水适量至100％。
6.根据权利要求5的药物组合物，其特征在于所述乳剂基质选自醇、脂肪酸和硬脂酰乳酸钠。
7.根据权利要求1或3的组合物的用途，其特征在于所述组合物用作抗变态反应、抗炎、止痛和免疫调节药物。
8.治疗、预防或抑制变应性疾病和炎症过程的方法，其特征在于包括给需要所述治疗、预防或抑制的病人服治疗有效量的如权利要求1到2之一所述的组合物。
9.治疗、预防或抑制变应性疾病和炎症过程的方法，其特征在于包括给需要所述治疗、预防或抑制的病人局部施用治疗有效量的如权利要求3到6之一所述的组合物。
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