发明内容
本发明提供一种松香基二萜改性α-氨基磷酸酯、制备方法及抗肿瘤应用,该产品活性高,成本低,且环保,产品对肿瘤的抑制率高,制备方法简单。
本发明采用如下技术方案:
一种松香基三环二萜改性的α-氨基膦酸酯,其结构通式如下:
其中,R1为下述取代基中的一种:脱氢枞基、枞基、二氢枞基、四氢枞基、降解脱氢枞基、降解枞基、降解二氢枞基、降解四氢枞基,
R2为下述基团中的一种:
甲基,乙基,正丙基,异丙基,丁基,苯基;
R3的取代位置为已外接长链基团苯环上相应位置的间、对、邻位置,R3表示的取代基为下述基团或基团组合中的一种:氢,邻氟,间氟,对氟,对氯,对三氟甲基,对甲氧基,对硝基,邻羟基,邻羟基和对硝基,邻羟基和对氯,邻羟基和对甲氧基。
上述松香基三环二萜改性的α-氨基膦酸酯的制备方法为,以松香基二萜胺、取代苯甲醛和亚磷酸酯为原料合成松香基三环二萜改性的α-氨基膦酸酯,合成方法为溶剂合成法或一锅合成法或无溶剂合成法,其中松香基二萜胺与取代苯甲醛与亚磷酸酯的物质的量之比为1∶(1-1.05)∶(1-1.1)。
上述技术方案中,溶剂合成法包括如下步骤:
第一步:亚胺的合成:
将松香基二萜胺溶解于低碳醇中,搅拌溶解后加入取代苯甲醛,在20-25℃搅拌反应3-5小时或者加热到60-80℃回流1-2小时,沉淀过滤后干燥;
第二步:松香基三环二萜改性的α-氨基膦酸酯的合成:
将亚胺与亚磷酸酯加入烧瓶中,以甲苯为溶剂,100-120℃反应5-6小时,沉淀经过滤真空干燥。
一锅合成法包括如下步骤,将松香基二萜胺、取代苯甲醛和亚磷酸酯加入烧瓶中,以冰醋酸为溶剂,80-85℃反应5-7小时,然后将溶剂蒸干,加入甲醇,沉淀经过滤后,真空干燥。
无溶剂合成法的步骤为,将松香基二萜胺、取代苯甲醛加热熔融后反应1-2小时,然后加入亚磷酸酯加热于100-120℃反应5-6小时,固体冷却后干燥。
一种用作抗肿瘤应用的松香基三环二萜改性的α-氨基膦酸酯,以上述松香基三环二萜改性的α-氨基膦酸酯为活性成分。
本发明获得如下技术效果:
1.为了对氨基膦酸酯先导化合物进行结构优化,获得高活性的化合物,本发明结合松香基二萜胺在物理和化学性质方面的特点,以生物质资源为原料,采用活性基团拼接原理,将松香基三环二萜结构引入氨基膦酸酯结构中,不仅能大大提高化合物的脂溶性,同时引入了多个手性中心,能大大提高氨基膦酸酯的生物活性,具有高效的抗肿瘤活性。同时R1结构来自天然产物松香,具有独特的化学结构和多个手性中心,产品毒性小,大大提高了松香的附加值,产品的成本低。
2.本发明取对数生长期的肿瘤细胞(如肝癌SMMC7721细胞),用0.25%胰蛋白酶消化后,以含10%小牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度至4.0×104/ml。按每孔100μl(4000个细胞)加入96孔培养板中,孵育8h后加入不同稀释浓度的脱氢枞胺衍生物,使其终浓度分别为100、10、1、0.1μmol/L,空白对照孔加等体积的溶剂。每个浓度均设6个复孔,置37℃、5%CO2孵箱中连续培养48h。培养结束前2h各孔加入MTT(5mg/m1)20μl,放置孵箱中继续孵育4h,弃上清,每孔加入DMSO 150μl,充分振荡混匀后,用酶联免疫检测仪在570nm处测定各孔的吸光度(用OD值表示),计算抑制率。抑制率(%)=(对照组OD值-药物组OD值)/对照组OD值×100%。当松香基二萜氨基膦酸酯衍生物浓度为0.1μmol/L时,对肝癌SMMC7721细胞的抑制率可以达到75%。
3.本发明的制备方法简单,大多数氨基膦酸酯的合成都需要采用甲苯、冰醋酸等溶剂,本发明采用无溶剂法二步合成,无溶剂合成法不仅节约反应成本,而且不造成环境污染,是一种绿色合成方法。松香基二萜的引入使产品具有多个手性中心,能增加产品在有机体中的酯溶性和渗透性,有利于人体吸收,原料来自天然产物,价格便宜,毒性小。部分化合物对肝癌SMMC7721细胞有较好的抑制作用,当实验用药浓度为0.1μmol/L时,对肝癌SMMC7721细胞的抑制率可以达到75%以上。大部分合成药物在体内的最大吸收浓度为100μmol/L,而本发明中的产品在0.1μmol/L时对肝癌SMMC7721细胞就显示出很高的活性。
4.本发明提供上述式的松香基二萜氨基膦酸酯衍生物,这些衍生物具有抗肿瘤活性,因此可以作为抗癌药物的主要成分。
具体实施方式
实施例1
一种松香基三环二萜改性的α-氨基膦酸酯,其结构通式如下:
其中,R1为下述取代基中的一种:
脱氢枞基、 枞基、 二氢枞基、 四氢枞基,
降解脱氢枞基 降解枞基 降解二氢枞基 降解四氢枞基,
R2为下述基团中的一种:
Me(甲基),Et(乙基),n-Pr(正丙基),i-Pr(异丙基),Bu(丁基),Ph(苯基);
R3的取代位置为已外接长链基团苯环上相应位置的间、对、邻位置,R3表示的取代基为下述基团或基团组合中的一种,
即R3可以是下述基团中的一种:
H(氢),o-F(邻氟),m-F(间氟),p-F(对氟),p-Cl(对氯),p-CF3(对三氟甲基),p-OMe(对甲氧基),p-NO2(对硝基),o-OH(邻羟基),
或者R3表示苯环的两个取代基,两个取代基为下述三组基团的一组:
o-OH与p-NO2(邻羟基、对硝基),o-OH与p-Cl(邻羟基、对氯),o-OH与p-OMe(邻羟基、对甲氧基)。
实施例2
上述松香基三环二萜改性的α-氨基膦酸酯的制备方法为,以松香基二萜胺(如脱氢枞基、枞基、二氢枞基、四氢枞基、降解脱氢枞基、降解枞基、降解二氢枞基、降解四氢枞基)、取代苯甲醛和亚磷酸酯为原料合成松香基三环二萜改性的α-氨基膦酸酯,合成方法为溶剂合成法或一锅合成法或无溶剂合成法,其中松香基二萜胺与取代苯甲醛与亚磷酸酯的物质的量之比为1∶(1-1.05)∶(1-1.1),例如可以选取为:1∶1.01∶1,1∶1.02∶1,1∶1.03∶1,1∶1.04∶1,,1∶1.05∶1,,1∶1.01∶1.01,1∶1.01∶1.02,1∶1.01∶1.03,1∶1.01∶1.04,1∶1.01∶1.05,1∶1.01∶1.06,1∶1.01∶1.07,1∶1.01∶1.09,1∶1.02∶1.01,1∶1.02∶1.03,1∶1.02∶1.05,1∶1.02∶1.06,1∶1.02∶1.06,1∶1.02∶1.09,1∶1.02∶1.1,1∶1.03∶1.01,1∶1.03∶1.03.1∶1.03∶1.05,1∶1.03∶1.07,1∶1.03∶1.08,1∶1.04∶1.01,1∶1.04∶1.03,1∶1.04∶1.06,1∶1.04∶1.08,1∶1.04∶1.09,1∶1.05∶1.01。
上述技术方案中,溶剂合成法包括如下步骤:
第一步:亚胺的合成,
将松香基二萜胺((如脱氢枞胺、四氢枞胺等))溶解于低碳醇溶剂中,低碳醇通常是碳原子数小于4的醇,可以为甲醇或者乙醇,加入体积比例为,每摩尔松香基二萜胺中加入4-5mL低碳醇,即溶剂的体积(单位为毫升)与松香基二萜胺的摩尔比为(4-5)∶1,例如4∶1或者4.5∶1,即在1摩尔中加入4毫升,2摩尔中加入9毫升,搅拌溶解后加入取代苯甲醛(取代基为实施例1中的R3,如对氟苯甲醛、对三氟甲基苯甲醛等),在常温(温度通常为20-25℃)搅拌反应3-5小时或者加热到60-80℃回流1-2小时,搅拌反应时间可以选取为3.5小时,4小时,4.6小时,加热回流时间可以为1.5小时,1.7小时,加热回流温度可以为65℃,70℃,75℃,80℃,沉淀过滤后用真空干燥,真空度可以为0.1MPa,干燥温度可以为50-60℃,例如55℃,58℃,真空干燥时间为2-3小时,例如2.5小时,2.8小时,即获得产品。
第二步:松香基三环二萜改性的α-氨基膦酸酯的合成,
将亚胺与亚磷酸酯(如亚磷酸二乙酯、亚磷酸二苯酯等)加入烧瓶中,加入溶剂甲苯,溶剂的体积(单位为毫升)与亚胺的摩尔比为(4-5)∶1,例如4∶1或者4.5∶1,即在1摩尔中加入4毫升,2摩尔中加入9毫升,100-120℃反应5-6小时,温度可以选取为105℃,110℃,114℃,118℃,反应时间可以选取为5.2小时,5.5小时,5.7小时,5.9小时,沉淀,经过滤后,将沉淀真空干燥,真空度可以为0.1MPa,干燥温度为50-60℃,例如选取为55℃,58℃,真空干燥时间为2-3小时,例如时间可以选取为2.5小时,2.8小时,即获得产品。
一锅合成法包括如下步骤,将松香基二萜胺、取代苯甲醛(取代基为实施例1中的R3)和亚磷酸酯加入烧瓶中,以冰醋酸为溶剂,溶剂冰醋酸的体积(单位为毫升)与松香基二萜胺的摩尔比为(4-5)∶1,例如4∶1或者4.5∶1,即在1摩尔中加入4毫升,2摩尔中加入9毫升,80-85℃反应5-7小时,温度可以选取为82℃,84℃,反应时间可以为5.5小时,6小时,6.4小时,然后将溶剂蒸干,加入溶剂甲醇,溶剂甲醇的体积(单位为毫升)与松香基二萜胺的摩尔比为(4-5)∶1,例如4∶1或者4.5∶1,即在1摩尔中加入4毫升,2摩尔中加入9毫升,,沉淀经过滤后,真空干燥,真空度为0.1MPa,干燥温度为50-60℃,例如可以为55℃,真空干燥时间为2-3小时,例如可以为2.5小时,即获得产品。
无溶剂合成法包括,将松香基二萜胺、取代苯甲醛加热熔融后反应1-2小时,然后加入亚磷酸酯加热于100-120℃反应5-6小时,反应温度为105℃,109℃,114℃,118℃,反应时间可以为5.5小时,5.8小时,固体冷却后于温度为50-60℃下,例如可以为55℃,真空度为0.1MPa下,干燥2-3小时,干燥时间可以为2.5小时。
其中溶剂合成法和无溶剂合成法中的亚磷酸酯的分子式为HOP(OR2)2,一锅合成法中的亚磷酸酯的分子式为HOP(OR2)3
R2=Me(甲基)Et(乙基)n-Pr(正丙基)i-Pr(异丙基)Bu(丁基)Ph(苯基)
实施例3
一种用作抗肿瘤应用的松香基三环二萜改性的α-氨基膦酸酯,以上述松香基三环二萜改性的α-氨基膦酸酯为活性成分。
实施例4
在四颈烧瓶中加入10mmol脱氢枞胺,用40毫升无水乙醇溶解,取10mmol苯甲醛,用40毫升乙醇溶解,加入烧瓶中,加热到80℃回流1h,冷却到室温,沉淀过滤,用无水乙醇洗涤数次后在真空度为0.1MPa,干燥温度为50-60℃真空干燥时间为2-3小时,即获得产品脱氢枞胺苯甲醛亚胺。
收率70.2%,m.p.104.5℃.IR(KBr.cm-1):2931,1644(C=N),1040,832H1NMR(CDCl3.δ/ppm.300MHz):8.265(1H,N=CH-);
7.765,7.423,7.2204,7.024,6.906(8H,C=CH-);3.536(1H,N-CH2-);2.879(1H,-CH(Me)2);
2.858,2.303,1.967,1.794,1.579(10H,-CH2-);1.485(1H,>CH-);1.271、1.258、1.084(9H,-CH3)在四颈烧瓶中加入1mmol脱氢枞胺苯甲醛亚胺,用4毫升甲苯溶解,加入1mmol亚磷酸二苯酯,加热到120℃搅拌放应5h,冷却到室温,沉淀经过滤后在真空度为0.1MPa,干燥温度为50-60℃真空干燥时间为2-3小时,即获得产品脱氢枞苯甲氨基磷酸酯。收率70.2%,m.p.104.5℃.
IR(KBr.cm-1):3429 2926 1630 1456 1220 1096 910 757
H1 NMR(CDCl3.δ/ppm.300MHz):7.69-6.82(18H,Ph);
4.82(1H,N-C
H-);3.38(2H,N-C
H 2-);2.88(1H,-C
H(Me)2);.28-1.72.20(10H,-C
H 2-);1.70(1H,>C
H-);1.22-1.09(12H,-C
H 3)
31p NMR(δ/ppm.300MHz):5.46
实验结果如下:
drugs |
Concentration(μmol/L) |
OD |
Inhibition(%) |
空白对照脱氢枞胺苯甲醛亚磷酸二苯酯 |
0.11.010100 |
1.74±0.050.44±0.070.42±0.040.43±0.050.37±0.05 |
075767679 |
实施例5
的制备:
在四颈烧瓶中加入10mmol脱氢枞胺,用40毫升无水乙醇溶解,取10mmol水杨醛,用40毫升无水乙醇溶解,加入烧瓶中,室温搅拌3h,沉淀经过滤后用无水乙醇洗涤数次,50-60℃真空0.1MPa干燥2-3小时,干燥至恒重待用,收率88.4%,m.p.153.2℃.
IR(KBr.cm-1):3442,2937,1628(C=N),1153,759
H1 NMR(CDCl3.δ/ppm.300MHz):13.619(1H,-OH);8.336(1H,N-CH2-);7.349,7.300,7.209,7.023,6.879(6H,C=CH-);3.530(1H,N-CH2-);2.864(1H,-CH(Me)2);2.313,1.837,1.806,1.585,1.503(10H,-CH2-);1.412(1H,>CH-);1.281,1.243,1.079(9H,-CH3)在四颈烧瓶中加入1mmol脱氢枞胺水杨醛亚胺,加入1mmol亚磷酸二乙酯,加入甲苯4毫升,加热到120℃搅拌放应5h,冷却,沉淀经过滤后,50-60℃真空0.1MPa干燥2-3小时,干燥至恒重得到氨基磷酸酯。
收率60.6%,m.p.232.5℃.
IR(KBr.cm-1):3406 2930 1604 1320 1210 1061 764
H1 NMR(CDCl3.δ/ppm.300MHz):6.89-7.51(7H,Ph);4.79(1H,POCH);3.24-3.79(4H,OCH2);2.72-2.87(2H,CH2N);2.29(1H,Me2CH);1.72-2.06(10H,CH2<);1.01-1.53(18H,CH3)
31PNMR(δ/ppm.300MHz):9.93
实施例6
的制备
在四颈烧瓶中加入10mmol脱氢枞胺,取10mmol 5-氯水杨醛加入烧瓶中,加热混合物熔融反应1h,然后加入1mmol亚磷酸二乙酯,加热到120℃反应5h,冷却,固体在50-60℃真空0.1MPa干燥2-3小时,干燥至恒重得到氨基磷酸酯。收率63.5%,m.p.235.2℃.
IR(KBr.cm-1):3456 2938 1626 1487 1236 1057 775
H1 NMR(CDCl3.δ/ppm.300MHz):6.90-7.51(6H,Ph);4.84(1H,POCH);3.28-3.85(4H,OCH2);2.75-2.88(2H,CH2N);2.34(1H,Me2CH);1.74-2.06(10H,CH2<);1.08-1.53(18H,CH3)31P NMR(δ/ppm.300MHz):9.20
实施例7
在四颈烧瓶中加入10mmol脱氢枞胺,取10mmol 5-硝基水杨醛,用40毫升冰醋酸溶解,加入烧瓶中,室温搅拌溶解后,加入1mmol亚磷酸三乙酯,加热到80℃搅拌反应5h,冷却,蒸除冰醋酸,加入40毫升甲醇,沉淀经过滤后,50-60℃真空0.1MPa干燥2-3小时得到氨基磷酸酯。收率66.2%,m.p.244.4℃.
IR(KBr.cm-1):3452 2937 1579 1340 1231 1056 756
H1 NMR(CDCl3.δ/ppm.300MHz):6.90-8.50(6H,Ph);4.95(1H,POCH);3.40-3.88(4H,OCH2);2.80-2.88(2H,CH2N);2.31(1H,Me2CH);1.70-2.06(10H,CH2<);1.05-1.22(18H,CH3)31pNMR(δ/ppm.300MHz):8.51
实施例8
本发明是以松香基三环二萜胺、取代苯甲醛和亚磷酸酯为原料,以乙醇、甲苯和冰醋酸等为溶剂,分两种方案进行。
方案一:溶剂合成法,反应方程式如下:
第一步:亚胺的合成:
在四颈烧瓶中加入10mmol松香基二萜胺(如脱氢枞胺、降解脱氢枞胺等),用40毫升无水乙醇溶解,取10-10.5mmol取代苯甲醛(如对氟苯甲醛、对三氟甲基苯甲醛等),用40毫升无水乙醇溶解,加入烧瓶中,室温搅拌3-5h或加热回流1-2h,冷却到室温,沉淀经过滤后用溶剂洗涤数次,50-60℃真空0.1MPa干燥2-3小时。
产品为亚胺,
R1=脱氢枞基、枞基、二氢枞基、四氢枞基,降解脱氢枞基、降解枞基、降解二氢枞基、降解四氢枞基
取代苯甲醛上的取代基R3=H(氢)o-F(邻氟)m-F(间氟)p-F(对氟)p~Cl(对氯)p-CF3(对三氟甲基)p-OMe(对甲氧基)p-NO2(对硝基)o-OH(邻羟基)o-OH,p-NO2(邻羟基、对硝基)o-OH,p-Cl(邻羟基、对氯)o-OH,p-OMe(邻羟基、对甲氧基)
第二步:氨基磷酸酯的合成:
在四颈烧瓶中加入1mmol松香基二萜胺取代苯甲醛亚胺(如脱氢枞基对氟苯甲醛亚胺),用4毫升甲苯溶解,加入1-1.1mmol亚磷酸二酯(如亚磷酸二苯酯),加热到100-120℃搅拌反应5-6h,冷却到室温,沉淀50-60℃真空0.1MPa干燥2-3小时得到氨基磷酸酯。亚磷酸酯的分子式为HOP(OR2)2,
R2=Me(甲基)Et(乙基)n-Pr(正丙基)i-Pr(异丙基)Bu(丁基)Ph(苯基)
方案二:一锅合成,反应方程式如下:
一锅法合成氨基磷酸酯:
在四颈烧瓶中加入1mmol松香基二萜胺(如脱氢枞胺),1-1.05mmol取代苯甲醛(如水杨醛),用4毫升冰醋酸溶解,加入1-1.1mmol亚磷酸三酯(如亚磷酸三乙酯),80-85℃搅拌反应5-7h,冷却到室温,蒸除溶剂冰醋酸,加入5毫升甲醇,放于冰箱中冷却到零下30℃,数天后析出沉淀,沉淀经过滤后,50-60℃真空0.1MPa干燥2-3小时。
R1=脱氢枞基、枞基、二氢枞基、四氢枞基,降解脱氢枞基、降解枞基、降解二氢枞基、降解四氢枞基
R2=Me(甲基)Et(乙基)n-Pr(正丙基)i-Pr(异丙基)Bu(丁基)Ph(苯基)R3=H(氢)o-F(邻氟)m-F(间氟)p-F(对氟)p-Cl(对氯)p-CF3(对三氟甲基)p-OMe(对甲氧基)p-NO2(对硝基)o-OH(邻羟基)o-OH,p-NO2(邻羟基、对硝基)o-OH,p-Cl(邻羟基、对氯)o-OH,p-OMe(邻羟基、对甲氧基)
方案三:无溶剂合成法。在四颈烧瓶中加入1mmol松香基二萜胺(如脱氢枞胺等),1-1.05mmol取代苯甲醛(如水杨醛等),加热到40-50℃使反应物熔融,搅拌反应1-2h,然后加入1-1.1mmol亚磷酸二酯(如亚磷酸二乙酯)在100-120℃反应5-6h,沉淀冷却后,50-60℃真空0.1MPa干燥2-3小时。氨基膦酸酯是氨基酸的含磷类似物,具有杀菌、除草、植物生长调节、抗肿瘤和破坏生物细胞膜等重要生物活性。
实施例9
取对数生长期的肿瘤细胞(如肝癌SMMC7721细胞),用0.25%胰蛋白酶消化后,以含10%小牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度至4.0×104/ml。按每孔100μl(4000个细胞)加入96孔培养板中,孵育8h后加入不同稀释浓度的松香基二萜改性α-氨基磷酸酯,使其终浓度分别为100、10、1、0.1μmol/L,空白对照孔加等体积的溶剂。每个浓度均设6个复孔,置37℃、5%CO2孵箱中连续培养48h。培养结束前2h各孔加入MTT(5mg/ml)20μl,放置孵箱中继续孵育4h,弃上清,每孔加入DMSO 150μl,充分振荡混匀后,用酶联免疫检测仪在570nm处测定各孔的吸光度(用OD值表示),计算抑制率。抑制率(%)=(对照组OD值-药物组OD值)/对照组OD值×100%。当松香基二萜改性α-氨基磷酸酯衍生物浓度为0.1μmol/L时,对肝癌SMMC7721细胞的抑制率可以达到75%。