CN102631686A

CN102631686A - 一种多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸复合物及制备方法和应用

Info

Publication number: CN102631686A
Application number: CN2012101147983A
Authority: CN
Inventors: 贾能勤; 马红美; 侯生磊
Original assignee: Shanghai Normal University
Current assignee: Shanghai Normal University; University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2012-04-18
Filing date: 2012-04-18
Publication date: 2012-08-15

Abstract

本发明涉及医药领域，公开了一种多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸复合物以多孔磷酸钙纳米粒子为载体，负载生存素反义寡聚核苷酸或者带荧光标记生存素反义寡聚核苷酸，粒径为30～60nm。通过反相微乳法制备的上述复合物，可介导反义寡聚核苷酸进入细胞，具有较高的细胞转染率，尤其是体外Hela宫颈癌细胞。显著提高反义核酸促进肿瘤细胞凋亡效率，增强其抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物，尤其是治疗宫颈癌的药物，制备方法简单快速。

Description

一种多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸复合物及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体为一种抗癌药物复合物，尤其是一种多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物及制备方法和应用。

背景技术

癌症是严重危害人类健康的主要疾病之一，有效地治疗癌症一直是世界瞩目的研究课题。反义核酸技术是近年发展的一种基因治疗肿瘤的有效方法，它以肿瘤发生相关基因为靶点，通过人工合成的反义寡核苷酸与之特异性互补结合，抑制靶向基因的表达而导致肿瘤细胞凋亡，具有高选择性、高效率、低毒性等特点。但是由于单纯的反义寡聚核苷酸很难进入肿瘤细胞或被降解而达不到治疗效果。研究表明通过选择合适的药物载体输送，可大大提高治疗恶性肿瘤的效果。因此，发展高效安全的基因载体系统在生物医学领域中具有重要意义。

纳米级羟基磷灰石具有良好的生物相容性，生物降解性和生物可吸收性并且无毒副作用，是发展新一代高效高性能药物前提，为治疗癌症这一人类重大疾病提供重要的理论和实验基础。近年来纳米磷酸钙的制备方法主要包括水热合成法、溶胶凝胶法、化学沉淀法和微乳法等，其中，微乳法的微乳液结构限制了颗粒的大小，使纳米微粒的制备成为可能。纳米微粒的制备通常是将两种确定的微乳体系通过混合实现的。含有反应物A，B的两个微乳液经过混合、相互的碰撞或聚结、反应成核和生长等形成纳米微粒。当水核内的微粒长到最后尺寸，表面活性剂分子将附着在微粒的表面，使微粒稳定并防止其进一步长大，最终形成的微粒粒径受到形成的水核大小调控，控制其达到合适的尺寸。

多孔的磷酸钙纳米粒子在药物载体上的应用具有如下优点：1)磷酸钙纳米粒子具有良好的生物相容性，对生物体系的毒性小；2)制备的磷酸钙纳米粒子具有有序的孔道，因而具有较大的比表面积，为药物、蛋白质、DNA及核酸等提供了更多的负载空间，大大提高负载量；

生存素(survivin)是近年来发现的一种凋亡抑制蛋白(IAP)，它主要抑制凋亡中主要的效应蛋白酶caspase3和caspase7来介导凋亡的抑制。在多数恶性肿瘤组织中表达丰富，但在相应正常组织中不表达，这种选择性表达特性使其成为目前恶性肿瘤诊断和治疗的新靶点。而针对生存素(survivin)基因作为药物治疗靶点，负载其反义寡聚核苷酸的多孔磷酸钙纳米粒子药物复合物未见报道。

发明内容

本发明的目的，在于提供一种多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物及其制备方法。

本发明的另一目的，在于将上述多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物用于制备治疗宫颈癌的药物。

为实现上述目的，本发明的技术解决方案是：

一种多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸复合物，含有生存素反义寡聚核苷酸或者带荧光标记生存素反义寡聚核苷酸，粒径为30～60nm。

一种多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物的制备，其特征在于包括以下步骤：

(1)将微乳液I和微乳液II以2000～4000rpm速度搅拌3～7min；两者体积比为1∶0.8～1∶1.2；

微乳液I以乙二醇丁醚和环己烷的混合物为溶剂，含有0.3～0.5μg/mL生存素ASODNs或6’-fam-生存素ASODNs、1～3mmol/L Na₂HPO₄和0.1～0.25mmol/L硅酸钠；乙二醇丁醚与环己烷体积比为1∶2～1∶4；制备方法为，将含有生存素ASODNs或6’-fam-生存素ASODNs、Na₂HPO₄、成核剂硅酸钠的水溶液与乙二醇丁醚、环己烷混合均匀；

微乳液II以乙二醇丁醚和环己烷的混合物为溶剂，含有氯化钙；微乳液II中氯化钙含量为2～4mmol/L；乙二醇丁醚与环己烷体积比为1∶2～1∶4；制备方法为，将氯化钙水溶液与乙二醇丁醚和环己烷混合均匀；

Na₂HPO₄与氯化钙的摩尔比为1∶1～1∶2；生存素ASODNs或6’-fam-生存素ASODNs与氯化钙的用量比为150～200μg/mmol。

(2)继续反应2～3min，加入分散剂柠檬酸钠继续反应10～12min；柠檬酸在总反应体系中含量为0.005～0.01mmol/L；

(3)离心取沉淀洗涤。

通过上述反相微乳法制备得到的多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物，可介导反义寡聚核苷酸进入细胞，具有较高的细胞转染率，尤其是体外Hela宫颈癌细胞。显著提高反义核酸促进肿瘤细胞凋亡效率，增强其抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物，尤其是治疗宫颈癌的药物。

采用上述技术方案后，本发明的多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物的制备及应用具有以下优点：

1、制备方法简单、快速，可靠；

2、该复合物具有转染率高、靶向性强，抑制肿瘤细胞效果明显；

3、对不同的生物体系以多孔磷酸钙纳米粒子为载体输送不同的靶向性生物分子或药物为其它肿瘤或疾病的治疗提供了一条新途径。

附图说明

图1为多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡糖核苷酸药物复合物的TEM图，插图为局部放大的纳米粒子。

图2为多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物随时间的溶解缓释响应。

图3带有FAM荧光素标记的多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物和Hela细胞孵育4小时后流式细胞仪测定其转染率图，未处理的Hela细胞作为对照。

图4为采用噻唑蓝法分别检测多孔磷酸钙纳米粒子、裸露的反义寡聚核苷酸、多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物对Hela细胞孵育不同时间(24、48、72小时)后的细胞抑制率示意图，未处理的Hela细胞作为对照(图中柱状图从左至右依次为未处理的Hela细胞、裸露的反义寡聚核苷酸、多孔磷酸钙纳米粒子和多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物)。

图5为多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物孵育4小时的HeLa细胞生物TEM图。

具体实施方式

以下结合实施例及其附图对本发明作更进一步说明。

实施例1

本发明的多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物的制备，其特征在于包括以下步骤：

a、将预先配制的50μL 120μg/mL ASODNs或6’-fam-ASODNs溶液，650μL0.03mol/L Na₂HPO₄溶液(含0.004mol/L硅酸钠作为成核剂)，4mL乙二醇丁醚和10mL环己烷混合均匀制成微乳液I，同时将650μL 0.05mol/L CaCl₂，4mL乙二醇丁醚和10mL环己烷混合均匀制成微乳液II；

b、在室温条件下，将两种微乳液在机械搅拌条件下强力搅拌5分钟使微乳液达到平衡后，进行快速混合形成微乳混合液。2-3分钟反应后，加入225μL0.001mol/L柠檬酸钠作为分散剂继续进行反应10-12分钟；

c、反应完成后将微乳混合液转至50mL离心管中在离心机转速14000rpm下离心15分钟。离心后，移去离心管中的上清液，将沉淀物用95％乙醇洗涤两次除去有机残液后再用pH7.4PBS洗涤两次以除去剩余的乙醇残液；

d、最后将沉淀物用25mL PBS溶解定容后即可得到分散的反义寡聚核苷酸-多孔磷酸钙纳米粒子(ASODNs-CP)溶液；

图1为本发明实施例的多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物的透射电镜图，从电镜图来看，其粒径为30～60nm。产品随时间的溶解缓释响应如图2所示。

本发明采用反相微乳法制备多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸，构建成一种新型多孔磷酸钙纳米粒子反义寡聚核苷酸复合体。该复合体作用于体外培养的Hela宫颈癌细胞，可有效地介导反义核酸进入细胞，具有较高的细胞转染率，并且显著提高反义核酸促进肿瘤细胞凋亡效率，增强其抗肿瘤活性。

实施例2

多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物的细胞转染率的测定

用带有FAM荧光素标记的反义寡聚核苷酸取代单纯的反义寡聚核苷酸制备多孔磷酸钙纳米粒子反义核酸复合体来考察该药物复合物的细胞转染率。将带有FAM荧光素标记的多孔磷酸钙纳米粒子反义核酸复合体加入到对数生长期的Hela细胞中，在37℃5％CO₂饱和温度下培养4小时。取未经任何处理的对数生长期的Hela细胞，作为阴性对照。胰酶消化后，用70％的乙醇固定。用流式细胞仪检测它们的转染率，结果如图3。该复合药物的转染率可以达到98％以上，说明多孔磷酸钙纳米粒子可以作为一种很好的药物载体应用于生物领域。

Hela宫颈癌细胞的培养：

Hela宫颈癌细胞株购买自中科院细胞库。Hela细胞在含10％小牛血清的MEM培养基，37℃5％CO2饱和温度下培养，实验选用对数生长期细胞。

细胞抑制率的测定：

将多孔磷酸钙纳米粒子(CP)，裸露的反义寡聚核苷酸(naked ASODNs)和多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸(CP-ASODNs)分别加入到对数生长期的Hela细胞中，在37℃5％CO₂饱和温度下培养24h。取未经任何处理的对数生长期的Hela细胞，作为阴性对照，通过噻唑蓝法(MTT)检测细胞的抑制率。结果如图4所示，与裸露的反义寡聚核苷酸相比，多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物可明显提高反义寡聚核苷酸的抑制肿瘤细胞的效率。裸露的反义寡聚核苷酸的肿瘤细胞抑制率为5％，而多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物的肿瘤细胞抑制率达到22％。

实施例3

多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物的应用

除在37℃5％CO₂饱和温度下培养48h，其余同实施例2，结果如图4。裸露的反义寡聚核苷酸的肿瘤细胞抑制率为7％，多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物的肿瘤细胞抑制率达到40％。

实施例4

除在37℃5％CO₂饱和温度下培养72h，其余同实施例2，结果如图4。裸露的反义寡聚核苷酸对肿瘤细胞的抑制率为9％，多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物的肿瘤细胞抑制率达到50％。

实施例5

多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸在HeLa细胞中实际分布情况。对反义寡聚核苷酸-磷酸钙纳米粒子在HeLa细胞中实际分布情况亦可用生物电镜(Biological TEM)进行检测，用反义寡聚核苷酸-磷酸钙纳米粒子(fam-ASODNs-CP)的转染液对HeLa细胞进行孵育4小时后，经胰蛋白酶消化及生物切片固定后，切片进行检测。黑色箭头指向的就是合成的ASODNs-CP纳米粒子，图5中亦可以清晰地看出纳米粒子可以通过细胞的内吞作用转染进入细胞质，而且部分可以到达细胞核的周围，这是由于反义寡聚核酸对细胞核的靶向作用，透射电镜图表征结果证实了制备的ASODNs-CP纳米粒子可以转染进入细胞内部，部分可到达细胞核周围。

以上实施例仅供说明本发明之用，而非对本发明的限制，有关技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以作出各种变换或变化。因此，所有等同的技术方案也应该属于本发明的范畴，应由各权利要求限定。

Claims

1.一种多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸复合物，其特征在于，以多孔磷酸钙纳米粒子为载体，负载生存素反义寡聚核苷酸或者带荧光标记生存素反义寡聚核苷酸，粒径为30～60nm。

2.权利要求1所述多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将微乳液I和微乳液II以2000～4000rpm速度搅拌3～7min；

微乳液I以乙二醇丁醚和环己烷的混合物为溶剂，含有0.3～0.5μg/mL生存素ASODNs或6’-fam-生存素ASODNs、1～3mmol/L Na₂HPO₄和0.1～0.25mmol/L硅酸钠；乙二醇丁醚与环己烷体积比为1∶2～1∶4；

微乳液II以乙二醇丁醚和环己烷的混合物为溶剂，含有氯化钙；微乳液II中氯化钙含量为2～4mmol/L；乙二醇丁醚与环己烷体积比为1∶2～1∶4；

(3)离心取沉淀洗涤。

3.权利要求2所述多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸复合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中微乳液I与微乳液II体积比为1∶0.8～1∶1.2。

4.权利要求2所述多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸复合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中微乳液I制备方法为，将含有生存素ASODNs或6’-fam-生存素ASODNs、Na₂HPO₄、成核剂硅酸钠的水溶液与乙二醇丁醚、环己烷混合均匀。

5.权利要求2所述多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸复合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中微乳液II制备方法为，制备方法为，将氯化钙水溶液与乙二醇丁醚和环己烷混合均匀。

6.权利要求1所述多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.权利要求1所述多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸复合物在制备治疗宫颈癌药物中的应用。