CN101011577B - 载生存素小分子rna聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒及其制备方法，其特征在于以聚酰胺-胺型树枝状聚合物为载体，聚酰胺-胺型树枝状聚合物的胺基团数与生存素小分子RNA的磷酸盐基团数的比例为1∶10，形成聚酰胺树枝状聚合物生存素小分子RNA交联复合物，微球粒径在25℃时平均粒径为85.46纳米。所得纳米微粒粒径小，对小分子RNA包裹率高，携带量大，提高小分子RNA抗酸及抗酶能力，增加细胞转染率，具有小分子干扰技术高效、特异的优点。疾病治疗中用于抗肝癌治疗，提高基因抗肝癌治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型药物剂型，具体为载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒及其制备方法。
背景技术
生存素(Survivin)是近年来新发现的一种重要的凋亡抑制因子，选择性地表达于多种恶性肿瘤(特别是肝癌)，而在正常组织细胞不表达，抑制生存素的表达有可能促进肝癌细胞凋亡，已成为当前恶性肿瘤治疗研究的新靶点。
反义技术是近年肿瘤治疗研究的一种有效基因治疗手段，对于封闭有害基因表达，阻断肿瘤发生发展具有重要价值。在各种反义手段中，新近出现的核糖核酸干扰(RNA interference，RNAi)技术尤其引人注目，是指由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平关闭相应序列基因表达的过程，具有特异、高效的特点，作为新兴的基因阻断技术，将在人类基因功能研究、基因治疗方面具有巨大的应用前景。而小分子干扰RNA是核糖核酸干扰技术中最关键的效应分子。
纳米技术作为一门新兴学科已交叉渗透到其它众多学科领域，在生物医药领域的最突出表现在于其作为药物载体具有广阔的应用前景。最近国外采用聚酰胺-胺型树枝状聚合物(PAMAM dendrimers)较以往采用的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)等纳米载体比较具有携带量更大、透膜能力更强、缓释性更好、对人体无害等多方面的优点，但迄今国内外均未见聚酰胺-胺型树枝状聚合物携带生存素特异性小分子RNA的报道。
发明内容
本发明的目的在于以7代(G7)的聚酰胺-胺型树枝状聚合物作为载体，将其与生存素特异性小分子RNA相结合，制备出具有一定抗酶及抗酸能力的载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒。该纳米微粒具有较好的抗酸、抗酶能力与缓释性，可较大的提高小分子RNA的携带量、转染率，增强小分子RNA的靶向特异性，且对人体无毒，较好的提高了生存素特异性小分子RNA抗肝癌治疗效果。
本发明提出的上述载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒具体制备步骤如下：
精密提取10D小分子RNA离心，用50微升的超纯水稀释，得到溶液A；取16微升7代聚酰胺-胺型树枝状聚合物(G7代PAMAM dendrimers)溶液用34微升超纯水稀释得溶液B；取B溶液1微升稀释到15微升得溶液C；取A溶液1微升，C溶液4微升，加入15微升无血清培养基中，使聚酰胺-胺型树枝状聚合物的胺基团数与小分子RNA的磷酸盐基团数的比例为1∶10，在室温下孵育10分钟，即得载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒。
本发明的纳米药物是以聚酰胺-胺型树枝状聚合物为载体，与生存素特异小分子RNA相互交联形成纳米微粒。该种纳米微粒平均粒径在25℃为85.46纳米，且具有较好抗酶、抗酸能力，在体外可较好的保护小分子RNA免受破坏。
上述微粒的载体为7代聚酰胺-胺型树枝状聚合物。
上述微粒的携带物为生存素特异性小分子RNA。
上述纳米微粒具有携带RNA量大，保护性好等优点，可提高小分子RNA的转染率。
本发明中，所用的纳米载体可以是各代聚酰胺树形分子其中的一种(包括G1、G2、G3、G4、G5、G6等)。
本发明中，所用的媒介为无血清培养液。
本发明研制的载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒，其平均粒径在25℃为85.46纳米。
本发明研制的载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒，其携带RNA的量可通过调节聚酰胺-胺型树枝状聚合物的胺基团数与小分子RNA的磷酸盐基团数的比例进行调整，以1∶10的比例可达到完全包裹。
目前，国际上携带siRNA的研究多偏重于以脂质体、病毒为载体，本发明研制的纳米微球具有以下优点：1、新型纳米载体聚酰胺-胺型树枝状聚合物属于非生物材料，对人体细胞无毒，也没有免疫原性，不会引起机体免疫反应；2、与病毒载体不同，无遗传毒性与细胞毒性；3、由于其特殊的树枝状结构(具有极大的比表面)，携带小分子RNA量大；4、纳米载体与小分子RNA相结合后，可较好的保护小分子RNA片断不被RNA酶降解；5、新型纳米载体可明显提高小分子RNA转染率，提高胞内浓度；6、小分子RNA技术具有特异、高效的特点，可明显抑制生存素基因的表达；7、该载体系统可缓慢的释放药物，维持有效的药物浓度；8、与质粒、病毒等介导的载药体系比较，具有较好的体外可操控性。
附图说明
图1为载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒抗酶能力
图2为载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒抗酸能力
图3为不同电荷比制备所得纳米微粒凝胶电泳图
具体实施方式
以下通过试验进一步阐明本发明所述药物的有益效果。
试验例1.载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒抗酶能力研究将制备的载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒和空白质粒用核糖核酸酶(Rnase)进行消化，消化液按下面的标准条件进行操作。将各组纳米粒在37-38℃分别孵育20min、40min、60min、90min，各组反应结束后放入液氮终止反应，全部反应结束后加入3μl肝磷脂以解离复合物，其他空白组直接用核糖核酸酶进行消化，将各组消化物在3％的琼脂糖凝胶中电泳，实验结果见图1。
图1中1：裸小分子RNA，未加入核糖核酸酶；2：载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒，未加入核糖核酸酶；3，4：裸小分子RNA和载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒，加入2.0μg核糖核酸酶孵育20min；5，6：裸小分子RNA和载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒纳米粒，加入2.5μg核糖核酸酶孵育40min；7，8：裸小分子RNA和载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒，加入3.0μg核糖核酸酶孵育60min；9，10：裸siRNA和载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒，加入3.5μg核糖核酸酶孵育90min。
试验表明，由聚酰胺-胺型树枝状聚合物携带的小分子RNA具有较好的抗酶能力，在于核糖核酸酶共孵育90分钟后，小分子RNA未见破坏。
试验例2载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒抗酸能力研究
载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒在Tris-HCl缓冲液中形成复合物，分别调pH值为2.0、5.0、7.0、10.0，1％琼脂糖凝胶电泳分析，具体结果见图2。
图2中1：PH 2.0组；2：PH 5.0组；3：PH 7.0组；4：PH 10.0组
经琼脂糖凝胶电泳结果表明，在pH值从2到10变化的范围内，载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒没有出现被解离的现象，充分表明该纳米微粒具有较好的抗酸能力。
现结合实施例，对本发明载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒制备做详细描述，应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行简单的修改都属于本发明要求保护的范围。
实施例1.
精密提取10D小分子RNA离心，用50微升的超纯水稀释，得到溶液A；取16微升7代聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶液用34微升超纯水稀释得溶液B；取B溶液1微升稀释到15微升得溶液C；取A溶液1微升，C溶液0.4微升，加入18.6微升无血清培养基中，在室温下孵育10分钟，即得载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒。
小分子RNA包裹情况见图3。
实施例2.
精密提取10D小分子RNA离心，用50微升的超纯水稀释，得到溶液A；取16微升7代聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶液用34微升超纯水稀释得溶液B；取B溶液1微升稀释到15微升得溶液C；取A溶液1微升，C溶液2微升，加入17微升无血清培养基中，在室温下孵育10分钟，即得载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒。
小分子RNA包裹情况见图3。
实施例3.
精密提取10D小分子RNA离心，用50微升的超纯水稀释，得到溶液A；取16微升7代聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶液用34微升超纯水稀释得溶液B；取B溶液1微升稀释到15微升得溶液C；取A溶液1微升，C溶液4微升，加入15微升无血清培养基中，在室温下孵育10分钟，即得载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒。
小分子RNA包裹情况见图3。
实施例4.
精密提取10D小分子RNA离心，用50微升的超纯水稀释，得到溶液A；取16微升7代聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶液用34微升超纯水稀释得溶液B；取A溶液1微升，B溶液0.5微升，加入18.5微升无血清培养基中，在室温下孵育10分钟，即得载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒。
小分子RNA包裹情况见图3。
实施例5.
精密提取10D小分子RNA离心，用50微升的超纯水稀释，得到溶液A；取16微升7代聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶液用34微升超纯水稀释得溶液B；取A溶液1微升，B溶液1微升，加入18.0微升无血清培养基中，在室温下孵育10分钟，即得载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒。
小分子RNA包裹情况见图3。
实施例6.
精密提取10D小分子RNA离心，用50微升的超纯水稀释，得到溶液A；取16微升7代聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶液用34微升超纯水稀释得溶液B；取A溶液1微升，B溶液2微升，加入17.0微升无血清培养基中，在室温下孵育10分钟，即得载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒。
小分子RNA包裹情况见图3。
实施例7.
精密提取10D小分子RNA离心，用50微升的超纯水稀释，得到溶液A；取16微升7代聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶液用34微升超纯水稀释得溶液B；取A溶液1微升，B溶液4微升，加入15.0微升无血清培养基中，在室温下孵育10分钟，即得载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒。
小分子RNA包裹情况见图3。
图3中1.裸小分子RNA；2.生存素小分子RNA与聚酰胺-胺型树枝状聚合物电荷比1∶1(实施例1)；3.生存素小分子RNA与聚酰胺-胺型树枝状聚合物电荷比1∶5(实施例2)；4.生存素小分子RNA与聚酰胺-胺型树枝状聚合物电荷比1∶10(实施例3)；5.生存素小分子RNA与聚酰胺-胺型树枝状聚合物电荷比1∶19(实施例4)；6.生存素小分子RNA与聚酰胺-胺型树枝状聚合物电荷比1∶37(实施例5)；7.生存素小分子RNA与聚酰胺-胺型树枝状聚合物电荷比1∶74(实施例6)；8.生存素小分子RNA与聚酰胺-胺型树枝状聚合物电荷比1∶155(实施例7)。
由图3可以看出，当生存素小分子RNA与聚酰胺-胺型树枝状聚合物电荷比1∶10时，小分子RNA被完全包裹，如减少聚酰胺-胺型树枝状聚合物的用量则部分小分子RNA未被包裹，如增加聚酰胺-胺型树枝状聚合物的用量则会导致材料的过渡浪费。
本发明的目的在于以7代(G7)的聚酰胺-胺型树枝状聚合物作为载体，将其与生存素特异性小分子RNA相结合，制备出具有一定抗酶及抗酸能力的载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒。该纳米微粒具有较好的抗酸、抗酶能力与缓释性，可较大的提高小分子RNA的携带量、转染率，增强小分子RNA的靶向特异性，且对人体无毒，较好的提高了生存素特异性小分子RNA抗肝癌治疗效果。在疾病治疗中可用于抗肝癌治疗，提高基因抗肝癌治疗效果。
Claims (2)
1.一种载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒，其组成包括聚酰胺-胺型树枝状聚合物、生存素小分子RNA，其特征在于由如下步骤制得：
取1OD生存素小分子RNA离心，用50微升的超纯水稀释，得到溶液A；
取16微升第7代聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶液用34微升超纯水稀释得溶液B；
取B溶液1微升稀释到15微升得溶液C；
取A溶液1微升，C溶液4微升，加入15微升无血清培养基中，使溶液中每含有1个胺基团数的聚酰胺-胺型树枝状聚合物，就同时含有10个磷酸盐基团数的生存素小分子RNA，在室温孵育10min，，即得载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒，微球粒径在25℃时平均粒径为85.46纳米。
2.权利要求1所述的一种载生存素小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒在制备抗肝癌药物中的应用。
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