ES2394316T3 - Composiciones farmac�uticas de Carapa Guianensis. - Google Patents

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ES2394316T3 ES05764528T ES05764528T ES2394316T3 ES 2394316 T3 ES2394316 T3 ES 2394316T3 ES 05764528 T ES05764528 T ES 05764528T ES 05764528 T ES05764528 T ES 05764528T ES 2394316 T3 ES2394316 T3 ES 2394316T3
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Carmem Penido Monteiro
Antonio Carlos Siani
Jislaine De F�Tima Guilhermino
M�Nica Freiman De Souza Ramos
Andr� Luiz Franco Sampaio
Elaine Cruz Rosas
Lucilene Azevedo De Lima
Renato Jabour Pennaforte
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Abstract

Una composición farmacéutica caracterizada por comprender como ingredientes activos los componentes (a) o(b) que siguen:(a) 5 a 30% de un aceite extraído de las semillas de Carapa guianensis Aublet y 0,01% a 5% detetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis Aublet, en la que lostetranortriterpenoides son responsables de la actividad farmacéutica;(b) 0,01% a 5% de tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis Aublet, en la quelos tetranortriterpenoides son responsables de la actividad farmacéutica;en la que la composición (a) o (b) comprende, además, como vehículos y/o aditivos, 0,5 a 6% de bases deemulsión; 0,2 a 2% de vaselina sólida; 0,05 a 0,1% de agentes conservantes; 2 a 20% de agentes humidificantes;0,1a 10% de 1,8-Cineol; y agua destilada, q.s.p. 100%.en la que la forma farmacéutica de la composición (a) o (b) es oral o tópica.

Description

Composiciones farmac�uticas de Carapa guianensis.
Campo de la invenci�n
Esta invenci�n se refiere a composiciones farmac�uticas a base del aceite extra�do de las semillas de Carapa guianensis Aublet y/o a base de compuestos qu�micos aislados de este aceite, que son responsables de su actividad biol�gica, los tetranortriterpenoides. Las composiciones farmac�uticas de esta invenci�n presentan las siguientes actividades farmacol�gicas: antial�rgica, antiinflamatoria, analg�sica e inmunomoduladora, y los compuestos citados reducen sustancialmente la aparici�n de efectos secundarios y tienen bajo coste de fabricaci�n.
Las composiciones farmac�uticas de esta invenci�n se dirigen al tratamiento, o la prevenci�n, o la inhibici�n de estados al�rgicos e inflamatorios de los seres humanos, mediante uso oral o t�pico. En cada uno de estos casos, el compuesto puede presentarse en forma l�quida o s�lida, y el compuesto de uso t�pico puede encontrarse, asimismo, en forma semis�lida . Los compuestos de esta invenci�n para uso t�pico, no son t�xicos o tienen baja toxicidad y son proporcionados, especialmente, en forma semis�lida (crema).
Las composiciones farmac�uticas de esta invenci�n constituyen una alternativa terap�utica importante para el tratamiento de alergias cut�neas y respiratorias, adem�s de actuar en diferentes reacciones inflamatorias de origen al�rgico o de origen infeccioso.
Por tanto, estos compuestos se utilizan tambi�n para el tratamiento sintom�tico de procesos reum�ticos, inflamatorios y degenerativos, traumas diversos, dolor e inflamaci�n posoperatoria y s�ndromes dolorosos agudos, entre otros, y pueden ser administrados por v�a oral o en forma t�pica..
Antecedentes de la invenci�n
Aproximadamente el 25-30% de la poblaci�n mundial presenta alg�n tipo de alergia, es decir, 1.800 millones de personas en todo el planeta son usuarios potenciales de medicamentos antial�rgicos. Las alergias m�s comunes son respiratorias, alimentarias y cut�neas.
Durante el proceso al�rgico existe liberaci�n de aminas vasoactivas, con histamina como faceta principal debido a que es una de las dianas terap�uticas de los medicamentos antial�rgicos. Estos medicamentos son en su mayor�a antihistam�nicos, es decir, antagonistas de los receptores H1 de la histamina, que son capaces de inhibir sus efectos y evitar los s�ntomas de la respuesta al�rgica. El desarrollo de los primeros medicamentos antial�rgenicos tuvo lugar en los a�os 60 y hoy en d�a esta contribuci�n del mercado farmac�utico es responsable de la venta de aproximadamente 1.657 millones de unidas farmac�uticas de medicamentos antialerg�nicos.
Los antiinflamatorios no esteroideos (AINES) representan el cuarto mercado m�s grande de la industria farmac�utica de Brasil. Los antiinflamatorios que existen en el mercado presentan diversos efectos secundarios, entre los que los m�s graves son la ulceraci�n g�strica, las hemorragias y las reacciones de hipersensibilidad. Adem�s de esto, todos ellos han sido desarrollados y registrados por la Industria Farmac�utica Internacional, lo que representa un alto coste para la poblaci�n de pa�ses en desarrollo, tales como Brasil. Por tanto, la b�squeda de nuevos medicamentos antiinflamatorios con efectos secundarios reducidos, adem�s de menor coste, tiene suma importancia.
Por otra parte, dado que muchas especies vegetales est�n reconocidas como or�genes de compuestos de actividad terap�utica, estas especies pueden presentar una alternativa a este caso.
En los Estados Unidos, entre 1983 y 1994, fueron aprobados 520 nuevos medicamentos, de los que el 39% eran productos naturales o productos derivados de sustancias extra�das de plantas. En la actualidad, el mercado mundial invierte 60.000 millones de d�lares por a�o en la fabricaci�n de medicamentos fitoterap�uticos.
La Organizaci�n Mundial de la Salud (OMS) ha comenzado tambi�n a desarrollar programas para estimular el uso de plantas medicinales validadas cient�ficamente. Datos relevantes apoyan la importancia de este incentivo para la medicina tradicional, dado que, aproximadamente, una tercera parte de la poblaci�n de pa�ses en desarrollo no tiene acceso a medicamentos esenciales, lo que hace que pa�ses tales como China, Corea del Norte, Corea del Sur y Vietnam las incorporen a la medicina tradicional como auxiliar de su sistema sanitario.
Recientemente, (solicitud de patente brasile�a PI0108940, presentada el 23 de Febrero de 2001) la composici�n antial�rgica a base de plantas, del producto Aller-7™, ha llegado a ser conocida (www.InterHealthUSA.com). protegida por la patente de EE.UU. No. 6.730.332.. Es un compuesto antial�rgico sin�rgico, a base de plantas, con extractos de : fruto de Terminalia chebula (15 a 50% p/p); fruto de Terminalia bellerica (15 a 50% p/p); piel de Albizia lebbeck (0,5 a 50% p/p); fruto de Emblica officinalis (15 a 50% p/p) y puede contener tambi�n extractos de: fruto de Piper longum (0,1a 5% p/p); fruto de Piper nigrum (0,1a 5% p/p); ra�ces de Zingiber officinale (0,1a 5% p/p).
Seg�n el documento de la patente y de la informaci�n sobre el producto Aller-7™ (www.arrowroot.com/aller-7.asp) tales plantas son conocidas en la medicina de Ayurvedic, para tratar alergias.
La composici�n sin�rgica de la solicitud de patente brasile�a PI0108940 se dirige, especialmente, al tratamiento de las rinitis y el asma. Esta composici�n act�a por estabilizaci�n de los mastocitos, es decir, por prevenci�n de la liberaci�n de histamina, responsable de la manifestaci�n de las alergias, con las caracter�sticas siguientes:
-
Intensa actividad antialerg�nica, que no solo proporciona alivio, en especial de las rinitis al�rgicas, el asma al�rgico y las bronquitis al�rgicas, sino que tambi�n ayuda a corregir enfermedades inmunol�gicas subyacentes;
-
el control de manifestaciones al�rgicas tales como, estornudos, nariz taponada, ojos acuosos, picor de garganta, ojos y nariz, respiraci�n ruidos y dificultad respiratoria;
-
no ocasiona somnolencia ni separaci�n inmunitaria, al contrario que otros medicamentos antialerg�nicos. Tambi�n act�a como antiinflamatorio.
Sin embargo, las plantas que componen este compuesto antialerg�nico sinerg�stico, adem�s de conocidas para el tratamiento de las alergias, tienen sus descripciones bot�nicas en la publicaci�n Wealth of Asia, y, por consiguiente, son plantas de esta regi�n. Este hecho puede constituir un factor restrictivo cuando se pretende una producci�n local. Por otra parte, la composici�n sinerg�stica de esta patente tiene actividad antiespasm�dica, pero no presenta actividad analg�sica.
Considerando que Brasil contiene el 35% de la diversidad de especies vegetales de la Tierra, puede aportar, por tanto, una contribuci�n decisiva al desarrollo de una terap�utica moderna para el tratamiento de procesos antialerg�nicos y antiinflamatorios. Adem�s de esto, el desarrollo de medicamentos fitoterap�uticos o de fitof�rmacos, desempe�a un papel esencial en la valoraci�n de materias primas nacionales con un impacto social y medioambiental.
Por consiguiente, con el prop�sito de superar los inconvenientes anteriormente citados, con respecto a los medicamentos antialerg�nicos y antiinflamatorios actuales, la presente invenci�n propone una nueva e importante alternativa terap�utica basada en plantas nativas, que es tanto o incluso m�s ventajosa que las del estado actual de la t�cnica. Es una alternativa terap�utica tal como la de los productos fitoterap�uticos, de Carapa guianensis Aublet para uso oral o uso t�pico.
La Carapa guianensis es una especie amaz�nica de la familia de las Meliaceas, conocida com�nmente como Andiroba, t�pica de bosques hidr�filos, y puede estar en estado salvaje y tambi�n ser cultivada. En Brasil esta especie se encuentra, por ejemplo, en el estado de Tocantins, a todo lo largo del r�o Solim�es hasta la costa del Atl�ntico, siendo ampliamente usada por sus habitantes as� como por los habitantes de otros pa�ses sudamericanos que viven en las proximidades del bosque amaz�nico.
Esta especie vegetal se usa com�nmente como repelente, insecticida, antipir�tico, verm�fugo, contra las dermatitis, lesiones y acn�, debido a sus propiedades curativas y bactericidas. Sus pieles y hojas se usan para tratar reacciones inflamatorias tales como reumatismo, artritis y dolor, y tambi�n contra infecciones del tracto superior respiratorio tales como neumon�a, as� como tambi�n tos y resfriados. La piel se usa para preparar un t� contra la fiebre, que tambi�n sirve como verm�fugo, Transformada en polvo trata heridas y tiene un efecto curativo en afecciones de la piel, dermatitis, lesiones d�rmicas secundarias, �lceras, excoriaciones y acn�, as� como tambi�n propiedades antipir�ticas. Las siguientes propiedades son atribuidas a las hojas: antidiarr�ica, vermifuga, tonica, antipir�tica, y sustitutiva de la quinina en el tratamiento de la fiebre pal�dica, adem�s de ser extremadamente �til contra eczemas, exantemas y otras afecciones de la piel (Pio Correa).
Es sabido que la Carapa guianensis o sus extractos, asociada o no a una o m�s especies vegetales en composiciones farmac�uticas para uso externo, puede aplicarse a :
1) Membranas, tales como piel, cavidad oral, pelo, etc., para evitar o mejorar eficazmente la ausencia de vigor de la funci�n de estas partes del cuerpo, causada por la tensi�n medioambiental o el envejecimiento (Solicitud de patente JP2001-151634).
2) Quitar el pelo del cuero cabelludo con objeto de activar los melanocitos de las ra�ces del cabello y estimular la producci�n de melanina . (Solicitud de patente JP2002-020243).
La semilla de Andiroba proporciona un aceite de color amarillento utilizado com�nmente como repelente e insecticida. Durante muchos a�os los indios han usado este aceite y el veh�culo para la aplicaci�n de pintura bix�cea y como repelente de insectos hemat�fagos., poniendo de manifiesto baja toxicidad en aplicaciones t�picas. .En la medicina dom�stica el aceite de Carapa guianensis se utiliza profusamente para ser frotado sobre tejidos doloridos, tumores y lesiones musculares. Este aceite est� caracterizado por las siguientes propiedades terap�uticas: es curativo, diur�tico, verm�fugo, sumamente �til contra eczemas, es purgante, antirreum�tico, �til contra �lceras cr�nicas, contra picaduras de insectos, contra el t�tanos, las hepatitis y contra enfermedades de la piel, desinfecta heridas y act�a contra las hinchazones de las erisipelas (Pio Correa – Diccion�rio das plantas �teis do Brasil).
El uso de un medicamento etnofarmacol�gico de esta clase, incluye tambi�n el tratamiento de la malaria, la lepra y la neumon�a.
El aceite de Andiroba se utiliza tambi�n en composiciones cosm�ticas (champ�s, cremas de acondicionamiento e hidratantes, seg�n las respectivas solicitudes de patentes BR PI9301949, BR PI9302004 y BR PI9302006).
El extracto de l�pido obtenido del n�cleo de las semillas de Andiroba se ha empleado tradicionalmente por sus propiedades antiinflamatorias contra los dolores reum�ticos y los dolores musculares, como ilustra la patente de EE.UU. No. 5.958.421, que se refiere al compuesto farmac�utico o compuesto cosm�tico para usar sobre la piel y que usa el referido extracto para regular el mecanismo implicado en las celulitis.
Por tanto, los investigadores presentes han observado que hasta el momento actual, la Andiroba ha sido empleada para uso externo, aprovechando principalmente su acci�n antiinflamatoria.
Por otra parte, la patente de EE.UU. No. 4.603.137 describe una sustancia aislada de plantas existentes en la India y de la misma familia de la Andiroba. (Meli�ceas). con propiedades antiinflamatorias, analg�sicas e inmunomoduladoras (col. 2, l�neas 49 a 53), y, en especial, inmunosupresoras. Tal sustancia alcaloidea, cromona, ha sido aislada particularmente desde varias partes de la planta Dysoxylum binectariferum (por ejemplo, : hojas, ramas, piel y madera procedente del tronco, y de piel y de madera procedente de las ra�ces) y puede utilizarse especialmente :
-
Para el tratamiento de pacientes que presentan respuestas indeseables al sistema inmunitario, presentes en el caso de enfermedades autoinmunitarias que, por regla general, est�n ocasionadas por anticuerpos y por estados alerg�nicos o hiperalerg�nicos del organismo y, en el caso de respuestas inflamatorias cr�nicas, aportadas principalmente por macr�fagos y granulocitos.
-
Como agente inmunosupresor en trasplantes de �rganos o prevenci�n de rechazos, en cuya prevenci�n los linfocitos y los macr�fagos desempe�an un papel importante.
Por consiguiente, los compuestos medicamentosos respectivos son tambi�n diferentes.
Aun cuando la planta tiene el mismo origen de la familia de Andiroba (Meli�ceas), el principio farmacol�gico activo de esta patente (el alcaloide cromona) es diferente de los de esta invenci�n (aceite de Andiroba y/o sustancias qu�micas aisladas desde este aceite, y responsables de su actividad biol�gica, los tetranortriterpenoides), debido a que tales principios son obtenidos como de especies diferentes. Por consiguiente, los respectivos compuestos medicamentosos tambi�n son diferentes.
Los compuestos de esta invenci�n presentan actividades farmacol�gicas: antialerg�nica, antiinflamatoria, analg�sica e inmunomoduladora, con efectos secundarios reducidos. Adem�s de constituir una alternativa terap�utica importante para el tratamiento de alergias de la piel y respiratorias, act�an tambi�n en diversas reacciones inflamatorias de origen al�rgico as� como en reacciones inflamatorias de origen infeccioso. Por tanto, los compuestos de esta invenci�n se utilizan tambi�n para el tratamiento sintom�tico de procesos reum�ticos inflamatorios y degenerativos, traumas diversos, dolor e inflamaciones posoperatorias, s�ndromes de dolores agudos, entre otros, con la posibilidad de poder ser administrados por v�a oral o en forma t�pica.
Sumario de la invenci�n
Esta invenci�n est� dirigida a proporcionar una composici�n farmac�utica caracterizada por comprender como ingredientes activos, los componentes (a) o (b) que siguen:
(a)
5 a 30% de un aceite extra�do de las semillas de Carapa guianensis Aublet y 0,01% a 5% de tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis Aublet, en la que los tetranortriterpenoides son responsables de la actividad farmac�utica;
(b)
0,01% a 5% de tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis Aublet, en la que los tetranortriterpenoides son responsables de la actividad farmac�utica,
en la que la composici�n (a) o (b) comprende, adem�s, como veh�culo y/o aditivos 0,5 a 6% de base de emulsi�n; 0,2 a 2% de vaselina s�lida; 0,05 a 0,1% de agentes conservantes, 2 a 20% de agentes humidificantes; 0,1a 10% de 1,8-Cineol; y agua destilada, q.s.p. 100%;
en la que la forma farmac�utica de la composici�n farmac�utica (a) o (b) es oral o t�pica, con actividades antialerg�nica, antiinflamatoria, analg�sica e inmunomoduladora, con disminuci�n sustancial de efectos colaterales y que tiene un coste de fabricaci�n bajo, debido a que proceden de una materia prima nacional.
Esta invenci�n proporciona esta composici�n farmac�utica para uso oral y para uso t�pico y en cada uno de estos casos, la composici�n puede estar o bien en forma l�quida o en forma s�lida, y la composici�n para uso t�pico puede estar tambi�n en forma semis�lida.
La composici�n farmac�utica de esta invenci�n para uso t�pico es at�xica o tiene toxicidad baja, estando constituida por un aceite extra�do de las semillas de Carapa guianensis Aublet y/o de los tetranortriterpenoides, compuestos qu�micos aislados de este aceite y responsables de su actividad biol�gica, con actividad antialerg�nica, antiinflamatoria, analg�sica e inmunorreguladora, y es proporcionada, especialmente, en forma semis�lida (crema).
Otra concreci�n de la invenci�n es el uso de la composici�n a base del aceite extra�do de las semillas de Carapa guianensis Aublet y/o los tetranortriterpenoides, los compuestos qu�micos aislados desde este aceite y que son responsables de su actividad biol�gica, como un medicamento antialerg�nico, antiinflamatorio, analg�sico e inmunomodulador.
Otra concreci�n de esta invenci�n es el m�todo de tratamiento, prevenci�n o inhibici�n de las condiciones alerg�nicas y procesos inflamatorios, que comprende la administraci�n de una cantidad eficaz desde el punto de vista terap�utico, de la composici�n a que se ha hecho referencia, a un ser humano que necesita el referido tratamiento, prevenci�n o inhibici�n.
Las composiciones farmac�uticas de esta invenci�n representan, por tanto, una alternativa terap�utica importante para el tratamiento de alergias de la piel y respiratorias.
Y otra importante caracter�stica de esta invenci�n es el hecho de que act�an no solamente en diferentes reacciones inflamatorias de origen al�rgico, sino que tambi�n act�an en reacciones inflamatorias de origen infeccioso. Por consiguiente, estas composiciones se emplean tambi�n para el tratamiento sintom�tico de procesos reum�ticos, inflamatorios y degenerativos, traumas diversos, dolor e inflamaci�n posoperatoria, s�ndromes de dolores agudos, entre otros, y pueden ser administradas por v�a oral o en forma t�pica.
Descripci�n de los dibujos
Figura 1 – Esta figura muestra los resultados de tratamiento previo (1 hora, v�a oral) con aceite de Carapa guianensis, sobre el edema al�rgico de la pata en ratones.
Figura 2 -Esta figura muestra el resultado de tratamiento previo (1 hora, v�a oral) con aceite de Carapa guianensis, sobre el edema de la pata inducido por histamina en ratones.
Figura 3 – La figura en cuesti�n hace referencia al resultado de tratamiento previo (1 horas, v�a oral) con aceite de Carapa guianensis ,sobre el edema de la oreja inducido por histamina en ratones.
Figura 4 – Esta figura muestra los resultados de tratamiento previo (1 hora, v�a oral) con aceite de Carapa guianensis sobre la exudaci�n pleural inducida por histamina en ratones.
Figura 5 – La figura en cuesti�n se refiere a los resultados de tratamiento previo (1 hora, v�a oral) con aceite de Carapa guianensis, sobre la exudaci�n pleural despu�s de estimulaci�n con histamina en ratas.
Figura 6 – Esta figura se refiere a los resultados de tratamiento previo (1 hora, v�a oral) con tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis, sobre el edema al�rgico de la pata en ratones.
Figura 7 – Esta figura muestra los resultados de tratamiento previo (1 hora, v�a oral) con tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis,, sobre la movilizaci�n celular en la pleures�a al�rgica en ratones.
Figura 8 – Esta figura muestra los resultados de tratamiento previo (1 hora, v�a oral) con tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis sobre el edema de la pata, inducido por histamina (A) en ratones y.
(B) en ratas.
Figura 9 – La figura en cuesti�n muestra los resultados de tratamiento previo (1 hora, v�a oral) con tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis, sobre el edema de la oreja del rat�n inducido por histamina.
Figura 10 – Esta figura hace referencia a los resultados de tratamiento previo (1 hora, v�a oral) con tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis, sobre la exudaci�n pleural inducida por histamina en ratones.
Figura 11 – Esta figura muestra los resultados de tratamiento t�pico previo con formulaciones de cremas a base de aceite de Carapa guianensis y con tetranortriterpenoides aislados desde el mismo aceite, sobre el edema al�rgico de la pata en ratones (A) y en ratas (B).
Figura 12 – Esta figura se refiere a los resultados de tratamiento t�pico previo con formulaciones de crema con aceite de Carapa guianensis y con tetranortriterpenoides aislados desde el mismos aceite, sobre el edema de la pata inducido por histamina en ratones (A) y en ratas (B).
Figura 13 – Esta figura muestra los resultados de tratamiento previo (1 hora, v�a oral) con aceite de Carapa guianensis, sobre el edema de la pata inducido por carragenina en ratones.
Figura 14 – La figura en cuesti�n muestra los resultados de tratamiento previo (1 hora, v�a oral) con aceite de Carapa guianensis sobre el edema de la pata inducido por zimos�n en ratones..
Figura 15 – Esta figura se refiere a los resultados de tratamiento previo (1 hora, v�a oral) con aceite de Carapa guianensis, sobre la exudaci�n pleural y pleuresias movilizadas celulares inducidas por carragenina en ratones.
Figura 16 – Esta figura muestra los resultados de tratamiento previo (1 hora, v�a oral) con tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis, sobre el edema de la pata inducido por el factor de activaci�n de las plaquetas de la sangre (PAF) en ratones.
Figura 17 – La figura en cuesti�n muestra los resultados de tratamiento previo (1 hora, v�a oral) con tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis, sobre el edema de la pata inducido por bradiquinina en ratas..
Figura 18 – La figura muestra los resultados de tratamiento previo (1 hora, v�a oral) con aceite de Carapa guianensis, sobre la hiperalgesia inducida por alb�mina de huevo en ratas previamente sensibilizadas.
Figura 19 – Esta figura muestra los resultados de tratamiento previo (1 hora, v�a oral) con aceite de Carapa guianensis, sobre la hiperalgesia inducida por histamina en ratas.
Figura 20 – Esta figura muestra los resultados de tratamiento previo (1 hora, v�a oral) con aceite de Carapa guianensis, sobre la hiperalgesia inducida por carragenina en ratas.
Figura 21 – Esta figura muestra los resultados de tratamiento previo (1 hora, v�a oral) con tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis, sobre la hiperalgesia inducida por histamina en ratas.
Figura 22 – La figura muestra el efecto inhibitorio de tratamiento con tetranortriterpenoides aislados desde Carapa guianensis sobre la producci�n de �xido n�trico por macr�fagos murinos.
Figura 23 – La figura muestra la inhibici�n de la producci�n de interfer�n-y por esplenocitos murinos, por tratamiento con tetranortriterpenoides aislados desde Carapa guianensis.
Figura 24 – La figura muestra el efecto de tratamiento con tetranortriterpenoides aislados desde Carapa guianensis, sobre la producci�n de TNF-a por macr�fagos murinos.
Figura 25 – La figura en cuesti�n muestra los resultados de tratamiento con tetranortriterpenoides aislados desde Carapa guianensis, sobre la proliferaci�n de linfocitos murinos.
Figura 26 – La figura muestra el resultado de tratamiento inhibitorio con tetranortriterpenoides aislados desde Carapa guianensis ,sobre la fagocitosis de zimos�n por macr�fagos murinos.
Figura 27 – La figura a que hace referencia muestra el efecto de la administraci�n oral de tetranortriterpenoides enla mucosa g�strica de ratones C57/B110. Los resultados est�n expresados como la Media del �ndice de Lesiones (M.I.L.).
Descripci�n detallada de la invenci�n
Datos etnofarmacol�gicos se�alan el uso de aceite de Carapa guianensis para diferentes fines terap�uticos, seg�n se ha descrito antes, incluyendo el uso externo como antiinflamatorio. Sin embargo, hasta ahora, no hab�a sido descrita la composici�n proporcionada por esta invenci�n a base del aceite extra�do de las semillas de Carapa guianensis Aublet y/o tetranortriterpenoides, compuestos qu�micos aislados desde este aceite y responsables de su actividad biol�gica, y veh�culos y/o aditivos farmac�uticamente aceptables, con actividad antialerg�nica, antiinflamatoria, analg�sica e inmunomoduladora, con efectos secundarios reducidos y de bajo coste, dada la procedencia desde materia prima nacional.
Esas composiciones farmac�uticas de esta invenci�n se dirigen al tratamiento o prevenci�n. o inhibici�n de los estados al�rgicos e inflamatorios de seres humanos, mediante uso oral o uso t�pico. En cada uno de estos casos la composici�n puede estar o bien en forma l�quida o bien en forma s�lida, y la composici�n de uso t�pico puede estar tambi�n en forma semis�lida. La composici�n farmac�utica de uso t�pico, de esta invenci�n, es at�xica o tiene toxicidad baja.
Las actividades antialerg�nica y antiinflamatoria de las composiciones farmac�uticas de esta invenci�n, son debidas a su actividad antiedemat�gena.
Ha de apreciarse que en esta invenci�n se pone de manifiesto la actividad antiedemat�gena del aceite extra�do de las semillas de Carapa guianensis Aublet, as� como tambi�n de tetranortriterpenoides, cuando se administran por v�a oral. Igualmente, mediante aplicaci�n t�pica, las formulaciones que hacen uso del aceite de Carapa guianensis Aublet y/o de tetranortriterpenoides fueron capaces, asimismo, de inhibir el edema al�rgico. Las composiciones de esta invenci�n de uso t�pico son at�xicas, o presentan baja toxicidad, y son proporcionadas especialmente en forma semis�lida (forma de crema),
En esta invenci�n la actividad antialerg�nica de las composiciones farmac�uticas a base del aceite extra�do desde las semillas de Carapa guianensis Aublet y/o de los tetranortriterpenoides, compuestos qu�micos aislados desde este aceite y responsables de su actividad biol�gica, fue caracterizada por las actividades de estos compuestos como antihistam�nicos, antagonistas de la bradiquinina y antagonistas del factor de agregaci�n de las plaquetas, mediadores implicados en la respuesta inflamatoria, que fue observada en ensayos biol�gicos in vivo.
Ante los est�mulos proinflamatorios, las composiciones farmac�uticas de la invenci�n procedentes del aceite de Carapa guianensis, act�an inhibiendo la movilizaci�n celular, la proliferaci�n de los linfocitos, la fagocitosis y la producci�n excesiva de prote�nas.
La actividad inmunomoduladora y tambi�n antiinflamatoria, de las composiciones farmac�uticas de esta invenci�n, fue caracterizada asimismo por la actividad inhibitoria de los tetranortriterpenoides sobre la producci�n de interfer�n-gamma, del factor de la necrosis tumoral (TNF), y de �xido n�trico, y tambi�n su actividad inmunomoduladora fue caracterizada por la inhibici�n sobre la proliferaci�n inducida de linfocitos T, y sobre la fagocitosis por macr�fagos murinos., siendo evidente que esta actividad es com�n a aceite extra�do desde las semillas de Carapa guianensis Aublet, a partir del cual son aislados tetranortriterpenoides.
Por medio de la acci�n inhibitoria del aceite extra�do de las semillas de Carapa guianensis Aublet y de los tetranortriterpenoides, se caracteriz� una actividad analg�sica sobre la hiperalgesia con las composiciones farmac�uticas de esta invenci�n.
Adem�s, se ha probado que las composiciones de esta invenci�n presentan disminuci�n de efectos secundarios.
Las composiciones farmac�uticas de esta invenci�n, adem�s de presentar una alternativa terap�utica importante para el tratamiento de las alergias de la piel (por ejemplo, urticaria) y alergias respiratorias, act�an o bien en las diversas respuestas inflamatorias de origen alerg�nico, o tambi�n en las respuestas inflamatorias de origen infeccioso. Por tanto, estas composiciones son utilizadas tambi�n para el tratamiento sintom�tico de procesos reum�ticos y degenerativos, traumas diversos, dolor e inflamaci�n posoperatoria y s�ndromes dolorosos agudos, entre otros, y pueden ser administradas por v�a oral o por v�a t�pica.
Los tetranortriterpenoides son conocidos. Estos compuestos son triterpenos que han perdido cuatro �tomos de carbono (C-24, C-25, C-26 y C-27), habi�ndose convertido los carbonos C-20. C-21, C-22 y C-23 en un anillo de furano. En esta mezcla de mol�culas est�n incluidas las siguientes: 6a-acetoxigedunina, 7-desacetoxi-7oxogedunina, andirobina, angolensato de metilo, gedunina y 6a-acetoxiepoxiazadiradi�n.
Debido al hecho de que los tetranortriterpenoides constituidos por la mezcla de los referidos compuestos, presentan, como se ha observado anteriormente, actividades antialerg�nica, antiinflamatoria, analg�sica e inmunomoduladora, se puede considerara que sus constituyentes presentan tambi�n las mismas caracter�sticas.
Para la administraci�n oral, la composici�n farmac�uticas de esta invenci�n puede ser presentada en forma de polvo, comprimidos, p�ldoras, c�psulas, o en forma de emulsiones, soluciones o suspensiones. Los componentes no activos incluyen, en este caso, excipientes, agentes de ligamiento, agentes de desintegraci�n, diluyentes, lubricantes, etc.
Las composiciones s�lidas contienen el ingrediente activo en mezcla con excipientes no t�xicos adecuados para la fabricaci�n de comprimidos, tales como amidas, lactosa, ciertos tipos de carbonatos y bicarbonatos, fosfatos, talco, etc. Los comprimidos pueden estar recubiertos o no, dependiendo del tracto gastrointestinal en que puede tener lugar la desintegraci�n y la absorci�n del medicamento.
En el caso de suspensiones. jarabes o soluciones fluidas, se emplean excipientes tales como metilcelulosa, alginato s�dico, goma ar�biga, lecitina, etc., y uno o m�s aditivos tales como agentes conservantes, colorantes, saborizantes, espesantes, polioles, sacarosa, glucosa, etc.
La composici�n farmac�utica de esta invenci�n para uso t�pico, puede tener la forma de crema, pomada, loci�n, gel, soluci�n o suspensi�n. Los componentes no activos son los utilizados habitualmente en este caso.
Esta invenci�n se describe con detalle por medio de los ejemplos que se presentan seguidamente. Es necesario notar que la invenci�n no se limita a estos ejemplos, sino que incluye tambi�n variaciones y modificaciones dentro de los l�mites en que opera,
Ejemplos
Ejemplo 1:
Preparaci�n de extractos.
(a)
Aceite de Carapa guianensis Aublet
El aceite de Carapa guianensis utilizado en esta invenci�n fue obtenido por expresi�n mec�nica de semillas. Para usar en los experimentos, partes al�cuotas del aceite fueron calentadas a 40�C hasta su fusi�n completa y diluidos en una soluci�n salina y de Tween 20, est�ril, en la proporci�n de 1 !l de Tween/mg de la masa total. Para la preparaci�n de la soluci�n de tratamiento, el aceite necesita ser calentado. Con la intenci�n de garantizar la estabilidad qu�mica del producto, cada parte al�cuota del aceite fue sometida a un calentamiento de 40�C hasta 2 veces.
(b)
Tetranortriterpenoides
Los tetranortriterpenoides de la invenci�n pueden ser obtenidos a partir del aceite de Andiroba o desde el bagazo de la semilla de Andiroba. Los procedimientos empleados en cada caso son procedimientos convencionales.
El aceite de Andiroba es extra�do con acetonitrilo en tres etapas como m�nimo, agitaci�n y decantaci�n, recogida del sobrenadante, y filtraci�n del sobrenadante y evaporaci�n en rotavapor.
Despu�s de extracci�n del bagazo de la semilla de Andiroba con hexano de calidad plaguicida durante cinco d�as aproximadamente, ocho horas por d�a, el material permanece en reposo para que se deposite el material s�lido. Despu�s de esto, se lleva a cabo filtraci�n y el material s�lido se deposita en un recipiente provisto de rejilla para que se seque. Despu�s se extiende y se deja secar.
Los tetranortriterpenoides se solubilizaron en una soluci�n salina y de Tween 20, est�ril, en la proporci�n de 1 !l de Tween/mg de masa total.
Las soluciones para administrar fueron preparadas en dosis de 12,5; 25; 50; 100 y 200 mg/Kg, en vol�menes de 200 !l (para los ratones) o de 400 !l (para las ratas).
Ejemplo 2
Preparaci�n de soluciones, medicamentos y formulaciones
Las soluciones, medicamentos y formulaciones que se usaron en los experimentos realizados, se describen a continuaci�n.
(a) Preparaci�n de medicamentos
El cloruro de prometacina en comprimidos (Aventis) fue macerado, pesado y solubilizado en el seno de una soluci�n est�ril de NaCl al 0,9% preparada inmediatamente antes de usarla. La ciproheptadina (Sigma) se solubiliz� en agua. La dipirona se diluy� y el diclofenaco se solubiliz� en agua de nueva aportaci�n 0,22 !m). La dexametasona (Sigma), WEB 2170 (Boehringer Ingelheim) y HOE 140 (Sigma) se solubilizaron en una soluci�n est�ril de NaCl al 0,9%. La prometacina en crema (Rhodia Farma) se aplic� directamente sobre las patas de los animales.
Todos los medicamentos fueron preparados inmediatamente antes de su uso.
(b) Preparaci�n de soluciones Soluci�n salina NaCl 0,9 g Agua destilada (q.s.p.) 100,00 ml pH ajustado a 7,2-7,4. Soluci�n salina heparinizada Soluci�n salina 100,00 ml Heparina 2.000 UI pH ajustado a 7,2-7,4. Soluci�n tamp�n de fosfato (PBS) NaH2PO4.H2O 0,256 g Na2HPO4.12H2O 3,004 g NaCl 8,766 g Agua destilada (q.s.p.) 1000 ml pH ajustado a 7,2-7,4 PBS heparinizada PBS 1000 ml Heparina 20.000 UI pH ajustado a 7,2-7,4. PBS / Tween Tween 20 50,0 !l PBS 100,0 ml May-Gr�nwald May-Gr�nwald 0,2 g Metanol 100,0 ml Los compuestos anteriores se mezclan, se calienta a 60�C durante 2 horas y se filtra por papel de filtro. Giemsa Giemsa 1,0 g Glicerina 60,0 ml Metanol 56,0 ml. Los compuestos anteriores se mezclan, se calienta a 60�C durante 2 horas y se filtra por papel de filtro. Para la
soluci�n de uso, la soluci�n anterior se diluye 10 veces. L�quido de T�rk �cido ac�tico glacial P.A. 2,0 ml Violeta cristal (q.s.p.) 5,0 mg Agua destilada (q.s.p.) 100,0 ml. RPMI / gentamicina RPMI 10,4 g Gentamicina 25 mg Agua desionizada (q.s.p.) 1,00 litro
Reactivo de Greiss
Soluci�n A
Soluci�n B
Sulfanilamida
1,0 g a-Naftiletilenodiamina 100,00 mg
H3PO4
5,0 ml Agua destilada (q.s.p.) 100 ml
Agua destilada (q.s.p)
100,0 ml
Se mezclan las Soluciones A y B, en partes iguales, (1:1) al tiempo de usarlas. XIX – PBS/Leche PBS/Leche, Sigma 3,0 g Agua destilada (q.s.p.) 100 ml Soluci�n de exposici�n de ELISA
OPD (Dihidrocloruro de
orto-fenilenodiamina
5,0 mg
Citrato
121,5 mg
Perborato s�dico
30 mg
5
Agua destilada (q.s.p.) 10,0 ml.
Soluci�n de �cido sulf�rico 2M
H2SO4 P.A.
166,67 ml
Agua destilada (q.s.p.)
1000,0 ml
(a) Preparaci�n de formulaciones t�picas
10
Los componentes y sus porcentajes se describen en las formulaciones. Tales preparaciones pueden ser
presentadas en forma de cremas y de lociones,
Aceite de Carapa guianensis
5 a 30 %
Tetranortriterpenoides
0 a 5%
Forma de emulsi�n (alcoholes y �cidos grasos y estearil lactato s�dico)
0,5 a 6%
Vaselina s�lida
0.2 a 2%
Agentes conservantes
0,05 a 0,1%
Humidificantes
2 a 20%
1,8-Cineol
0,1a 10%
Agua destilada, q.s.p.
100%
Los componentes oleosos (base emulsionada, humidificantes y agentes conservantes) se calentaron a 75�C y los componentes acuosos se calentaron hasta la temperatura de 80�C hasta su disoluci�n total. Despu�s de esto, se
15 verti� una fase sobre la otra y se homogeneiz� por agitaci�n (2.000 rpm) hasta el enfriamiento completo de la formulaci�n
Ejemplo 3:
Metodolog�a de ensayos in vivo que se refieren a la actividad antialerg�nica del aceite de Carapa guianensis y de tetranortriterpenoides, administrados por v�a oral
20 Para todos los procedimientos operatorios realizados in vivo, descritos del modo que sigue, se emplearon ratones Swiss machos de peso entre 18 y 25 gramos y/o ratas Wistar machos, de peso entre 200 y 300 gramos. Los animales fueron proporcionados por la Central Biotery de la Fundaci�n Oswaldo Cruz y mantenidos en el estabulario del Laboratorio de Farmacolog�a Aplicada, Far-Manguinhos, hasta el momento de uso. Los animales ten�an libre acceso a agua y la alimentaci�n de los animales se someti� a ciclos alternados de 12 horas de iluminaci�n y
25 oscuridad, a la temperatura de 25�C. Los animales fueron tratados con un medicamento verm�fugo (Mebendazol, 20 mg/1000 ml de agua) durante 3 d�as, y solamente fueron usados para la experimentaci�n despu�s de un intervalo de3 d�as. Todos los procedimientos operatorios experimentales fueron llevados a cabo seg�n la �tica de Experimentos con Animales de la Fundaci�n Oswaldo Cruz, RJ.
a) Ensayo del edema de la pata
30 Los animales fueron estimulados mediante inyecci�n interplantar del est�mulo (histamina, bradiquinina y PAF (Factor de Activaci�n de las Plaquetas) en una de las patas traseras, con vol�menes de 50 � 100 !l/pata para los ratones o las ratas, respectivamente. Las dosificaciones usadas fueron: 100 !g/pata de histamina, 10 nmol/pata de bradiquinina y 1 !g/pata de PAF ((hay que hacer notar que solamente la bradiquinina se inyect� en un volumen de 50 !l). En el lado contralateral de la pata se aplic� el mismo volumen del veh�culo (soluci�n salina est�ril exenta de
35 pir�genos). Treinta minutos o una hora despu�s del est�mulo, se analiz� el edema en un pletism�grafo digital, por medio del desplazamiento de fluido (0,5 g de NaCl; 3 ml de Extr�n 100%/1 litro) producido, mediante la inserci�n de cada pata en la bandeja de medida. Cada an�lisis se realiz� 3 veces.
b) Ensayo del edema al�rgico de la pata
Este ensayo fue llevado a cabo en animales previamente sensibilizados mediante una inyecci�n subcut�nea (s.c.) en la regi�n dorsal, de 200 !l de una suspensi�n que conten�a 50 !g de alb�mina de huevo + 5 mg de Al(OH)3 diluido en soluci�n salina est�ril exenta de pir�genos (200 !l/animal). El edema de la pata fue inducido por una inyecci�n intraplantar de alb�mina de huevo (3 !g/pata, en un volumen final de 50 !l) en una de las patas traseras, catorce d�as despu�s de la sensibilizaci�n. La pata contralateral recibi� una inyecci�n con el mismo volumen del veh�culo (soluci�n salina).. El edema fue analizado en un pletism�grafo digital, por medio del desplazamiento de fluido (0,5 g de NaCl: 3 ml de Extr�n 100%/1 litro) producido, por la inserci�n de la pata en ensayo en la bandeja de medida. Cada an�lisis se llev� a cabo 3 veces.
c) Ensayo del edema de la oreja
El edema de la oreja fue inducido en ratones anestesiados (pentobarbital, 40 mg/kg, v�a intravenosa, 1.v.) con una inyecci�n intravenosa (i.v.) de Azul de Evans al 1% (25 mg/kg), en el plexo orbital 24 horas antes del est�mulo. Los animales fueron estimulados con una inyecci�n intrad�rmica (i.d). de histamina (10 !g/sitio en 25 !l) en la cara superior de la oreja, con jeringuillas de vidrio y agujas de di�metro 30 ½ G. La oreja opuesta a la estimulada recibi� el mismo volumen de veh�culo (soluci�n salina est�ril exenta de pir�genos). Treinta minutos despu�s del est�mulo. los animales fueron sacrificados en la c�mara de CO2 y sus orejas fueron separadas y colocadas en formamida (500 !l/oreja) durante 24 horas para la extracci�n del Azul de Evans. La concentraci�n de Azul de Evans en el sobrenadante se analiz� por espectrofotometr�a (espectrofot�metro SpectraMax�) a I 600 nm. La concentraci�n de Azul de Evans se determin� comparando la densidad �ptica (D.O.) de una curva patr�n (desde 25,6 a 0,2 !g/ml).
d) Ensayo de pleures�a
La pleures�a fue inducida mediante inyecci�n intrator�cica (i.t.) de histamina (100 !g/cavidad) en un volumen final de 100 !l. El grupo testigo recibi� 100 !l de veh�culo (soluci�n salina est�ril). Una hora despu�s del est�mulo, los animales fueron sacrificados en una c�mara de CO2, y sus cavidades tor�cicas fueron expuestas y lavadas con soluci�n tamp�n de fosfato (PBS) heparinizada (20 UI/ml). La cavidad pleural de los animales se lav� con ayuda de una pipeta autom�tica, con vol�menes de 1 y 3 ml, respectivamente, para los ratones y las ratas. Los lavados pleurales fueron recogidos y centrifugados (740 G, 10 minutos) para separar las c�lulas para la evaluaci�n posterior de la exudaci�n proteica, seg�n se describe seguidamente. En experiencias realizadas con ratones, estos fueron inyectados previamente con Azul de Evans al 1% (25 mg/Kg), en el plexo orbital, y la exudaci�n proteica fue evaluada por el exceso de Azul de Evans, por espectrofotometr�a a I 600 nm. La concentraci�n de Azul de Evans se determin� comparando la densidad �ptica (D,O,) de los lavados con una curva patr�n de Azul de Evans (de 25,6 a 0,2 !g/ml). Los resultados fueron expresados como !g/ml de Azul de Evans. Para el an�lisis en las ratas, la exudaci�n del lavado pleural se evalu� por la medida del volumen recogido desde la cavidad con ayuda de una jeringuilla graduada, y la descarga de prote�nas fue evaluada mediante la cuantificaci�n de las prote�nas existentes en el sobrenadante por el m�todo de Lowry (Lowry et al., 1951). El recuento del n�mero de leucocitos totales existentes en el lavado pleural se llev� a cabo con ayuda de una c�mara Neubauer sobre una parte al�cuota del lavado pleural, diluida 40 veces en l�quido de T�rk para realizar la lisis de los eritrocitos. El recuento diferencial de c�lulas mononucleares, de neutr�filos y de eosin�filos, se realiz� por medio de una torunda de algod�n con las c�lulas coloreadas mediante el m�todo de May-Gr�nwald, con ayuda del microscopio �ptico con objetivo de inmersi�n (100 x). Los resultados se expresan como el n�mero de c�lulas (x 106) por cavidad.
e) Ensayo de la pleures�a al�rgica
Este ensayo se llev� a cabo en animales previamente sensibilizados mediante inyecci�n subcut�nea (s.c.) en la regi�n dorsal, de 200 !l de una suspensi�n que conten�a 50 !g de alb�mina de huevo + 5 mg de Al(OH)3 diluido en soluci�n salina est�ril exenta de pir�genos (200 !l/animal). Catorce d�as despu�s de la sensibilizaci�n, los animales fueron enfrentados con alb�mina de huevo (12,5 !g/cavidad) por inyecci�n i.t., en un volumen final de 100 !l. Los animales testigo recibieron un volumen igual de soluci�n salina est�ril. Una hora despu�s del enfrentamiento con alb�mina de huevo, las cavidades tor�cicas de los animales fueron expuestas y lavadas con 1 ml (ratones) o 3 ml (ratas) de PBS heparinizado (20 UI/ml). Se recogieron los lavados pleurales para evaluar la exudaci�n proteica.
f) Tratamientos
Los tratamientos con aceite o tetranortriterpenoides fueron llevados a cabo por v�a oral (p.o) 1 hora antes de la estimulaci�n en animales conscientes, mantenidos en estado de ayuno previo de 12 horas, con libre acceso a agua, Las soluciones de tratamiento fueron administradas con ayuda de una aguja curva con final esf�rico, con vol�menes de 200 !l � 400 !l para los ratones (de 25 g) o las ratas (de 200 g). Las dosis empleadas fueron 200 � 400 mg/Kg para los ratones y 150 � 300 mg/kg para las ratas. Los tetranortriterpenoides fueron administrados en dosis de 12,5; 25; 50; 100 y 200 mg/Kg. El tratamiento t�pico con formulaciones a base de aceite de Carapa guianensis y/o tetranortriterpenoides se llev� a cabo con ayuda de una esp�tula y las patas tratadas fueron inmovilizadas durante 5 minutos para permitir la absorci�n de la crema. El tratamiento t�pico se efectu� 30 minutos antes de la estimulaci�n. Los inhibidores que figuran seguidamente fueron administrados por v�a oral (p.o.) 1 hora antes del est�mulo: prometacina (antagonista competitivo de los receptores H1; 10, 30 � 60 mg/Kg), ciproheptadina (antagonista serotonin�rgico y de receptores H2, 30 mg/Kg), WEB 2170 (antagonista de PAF; 16 mg/Kg), dipirona (antiinflamatorio y antipir�tico; 100 mg/Kg) y diclofenaco de potasio (inhibidor de la ciclooxigenasa-1 y –2; 100 mg/Kg). Se administr� dexametasona (antiinflamatorio; 2 mg/Kg, p.o.) 24 y 1 hora antes del est�mulo, y se llev� a cabo una administraci�n de HOE 140 (antagonista de la bradiquinina; 1 !g/pata) inmediatamente antes del est�mulo, mediante inyecci�n intraplantar.
Ejemplo 4:
Evaluaci�n in vivo de la actividad antialerg�nica del aceite de Carapa guianensis administrado por v�a oral
Para evaluar la actividad antialerg�nica del aceite de Carapa guianensis, se ensayaron las dosis de 200 y 400 mg/Kg para los ratones y 150 y 300 mg/Kg para las ratas, dependiendo del modelo ensayado. Las soluciones de tratamiento fueron administradas por v�a oral (p.o.) 1 hora antes de la estimulaci�n. Con fines de comparaci�n se uso hidrocloruro de prometacina, antihistam�nico, un antagonista competitivo de los receptores H1, como inhibidor de referencia. Los resultados fueron expresados como media y error t�pico de la media (AND.P.M.), y analizados estad�sticamente mediante el an�lisis de la varianza (ANOVA), seguido de ensayo de comparaciones m�ltiples de Newman-Keuls, o el ensayo de la T de Student con un nivel de significaci�n menor o igual que 0,05 (p:0,05).
La Figura 1 expone los resultados del tratamiento previo de ratones con aceite de Carapa guianensis en dosis de 100, 200, 300 y 400 mg/Kg en el modelo del edema al�rgico de la pata. Cada barra muestra la media � AND.P.M. de al menos 7 animales. La barra abierta corresponde al grupo de animales que hab�a recibido el est�mulo interplantar con alb�mina de huevo. La barra cerrada corresponde al grupo que hab�a recibido tratamiento previo por v�a oral con prometacina (testigo positivo), y las barras rayadas ilustran los animales tratados previamente con diferentes dosis de aceite. Todos los grupos fueron sensibilizados con alb�mina de huevo 14 d�as antes del est�mulo con la alb�mina de huevo. Los asteriscos indican valores estad�sticamente diferentes con respecto al grupo testigo positivo (p:0,05) , seg�n el ensayo de la T de Student y Newman Keuls. La Figura 1 pone de manifiesto que la inyecci�n interplantar con alb�mina de huevo (3 !g/pata) en los ratones hab�a sido capaz de inducir edema de la pata, seg�n informes de la bibliograf�a cient�fica (Sampaio et al., 1995). Este edema fue inhibido significativamente mediante tratamiento con prometacina (30 mg/Kg) por v�a oral. El tratamiento previo con aceite de Carapa guianensis fue capaz de inhibir significativamente el edema inducida por alb�mina de huevo con dosis de 100, 200, 300 y 400 mg/Kg, sin mostrar diferencia entre las dosis.
Ejemplo 5:
Evaluaci�n in vivo de la actividad antihistam�nica del aceite de Carapa guianensis administrado por v�a oral
Entre los mediadores responsables de la respuesta alerg�nica, la histamina desempe�a un papel importante, que conduce al aumento de la permeabilidad vascular, la producci�n excesiva proteica y edema (Bilici et al.). Por tanto, se analiz� la actividad antihistam�nica del aceite de Carapa guianensis. La Figura 2 presenta los resultados de tratamiento previo por v�a oral del aceite de Carapa guianensis sobre el edema de la pata inducido por la estimulaci�n intraplantar con histamina (100 !g/pata) en el rat�n. Cada barra indica la media � AND.P.M. de 8 animales. La barra cerrada corresponde a la media del grupo estimulado con histamina (testigo positivo). La barra abierta corresponde a la media del grupo tratado previamente con prometacina (10 mg/Kg), p.o.), y las barras rayadas corresponden a los grupos tratados previamente con aceite de Carapa guianensis, en dosis de 100, 200, 300 y 400 mg/Kg. Los asteriscos indican los valores estad�sticamente diferentes con respecto al grupo testigo positivo (p:0,05),.seg�n los ensayos de la T de Student y Newman Keuls. La Figura 2 pone de manifiesto que el tratamiento previo con aceite de Carapa guianensis hab�a sido capaz de inhibir significativamente el edema de la pata inducido por histamina, en todas las dosis ensayadas, con la misma magnitud que el inhibidor de referencia (prometacina),
Despu�s de esto se evalu� el efecto antihistam�nico del aceite de Carapa guianensis en otro modelo experimental, el edema de la oreja. La Figura 3 muestra los resultados del tratamiento previo por v�a oral con el aceite, en dosis de 200 y 400 mg/Kg, sobre el edema de la oreja inducido por histamina en animales sensibilizados. Cada barra indica la media � AND.P.M: de 7 animales. Los asteriscos indican valores estad�sticamente diferentes con respecto al grupo de soluci�n salina (testigo negativo) y + indica diferencias con relaci�n al grupo estimulado con histamina (testigo positivo) (p:0,05), seg�n los ensayos de la T de Student y Newman Keuls. La Figura 3 pone de manifiesto que la inyecci�n de histamina fue capaz de inducir el exceso de producci�n proteica en las orejas de los ratones (segunda columna), y que el tratamiento previo por v�a oral con prometacina (10 mg/Kg, p.o.) hab�a podido inhibir significativamente el edema inducido por histamina (tercera columna). Igualmente, el tratamiento previo con dos dosis de aceite de Carapa guianensis (200 y 400 mg/Kg, p.o.) hab�a sido capaz de inhibir significativamente el edema ocasionado por la inyecci�n de histamina en el per�odo de 30 minutos, en la misma magnitud que el inhibidor de referencia.
La evaluaci�n de la actividad antihistam�nica del aceite de Carapa guianensis se llev� a cabo tambi�n mediante el modelo de pleures�a (da Cunha et al., 2001; Calheiros et al., 2001). La Figura 4 muestra los resultados de tratamiento previo por v�a oral con aceite, en dosis de 200 y 400 mg/Kg, sobre la exudaci�n proteica en la pleures�a inducida por histamina en ratones Swiss. Cada barra indica la media � AND.P.M. de 8 animales. Los asteriscos indican valores estad�sticamente diferentes con respecto al grupo que hab�a recibido inyecci�n i.t. de soluci�n salina (testigo negativo) y + indica diferencia en relaci�n con el grupo estimulado con histamina (testigo positivo) (p:0,05), seg�n el ensayo de la T de Student y de Newman Keuls. La Figura pone de manifiesto que la inyecci�n de histamina (100 !g/cavidad) hab�a sido capaz de inducir producci�n proteica en exceso para la actividad pleural de los ratones (segunda columna), significativamente diferente de la del grupo testigo negativo. El tratamiento previo por v�a oral con prometacina (30 mg/Kg, p.o.) (Tercera columna) fue capaz de inhibir el exceso de producci�n proteica inducido por histamina. Igualmente, el tratamiento previo con dos dosis de aceite de Carapa guianensis (200 y 400 mg/Kg, p.o.) hab�a sido capaz de inhibir significativamente la exudaci�n pleural inducida por histamina, con la misma magnitud que el inhibidor de referencia.
El mismo modelo experimental se emple� en ratas Wistar, como muestra la figura 5. En esta figura, cada barra corresponde a la media � AND.P.M. de 8 animales por lo menos. La primera barra corresponde a la media del grupo no estimulado (que hab�a recibido inyecci�n de soluci�n salina), y los otros grupos hab�an sido estimulados con histamina (100 !g/cavidad). La segunda barra corresponde a los animales sin tratar, la tercera a los animales tratados con el inhibidor de referencia (prometacina, 30 mg/Kg) por v�a oral. Las otras barras corresponden a los grupos que hab�an recibido tratamiento previo con aceite de Carapa guianensis en dosis de 200 y 400 mg/Kg, por v�a oral. Los asteriscos indican la diferencia estad�stica entre el grupo que hab�a recibido inyecci�n intrator�cica de soluci�n salina (testigo negativo) y + indica diferencias con respecto al grupo estimulado con histamina (testigo positivo) (p:0,05), seg�n el ensayo de la T de Student y de Newman Keuls. La figura pone de manifiesto que la inyecci�n de histamina hab�a sido capaz de inducir un exceso de producci�n proteica en la cavidad pleural de las ratas (segunda columna) significativamente diferente de la del grupo testigo negativo. El tratamiento previo por v�a oral con dos dosis de aceite de Carapa guianensis (200 y 400 mg/Kg, p.o.) fue capaz de inhibir significativamente la producci�n proteica excesiva inducida por histamina, con la misma intensidad que la prometacina (30 mg/Kg, p.o.).
Ejemplo 6:
Evaluaci�n in vivo de la actividad antialerg�nica de tetranortriterpenoides aislados del aceite de Carapa guianensis, administrados por v�a oral.
La actividad antialerg�nica de los tetranortriterpenoides fue evaluada mediante el edema de la pata en ratones Swiss (figura 6). En la figura 6, cada barra indica la media � AND.P.M. de al menos 8 animales. Los resultados presentados demuestran el edema inducido por la inyecci�n de alb�mina de huevo (3 !g/pata) en ratones sensibilizados (primera barra) y la inhibici�n del edema por tratamiento previo por v�a oral con prometacina (30 mg/Kg, segunda barra). Las otras barras corresponden a grupos tratados previamente por v�a oral con tetranortriterpenoides, y demuestran que dosis de 50. 100 y 200 mg/Kg hab�an sido capaces de inhibir el edema alerg�nico, pero que las dosis de 12,5 y 25 mg/Kg no lo hab�an sido. Los asteriscos indican diferencias estad�sticamente diferentes (p:0,05) con respecto al grupo estimulado y no tratado, seg�n el ensayo de Student Newman Keuls de comparaciones m�ltiples.
La actividad antialerg�nica de los tetranortriterpenoides fue evaluada tambi�n mediante el modelo de pleures�a alerg�nica (Penido et al., 2001; Sampaio et al., 2000). La Figura 7 indica los resultados del tratamiento previo por v�a oral con tetranortriterpenoides en dosis de 25, 50, 100 y 200 mg/l sobre la pleures�a inducida por alb�mina de huevo en ratones Swiss, durante el per�odo de 24 horas. Cada barra muestra la media � AND.P.M. de al menos 8 animales. Los asteriscos indican valores estad�sticamente diferentes con respecto al grupo que hab�a recibido una inyecci�n intrator�cica de soluci�n salina (testigo negativo) y + indica diferencias con respecto al grupo estimulado con alb�mina de huevo (testigo positivo) (p:0,05), seg�n el ensayo de la T de Student y Newman Keuls. La figura pone de manifiesto que la inyecci�n de alb�mina de huevo (12 !g/cavidad) hab�a sido capaz de inducir producci�n proteica excesiva en la cavidad pleural de los ratones (segunda columna) significativamente diferente de la del grupo testigo negativo. La dexametasona es antiinflamatoria y la dosis de 2 mg/Kg (30 mg/Kg, p.o.) (tercera columna) fue capaz de inhibir significativamente la acumulaci�n de c�lulas inducida por la alb�mina de huevo. Igualmente, el tratamiento previo con los tetranortriterpenoides (dosis de 50, 100 y 200 mg/Kg, p.o.) hab�a sido capaz de inhibir significativamente la acumulaci�n de leucocitos totales inducida por la alb�mina de huevo, debido a la inhibici�n de la movilizaci�n de eosin�filos en la cavidad pleural, de la misma magnitud que el inhibidor de referencia.
Ejemplo 7:
Evaluaci�n in vivo de la actividad antihistam�nica de los tetranortriterpenoides aislados del aceite de Carapa guianensis, administrados por v�a oral.
Despu�s se evalu� la actividad antihistam�nica de los tetranortriterpenoides mediante el modelo del edema de la pata, el edema de la oreja y la pleures�a. La figura 8 est� relacionada con los resultados del tratamiento previo por v�a oral con tetranortriterpenoides sobre el edema de la pata inducido por histamina en el rat�n (a, 12,5; 25; 50; 100; y 200 mg/Kg) y en la rata (b, 12,5; 25; 50 y 100 mg/Kg). En el experimento con ratones se uso como inhibidor de referencia el antihistam�nico hidrocloruro de prometacina, por comparaci�n, como testigo positivo. En el experimento con ratas, se us� ciproheptadina, un antagonista de la pareja de receptores de serotonina (5-HT2) e histamina (H1).
Cada barra muestra la media � AND. P.M. de 8 animales en la figura 8a, y de 5 animales en la figura 8b. Las barras abiertas indican las medias de animales estimulados con histamina que no hab�an recibido tratamiento (testigo positivo). Las barras cerradas corresponden a grupos estimulados con histamina, que hab�an recibido tratamiento previo por v�a oral con inhibidores de referencia (prometacina, 30 mg/Kg para los ratones y ciproheptadina, 30 mg/Kg para las ratas). Las barras rayadas muestran grupos de animales estimulados con histamina y tratados previamente por v�a oral con dosis diferentes de tetranortriterpenoides. Los asteriscos muestran diferencias estad�sticamente significativas (p:0,05) con respecto al grupo testigo positivo. Como se ha demostrado anteriormente, la figura pone de manifiesto que la estimulaci�n intraplantar con histamina fue capaz de inducir el edema en ratones (Sampaio et al., 1995) y en ratas (Henriques et al., 1991), y que este fen�meno hab�a sido inhibido por los compuestos de referencia empleados. En los ratones, todas las dosis de tetranortriterpenoides ensayadas pudieron inhibir significativamente el edema de la pata inducido por histamina, mientras que en las ratas, solamente dosis superiores a 12,5 mg/Kg fueron capaces de inhibir esta reacci�n. V�ase: Figura 8.
Despu�s, se evalu� la actividad antihistam�nica de los tetranortriterpenoides en el edema de la oreja del rat�n (figura 9). En esta figura cada barra corresponde a la media � And.P.M. de 7 animales. El asterisco indica la diferencia estad�stica (p:0,05) entre el grupo testigo negativo (inyectado con soluci�n salina) y el testigo positivo (inyectado con histamina). + indica la diferencia estad�stica con respecto con el grupo testigo positivo.. La gr�fica pone de manifiesto que la inyecci�n de histamina hab�a sido capaz de inducir exceso de producci�n de plasma en la oreja de los ratones 30 minutos despu�s del est�mulo (segunda barra), significativamente diferentes de la media del grupo inyectado con soluci�n salina (primera barra). El tratamiento previo por v�a oral con las dos dosis de tetranortriterpenoides (50 y 100 mg/Kg) pudo inhibir la formaci�n de edema en la misma cantidad que el tratamiento previo con el inhibidor de referencia (prometacina, 10 mg/Kg, p.p.).
La figura 10 muestra el efecto antiedemat�geno de los tetranortriterpenoides en el modelo de pleures�a inducida por histamina en el rat�n. Cada barra corresponde a la media � AND.P.M. de 7 animales. El asterisco indica diferencia estad�stica (p:0,05) entre el grupo testigo negativo (inyectado con soluci�n salina) y el testigo positivo (inyectado con histamina). + indica diferencia estad�stica con respecto al grupo testigo positivo. Como pone de manifiesto la figura, la estimulaci�n intrator�cica con histamina (100 !g/cavidad) hab�a sido capaz de inducir exudaci�n pleural en le per�odo de 1 hora (segunda barra) en comparaci�n con el grupo testigo negativo (primera barra). Las otras barras corresponden a las medias de grupos tratados previamente por v�a oral con prometacina (30 mg/Kg, tercera barra) o con diferentes dosis de tetranortriterpenoides (25, 50, 100 y 200 mg/Kg, otras barras) y estimulados con histamina una hora despu�s del tratamiento. Puede observarse que todas las dosis de tetranortriterpenoides hab�an podido inhibir la exudaci�n plasm�tica de la cavidad tor�cica, sin diferencia estad�stica entre la media de los grupos tratados.
Ejemplo 8:
Metodolog�a de ensayos in vivo que se refieren a la actividad antialerg�nica de formulaciones de cremas de aceite de Carapa guianensis y de tetranortriterpenoides aislados del aceite de Carapa guianensis , administradas por v�a t�pica.
El an�lisis de la actividad antialerg�nica de formulaciones de cremas del aceite de Carapa guianensis y de tetranortriterpenoides aislados del aceite de Carapa guianensis, para uso t�pico, fue llevado a cabo mediante la metodolog�a del edema al�rgico de la pata, en ratones Swiss y en ratas Wistar. Para este an�lisis, el tratamiento por v�a t�pica con una formulaci�n particular de esta invenci�n se llev� a cabo en una de las patas traseras de los animales. Es importante apreciar que en el estudio se incluy� un grupo testigo, que recibi� el “blanco” (una formulaci�n que conten�a todos los excipientes, no provista del principio activo). La aplicaci�n de la crema se efectu� con ayuda de una esp�tula, y las patas traseras fueron inmovilizadas durante 5 minutos para permitir la absorci�n de la crema. Treinta minutos despu�s del tratamiento t�pico, se efectu� la estimulaci�n, mediante inyecci�n intraplantar de alb�mina de huevo (3 !g/pata) en animales previamente sensibilizados. El an�lisis del edema se llev� a cabo treinta minutos despu�s de la estimulaci�n.
Ejemplo 9:
Evaluaci�n de ensayos in vivo que se refieren a la actividad antialerg�nica de formulaciones de cremas a base de aceite de Carapa guianensis y de tetranortriterpenoides aislados de aceites de Carapa guianensis, administradas por v�a t�pica.
La figura 11 se refiere a los resultados de tratamiento previo por v�a t�pica con formulaciones de cremas a base de aceite de Carapa guianensis y de tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis, sobre el edema de la pata del rat�n (A) o de la rata (B), inducido por alb�mina de huevo (3 !g/pata) en los ratones. En ambos experimentos se us� prometacina en crema como inhibidor de referencia. Cada barra muestra la media � AND.P.M. de 7 animales por grupo. La barra abierta muestra la media de los animales estimulados con alb�mina de huevo que no hab�an recibido tratamiento (testigo positivo). Es importante observar que el tratamiento con la formulaci�n testigo (excipientes) no indujo alteraci�n alguna del volumen de las patas de los animales tratados. Las barras cerradas corresponden a los grupos estimulados con alb�mina de huevo, que hab�an recibido tratamiento t�pico previo con la crema de prometacina. Las barras rayadas muestran grupos de animales estimulados con alb�mina de huevo y tratados previamente con formulaciones de cremas a base de aceite de Carapa guianensis y de tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis. Los asteriscos muestran diferencias estad�sticamente significantes (p:0,05) con respecto al grupo testigo positivo. La figura pone de manifiesto que la estimulaci�n intraplantar con alb�mina de huevo hab�a podido inducir el edema en los ratones, y que este fen�meno hab�a sido inhibido por la crema de prometacina. Como puede observarse, las formulaciones de cremas a base de aceite de Carapa guianensis y de tetranortriterpenoides aislados del aceite de Carapa guianensis, presentaban actividad antialerg�nica estad�sticamente significativa cuando se aplicaron a las patas de los ratones treinta minutos antes de la estimulaci�n por alb�mina de huevo. (Las formulaciones H e I tambi�n pusieron de manifiesto buenos resultados en las ratas).
Ejemplo 10:
Metodolog�a de ensayos in vivo que se refieren a la actividad antihistam�nica de formulaciones de cremas a base de aceite de Carapa guianensis y de tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis, administradas por v�a t�pica.
El an�lisis de la actividad antiinflamatoria de formulaciones de cremas a base de aceite de Carapa guianensis y de tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis, para uso t�pico, se realiz� por medio de la metodolog�a del edema de la pata en ratones Swiss y en ratas Wistar. Para este an�lisis se llev� a cabo un tratamiento t�pico en las patas traseras de los animales con una formulaci�n de ensayo. La formulaci�n que conten�a todos los excipientes, pero que no conten�a principio activo, (blanco) se administr� al grupo testigo. La aplicaci�n de la crema se efectu� con ayuda de una esp�tula, y las patas traseras fueron inmovilizadas durante 5 minutos para permitir la absorci�n de la crema. Treinta minutos despu�s del tratamiento t�pico, se llev� a cabo una estimulaci�n, mediante la inyecci�n intraplantar de histamina (100 !g/pata). El an�lisis del edema se realiz� treinta minutos despu�s de la estimulaci�n.
Ejemplo 11:
Evaluaci�n de ensayos in vivo que se refieren a la actividad antihistam�nica de formulaciones de cremas a base de aceite de Carapa guianensis y de tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis, administradas por v�a t�pica
La figura 12 se refiere a los resultados del tratamiento previo por v�a t�pica con formulaciones de cremas a base de aceite de Carapa guianensis y de tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis, sobre el edema de la pata inducido por histamina en el rat�n (Aa) y en la rata (Bb). En ambos experimentos, se us� prometacina en crema como inhibidor de referencia (testigo positivo). Cada barra muestra la media � AND.P.M. de 8 animales en la figura 12(A) y de 5 animales en la figura 12(B). Las barras abiertas muestran las medias de los animales estimulados con histamina que no hab�an recibido tratamiento (testigo positivo). Es importante apreciar que el tratamiento con la formulaci�n testigo (excipientes) no indujo alteraci�n alguna del volumen de las patas de los animales tratados. Las barras cerradas corresponden a grupos estimulados con histamina, que hab�an recibido tratamiento previo por v�a t�pica con crema de prometacina. Las barras rayadas presentan grupos de animales estimulados con histamina y tratados previamente con formulaciones de cremas a base de aceite de Carapa guianensis y de tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis. Los asteriscos muestran diferencias estad�sticamente significativas (p:0,05) con respecto al grupo testigo positivo. La figura pone de manifiesto que la estimulaci�n intraplantar con histamina pudo inducir el edema en los ratones v en las ratas, y que este fen�meno hab�a sido inhibido por la crema de prometacina. Como puede apreciarse, las formulaciones de cremas a base de aceite de Carapa guianensis y de tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis presentaban una actividad antihistam�nica estad�sticamente significativa cuando se aplicaron t�picamente a las patas de los ratones y de las ratas treinta minutos antes de la estimulaci�n con histamina. (La figura 12 expone solamente los resultados de los ratones (A); los resultados de las ratas est�n ausentes (B)).
Ejemplo 12:
Metodolog�a de ensayos in vivo que se refieren a la actividad antiinflamatoria del aceite de Carapa guianensis administrado por v�a oral
La actividad antiinflamatoria del aceite de Carapa guianensis fue evaluada por medio del edema de la pata y de la pleures�a, inducidos por diferentes est�mulos, que se describen como sigue. en ratones Swiss machos
a) Ensayo del edema de la pata
Los animales fueron estimulados mediante inyecci�n intraplantar del est�mulo (zimos�n o carragenina) en una de sus patas traseras, con un volumen de 50 !l/pata). Las dosis usadas fueron: 500 !g/pata de zimos�n y 300 !g/pata de carragenina. En la pata contralateral se inyect� el mismo volumen de veh�culo (soluci�n salina exenta de pir�genos). Cuatro horas despu�s del est�mulo, se analiz� el edema en el pletism�grafo digital, por medio del desplazamiento de fluido ( 0,5 g de NaCl; 3 ml d Extr�n 100%/ 1 litro) producido, por inserci�n de cada pata en la bandeja de medida. Cada an�lisis se llev� a cabo 3 veces.
b) Ensayo de pleures�a
Se indujo pleures�a mediante inyecci�n intrator�cica (i.t.) de carragenina (300 !g/cavidad) en un volumen final de 100 !l (Henriques et al., 1991).. El grupo testigo recibi� 100 !l de veh�culo (soluci�n salina est�ril). Cuatro horas despu�s del est�mulo los animales fueron sacrificados en una c�mara de CO2, sus cavidades pleurales tor�cica fueron expuestas y lavadas con soluci�n tamp�n de fosfato (PBS) heparinizada (20 UI/ml). La cavidad pleural de los animales se lav� con ayuda de una pipeta autom�tica, con un volumen de 1 ml. El lavado de la cavidad pleural se recogi� y se centrifug� (740 g, 10 minutos) para separar las c�lulas para la evaluaci�n posterior de la exudaci�n proteica, seg�n se describe como sigue. Los ratones fueron inyectados previamente por v�a intravenosa en su plexo orbital con azul de Evans al 1% (25 mg/Kg), y la exudaci�n proteica se evalu� por medio de la descarga de azul de Evans, medida por espectrofotometr�a a I 600 nm. La concentraci�n de azul de Evans se determin� comparando la densidad �ptica (D.O.) de los lavados con una curva patr�n de azul de Evans (desde 25,6 hasta 0,2 !g/ml). Los resultados fueron expresados como !g/ml de azul de Evans. El recuento del n�mero de leucocitos totales de la cavidad pleural se efectu� con ayuda de una c�mara de Neubauer de una parte al�cuota del lavado pleural diluida 40 veces con l�quido de T�rk para la lisis de los eritrocitos. El recuento diferencial de c�lulas mononucleares, de neutr�filos y de eosin�filos, se hizo mediante torundas de recogida de las c�lulas coloreadas por el m�todo de MayGr�nwald-Giemsa, con ayuda de un microscopio �ptico con objetivo de inmersi�n (100 x). Los resultados son expresados como el n�mero de c�lulas (x 106) por cavidad.
Ejemplo 13:
Evaluaci�n de ensayos in vivo que se refieren a la actividad antiinflamatoria del aceite de Carapa guianensis administrado por v�a oral.
La actividad antiinflamatoria de los tetranortriterpenoides se evalu� mediante el edema de la pata y la pleures�a, en ratones Swiss. En las figuras 13 y 14, cada barra expone la media � AND.P.M. de 8 animales por grupo. Las columnas abiertas muestran las medias de los vol�menes de la patas de los animales de los grupos estimulados por la inyecci�n de carragenina (300 !g/pata, fig. 13) o zimos�n (500 !g/pata, fig. 14) y las barras cerradas corresponden a la inhibici�n del edema por tratamiento previ� por v�a oral con diclofenaco (100 mg/Kg, segunda barra). Las otras barras corresponden a grupos tratados previamente por v�a oral con aceite de Carapa guianensis y demuestran que las dosis de 100 y 400 mg/Kg pudieron inhibir el edema inducido por zimos�n, y que una dosis de 100 mg/Kg pudo inhibir el edema inducido por carragenina. Los asteriscos indican diferencias estad�sticamente significativas (p:0,05) con respecto al grupo estimulado y sin tratar, seg�n el ensayo de comparaciones m�ltiples de Student Newman Keuls.
La actividad antiinflamatoria del aceite de Carapa guianensis se evalu� tambi�n mediante el modelo de pleures�a. La figura 15 ilustra los resultados del tratamiento previo por v�a oral con aceite de Carapa guianensis en dosis de 100, 200, 300 y 400 mg/Kg, sobre la pleures�a inducida por carragenina en ratones Swiss durante el per�odo de 4 horas. Cada barra muestra la media � AND.P.M. de al menos 7 animales. Los asteriscos indican valores estad�sticamente diferentes con respecto al grupo que hab�a recibido inyecci�n intrator�cica de soluci�n salina (testigo negativo) y + indica diferencias con respecto al grupo estimulado con carragenina (testigo positivo) (p:0,05) seg�n el ensayo de la T de Student y Newman Keuls. La figura pone de manifiesto que la inyecci�n de carragenina (300 !g/cavidad) pudo inducir una producci�n proteica excesiva en la cavidad pleural de los ratones (segunda columna) significativamente diferente de la del grupo testigo negativo. El tratamiento previo por v�a oral con diclofenaco (100 mg/Kg, p.o.) (tercera columna) pudo inhibir de modo importante la superproducci�n proteica inducida por carragenina, como la dosis de 400 mg/kg de aceite de Carapa guianensis. La inyecci�n de carragenina pudo, tambi�n, inducir la acumulaci�n de leucocitos en el foco inflamatorio (B y C, segunda barra). El tratamiento previo con aceite de Carapa guianensis a la dosis de 400 mg/Kg, fue capaz, asimismo, de inhibir significativamente la acumulaci�n de leucocitos totales inducida por carragenina, debido a la inhibici�n de la movilizaci�n de eosin�filos en la cavidad pleural, de la misma magnitud que el inhibidor de referencia.
Ejemplo 14:
Metodolog�a de ensayos in vivo que se refieren a la actividad antiinflamatoria de los tetranortriterpenoides administrados por v�a oral.
Se evalu� la actividad antiinflamatoria de los tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis, por el edema de la pata de ratones Swiss y de ratas Wistar, inducido por diferentes est�mulos, mediante los ensayos que siguen:
a) Ensayo del edema de la pata inducido por el factor activador de plaquetas.
Ratones Swiss fueron estimulados mediante inyecci�n intraplantar de 1 !g/pata de factor activador de plaquetas (PAF) en una de las patas traseras, en un volumen de 50 !l/pata. En la pata contralateral se inyect� el mismo volumen de veh�culo (soluci�n salina est�ril exenta de pir�genos). La estimulaci�n se llev� a cabo en animales sin tratar y en animales tratados previamente con 16 mg/Kg del antagonista del PAF WEB 2170 (p.o., 100 !l). Treinta minutos despu�s del est�mulo el edema se analiz� mediante el pletism�grafo digital, por el desplazamiento de fluido (0,5 g de NaCl; 3 ml de Extr�n 100%/ 1 litro) producido, por inserci�n de cada pata en la bandeja de medida. Cada an�lisis se llev� a cabo 3 veces.,
b) Ensayo del edema de la pata inducido por bradiquinina
Ratas Wistar fueron estimuladas por inyecci�n intraplantar de 10 nmol/pata de bradiquinina (BK) en una de las patas traseras, en un volumen de 50 !l/pata (Henriques, 1951). En la pata contralateral se inyect� el mismo volumen de veh�culo (soluci�n salina est�ril exenta de pir�genos). La estimulaci�n se llev� a cabo en animales sin tratar y en animales tratados previamente mediante una inyecci�n intraplantar de 10 nmol/pata del antagonista de bradiquinina HOE 140, en un volumen de 50 !l. Treinta minutos despu�s del est�mulo se analiz� el edema en el pletism�grafo digital, por el desplazamiento de fluido (0,5 g de NaCl; 3 ml de Extr�n 100%/1 litro) producido, por inserci�n de cada pata en la bandeja de medida. Cada an�lisis se llev� a cabo 3 veces.
Ejemplo 15:
Evaluaci�n de ensayos in vivo que se refieren a la actividad antiinflamatoria de tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis, administrado por v�a oral.
En la figura 16, cada barra muestra la media � E.P.M. de 7 animales. Los resultados presentados demuestran el edema inducido por inyecci�n intraplantar de factor activador de plaquetas (PAF, 1 !g/pata) en ratones Swiss (primera barra) y la inhibici�n del edema por tratamiento previo por v�a oral con el antagonista de PAF, WEB 2170 (16 mg/Kg, segunda barra). Las otras barras corresponden a grupos tratados previamente por v�a oral con los tetranortriterpenoides, y demuestran que las dosis de 15, 50 y 100 mg/Kg hab�an podido inhibir el edema inducida por PAF, pero no lo hab�a hecho la dosis de 12,5 mg/Kg, Los asteriscos indican diferencias estad�sticamente significativas (p:0,05) con respecto al grupo estimulado y no tratado, seg�n el ensayo de comparaciones m�ltiples de Student Newman Keuls.
En la figura 17, cada barra expone la media � E.P.M. de 7 animales. Los resultados presentados demuestran el edema inducido por inyecci�n intraplantar de bradiquinina (10 nmol/pata) en ratas Wistar (primera barra) y la inhibici�n del edema por tratamiento intraplantar previo con el antagonista de la bradiquinina, HOE 140 (10 nmol/pata, intraplantar, segunda barra). Las otras barras corresponden a los grupos tratados previamente por v�a oral con tetranortriterpenoides, y demuestran que las dosis de 12,5, 25, 50 y 100 mg/Kg, pod�an inhibir el edema inducido por bradiquinina. Los asteriscos indican diferencias estad�sticamente significativas (p:0,05) con respecto al grupo estimulado y no tratado, seg�n el ensayo de comparaciones m�ltiples de Student Newman Keuls.
Ejemplo 16:
Metodolog�a de ensayos in vivo que se refieren a la actividad analg�sica del aceite de Carapa guianensis administrado por v�a oral.
Se evalu� la actividad antialerg�nica por medio de un ensayo de hiperalgesia, llevado a cabo en una placa calentada (Hot Plate, Ugo Basile-Italia, modelo DS-37), con ratas Wistar. El ensayo se realiz� por colocaci�n de los animales sobre la placa caliente, limitada por una c�pula acr�lica de aproximadamente 12 cm de di�metro por 40 cm de altura.
a) Hiperalgesia de respuesta al�rgica
La inducci�n del estado de hiperalgesia se llev� a cabo por inyecci�n intraplantar de 10 nmol/pata de alb�mina de huevo en animales previamente sensibilizados (12 !g/pata) en una de las patas traseras de ratas Wistar, en un volumen final de 100 !l/pata. En la pata contralateral se inyect� el mismo volumen de veh�culo (soluci�n salina est�ril exenta de pir�genos). La aplicaci�n del est�mulo se llev� a cabo en animales sin tratar y en animales previamente tratados con diclofenaco (100 mg/Kg, p.o.). Una hora despu�s del est�mulo los animales fueron colocados sobre una placa caliente a 52,5 � 0,5�C y se fijaron dos cron�metros para registrar la latencia de respuesta de retirada de la placa de cada pata trasera. Los resultados fueron expresados en t�rminos de la variaci�n del periodo latente de retirada de las patas de lado derecho y del lado izquierdo, medido en segundos.
b) Hiperalgesia inducida por histamina
La inducci�n de un estado de hiperalgesia se realiz� por inyecci�n intraplantar de 100 !g/pata de histamina en ratas Wistar, en una de las patas traseras, en el volumen final de 100 !l/pata. En la pata contralateral se inyect� el mismo volumen de veh�culo (soluci�n salina est�ril exenta de pir�genos). El est�mulo se llev� a cabo en animales sin tratar y en animales tratados previamente con prometacina (30 mg/Kg, p.o.). Treinta minutos despu�s del est�mulo, los animales fueron colocados en una placa caliente a 52,5 � 0,5�C y se fijaron dos cron�metros para registrar el per�odo latente de respuesta de retirada de cada pata trasera. Los resultados fueron expresados en t�rminos de variaci�n de la latencia de retirada de las patas del lado izquierdo y del lado derecho, medida en segundos.
c) Hiperalgesia inducida por carragenina La inducci�n de un estado de hiperalgesia se realiz� por inyecci�n intraplantar de 600 !g/pata de carragenina en ratas Wistar, en una de las patas traseras, en el volumen final de 100 !l/pata. En la pata contralateral se inyect� el mismo volumen de veh�culo (soluci�n salina est�ril exenta de pir�genos). El est�mulo se llev� a cabo en animales sin tratar y en animales tratados previamente con dipirona (100 mg/Kg, p.o.). Tres horas despu�s del est�mulo, los animales fueron colocados en una placa caliente a 52,5 � 0,5�C y se fijaron dos cron�metros para registrar el per�odo latente de respuesta de retirada de cada pata trasera. Los resultados fueron expresados en t�rminos de variaci�n de la latencia de retirada de las patas del lado izquierdo y del lado derecho, medida en segundos.
Ejemplo 17:
Evaluaci�n de ensayos in vivo que se refieren a la actividad analg�sica del aceite de Carapa guianensis administrado por v�a oral.
En la figura 18, cada barra muestra la media � E.P.M. de 7 animales. Los resultados presentados demuestran hiperalgesia inducida por inyecci�n intraplantar de alb�mina de huevo (12 !g/pata) en ratas Wistar (segunda barra) y la inhibici�n de hiperalgesia por tratamiento previo con diclofenaco (100 mg/Kg, p.o.) (tercera barra). Las otras barras corresponden a grupos tratados previamente por v�a oral con aceite de Carapa guianensis, y demuestran que las dosis de 100, 200 y 400 mg/Kg pudieron inhibir el estado de hiperalgesia inducido por la alb�mina de huevo. El asterisco indica diferencias estad�sticamente significativas (p:0,05) con respecto al grupo sin estimular, y + pone de manifiesto una diferencia estad�stica entre el grupo estimulado y no tratado, seg�n el ensayo de comparaciones m�ltiples de Student Newman Keuls.
La figura 19 muestra la hiperalgesia inducida por inyecci�n intraplantar de histamina (100 !g/pata) en ratas Wistar. Cada barra indica la media � E.P.M. de 7 animales. Una tercera barra indica la inhibici�n de hiperalgesia por tratamiento previo con prometacina (30 mg/Kg, p.o.). Las otras barras corresponden a los grupos tratados previamente por v�a oral con aceite de Carapa guianensis (en dosis de 50, 100, 200 y 400 mg/Kg). Solamente la dosis de 400 mg/Kg fue capaz de inhibir el estado de hiperalgesia inducido por histamina, en la misma intensidad que el inhibidor de referencia. El asterisco indica diferencias estad�sticamente significativas (p:0,05) con respecto al grupo sin estimular, y + pone de manifiesto la diferencia estad�stica entre el grupo estimulado y no tratado, seg�n el ensayo de comparaciones m�ltiples de Student Newman Keuls.
En la figura 20, cada barra indica la media � E.P.M. de 7 animales. Los resultados presentados demuestran hiperalgesia inducida por inyecci�n intraplantar de carragenina (800 mg/pata) en ratas Wistar (segunda barra) y la inhibici�n de hiperalgesia por tratamiento previo con dipirona (100 mg/Kg, p.o., tercera barra). Las otras barras corresponden a los grupos tratados previamente por v�a oral con aceite de Carapa guianensis (en dosis de 50, 100, 200 y 400 mg/Kg). Las dosis de 100, 200 y 400 mg/Kg pudieron inhibir el estado de hiperalgesia inducido por carragenina. El asterisco indica diferencias estad�sticamente significativas (p:0,05) con respecto al grupo sin estimular, y + indica una diferencia estad�stica entre el grupo estimulado y no tratado, seg�n el ensayo de comparaciones m�ltiples de Student Newman Keuls.
Ejemplo 18:
Metodolog�a de ensayos in vivo que se refieren a la actividad analg�sica de tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis, administrados por v�a oral.
a) Hiperalgesia inducida por histamina
La inducci�n de un estado de hiperalgesia se llev� a cabo por inyecci�n intraplantar de 100 !g/pata de histamina en ratas Wistar, en una de las patas traseras, en un volumen final de 100 !l/pata. En la pata contralateral se inyect� el mismo volumen de veh�culo (soluci�n salina est�ril exenta de pir�genos). El est�mulo se efectu� en animales sin tratar y en animales tratados previamente con ciproheptadina (30 mg/Kg, p.o.). Treinta minutos despu�s del est�mulo los animales fueron colocados en una placa caliente a 52,5 � 0,5�C, y se fijaron dos cron�metros para registrar el per�odo latente de respuesta de retirada de la placa de cada una de las patas traseras. Los resultados fueron expresados en t�rminos de variaci�n de la latencia de retirada de las patas del lado izquierdo y derecho, medida en segundos.
Ejemplo 19:
Evaluaci�n de ensayos in vivo que se refieren a la actividad analg�sica de tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis, administrados por v�a oral
En la figura 21, cada barra indica la media � E.P.M. de 7 animales. La primera barra de la figura expone la inducci�n del estados de hiperalgesia, y una segunda barra su inhibici�n por tratamiento previo con el inhibidor de referencia (ciproheptadina, 30 mg/Kg, p.o.). Las otras barras ponen de manifiesto que el tratamiento previo con tetranortriterpenoides en dosis de 12,5, 25, 50 y 100 mg/Kg, hab�a podido inhibir la hiperalgesia inducida por histamina.
Ejemplo 20:
Metodolog�a de ensayos in vitro con referencia a la actividad inmunomoduladora antiinflamatoria de tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis.
a) Ensayo de producci�n de NO
Ratones Balb/c recibieron una inyecci�n intraperitoneal de tioglicolato al 3% (1 ml) y 72 horas despu�s se recogieron los macr�fagos peritoneales por lavado con 5 ml de medio RPMI 1640 est�ril. Las c�lulas obtenidas desde el peritoneo fueron depositadas en una placa de 96 pocillos (2,5 x 105 c�lulas/pocillo) e incubadas durante 1 hora en una estufa de CO2. Despu�s de este per�odo, se recogieron las c�lulas no adherentes por lavado y las c�lulas adherentes fueron estimuladas con LPS (37,5 ng/ml) en un medio rico en interfer�n y/o con tetranortriterpenoides (1, 10. 100 !g/ml) e incubadas durante 24 horas en una estufa de CO2. Parte del sobrenadante libre de c�lulas fue recogido despu�s de centrifugar (2 min; 2800 rpm), transferido (100 !l) a otra placa en la que se a�adi� reactivo de Greiss (100 !l). La determinaci�n de la concentraci�n de nitrito se llev� a cabo en un microlector de placas a 540 nm, por comparaci�n con una curva patr�n de nitrito s�dico. Los resultados obtenidos fueron analizados por an�lisis de la varianza ANOVA, Student-Newman-Keuls o el ensayo de la T de Student. Los resultados fueron expresados como media � error t�pico de la media (E.P.M). Los valores de p : 0,05 fueron considerados significativos,
b) Producci�n de interfer�n-y por esplenocitos
Bazos de ratones Balb-c machos fueron extra�dos en una zona est�ril, y llevados a una placa de Petri que conten�a 3 ml de medio RPMI 1640 con gentamicina (25 !g/ml). En una cabina de flujo laminar los bazos fueron disociados individualmente. Las suspensiones de c�lulas fueron reunidas en un pool en tubos de 15 ml est�riles. La suspensi�n se dej� sedimentar durante 5 minutos y despu�s de este per�odo se recogi� el sobrenadante. La suspensi�n de c�lulas de centrifug� durante 10 minutos a 400 g, y el agregado de c�lulas fue resuspendido con 4 ml de medio RPMI 1640/gentamicina. En otro tubo se colocaron 2 ml de histopaque 1072 y despu�s la suspensi�n de c�lulas. Despu�s de centrifugar durante 30 minutos a 400 g, las c�lulas situadas en la interfase entre el medio de cultivo y el histopaque 1077 fueron recogidas, lavadas (10 minutos a 1500 rpm) y resuspendidas en 1 ml de medio RPMI 1640 suplementado para realizar el recuento de la viabilidad celular por el m�todo del azul trip�n.
Despu�s de obtener y contar la viabilidad celular, las c�lulas fueron sembradas en placas de 96 pocillos (2,5 x 105/pocillo), incubadas durante 30 minutos y se a�adi� Con A (0,4 !g/pocillo) en presencia o no de la muestra de ensayo (1, 10, 100 !g/ml). Para determinar la producci�n de IFN-y, las c�lulas fueron mantenidas en cultivo durante 24 horas despu�s de la estimulaci�n, se centrifug� la placa (2 minutos; 2800 rpm) y el sobrenadante, libre de c�lulas, se recogi� para la valoraci�n del IFN-y por el m�todo ELISA.
C) Ensayo de producci�n de TNF-a
Ratones Balb/c recibieron una inyecci�n intraperitoneal de tioglicolato al 3% (1 ml) y 72 horas despu�s se recogieron los macr�fagos peritoneales por lavado con 5 ml de medio RPMI 1640 est�ril. Las c�lulas obtenidas desde el peritoneo fueron sembradas en una placa de 96 pocillos (2,5 x 105 c�lulas/pocillo) e incubadas durante 1 hora en una estufa de CO2. Despu�s de este per�odo, se recogieron las c�lulas no adherentes por lavado y las c�lulas adherentes fueron estimuladas con LPS (37,5 ng/ml) y/o tetranortriterpenoides (1, 10. 100 !g/ml) e incubadas durante 24 horas en una estufa de CO2. Despu�s de este per�odo la placa se centrifug� (2 minutos, 2800 rpm) y se recogi� parte del sobrenadante exento de c�lulas (100 !l) y se distribuy� en partes al�cuotas para valorar el TNF-a por el m�todo ELISA.
d) Valoraci�n de TNF-a o TNF-y por el m�todo ELISA de captura
Para la valoraci�n de citoquinas, 4 !g/ml de anticuerpo monoclonal purificado anti-TNF-a o anti-TNF-y , se diluyeron con soluci�n tamp�n de Na2HPO4 (0,1 M; pH 9,2), se distribuy� en una placa de 96 pocillos (50 !l/pocillo; Maxisorp NUNC) y se incub� a 4�C durante 18 horas. Despu�s de este per�odo la placa se lav� con PBS Tween (0,05%) y se incub� durante 1 hora a temperatura ambiente con una soluci�n de leche descremada-PBS al 3% (100 !l/pocillo). Despu�s de un nuevo lavado con PBS-Tween (0,05%; PBS-T), la placa se incub� con sobrenadantes duplicados (100 !l) y se incub� a 4�C durante 18 horas. Al cabo de 24 horas, la placa se lav� con PBS-T y se incub� durante 1 hora a temperatura ambiente con 100 !l de anticuerpo monoclonal biotinilado anti-TNF-a o anti-TNF-y (0.4 !g/ml). La placa se lav� luego con PBS-T y se incub� con 50 !l de estreptoavidina peroxidasa (diluci�n 1:800) durante 30 minutos, a temperatura ambiente. La exposici�n se llev� a cabo mediante la adici�n de 100 !l de soluci�n tamp�n de citrato/perborato de sodio que conten�a OPD (0,5 mg/ml). El bloqueo de la respuesta se llev� a cabo mediante la adici�n de 100 !l de H2SO4 2 M, y la lectura se efectu� en un espectrofot�metro a 490 nm. La concentraci�n de citoquinas en el sobrenadante se determin� por comparaci�n con una curva patr�n de TNF-a o TNF-y recombinantes, mediante el programa de an�lisis Soft Max Pro. Los datos de los resultados obtenidos fueron analizados por an�lisis de la varianza ANOVA, Student-Newman-Keuls o el ensayo de la T de Student. Los resultados fueron expresados como media � error t�pico de la media (E.P.M). Los valores de p : 0,05 fueron considerados significativos.
e) Ensayo de proliferaci�n de linfocitos
Se obtuvieron esplenocitos seg�n se ha descrito en el apartado b de este ejemplo. 2,5 x 106 c�lulas fueron sembradas en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. La placa se incub� durante 30 minutos en una estufa a 37�C y se a�adi� CO2 al 5% como ensayos de muestras (0,1-100 !g/ml) en presencia o no de Concanavalina A (Con A, 0,4 !g/pocillo). Las c�lulas fueron mantenidas en la estufa y despu�s de 72 horas se a�adi� 1 !Ci/pocillo de timidina tritiada. Despu�s de 18 horas de la adici�n de timidina, las c�lulas fueron transferidas a una membrana con ayuda de Cell Harvester (Packard). La lectura de la radiactividad se llev� a cabo por centelleo (TopCount NXT; Packard) y los resultados obtenidos fueron expresados como cuentas por minuto (CPM). Los datos obtenidos fueron analizados mediante el an�lisis de la varianza ANOVA, Student-Newman-Keuls o el ensayo de la T de Student. Los resultados fueron expresados como media � error t�pico de la media (E.P.M). Los valores de p : 0,05 fueron considerados significativos.
f) Ensayo de fagocitosis
Para el an�lisis del grado de fagocitosis de los macr�fagos, se emplearon placas de 24 pocillos que conten�an en cada pocillo una l�mina de vidrio de 13 mm de di�metro. Para usar las l�minas se lavaron previamente con una soluci�n al 0,1& de Extr�n Neuter (Merck), y fueron calentadas durante 35 minutos aproximadamente. La operaci�n se duplic� con agua destilada, Las l�minas se secaron en una estufa y se sumergieron durante 18 horas en una soluci�n de �cido n�trico al 0,1%, Despu�s de este tratamiento fueron enjuagas con agua destilada, secadas en estufa e irradiadas (2500 rad). 2 x 105 c�lulas/pocillo fueron sembradas en presencia de IFN-y (10 Unidades/ml), tetranortriterpenoides (100 !g/ml) o como testigo, medio RPMI 1640 suplementado. Al cabo de 1 hora en la estufa a 37�C (5% de CO2), se a�adi� 50 !l de zimos�n (concentraci�n final de 106 part�culas/ml). Esta suspensi�n de zimos�n se prepar� con una concentraci�n 2,5 mg/ml en el seno de PBS est�ril, se centrifug� durante 15 minutos (3500 rpm), y el agregado se volvi� a suspender en 1 ml de PBS est�ril. Despu�s de someter a ultrasonidos (10 minutos), se separ� una parte al�cuota de la suspensi�n y se diluy� para contar el n�mero de part�culas exentas de zimos�n, en la c�mara de Neubauer con microscopio �ptico (objetivo de 20 aumentos). Despu�s de la adici�n de zimos�n, el cultivo se llev� de nuevo a la estufa durante 1 hora m�s. Despu�s de este per�odo las l�minas fueron procesadas para evaluar la fagocitosis. Para la evaluaci�n de las l�minas, las c�lulas fueron lavadas con PBS y fijadas con paraformaldeh�do al 2% durante 20 minutos. Despu�s de un nuevo lavado, las c�lulas fueron coloreadas con Hematoxilina-Eosina. Una vez coloreadas, las l�minas fueron lavadas con agua de nueva aportaci�n, colocadas sobre un porta y llevadas al microscopio para efectuar el recuento de las c�lulas.
Con objeto de cuantificar el grado de fagocitosis se cont� el n�mero de part�culas encontradas en 200 c�lulas. Las c�lulas que presentaban en su interior un n�mero igual o mayor que 4 part�culas de zimos�n, fueron aceptadas como positivas de fagocitosis. Los resultados fueron expresados como porcentaje de fagocitosis con respecto al grupo testigo mediante la f�rmula que sigue:
N� de c�lulas positivas en el grupo tratado
Fagocitosis (%) =--------------------x 100
N� de c�lulas positivas en el grupo del medio
Los datos obtenidos fueron analizados mediante el an�lisis de la varianza ANOVA, Student-Newman-Keuls o el ensayo de la T de Student. Los resultados fueron expresados como media � error t�pico de la media (E.P.M). Los valores de p : 0,05 fueron considerados significativos
Ejemplo 21:
Evaluaci�n de ensayos in vitro que se refieren a la actividad antiinflamatoria e inmunomoduladora de los tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis.
a) Evaluaci�n de la influencia de tetranortripernoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis sobre la producci�n de �xido n�trico.
El primer modelo experimental in vitro utilizado para evaluar la actividad antiinflamatoria de los tetranortriterpenoides fue el modelo de producci�n de �xido n�trico por los macr�fagos peritoneales. En la figura 22, cada columna ilustra la media de una experimento de demostraci�n realizado por duplicado y los asteriscos y las cruces indican p:0,05 comparados respectivamente con los valores de grupos sin estimular (columna abierta) o con los valores del grupo estimulado con LPS en un medio acondicionado (columna cerrada)
Se observ� la producci�n de �xido n�trico inducida por estimulaci�n durante 24 horas con LPS (30 mg/ml) y un medio rico en interfer�n (columna cerrada), la producci�n basal de �xido n�trico (primera columna abierta) y el efecto de los tetranortriterpenoides (1, 10 y 100 !g/ml) (columna rayada). La producci�n basal (tercera a quinta columnas) de �xido n�trico fue inhibida significativamente con la dosis de 1 !g/ml, y la dosis m�xima fue 100 !g/ml. En los grupos estimulados con LPS y con un medio rico en interfer�n se observ� una inhibici�n discreta de la producci�n de �xido n�trico en dosis de 1 y 10 !g/ml de tetranortriterpenoides, sin embargo, el tratamiento con una dosis de 100 !g/ml pudo reducir la producci�n de �xido n�trico a valores inferiores al valor basal.
b) Evaluaci�n de la influencia de tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis sobre la producci�n de interfer�n-y y TNF-a.
La evaluaci�n de la actividad antiinflamatoria y de inmunomodulaci�n se efectu� mediante la producci�n de IFN-y por esplenocitos y de TNF-a por los macr�fagos peritoneales murinos. En las figuras 23 y 24, cada columna muestra la media de los replicados de un experimento de demostraci�n, y los asteriscos y las cruces indican p:0,05 cuando se compararon, respectivamente, con los valores del grupo sin estimular (columna abierta) o con los valores del grupo estimulado (columna cerrada). La producci�n de IFN-y por los esplenocitos murinos fue evaluada 24 horas despu�s de la estimulaci�n con Con-A (0,4 !g/pocillo) en presencia o no de dosis crecientes de tetranortriterpenoides (1, 10, 100 !g/ml). Tambi�n se analiz� el efecto de los tetranortriterpenoides sobre la producci�n basal de IFN-y. En la figura 23 se observa que el tratamiento con tetranortriterpenoides no hab�a alterado la producci�n basal de IFN-y (tercera a quinta columnas). La estimulaci�n con Con-A induce la producci�n de IFN-y (p:0,05) en 24 horas y el tratamiento con tetranortriterpenoides hab�a inhibido significativamente (p<0,05) la producci�n de esta citoquina. En el modelo de producci�n de TNF-a por los macr�fagos murinos, se observ� que el tratamiento con tetranortriterpenoides (cuarta a s�ptima columnas, figura 24) no hab�a alterado la producci�n basal de TNF-a (columna abierta. El glucocorticoide dexametasona (0,005 !M; tercera columna) inhibi� significativamente la producci�n de TNF (300 ng/ml; columna cerrada) por macr�fagos estimulados con LPS (30 ng/ml) durante 24 horas; sin embargo, el tratamiento con tetranortriterpenoides no pudo alterar la producci�n basal de TNF-a, pero fue capaz de inhibir (p<0,05) en dosis de 0,01, 0,1 y 10 !g/ml, la producci�n de esta citoquina inducida por LPS.
c) Evaluaci�n de la influencia de los tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis sobre la proliferaci�n de linfocitos.
En la figura 25 cada columna muestra la media de experimentos de demostraci�n replicados, y los asteriscos y las cruces indican p:0,05 al comparar, respectivamente, con las del grupo sin estimular (columna abierta; primera columna) o con las del grupo estimulado con Con-A (0,4 !g/pocillo; columna cerrada). Se observa que la incubaci�n de linfocitos con los tetranortriterpenoides no pudo alterar la proliferaci�n basal de linfocitos in vitro (cuarta a octava columnas) y que la estimulaci�n durante 72 horas con Con-A induce la proliferaci�n de linfocitos (columna cerrada). El tratamiento previo con tetranortriterpenoides inhibi� (p<0,05) en dosis de 0,1, 10 y 100 !g/ml (columnas nueve a trece) la proliferaci�n de linfocitos inducida por Con-A. El tratamiento con dexametasona (0,005 !M) inhibi� significativamente la proliferaci�n de linfocitos (p<0,05).
d) Evaluaci�n de la influencia de los tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis sobre la fagocitosis por macr�fagos murinos.
Con objeto de evaluar la modulaci�n de la actividad de macr�fagos, se analiz� el efecto de los tetranortriterpenoides sobre la fagocitosis de part�culas de zimos�n por los macr�fagos murinos. En la figura 26 los datos de los resultados obtenidos fueron expresados como porcentaje del grado de fagocitosis, y cada columna ilustra la media de un experimento de demostraci�n realizado por triplicado, y los asteriscos y las cruces indican p:0,05 al comparar, respectivamente, con el grupo que hab�a recibido solamente zimos�n (106 part../ml; primera columna) o con el grupo estimulado con zimos�n en presencia de IFN-y (10 UI(ml; tercera columna). Se observa que el tratamiento con tetranortriterpenoides (100 !g/ml; segunda columna) inhibi� significativamente la fagocitosis basal de los macr�fagos peritoneales. El tratamiento de las c�lulas con IFN indujo un aumento discreto del grado de fagocitosis y el tratamiento con tetranortriterpenoides fue capaz de hacer disminuir el grado de fagocitosis a valores por debajo del valor basal (cuarta columna; p<0,05).
Ejemplo 22:
Metodolog�a de ensayos in vivo que se refieren a la inducci�n de ulceraci�n g�strica aguda por administraci�n oral de tetranortriterpenoides.
Ensayo de inducci�n de ulceraci�n aguda por tetranortriterpenoides.
Este ensayo se efectu� en animales C57/B110 en ayuno durante 24 horas con libre acceso a agua, mantenidos en una jaula que imped�a la ingesti�n de virutas de madera. Los animales recibieron. por v�a oral, 100 � 200 mg/Kg de tetranortriterpenoides en el seno de 200 !l de soluci�n salina, con ayuda de una aguja curva especial con extremo esf�rico. Al grupo testigo se administr� solamente soluci�n salina, con el mismo volumen. Cinco horas despu�s de la administraci�n oral los ratones fueron sacrificados en una c�mara de CO2 y fijados en una rejilla con p�as adecuadas. El pelo de los animales fue asegurado con alcohol para evitar la interferencia de los pelos mientras se extra�a el est�mago. El pelo de los ratones fue retirado con unas pinzas planas en la regi�n cercana al �rgano genital y se hizo una incisi�n desde esta regi�n hasta la zona del cuello. Despu�s, se estir� la piel en sentido
horizontal, quedando completamente visible la zona abdominal para poder manipular. A trav�s de una incisi�n en esta regi�n se aisl� el est�mago, se extrajo de la cavidad abdominal y se lav� exteriormente con PBS, Cada est�mago se abri� por la curvatura m�s peque�a, se lav� y se hizo pasar a tubos de polipropileno de 50 ml con fondo c�nico, debidamente identificados y que conten�an PBS. Despu�s de retirar todos los est�magos, fueron 5 colocados cuidadosamente sobre una rejilla y las dos primeras p�as se colocaron en las extremidades de la regi�n del fondo y las otras dos, en la regi�n de la cavidad. Con la fijaci�n de todos los est�magos sobre la rejilla, se instilaron 2-3 gotas de PBS en la mucosa g�strica de cada uno de ellos, con objeto de preservar la humedad y se efectu� el an�lisis macrosc�pico de la mucosa g�strica por medio de un microscopio estereosc�pico. En la tabla que figura a continuaci�n, se describen los par�metros que fueron evaluados, considerando los siguientes grados de la 10 gravedad de las lesiones:
Ligera – cuando la zona afectada es < 25%;
Moderada – cuando la zona es � 50%
Intensa – Cuando la zona afectada es > 50%.
Grupo de lesiones g�stricas
Gravedad de la lesi�n Puntuaci�n Animal X
1. Color de la mucosa
Normal 1 1
Hiper�mica
2
Descolorida
3
2. P�rdida de pliegues de la mucosa
1
3. Petequia
Ligera 1
Moderada
2
Intensa
3
4. Edema
Ligera 1
Moderada
2
Intensa
3
5. Hemorragia
Ligera 1
Moderada
2
Intensa
3
6. P�rdida de mucosa
Ligera 1
Moderada
2
Intensa
3
7. Lesiones ulcerativas
Hasta 1 mm 1
> 1 mm
1,5 x n
Perforada
5 x n
Total
Med�a de lesiones
Desviaci�n t�pica
Error t�pico de la media
15 Ejemplo 23: Evaluaci�n del da�o g�strico in vivo despu�s de la administraci�n oral de tetranortriterpenoides
Para evaluar la actividad ulcer�gena de los tetranortriterpenoides, se ensayaron dosis de 100 y 200 mg/Kg en ratones C57/B110. Los an�lisis fueron llevados a cabo 5 horas despu�s de la administraci�n de los tetranortriterpenoides. Los resultados han sido expresados como media del grado de las lesiones, seg�n se ha descrito por Lapa et al. (2003), y el error t�pico de la media (E.P.M.), y analizados estad�sticamente mediante an�lisis
5 de la varianza (ANOVA), seguido del ensayo de comparaciones m�ltiples de Newman-Keuls, o mediante el ensayo de la T de Student con un nivel de significaci�n menor o igual que 0,05 (p:0,05).
La Figura 27 ilustra los resultados del tratamiento previo de ratones con tetranortriterpenoides, en dosis de 100 y 200 mg/Kg. Cada barra muestra la media � E.P.M. de 7 animales por lo menos. La barra abierta corresponde al grupo de animales que hab�a recibido el veh�culo (soluci�n salina). La segunda barra corresponde al grupo que hab�a
10 recibido 100 mg/Kg de tetranortriterpenoides, y la tercera barra muestra los animales que hab�an recibido una dosis de 200 mg/Kg. La figura 27 pone de manifiesto que la administraci�n oral de tetranortriterpenoides en el rat�n no indujo alteraci�n alguna en la mucosa g�strica, conforme a la escala de evaluaci�n descrita en el ejemplo 22, en ninguna de las dosis ensayadas..

Claims (4)

  1. REIVINDICACIONES
    1.-Una composici�n farmac�utica caracterizada por comprender como ingredientes activos los componentes (a) o
    (b) que siguen:
    (a) 5 a 30% de un aceite extra�do de las semillas de Carapa guianensis Aublet y 0,01% a 5% de
    tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis Aublet, en la que los 5 tetranortriterpenoides son responsables de la actividad farmac�utica;
    (b) 0,01% a 5% de tetranortriterpenoides aislados desde el aceite de Carapa guianensis Aublet, en la que los tetranortriterpenoides son responsables de la actividad farmac�utica;
    en la que la composici�n (a) o (b) comprende, adem�s, como veh�culos y/o aditivos, 0,5 a 6% de bases de emulsi�n; 0,2 a 2% de vaselina s�lida; 0,05 a 0,1% de agentes conservantes; 2 a 20% de agentes humidificantes; 10 0,1a 10% de 1,8-Cineol; y agua destilada, q.s.p. 100%.
    en la que la forma farmac�utica de la composici�n (a) o (b) es oral o t�pica.
  2. 2.-Una composici�n farmac�utica seg�n la reivindicaci�n 1, caracterizada por tener forma l�quida, s�lida o semis�lida.
  3. 3.-Una composici�n farmac�utica seg�n la reivindicaci�n 1 � 2, caracterizada porque la forma farmac�utica es la de 15 una formulaci�n t�pica seleccionada entre el grupo que consiste en crema, pomada, loci�n, gel o suspensi�n.
  4. 4..-Uso de la composici�n farmac�utica seg�n cualquiera de las reivindicaciones 1a 3, para preparar un medicamento antialerg�nico, antiinflamatorio, analg�sico e inmunomodulador.
    Fig. 4
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