CN1009082B

CN1009082B - 普瑞霉素的成分和抗菌复合物的分离过程

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Publication number: CN1009082B
Application number: CN 85104165
Authority: CN
Inventors: 伊姆里·茨拉吉; 吉尤拉·达卡尼; 朱蒂特·弗朗克; 加博·豪瓦斯; 加博·卡尔克萨
Original assignee: Chinoin Jiojisze Virgistita Mikejilate
Current assignee: Chinoin Jiojisze Virgistita Mikejilate; Chinoin Private Co Ltd
Priority date: 1984-05-31
Filing date: 1985-05-31
Publication date: 1990-08-08
Also published as: CN85104165A; CN1043627A; HU195514B; HUT39186A; JPS61502398A

Abstract

本发明涉及的是普瑞霉素抗菌素混合物的成份和它们的盐以及用色谱法分离各种成份的过程，本发明的进一步涉及的是含有上述成份的增效抗微生物合剂和它们的制备过程。

Description

本发明涉及的是分离普瑞霉素混合物获取普瑞霉素的不同成份，和从抗菌复合物中分离这些成份的过程。本发明的进一步目的是含有上述成份的增效合剂和它们的配制过程。

普瑞霉素抗菌复合物可由人工培养热多孢霉属的galeriensis（属于链丝菌类）获得，经发酵得到的其制剂已由Hugarian在专利说明№153，593中叙述过。

普瑞霉素是大环内脂类抗菌素，在先有技术（J.Chem.Soc，Perkin I.P816，1974）中以一单一化学式为其特点的：｛5-[18-（aD-阿糖胶-呋喃糖成氧（furanosyloxy））-2-丁基-3，7，11，15，19，21，23，35，27-九羟基-4，16，32，34-四甲基-1-氧-环氧36环-16，32-二烯-35-基]-4-羟基己基｝-胍的硫酸盐。

普瑞霉素是一种非常有效的广泛应用的抗菌素，它不但对抵抗革兰氏阳性细菌有效，也对抵抗多种耐药菌族有效，在抵抗细菌时耐药性仍不会发展。

我们以前的试验是参照发酵得到的普瑞霉素不是单一的物质的事实。色谱法的最近发展允许我们对普瑞霉素物质混合物进行更详细地检验。

我们发现，发酵得到的普瑞霉素，含有三种主要成份和六种次要成份，我们发明的过程是适于定性的，微量的分离这些成份。我们也意外地发现，这些成份能相互增强效力，即它们表现出增效活性。

我们努力的目标是分离和隔离由热多孢霉属的galeriensis产生的抗菌混合物的各种成份。一系列的色谱法都已试过，并且发现，薄层色谱法对上述过程是最有效的。

在薄层色谱法（TLC）领域内，采用带有硅胶的吸附层的商品色谱片，在成份分离中取得了意外的好结果。

根据我们发明的分离过程的比较好的实例，从热多孢霉的galeriensis菌丝分离出来的，没有脂肪的，粗产品形式的，半纯产品的，或纯净产品的原液施加到TLC薄层色谱片上，经展开后，检验得到的斑点，并且分离出抗菌复合物的主要成份和（或）次要成份。

为了配制从培养介质中收取粗产品形式的，半纯的或纯产品的原液，我们使用了含1-4个碳原子的醇的水溶液，例如，比较适用的是体积为，乙醇∶n-丁醇∶水为25∶25∶50的混合物。借助于上述混合物可以制备0.5-1W/V%的原液，而且把50-200μg的被检测的物质施加到薄层色谱片上。

在我们的试验中，首先使用商品硅胶色谱片Kieselgel60F254，尺寸为20×20cm，硅胶厚度为0.2mm。为了实现普瑞霉素混合物的最佳分离，在此种片上进行了各种溶剂混合物的试验。

当采用含有卤代烃，有机酸，乙醇，水，更好的是还有醛作为洗提剂时，可以获得最佳分离。

下列溶剂可以用作为洗提剂：卤代脂族烃（如氯仿，二氯甲烷），特别是含1-4个碳原子的脂族羧酸（如甲酸，醋酸），卤代脂族羧酸（如-氯、二氯、三氯醋酸，三氟醋酸），芳族羧酸（如苯甲酸），有机磺酸（如甲基磺酸，甲苯磺酸），醇类，特别是脂族直链或支链含1-10个碳原子的醇类（如甲醇，乙醇，n-丁醇，异丙醇），醛类，特别是含1-4碳原子的脂族醛类（如36%甲醛）或者是上述物质的水溶液混合物。

对于分离普瑞霉素抗菌素的成份，下列溶剂可产生最好的效果：

Ⅰ.n-丁醇∶冰醋酸∶水为60∶10∶30的混合物的上层。

Ⅱ.n-丁醇，甲醇，冰醋酸和水的比例为75∶2∶8∶15的混合物。

Ⅲ.氯仿∶甲醇∶冰醋酸∶水为45∶30∶15∶20的混合物的下层。

Ⅳ.氯仿，甲醇和水的比例为50∶35∶14∶1的混合物。

Ⅴ.氯仿，甲醇，甲酸，水，甲醛和n-丁醇的比例为130∶53∶6∶9∶3∶3的混合物。

Ⅵ.氯仿，甲醇，甲酸，水，甲醛和n-丁醇的比例为160∶53∶6∶9∶3∶3的混合物。

Ⅶ.15份重量的一氯代醋酸溶解在氯仿，甲醇，甲酸，水，甲醛和n-丁醇的比例为125∶53∶9∶3∶3的混合物中。

Ⅷ.溶液Ⅲ，氯仿和甲醇的比例为15∶2∶1的混合物。

溶液Ⅰ和Ⅱ容量较高，而溶液Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅶ，和Ⅷ的选择性较高，并且特别是展开时间较短，这更适于工业系列试验的目的。溶液Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ由于甲酸酯生成，化学上呈亚稳定状态，而溶液Ⅲ则是在物理上呈亚稳定状态。按照其等温曲线，溶液Ⅳ应在16-24小时内用完（从其配制开始计算）;Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ和Ⅷ，在其成份彼此添加到一起后要立即使用;而混合物Ⅲ中如果添加1-2%甲醇后可保留一个星期。混合溶剂Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ，Ⅷ是比较理想的。因为抗菌素复合体不同成份的Rf值是非常接近的，如果进行两次展开，则在洗提液Ⅳ中可实现有效的分离;而如果用Ⅴ，Ⅶ或Ⅷ时，甚至一次展开即导致适当的分离。最理想的溶液是Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ。溶液Ⅴ可用于普通的薄层色谱法所用的色谱片，而洗提液Ⅵ可用于HPTLC色谱片，溶液Ⅶ适用于浸渍过的色谱片，溶液Ⅷ对Lobar-色谱柱则特别合适。

由薄层色谱法分离出普瑞霉素复合物的成份，可由化学方法和（或）生物自检展开检测。

对于化学检测法，硫酸香草醛，氯甲苯胺，磷钼酸，联苯胺或硫酸乙醇酯，以及改进的Sakaguchi试剂和硫酸乙醇脂，从先有技术得知都是相当有效地;或者热处理，以及用前述物质和热处理共用都是相当有效地提供了特征值的和灵敏的颜色反应。把展开过的色谱片浸渍到合适的反应剂中，色斑即可确定，干燥后的色谱片在某些情况下可由Shimadzu密度计定值。

生物自检显示按下列方法进行：

薄层色谱展开和化学检测以后，沿着滴斑的边缘，将色谱片垂直地切割成很多带条，这时做好琼脂片并且用枯草杆菌ATTC6633培养。带条的另一边标记后，将切割后的谱带压在琼脂片上;或者将所有带条再切成两块，只有两块中的一块压在琼脂片上。接下来，琼脂片在37℃温度中培养20-24小时。从恒温器取出以后即可看到这些斑点（细菌在这里不能生长）。如果使用的是整块带条，可以根据另一边的标记鉴别出能抑制细菌生长的斑点;或者用另一半原来带条边的位量鉴别。

为了说明上述过程，用溶液Ⅳ两次展开以后得到的薄层色谱片的图1表示，由不同培养基得到的普瑞霉素样品展开以后所获得的不同斑点（1-4个斑点）充分证实了普瑞霉素是混合物。分离的主要成份A₁、B₁和C₁以及混合物的生物自检谱也能在图上看到。

采用溶液Ⅴ的一次展开普瑞霉素混合物，分离成以括弧内Rf值为特征的下列成份：A₁（0.29），A₂（0.31），A₃（0.33），C₁（0.35），C₂（0.37），C₃（0.39），B₁（0.54），B₂（0.56），B₃（0.58），一些没有鉴别出来的次要成份也能看到痕迹。色谱由图2表示。

可用HPTLC色谱片提高分离效率。这时溶液Ⅵ作为洗提剂应用可以产生合适的分离作用。

当Kieselgel60F254硅胶色谱片浸渍了适当的金属盐，特别是浸渍银盐以代替很难得到的，昂贵的HPTLC色谱片时，可得到类似的出色的分离作用。在浸渍过程中，色谱片插入到水或有机溶剂中或者水和有机溶剂的混合物中，例如，金属盐的乙腈溶液，最好采用20%的水溶液。银盐（如硝酸银），铁盐（如磷酸亚铁）可以作为较适用的金属盐，浸渍层的表面潮气，可以在隔绝光线的条件下，经120℃的温度处理一小时除掉。对于展开色谱片，溶液Ⅴ和Ⅵ在这种情况下同样是有用的，但当采用溶液Ⅶ时则可实现最好的分离作用。在这样的系统中，由于各种成份增加的Rf值是不同的，因此使分离效率大大提高。

业已发现，普瑞霉素是由三种主要成份（A₁，B₁，C₁）和多种次要成份组合的混合物。

根据溶解度的情况，各种成份一起结晶。抗菌素的组成受到发酵条件改变的影响（培养基，时间和温度，通气的程度等）。

用柱色谱的方法，将普瑞霉素混合物予与分离，能够改进薄层色谱洗提作用的效益。我们已经作过分配柱色谱和吸收柱色谱的试验

按照我们的发明，我们采用交联葡萄糖凝胶作固定载体（Sephadex LH-20）和逆流法（小滴逆流谱法Droplet Counter Current Chromatography，以后称之为DCCC）实现了分配柱色谱法的分离。

薄层色谱法适用的同样溶剂都可用于这种方法，例如含有有机酸，和（或）氯代烃和（或）1-4个碳原子的烷基醇和（或）水的双层溶剂。溶液Ⅰ系统是喜欢采用的（固定相），在溶液Ⅰ中固态（Sephadax LH-20）经两天就溶胀了，然后填充到色谱柱中，并使用n-丁烷，冰醋酸和水的比例为30∶16∶60的混合的（流动相）冲洗色谱柱。“普瑞霉素是溶解在流动相∶固定相为20∶1的混合液中，经一玻璃过滤器过滤后，施加到色谱柱上。下层、流动相作为洗提剂应用时，最好采用蠕动泵和收集器。色谱馏分的组成和纯度用薄层色谱法控制，分离的情况可用紫外线光（206nm）下的薄层色谱图进行检查。

相同组成的色谱馏分收集到一起，并置于真空中蒸馏，以后确定产率。对柱色谱产品的回收率为90-95%。

主要是含有主要成份的A₁，B₁，C₁的提取液可由色谱法进一步提纯。

成份A₁用溶液Ⅰ进行色谱分离：B₁可用含有苯，n-丁醇，甲苯，冰醋酸和水的溶液获得;而成份C由DCCC方法分离，采用的溶液系统由氯仿，甲醇，冰醋酸和水组成。

已经发现，普瑞霉素混合物的成份最好由色谱柱法在选定压力下用适当的硅胶填料分离。用下列色谱柱作过试验：我们自己填充的硅胶，作好备用的Lobar柱（Merck）。用适当的金属盐（和薄层色谱片所用的相似）浸渍过的硅胶填充的色谱柱。

若采用Lobar色谱柱，或因缺少这种色谱柱而使用浸渍过的硅胶填充色谱柱以代替只用单一的硅胶填充的色谱柱，则分离的效率能大大提高。在Lobar色谱柱情况下，采用略高的压力（1.1-5atm）是很有用的。

在浸渍的过程中，硅胶与合适的金属盐混合，最好是悬浮在由有机溶剂配制的金属盐溶液中，然后用任意的方法除去溶剂，这样浸渍的硅胶就能够用于填充色谱柱。色谱柱是用悬浮在有机溶剂的硅胶填充，较好的溶剂是卤代脂肪烃（如氯仿），并且用略高的压力（1.1-2.5atm）压紧。如果银盐作为金属盐，则要求防止色谱柱受光，以避免银盐还原成银。

要分离的普瑞霉素混合物或者它的已经分离出来的组成加到色谱柱的顶部，溶解在作为洗提液的溶剂混合物中，在高于大气压的条件下，被色谱柱吸收。

要分离的混合物可以是工业普瑞霉素的硫酸盐或者其它的普瑞霉素盐，特别是普瑞霉素的醋酸盐或普瑞霉素的一氯代醋酸盐（用普瑞霉素的硫酸盐按Hungarian专利说明№257/84制备）。

溶剂系统Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ和Ⅷ可作为溶剂。如果溶剂Ⅴ，Ⅵ或Ⅷ用来洗提Lobar色谱柱时，则可实现最好的分离效果，而混合液Ⅶ最适于洗提用金属盐浸渍过硅胶填充的色谱柱。

用恒定的液体流速收集相同体积的色谱馏分，并且用薄层色谱法控制它的组成。将具有相同的Rf值的馏分集中，并且用溶剂沉淀法收取单个成份。

作为用色谱柱法分离的结果，下列成份被分离出来：

A₁＝Chinopricin（Rf＝0.29）

A₂＝Midopricin（Rf＝0.31）

A₃＝Metipricin（Rf＝0.33）

C₁＝Oxipricin（Rf＝0.35）

C₂＝Oximipricin（Rf＝0.37）

C₃＝Oximetipricin（Rf＝0.39）

B₁＝hidropricin（Rf＝0.54）

B₂＝himipricin（Rf＝0.36）

B₃＝himetipricin（Rf＝0.58）

分离的成份已进行过试验，下面是得到的结果：

1.A₁＝chinopricin（Rf＝0.29）

用快速原子轰击质谱检测法（FAB-MS）测得分子量为1078（图3）。已发现，离析的成份A₁，由薄层色谱法和FAB-MS法分析，在化学上是单一的。根据分子量，IR和¹H以及¹³C NMR-维和二维图谱，其确定的结构是由式Ⅰ表示的。

2.A₂＝midopricin（Rf＝0.31）和

A₃＝methipricin（Rf＝0.33）

分子量（FAB-MS）：1092和1106

根据分子量，化学方法和¹H和¹³C NMR-维和二维图谱的检测。已发现，成份A₂和A₃是

A₁的同系物，A₂的旁链较A₁长（有一亚甲基）A₃的旁链较A₁长（有-亚乙基团）。

3.C₁＝oxypricin（Rf＝0.35）

分子量：946（FAB-MS）

根据上述分析方法，C的组成可由下式Ⅱ表示。

成份C₁和A₁之间的差别就在于：代替糖元的羟基链连到碳原子上（在位置18）。

4.C₂＝Oxymipricin（Rf＝0.37）和

C₃＝Oxymetipricin（Rf＝0.39）

分子量（FAB-MS）：960和974

根据上述分析可以发现，成份C₂的旁链较C₁长（有-亚甲基），而C₃的旁链也比C₁长（有-亚乙基）

5.B₁＝hydropricin（Rf＝0.54）

分子量（FAB-MS）：930

根据上述分析方法，化合物可由式Ⅳ表示。

在这里，代替糖元的氢被链连到碳原子上（位置18）。

6.B₂＝hymipricin（Rf＝0.56）和

B₃＝hymetipricin（Rf＝0.58）

分子量（FAB-MS）：944和960

根据上述分析方法可以发现，成份B₂的旁链较B₁长（有-亚甲基），成份B₃的旁链也比B₁长（有-亚乙基）。

有用的物理常数（熔点，元素分析数据，旋光度，UV和IR光谱等）对每个化合物不是特征性的。也就是，单一成份的熔点是160-170℃，它们的混合物的熔点是167-168℃。元素分析数据对于分馏成份来说也不是特征性的，因为它们有类似的结构，很高的分子量，因此元素分析的数据的差别是在测量误差范围之内的。普瑞霉素混合物的主要部分含有成份A₁B₁和C₁，因此它们被称之为主要成份，存在的另一些成份数量很小，称之为次要成份。

根据原料混合物的情况，普瑞霉素的成份以硫酸盐的形式，或与硫酸不同的其它盐的形式，特别是醋酸盐或氯代醋酸盐的形式离析出来。

离析出来的普瑞霉素成份的硫酸盐可借助于不同的有机酸转变成其它盐。这一点在Hungarian专利说明№2571/84中已叙述过了。

普瑞霉素混合物的抗微生物活性谱和三种主要成分（A₁，B₁和C₁）的抗微生物谱由表O表示（见后面P24）。表中含有MIC值（μ/ml）是在人类病原体多种抗菌株中测量的。不同的值可能说明这样的事实：三种主要成份在以不同方式产生抗微生物活性，它们进攻微生物的不同位置。

我们意外地发现了成份之间的相互增强作用效应，即它们表现出增效协合性。根据协合效应和主要成份不同攻击点的假定，则采用多种成份的组合物即可实现下述有益的效果：

1.在不同的位置上同时攻击病原体的新陈代谢，“杀灭作用”，即微生物的消灭可以更安全地实现，这比起静态效应，即单一抑制微生物生长更有利。

2.如果新陈代谢的不同途径同时受到攻击，则抵抗活性成份的组合的抗药性可不发生或缓慢发生。

3.各种成份的使用量可大大减少。这就产生了一个优点：由于治疗的活性成份减少，有害的副作用减少或完全消失了。这一作用从治疗的观点来看是非常有利的，当采用较少的活性成份时，成本也下降了，这从经济的观点看也是适宜的。

在采用增效合剂时，按我们的发明，普瑞霉素的主要成份（A₁，B₁，C₁）和其它的次要成份和衍生物，（以它们的盐为好）都可以使用，可含两、三种或更多的不同成份。

如果在合剂中采用两种主要成份，则其重量比在5∶95-25∶75的范围的内，而采用三种成份时，则重量比在4∶3∶3-7∶1∶2的范围内。按本发明的增效合剂的优选的具体组成在下面的例子中介绍，其中MIC值是用不同微生物族测得的，而且也指出了加合的程度和增效的效益。根据“加合效应”这个词可理解为，多种成份的效果相加，即一种成份的一半MIC值与另种成份的一半MIC值，得到两种活性成分的组合MIC值。当抗微生物活性由于成份之间有益的相互作用超过加合效应时，潜在的协同增效出现，这样获得的效应是增效效应（或协同效应）。

MIC值是在Difco-Bouillon培养基中确定的。每毫升5×10⁵的孢子进行接种，进行MIC值的定值。在例13-15中，197种情况说明，含有较多活性成份的组合剂是具有增效活性的合剂，于是为了实现同样的效果，只需有一部分或很少一部分原来的活性成份的投药量参与治疗。

按本发明的普瑞霉素的成份可单独地或选择性地与其它药物的有效成份一起相互混合进行投药。它们可以单独使用，但常常根据用药规范和实际用药标准选择后与药物载体一起使用。有效成份可以用固体配剂的形式如胶囊，片剂，糖衣药片，栓剂;半固体形式如软膏或凝胶;或液体配剂形式，如注射液，悬浮液或糖浆。优选的配剂的形式是凝胶，软膏，外科粉剂，注射液，悬浮液和粉末安培溶剂安培。

根据我们的发明，本品可以口服，胃肠外，直肠或局部（软膏）给药。它们含有有用的药物载体（如碳酸镁，硬脂酸镁，淀粉，滑石，水等）或新的载体如环状糊精和任选的赋形剂，裂介剂，乳化剂等。

适于口服治疗的配药形式可以是胶囊，片剂或糖衣药丸。按本发明，含有更多有效成份的增效合剂也可用于兽医治疗，即以液体的形式混合到饲料中。适于胃肠外治疗的配药形式可以是水乳浊剂，溶液或悬浮液。软膏，水或油乳剂或用这些乳剂悬浮液，喷雾浸渍的绷带都可用于局部给药。

本发明用下述非限定性的实例详细说明。

例1

在硅胶（Kieselgel）上用薄层色谱法两次展开分离普瑞霉素0.5%（重量）普瑞霉素混合物溶液是用n-丁醇∶乙醇∶水（或甲醇）为1∶1∶2的混合物制备而成。10ml（50μg活性成份）的溶液滴到硅胶（Kieselgel）上（DC-plastikfolie，Kieselgel 60F254ak DC-Alufolie Kieselgel 60，由Merck生产，层厚0.2mm），溶液Ⅳ作为洗提剂，色谱展开距离16cm，展开两次，染色反应使斑点可见，用光密度分析法在590nm估算，用生物自检试验法检测生物活性。

用于生物自检试验法的培养基的成份如下：

牛肉汁（Difco） 3g

Bacto蛋白胨（Difco） 5g

氯化钠 5g

磷酸氢二钠 10g

磷酸二氢钾 1g

Bacto琼脂（Difco） 18g

蒸馏水加到 1000ml

培养基在120℃保温，然后调整pH为8.0。然后将53℃130ml的培养基装到消毒玻璃盘内（18×25cm）以1∶2000的比例加上枯草杆菌（Bacillus Subtilis）ATCC6633孢子悬浮液。将干燥过的，没有溶剂的薄层色谱片切割成5mm宽的条带，然后叠加到琼脂片上，并在37℃下培养18-24小时。

例2

在硅胶（Kieselgel）上用一次薄层色谱展开法分离普瑞霉素混合物。

按例1的过程进行，但采用溶液Ⅴ作为洗提剂，因此展开是一次完成。

例3

在HPTLC色谱板上用一次展开分离普瑞霉素混合物4ml（20μg活性成份）0.5%溶液是按例1配制，将其加到HPTLC（Merck）色谱上，展开距离为18cm，其余步骤与例1相同。

例4

在浸渍过的硅胶（Kieselgel）上用一次展开分离普瑞霉素混合物除展开时使用溶液混合物Ⅷ以外，其余按例1过程进行。硅胶片（Kieselgel 60 F254）按前叙方法在使用前用金属盐浸渍。

后面的步骤与例1所叙相同。

例5

在预制的薄层色谱片上分离普瑞霉素混合物

2ml1%的被测样品溶液加到PSC-Fertigplatten，硅胶（Kieselgel）60F254（Merck）片上，硅胶片用溶剂混合物Ⅳ多次展开。如果将玻璃板的左侧右侧的3-3cm宽的条形插到预先加热的Sakaguchi试剂中，则在室温下以鲜明的红色斑出现。刮掉不同的色谱馏分，并在一微渗滤器中用10%醋酸甲醇提取，直到加入硫酸香草醛时看不到反应为止。提取物在真空中蒸馏，干燥后残留物在溶剂Ⅰ中溶解，用1/5体积的蒸馏水分四次提取。

抗菌素的成份在上层，而“层滞留重量”（layer dead weight）是在下层物相中，蒸发上层物相得到的成份按例1的方法进一步提纯。

例6

用分配柱色谱分离普瑞霉素的成份A₁，溶剂系统采用：

固定相：溶剂混合物Ⅰ

流动相：n-丁醇，冰醋酸和水的比例为30∶10∶60的下层物相混合物。

色谱柱的制备：

720g的Sephadex LH-20交联葡聚糖凝胶在3L溶剂混合物Ⅰ中溶胀一天，将悬浮液填充到色谱柱（58×1150mm）中，固定后用1.5L流动相冲洗。

色谱分离过程：

2g普瑞霉素溶解在300ml流动相和15ml固定相混合物中，将溶液过滤并施加到色谱柱上。用流动相以50-60滴/分的低流速进行洗提。

通常收集到17ml（＝800滴）的色谱馏分。继续洗提，直到300-400ml色谱馏分为止。

如果改变物相，固定相的硅胶柱Sephadx LH-20可用3-4次，硅胶柱可按下列方法再生：将它悬浮在丙酮中，过滤，将其置于丙酮蒸汽气氛中，用丙酮蒸汽回流2小时，然后进行干燥，在不同色谱馏分中的物质可由薄层色谱法和UV光谱鉴别。

成份的离析：

根据分析数据（UV和TLC），将含有相同物质的色谱馏分合并。溶剂蒸发以后得到的残留物溶解在甲醇与苯的比例为2∶1的混合物中在蒸发。

于是得到743mg成份A的混合物和包含成份A与C的570mg混合的馏分。成份B留在此系统的色谱柱内，它们可用溶剂Ⅰ溶解，能得到480mg的成份B。在上述条件下成份A的混合物进一步色谱分离得到纯度高于98%的主要成份A₁。

例7

用分配柱分离普瑞霉素的成份B₁

按例6所述方法得到的成份B可按前述色谱法进一步提纯，但要使用所谓“B-选择性”溶剂为提取液，这样主要成份B₁可获得的纯度高于96%。

“B-选择性”溶液的成份如下：

固定相：苯，n-丁醇，甲醇，冰醋酸和水的混合物（比例o1∶41∶10∶5∶43）的上层物相。

流动相：苯，n-丁醇，甲醇，冰醋酸和水的混合物（比例为1∶24∶10∶5∶60）的下层物相。

例8

用DCCC（小滴逆流色谱法）分离普瑞霉素成份

在例6中得到的混合色谱馏分可由DCCC法进一步提纯。

采用的溶剂如下：

固定相：氯仿，甲醇，冰醋酸和水的混合物（26∶39∶9∶26）的下层物相。

流动相：同样混合物的上层物相。

洗提：

将溶剂搅拌2小时，静止放置16小时，物相分离。将DCCC仪器（ID＝0.2mm，300管）用下层相（固定相）填充。130mg要提纯的物质溶解在12ml上层物相（流动相）中，过滤并泵到容器中。洗提借助于上层相进行，压力为1.7-1.8atm，流动速度为15ml/小时，于是收集到3.7ml（＝220滴）的色谱馏分。这样得到的主成份C₁纯度为90%

例9

用吸附柱色谱法在浸渍了金属盐的硅胶中分离普瑞霉素的成份。色谱柱的制备：

200g硅胶（Kieselgel）HF254悬浮在40g硝酸银和500ml乙腈的溶液中，然后溶剂在真空中蒸发。浸渍过的硅胶悬浮在500ml的氯仿中后填充到色谱柱色中。为了加强固定和密实，采用了稍高的压力（1.1-2.5大气压），直到填充床的固定的高度为止。为了避免硝酸银因见光而还原，色谱柱用铝箔盖住。

色谱分离的过程：

400mg的普瑞霉素溶解在12ml新配制的溶剂Ⅶ中，溶液借助于稍高的压力（1.1大气压）被吸收在填充床上。30ml的提取液（溶剂Ⅶ）加到填充物的顶部，提取过程以1.1ml/分的流速和在稍高的压力（1.5-2.5大气压）的条件下开始进行。

检查：

色谱馏分中的物质用薄层色谱法鉴别。将10ml的每种馏分施加到Kieselgel 60F254（Merck）色谱片的开始点，展开是使用溶剂Ⅴ在未饱和的通路中进行16cm完成。用冷空气干燥后，用氯联甲苯胺试剂和（或）硫酸展开和（或）热处理以确定斑点的位置。

将含有相同物质的馏分合并，普瑞霉素成份在加入乙醚后沉淀。将沉淀的固体物质过滤出，并用腈和乙醚冲洗。残留物溶解在n-丁醇，醋酸和水的混合物（比例为4∶1∶5）的上层，用5ml水冲洗三次。将上层溶液在真空中蒸发，以除去溶剂，残留物用乙醚研磨，过滤后在真空中干燥。

于是得：

135mg的成份A₁＝chinopricin，

30mg的成份A₂＝midopricin，

40mg的成份A₃＝metipricin，

20mg的成份C₁＝oxypricin，

20mg的成份B₁＝hydropricin.

注意：在色谱柱内的，受不到光线照射的大部分硝酸银可用乙腈冲洗回收并重新使用。

例10

在现成的Lobar色谱柱上用吸收柱色谱法分离普瑞霉素的成份

采用的色谱柱：

用Lichroprep填充的LobarC（Merck）色谱柱，最好是两个或多个色谱柱联接在一起。色谱分离的方法：

与例9的过程相同，但采用溶剂Ⅷ作为洗提剂。3400mg普瑞霉素溶解在40mg溶剂Ⅷ中，然后将这种溶液施加到由四个色谱柱联接的色谱柱系统顶部。

检查：

将含有相同物质的色谱馏分合并在一起，向色谱馏分中加入相当于馏分总体积的10%的n-丁醇，溶液于真空中在最高温度为45℃时蒸发，固体残留物用乙醚研磨后过滤。

于是得到：

1100mg的成份A₁＝chinopricin，

110mg的成份A₂＝midopricin，

80mg的成份A₃＝metipricin，

110mg的成份C₁＝oxypricin，

20mg的成份C₂＝oxymipricin，

150mg的成份B₁＝hydropricin，

50mg的成份B₂＝hymipricin，

40mg的成份B₃＝hymetipricin，

15mg的成份C₃＝oxymetipricin，

例11

普瑞霉素成份的硫酸盐的制备

按例10的过程进行，但是向合并在一起的色谱留出组分中加入的是5ml甲醇和0.3ml1N硫酸。加入300ml乙醚使沉淀完全。这样就得到以硫酸盐形式存在的例10中的普瑞霉素成份。

例12

与硫酸盐不同的普瑞霉素成份的盐的制备

从普瑞霉素成份的硫酸盐，依据Hungarian专利说明№2571/84的过程，加入钡盐即可制备出与硫酸盐不同的其它盐。

可以得到的与硫酸盐不同的普瑞霉素成份的盐可以是下述形式：甲酸盐，乙酸盐，一氯乙酸盐，草酸盐，苯甲酸盐，对甲苯磺酸盐，高氯酸盐，氯化物等。

普瑞霉素混合物和其成份的抗微生物活性已在不同的微生物族中试验过。结果列在表O中。

例13

增效组合物No.Ⅰ

n（成份数）＝2

成份比：A₁∶B₁＝75∶25

其结果汇总于表Ⅰ

表的说明：

竖行Ⅰ：成份A₁的MIC值（μg/ml）竖行Ⅱ：成份B₁的MIC值（μg/ml）竖行Ⅲ：含成份A₁和B₁的合剂的MIC值。竖行Ⅳ：

合剂中A₁相对于A₁MIC值的数值（%）竖行Ⅴ：合剂中B₁相对于B₁MIC值的数值（%）竖行Ⅵ：（Ⅳ+Ⅵ）/n竖行Ⅶ：抗微生物活性的加合部份（Ⅳ+Ⅴ）竖行Ⅷ：抗微生物活性的增效部份（100%-Ⅶ）

例14

增效合剂№Ⅱ

n＝2

成份比：A₁∶B₁＝50∶5

例15

增效合剂№Ⅲ

n＝2

成份比：A₁∶B₁＝25∶75

抗微生物活性的试验结果汇总在表Ⅲ中（缩写与表1相同）

例16

增效合剂NoⅣ

n＝2

成份比：A₁∶C₁＝75∶25

关于合剂的抗微生物活性的结果汇总在表Ⅳ中（除了用成分C₁代替B₁外，缩写与例13相同）

例17

增效合剂NoⅤ

n＝2

成份比：A₁∶C₁＝50∶50

关于合剂的抗微生物活性的结果汇总在表Ⅴ中（除了用成分C₁代替B₁外，缩写与例13相同）

例18

增效合剂NoⅥ

n＝2

成份比：A₁∶C₁＝25∶75

关于合剂的抗微生物活性的结果汇总在表Ⅵ中（除了用成分C₁代替B₁外，缩写与例13相同）

例19

增效合剂NoⅦ

n＝2

成份比：C₁∶B₁＝75∶25

关于合剂的抗微生物活性的结果汇总在表Ⅶ中（除了用成分C₁代替成分A₁外，缩写与例13相同）

例20

增效合剂NoⅧ

n＝2

成份比：C₁∶B₁＝50∶50

关于合剂的抗微生物活性的结果汇总在表Ⅷ中（除了用成分C₁代替A₁外，缩写与例13相同）

例21

增效合剂NoⅨ

n＝2

成份比：C₁∶B₁＝25∶75

关于合剂的抗微生物活性的结果汇总在表Ⅸ中（除了用成分C₁代替成分A₁外，缩写与例13相同）

例22

增效合剂NoⅩ

n＝3

成份比：A₁∶C₁∶B₁＝40∶30∶30

关于合剂的抗微生物活性的结果汇总在表Ⅹ中，表Ⅹ中的缩写意义如下：

竖行Ⅰ：成分A₁的MIC值（μg/ml）

竖行Ⅱ：成分C₁的MIC值（μg/ml）

竖行Ⅲ：成分B₁的MIC值（μg/ml）

竖行Ⅳ：包含的成分A₁+B₁+C₁的合剂的MIC值。

竖行Ⅴ：合剂中相应于成分A₁的MIC值时A₁的量（%）

竖行Ⅵ：相应于成分C₁的MIC值时合剂C₁的量（%）

竖行Ⅶ：合剂中相应于成分B₁的MIC值时成分B₁的量（%）

竖行Ⅷ：（Ⅴ+Ⅵ+Ⅶ）/n

竖行Ⅸ：抗微生物活性的加合部分（Ⅴ+Ⅵ+Ⅶ）

竖行Ⅹ：抗微生物活性的增效部分（100%-Ⅸ）

例23

增效合剂NoⅪ

n＝3

成份比：A₁∶C₁∶B₁＝50∶25∶25

关于合剂的抗微生物活性的结果汇总在表Ⅺ中（表中缩写与例22相同）

例24

增效合剂NoⅫ

n＝3

成份比：A₁∶C₁∶B₁＝60∶20∶20

关于合剂的抗微生物活性的结果汇总在表Ⅻ中（表中缩写意义与例22相同）

例25

增效合剂NoⅩⅢ

n＝3

成份比：A₁∶C₁∶B₁＝70∶10∶20

关于合剂的抗微生物活性的结果汇总在表Ⅷ中（表中缩写与例22相同）

下面的例子指的是包含作为有效成分的普瑞霉素这种成分或其增效混合物的药物合剂。药物合剂的制备采用人所共知的方法。

离析的普瑞霉素成分或其混合物是被作为“有效成分”。

例26

粉剂NoⅠ

有效成分 1.0g

环糊精 9.0g

10.0g

例27

粉剂NoⅡ

有效成分 1.0g

非胶状淀粉 9.0g

10.0g

例28

粉剂NoⅢ

有效成分 1.0g

薰心草油 0.02g

（Aetheroleum lavandulae）.

酸性硅胶 0.10g

硬脂酸镁 0.10g

氧化锌 0.20g

白陶土 0.50g

硷式碳酸镁 1.00g

（Magnesium Carbonicum hydroxidatum）

环糊精 7.08g

10.0g

例29

可喷雾的粉剂

有效成分 2.0g

异丙基肉豆蔻酸盐 1.00g

（Isopropylmyristate）

氟利昂11/125050

（载气） 98.8g

100.00g

例30

水气溶胶

有效成分 0.5g

乙醇（体积比为62.5%） 10.0g

水 39.5g

载气 50.0g

100.0g

例31

可喷的外科膏剂

有效成分 0.1g

聚乙烯-吡咯烷酮 1.50g

乙醇（体积比为62.5%） 48.40g

推进气体 50.00g

例32

凝胶

有效成分 0.20g

利多卡因 2.00g

叶绿素 0.005g

薄荷醇 0.20g

Carbope1940 1.20g

三乙醇胺 1.50g

tween20（非离子活性剂） 1.50g

异己二酸盐 5.00g

96%乙醇 50.00g

蒸馏水加到 100.00g

成分混合并装到一烧瓶中

例33

软膏

有效成分 2.00g

液态石蜡 33.0g

白凡士林 31.0g

96%乙醇 20.0g

tween60（非离子活性剂） 9.0g

羊毛脂 5.0g

100.0g

所有成分混合后装入瓶子中。

例34

眼膏

有效成分 0.04g

乙醇（体积比为62.5%） 0.08g

蒸馏水 3.16g

蜂蜡 300.00g

胆甾醇（Colesterine） 25.00g

无菌蓖麻油加到 1000.0g

例35

可用水洗的软膏No1

有效成分 2.0g

tween 60（非离子活性剂） 5.0g

液体石蜡 5.0g

十六烷基十八烷基醇 15.0g

（Cetylstearylalcohol）

白凡士林 25.0g

蒸馏水加到 100.0g

例36

可用水洗的软膏No11

乙醇（体积比为62.5%） 2.000g

水 7.900g

硬脂酸烯基山梨酯 3.600g

（Sorboxaethene steavate）

液体石蜡 3.600g

十六烷基十八烷基醇 10.800g

白凡士林 18.000g

丙基-对氧苯甲酸酯 0.054g

甲基对氧苯甲酸酯 0.126g

乙醇（容积96%） 2.930g

利多卡因的氯化物 1.000g

蒸馏水加到 100.000g

例37

眼膏

有效成分 0.02g

碳酸氢钠 18.00g

粘性溶剂（4g甲基纤维素+ 510.00g

3.5gNaCl+蒸馏水到510g）

苯基-汞-硼酸盐（0.1%） 15.1g

蒸馏水加到 1000.0g

例38

油状眼膏

有效成分 0.02g

乙醇（体积比维62.5%） 0.40g

蒸馏水 1.58g

胆甾醇 25.00g

无菌蓖麻油加到 100.00g

例39

阴道栓

有效成分 0.02g

乙醇（体积比维62.5%） 0.262g

明胶 1.40g

醋酸钠 0.26g

甘油 4.50g

蒸馏水加到 9.50g

例40

抗微生物绷带

制成普瑞霉素分离成分或它们的混合物的溶液（最好用乙醇制成），绷带（例如多层软布）浸渍在此溶液中，然后以通常的方法包装和灭菌。

这样制备的消毒的，抗菌的绷带是可在任何时间使用的。

表O

普瑞霉素主要成份的抗菌谱

（接种：5×10/ml，在37℃中培养24小时）

人类致病抗药性菌种 MIC（μg/ml）

主成分

Al Cl Bl

1.金黄色葡萄球菌 CCM.885 0.05 0.075 0.5

（Staphylococcus aureus）

2.金黄色葡萄球菌 DSM.20231 0.05 0.05 0.1

（Staphylococcus aureus）

3.金黄色葡萄球菌 CCM.3217 0.25 0.05 0.1

（Staphylococcus aureus）

4.金黄色葡萄球菌 CCM.2326 0.25 0.05 0.25

（Staphylococcus aureus）

5.金黄色葡萄球菌 CCM.2514 0.25 0.05 0.1

（Staphylococcus aureus）

6.金黄色葡萄球菌 CCM.2515 0.25 0.025 0.1

（Staphylococcus aureus）

7.表皮葡萄球菌 CCM.2271 0.75 0.025 0.25

（Staphylococcus epidermidis）

8.金黄色葡萄球菌（Smith） 0.25 0.05 0.5

（Staphylococcus aureus smith

9.粪便链球菌 CCM.1875 2.5 0.75 2.5

（Streptococcus faecalis）

10.无乳链球菌 CCM.5153 0.75 0.075 0.5

（Streptococcus agalactiae）

11.无乳链球菌 CCM.5534 1.0 0.25 1.0

（Streptococcus agalactiae）

12.泌乳障碍链球菌 ATTC9926 2.5 0.5 2.5

（Streptococcus dysgalactiae）

13.枯草杆菌 ATTC6633 0.25 0.025 0.1

（Bacillus Subtilis）

14.仙影拳杆菌 CCM.2010 0.25 0.025 0.25

（Bacillus cereus）

15.地衣杆菌 CCM.2182 0.25 0.025 0.25

（Bacillus licheniformis）

16.地衣杆菌 CCM.2205 0.25 0.025 0.25

（Bacillus licheniformis）

17.枯草杆菌 CCM.1718 0.25 0.05 0.25

（Bacillus Subtilis）

18.单核李氏杆菌 CCM.5576 0.5 0.075 0.25

（Listeria monocytogenes）

19.黄色微球菌 ATCC.10240 0.075 0.01 0.05

（Micrococcus flavus）

20.棕色微球菌 DSM.20030 0.05 0.01 0.075

（Micrococcus lutocus）

21.脲芽孢八叠球菌 DSM.317 0.025 0.01 0.025

（Sporosarcina ureae）

22.绿脓杆菌 CCM.1960 25 25 25

（Pseudomonas aeruginosa）

23.荧光假单胞菌 CCM.2115 25 25 25

（Pseudomonas fluorescens）

24.嗜酸假单胞菌 CCM.283 25 25 25

（Pseudomonas acidoverans）

25.普通的变形杆菌 CCM.1799 50 50 50

（Proteus Vulgaris）

26.宋内氏志贺氏菌 CCM.1373 50 50 50

（Shigella Sonnei）

27.鼠伤寒沙门氏菌 CCM.5445 50 50 50

（Salmonella typhimurium）

28.大肠杆菌 DSM.30038 50 50 50

（Escherichiacoli）

表O/a

普瑞霉素抗菌素复合物对于人类致病菌的抗菌谱

菌族 MIC（μg/ml）

1.枯草杆菌 ATTC.6633 0.02

（Bacillus Subtilis）

2.枯草杆菌 CCM.1718 0.1

（Bacillus Subtilis）

3.仙影拳杆菌 CCM.2010 0.1

（Bacillus cereus）

4.地衣杆菌 CCM.2182 0.075

（Bacillus licheniformis）

5.地衣杆菌 CCM.2205 0.075

（Bacillus licheniformis）

6.金黄色葡萄球菌 CCM.885 0.25

（Staphylococcus aureus）

7.金黄色葡萄球菌 CCM.2317 0.1

（Staphylococcus aureus）

8.金黄色葡萄球菌 CCM.2514 0.25

（Staphylococcus aureus）

9.金黄色葡萄球菌 CCM.2515 0.25

（Staphylococcus aureus）

10.粪链球菌 CCM.1875 0.5

（Straptococcus faecalis）

11.无乳链球菌 CCM.5534 0.5

（Straptococcus agalactiae）

12.泌乳障碍链球菌 CCM.5548 0.5

（Straptococcusdysagalactiae）

13.无乳链球菌 CCM.5153 0.5

（Straptococcus agalactiae）

14.结核杆菌类 typ.hu H₃₇Rv 0.05

（Mycobacterium tuberculosis）

15.结核杆菌类 typ.boyin E₅0.8-1.0

（Mycobacterium tuberculosis）

16.结核杆菌类607 0.5

（Mycobacterium tuberculosis）

17.黄色微球菌 ATTC.10240 0.075

（Micrococcus flavus）

18.绿脓杆菌 CCM.1960 25

（Pseudo monas aeruginosa）

19.荧光假单胞菌 CCM.2115 25

（Pseudomonas fluorescens）

20.嗜酸假单胞菌 CCM.283 25

（Pseudomonas acidoverans）

21.Pictorum假单胞菌 CCM.284 10

（Pseudomonas pictorum）

22.普通的变形杆菌 CCM.1799 25

（Proteus vulgaris）

23.宋内氏（Sonnei）志贺氏菌 CCM.1373 25

（Shigella Sonnei）

24.鼠伤寒沙门氏菌 CCM.5445 50

（Salmonella typhi-murium）

25.猪属霍乱沙门氏菌例如巴斯德氏菌株 CCM.5438 50

（Salmonella cholerae-sus Inst.Pasteur strain）

26.大肠杆菌 DSM.30038 50

（Escherichia coli）

27.希氏溶血杆菌 CCM.5862 50

（Escherichia haemolyticus）

28.大肠杆菌（ATCC11775，膀胱炎） CCM.5172 50

（Escherichia coli ATCC11775 cyst it is）

29.溶生大肠杆菌，产生大肠杆菌素 CCM.180 50

（Escherichia coli lysegenic colicinogenic）

30.大肠杆菌 OTKI.17963 25

（Escherichia coli）

31.大肠杆菌 OTKI.23473 50

（Escherichia coli）

32.克雷伯氏肺炎杆菌 CCM.1848 50

（Klebsiella pneumoniae）

33.沙雷氏粘质杆菌 CCM.303 25

（Serratia Marcescens）

34.巴斯德氏菌 CCM.5419 25

（Pasteurella multocida）

35.副溶血弧菌 CCM.5938 25

（Vibrio parahaemo lyticus）

36.纯白的假丝酵母属 CBS.562 25

（Candida albicans）

37.热带的假丝酵母属 CBS.433 25

（Candida tropicalis）

38.假热带假丝酵母属372 5

（Candida pseudo tropicalis）

39.克鲁泽氏假丝酵母属K47 10

（Candida Krusei K-47）

40.隐球酵母属的新型细球菌K-16 5

（Cryptococcus neoformans K-16）

41.啤酒酵母菌类 OKI.1282 10

（Saccharomyces cerevisiae）

表Ⅰ

试验菌株

的序号 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ

1 0.25 0.5 0.2 60 10 35 70 30

6 0.25 0.1 0.06 18 15 16.5 33 67

8 0.25 0.5 0.2 60 10 35 70 30

10 0.75 0.5 0.4 40 20 30 60 40

11 1 1 0.8 60 20 35 80 20

12 2.5 2.5 1 30 10 20 40 60

13 0.25 0.1 0.08 24 20 22 44 56

14 0.25 0.25 0.1 30 10 20 40 60

15 0.25 0.25 0.08 24 8 16 32 68

16 0.25 0.25 0.08 24 8 16 32 68

17 0.25 -0.25 0.05 12 5 8.5 17 83

18 0.5 0.25 0.2 30 20 25 50 50

19 0.075 0.05 0.02 20 10 15 30 70

合剂的抗微生物活性汇总于表Ⅱ

被测菌株 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ

的序号

1 0.25 0.5 0.2 40 20 30 60 40

4 0.25 0.25 0.08 16 16 16 32 68

5 0.25 0.1 0.08 16 40 28 56 44

6 0.25 0.1 0.04 8 20 14 28 72

7 0.75 0.25 0.06 4 12 8 16 84

8 0.25 0.5 0.2 40 20 30 60 40

9 2.5 2.5 1 20 20 20 40 60

10 0.75 0.5 0.08 5.3 8 6.6 13.3 86.7

11 1 1 0.6 30 30 30 60 40

12 2.5 2.5 0.8 16 16 16 32 68

13 0.25 0.1 0.08 16 40 28 56 44

14 0.25 0.25 0.1 20 20 20 40 60

15 0.25 0.25 0.06 12 12 12 24 76

16 0.25 0.25 0.06 12 12 12 24 76

17 0.25 0.25 0.05 10 10 10 20 80

19 0.075 0.05 0.03 20 30 25 50 50

20 0.05 0.075 0.03 30 20 25 50 50

例15

增效合剂NoⅢ

n＝2

成分比：A₁∶B₁＝25∶75

抗微生物活性的试验结果汇总在表Ⅲ中（缩写与表1相同）

表Ⅲ

被测菌株的序号 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ

1 0.25 0.5 0.2 20 30 25 50 50

4 0.25 0.25 0.1 25 30 27.5 55 45

6 0.25 0.1 0.03 3 22.5 11.7 25.5 74.5

7 0.75 0.25 0.1 3.3 30 16.7 33.3 66.7

8 0.25 0.5 0.2 20 30 25 50 50

9 2.5 2.5 1 10 30 20 40 60

10 0.75 0.5 0.2 6.7 30 18.4 36.7 63.3

11 1 1 0.6 15 45 30 60 40

13 0.25 0.1 0.05 5 37.5 21.2 42.5 57.5

14 0.25 0.25 0.1 10 30 20 40 60

15 0.25 0.25 0.08 8 24 16 32 68

16 0.25 0.25 0.08 8 24 16 32 68

17 0.25 0.25 0.06 10 18 12 24 76

19 0.075 0.05 0.03 10 45 27.5 55 45

20 0.05 0.075 0.03 15 30 22.5 45 55

表Ⅳ

被测菌株的序号 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ

1 0.25 0.075 0.03 9 10 9.5 19 81

2 0.05 0.05 0.03 45 15 30 60 40

3 0.25 0.05 0.02 6 10 8 16 84

4 0.25 0.05 0.03 9 15 12 24 76

5 0.25 0.05 0.04 12 20 16 32 68

6 0.25 0.025 0.02 6 20 13 26 74

7 0.75 0.025 0.01 1 10 5.5 11 89

8 0.25 0.05 0.01 3 5 4 8 92

9 2.5 0.75 0.8 24 26.6 25.3 50.6 49.4

10 0.75 0.075 0.03 3 10 6.5 13 87

11 1 0.25 0.2 15 20 17.5 35 65

12 2.5 0.5 0.4 12 20 16 32 68

13 0.25 0.025 0.02 6 20 13 26 74

14 0.25 0.025 0.03 9 20 13 26 74

15 0.25 0.025 0.03 9 30 19.5 39 61

16 0.25 0.025 0.03 9 30 19.5 39 61

17 0.25 0.05 0.03 9 15 12 24 76

18 0.5 0.075 0.06 9 20 14.5 29 71

19 0.075 0.01 0.02 20 50 35 70 30

20 0.05 0.01 0.02 30 50 40 80 20

表Ⅴ

被测菌株的序号 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ

1 0.25 0.075 0.04 8 26.6 17.3 34.6 63.4

2 0.05 0.05 0.02 20 20 20 40 60

3 0.25 0.05 0.02 4 20 12 24 76

4 0.25 0.05 0.02 4 20 12 24 76

5 0.25 0.05 0.02 4 20 12 24 76

6 0.25 0.025 0.01 2 20 11 22 78

7 0.75 0.025 0.02 1.3 40 20.6 41.3 58.7

8 0.25 0.05 0.01 2 10 6 12 88

10 0.75 0.075 0.02 1.3 13.3 7.3 14.6 83.4

12 2.5 0.5 0.6 12 60 36 72 28

13 0.25 0.025 0.02 4 40 22 44 56

14 0.25 0.025 0.02 4 40 22 44 56

15 0.25 0.025 0.02 4 40 22 44 56

16 0.25 0.025 0.02 4 40 22 44 56

17 0.25 0.05 0.04 8 40 24 48 52

18 0.5 0.075 0.1 10 66.6 38.3 76.6 23.4

表Ⅵ

被测菌株的序号 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ

3 0.25 0.05 0.05 5 75 40 80 20

12 2.5 0.5 0.6 6 90 48 96 4

表Ⅶ

被测菌株的序号 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ

1 0.075 0.5 0.04 40 2 21 42 58

2 0.1 0.5 0.02 15 1 8 16 84

3 0.05 0.1 0.02 30 5 17.5 35 65

4 0.05 0.25 0.03 45 3 24 48 52

5 0.05 0.1 0.03 45 7.5 26.3 52.5 47.5

6 0.025 0.1 0.02 60 5 32.5 65 35

8 0.05 0.5 0.02 30 1 15.5 31 69

10 0.075 0.5 0.06 60 3 31.5 63 37

11 0.25 1 0.2 60 5 32.5 65 35

12 0.5 2.5 0.04 6 0.4 3.2 6.4 93.6

17 0.05 0.25 0.02 30 2 16 32 68

表Ⅷ

被测菌株的序号 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ

1 0.075 0.5 0.08 53.3 8 30.6 61.3 38.7

2 0.05 0.1 0.03 30 15 22.5 45 55

3 0.05 0.1 0.03 30 15 22.5 45 55

4 0.05 0.25 0.03 30 6 18 36 64

5 0.05 0.1 0.03 30 15 22.5 45 55

6 0.025 0.1 0.02 40 10 25 50 50

7 0.025 0.25 0.02 40 4 22 44 66

8 0.05 0.5 0.03 30 3 16.5 33 67

9 0.75 2.5 0.8 53.3 16 34.6 69.3 30.7

10 0.075 0.5 0.1 66.6 10 38.3 76.6 23.4

11 0.25 1 0.06 12 3 7.5 15 85

12 0.5 2.5 0.03 3 0.6 1.8 3.6 96.4

13 0.025 0.1 0.02 40 10 25 50 50

15 0.025 0.25 0.02 40 4 22 44 66

16 0.025 0.25 0.02 40 4 22 44 66

17 0.05 0.25 0.02 20 4 12 24 76

18 0.075 0.25 0.08 53.3 10 34.6 69.3 30.7

表Ⅸ

被测菌株的序号 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ

1 0.075 0.5 0.1 33.3 15 24.1 48.3 51.7

2 0.05 0.5 0.04 20 6 13 26 74

3 0.05 0.1 0.04 20 30 25.5 50 50

4 0.05 0.25 0.08 40 8 24 48 52

6 0.025 0.1 0.02 20 15 17.5 35 65

7 0.025 0.25 0.03 30 9 19.5 39 61

12 0.5 2.5 0.1 5 3 4 8 92

13 0.025 0.1 0.02 20 15 17.5 35 65

14 0.025 0.25 0.03 30 9 19.5 39 61

15 0.025 0.25 0.03 30 9 19.5 39 61

16 0.025 0.25 0.03 30 9 19.5 39 61

17 0.05 0.25 0.03 15 9 12 24 76

18 0.075 0.25 0.1 33.3 30 31.6 63.3 36.7

19 0.01 0.05 0.02 50 30 40 80 20

20 0.01 0.075 0.02 50 20 35 70 30

竖行Ⅹ：抗微生物活性的增效部分（100%-Ⅸ）

表Ⅹ

被测菌Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ Ⅸ Ⅹ

株序号

1 0.25 0.075 0.5 0.1 16 40 6 20.6 62 38

2 0.05 0.05 0.1 0.05 40 30 15 28.3 85 15

5 0.25 0.05 0.1 0.05 8 30 15 17.6 53 47

6 0.25 0.025 0.1 0.03 4.8 36 9 16.6 49.8 50

7 0.75 0.025 0.25 0.05 2.6 60 6 22.8 68.6 31.4

8 0.25 0.05 0.5 0.08 12.8 48 4.8 21.8 65.6 34.4

10 0.75 0.075 0.5 0.08 4.2 32 4.8 13.6 41 59

11 1 0.25 1 0.08 3.2 9.6 2.4 5.1 15.2 84.8

12 2.5 0.5 1 0.6 9.6 36 7.2 17.6 52.8 47.2

13 0.25 0.025 2.5 0.3 4.8 36 9 16.6 49.8 50.2

14 0.25 0.025 0.1 0.03 4.8 36 3.6 14.8 44.4 55.6

15 0.25 0.025 0.25 0.03 4.8 36 3.6 14.8 44.4 55.6

16 0.25 0.025 0.25 0.05 8 60 6 24.6 74 26

17 0.25 0.05 0.25 0.02 3.2 12 2.4 5.8 17.6 82.4

20 0.05 0.01 0.075 0.01 8 30 4 14 42 58

表Ⅺ

被测菌Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ Ⅸ Ⅹ

株序号

1 0.25 0.075 0.5 0.1 20 33.3 5 19.4 58.3 41.7

3 0.25 0.05 0.1 0.08 16 40 20 25.3 76 24

4 0.25 0.05 0.25 0.1 20 50 10 26.6 80 20

5 0.25 0.05 0.1 0.04 8 20 10 12.6 38 62

6 0.25 0.025 0.1 0.04 8 40 10 19.3 58 42

7 0.75 0.025 0.25 0.05 3.3 50 5 19.4 58.3 41.7

8 0.25 0.05 0.5 0.05 10 25 2.5 12.5 37.5 62.5

9 2.5 0.75 2.5 1 20 33.3 10 21.1 63.3 36.7

10 0.75 0.075 0.5 0.1 6.6 33.3 5 14.9 44.9 55.1

11 1 0.2 1 0.4 20 40 10 23.3 70 30

12 2.5 0.5 2.5 0.4 8 20 4 10.6 32 68

13 0.25 0.025 0.1 0.04 8 40 10 19.3 58 42

14 0.25 0.025 0.25 0.06 12 60 6 26 78 22

15 0.25 0.025 0.25 0.03 6 30 3 13 39 61

16 0.25 0.025 0.25 0.05 10 50 5 21.6 65 35

17 0.25 0.05 0.25 0.05 10 25 5 13.3 40 60

18 0.5 0.075 0.25 0.08 8 26.6 8 14.2 42.6 57.3

19 0.075 0.01 0.05 0.02 13.3 50 10 24.4 73.3 26.7

20 0.05 0.01 0.075 0.02 20 50 6.6 25.5 76.6 23.4

表Ⅻ

被测菌Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ Ⅸ Ⅹ

株序号

1 0.25 0.075 0.5 0.08 19.2 21.3 3.2 14.6 43.7 56.3

4 0.25 0.05 0.25 0.1 24 40 8 24 72 28

5 0.25 0.05 0.1 0.04 9.6 16 7.3 11 32.9 67.1

6 0.25 0.025 0.1 0.03 7.2 24 6 12.4 37.2 62.8

7 0.75 0.025 0.25 0.05 4 40 4 24 48 52

8 0.25 0.05 0.5 0.04 9.6 16 1.6 9.1 27.2 72.8

9 2.5 0.75 2.5 1 24 26.7 8 19.6 58.7 41.3

10 0.75 0.075 0.5 0.03 2.4 8 1.2 3.9 11.6 88.4

11 1 0.25 1 0.4 24 32 8 21.3 64 36

12 2.5 0.5 2.5 0.4 9.6 16 3.2 9.6 28.8 71.2

13 0.25 0.025 0.1 0.04 9.6 32 8 16.5 49.6 50.4

14 0.25 0.025 0.25 0.04 9.6 32 3.2 14.9 44.8 55.2

15 0.25 0.025 0.25 0.05 12 40 4 18.6 56 44

16 0.25 0.025 0.25 0.04 9.6 32 3.2 14.9 44.8 55.2

17 0.25 0.05 0.25 0.04 9.6 16 3.2 9.6 28.8 71.2

19 0.075 0.01 0.05 0.02 16 40 8 21.3 64 36

20 0.05 0.01 0.075 0.02 24 40 5.3 23.1 69.3 30.7

表ⅩⅢ

被测菌Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ Ⅸ Ⅹ

株序号

2 0.05 0.05 0.1 0.04 56 8 8 24 72 28

3 0.25 0.05 0.1 0.1 28 20 20 22.6 68 32

4 0.25 0.05 0.25 0.1 28 20 8 18.6 56 44

5 0.25 0.05 0.1 0.05 14 10 10 11.3 34 66

6 0.25 0.025 0.1 0.03 8.4 12 6 8.8 26.4 73.6

7 0.75 0.025 0.25 0.04 3.7 16 3.2 7.6 22.9 77.1

8 0.25 0.05 0.5 0.08 22.4 16 3.2 13.8 41.6 58.4

10 0.75 0.075 0.5 0.2 18.6 26.6 8 17.7 53.2 46.8

11 1 0.25 1 0.4 28 16 8 17.3 52 48

12 2.5 0.5 2.5 0.6 16.8 12 4.8 11.2 33.6 66.4

13 0.25 0.025 0.1 0.03 8.4 12 6 8.8 26.4 73.6

14 0.25 0.025 0.25 0.04 11.2 16 3.2 10.1 30.4 69.6

15 0.25 0.025 0.25 0.06 16.8 24 4.8 15.2 45.6 54.4

16 0.25 0.025 0.25 0.03 8.4 12 2.4 7.6 22.8 77.2

17 0.25 0.5 0.25 0.04 11.2 8 3.2 7.4 22.4 77.6

18 0.5 0.075 0.25 0.2 28 26.6 16 23.5 70.6 29.4

19 0.075 0.01 0.05 0.02 18.6 20 8 15.3 46.6 53.4

20 0.05 0.01 0.075 0.01 14 10 2.6 8.8 26.6 73.4

Claims

1、将普瑞霉素抗菌混合物分离成主要成分A₁，B₁和C₁及次要成分A₂，A₃，B₂，B₃，C₂和C₃的工艺方法，其中的各成分有下述结构和特征，

其中Bu代表丁基，ME代表甲基，在硅胶薄层色谱上用氯仿、甲醇甲酸、水、甲醛和正丁醇的比为130∶53∶6∶9∶3∶3的混合洗脱液展开时，其Rf值为0.29，质谱法确定的分子量为1078；

成分A₂(Midopricin)，其化学式同A₁，但戊基代替了A₁式中的丁基，在硅胶薄层色谱上用氯仿，甲醇、甲酸、水，甲醛和正丁醇的比为130∶53∶6∶3∶3∶3的混合洗脱液展开时，其Rf值为0.31，质谱法确定的分子量为1092；

成分A₃(Methipricin)，其化学式同A₁，但已基代替了A₁式中的丁基，在硅胶薄层色谱上用氯仿，甲醇、甲酸、水、甲醛和正丁醇的比为130∶53∶6∶9∶3∶3的混合洗脱液展开时，其Rf值为0.33，质谱法确定其分子量为1106；

其中Bu代表丁基，Me代表甲基，在硅胶薄层色谱上用氯仿、甲醇、甲酸、水、甲醛和正丁醇的比为130∶53∶6∶9∶3∶3的混合洗脱液展开的Rf值为0.35，质谱法确定的分子量为946；

成分C₂(oxymipricin)，其化学式同C₁，但戊基代替了式C₁中的丁基，在硅胶薄层色谱上用氯仿、甲醇、甲酸、水、甲醛和正丁醇的比为130∶53∶6∶9∶3∶3的混合洗脱液展开的Rf值为0.37，质谱法确定的分子量为960；

成分C₃(oxymethipricin)，其化学式同C₁，但已基代替了式C₁中的丁基，在硅胶薄层色谱上用氯仿、甲醇、甲酸、水、甲醛和正丁醇的比为130∶53∶6∶9∶3∶3的混合洗脱液展开的Rf值为0.39，质谱法确定的分子量为974；

其中Bu代表丁基，ME代表甲基，在硅胶薄层色谱上用氯仿、甲醇、甲酸、水、甲醛和正丁醇的比为130∶53∶6∶9∶3∶3的混合洗脱液展开的Rf值为0.54，质谱法确定的分子量为930。

成分B₂(Hymipricin)其化学式同B₁，但戊基代替了B₁式中的丁基，在硅胶薄层色谱上用氯仿、甲醇、甲酸、水、甲醛和正丁醇的比为130∶53∶6∶9∶3∶3的混合洗脱液展开的Rf值为0.56，质谱法确定的分子量为944；

成分B₃(Hymethipricin)，其化学式同B₁但已基代替了B₁式中的丁基，在硅胶薄层色谱上用氯仿、甲醇、甲酸、水、甲醇和正丁醇的比为130∶53∶6∶9∶3∶3的混合洗脱液展开的Rf值为0.58，质谱法确定的分子量为958；该方法的特征在于包括通过一次或二次展开薄层包谱，或柱色谱，或两者都使用，分离由发酵制备的普瑞霉素粗产品，半纯产品或纯产品中的成分，色谱分离过程中使用组合溶剂作为洗脱液，洗脱液是氯代C_1-4脂族烃和/或C_1-4脂族醇和/或C_1-4脂族有机酸和/或C_1-4脂族醛和/或水的混合物；然后将色谱分离出含相同组分的馏分合并，再用溶剂沉淀或蒸发法回收普瑞霉素各成分。

2、权利要求1的方法，其特征在于还包括以盐的形式分离普瑞霉素各成分。

3、权利要求2的方法，其特征在于以乙酸盐，氯乙酸盐，甲酸盐或硫酸盐形式分离普瑞霉素各成分。

4、权利要求1的方法，其中氯代C_1-4脂族烃是氯仿，C_1-4脂族醇是甲醇、乙醇、丁醇或异丙醇，C_1-4脂族有机酸是甲酸、乙酸或氯乙酸，C_1-4脂族醛是甲醛。

5、权利要求1的方法，其特征在于，把抗菌混合物按0.5-1.0%（重量）浓度溶解到配制好的含1-4个碳原子的醇的混合溶剂，或含有水的混合溶剂中，然后在含有硅胶的薄层色谱片上，或含有硅胶的高压薄层色谱片上展开，色谱片上的作为固体载体的硅胶最好在金属盐溶液中浸渍过。

6、权利要求1的方法，其特征在于用分配柱色谱法或吸收柱色谱法分离普瑞霉素的成份，在吸收柱色谱的过程中使用Lobar式色谱柱，或者用在金属盐溶液中浸渍过的硅胶填充色谱柱。

7、权利要求4的方法，其中在吸收柱色谱中使用用银盐或铁盐浸渍过的硅胶填充色谱柱，在分配柱色谱中使用Sephadex LH20为固体载体在过压条件下进行。

8、权利要求1的方法，其中包括选择使用下述各种混合溶液作为洗脱液：

采用正丁醇、冰醋酸和水的比例为60∶10∶30的混合物（溶剂系统Ⅰ）的上层作为洗脱液;

用正丁醇、甲醇、冰醋酸和水的比例为75∶2∶8∶15的混合液（溶剂系统Ⅱ）的上层作为洗脱液;

采用氯仿、甲醇、冰醋酸和水的比例为45∶30∶15∶20的混合液（溶剂系统Ⅲ）的下层作为洗脱液;

采用氯仿、甲醇、甲酸和水的比例为50∶35∶14∶1的混合液（溶剂系统Ⅳ）作为洗脱液;

采用氯仿、甲醇、甲酸、水、甲醛和正丁醇的比例为130∶53∶6∶9∶3∶3的混合物（溶剂系统Ⅴ）作为洗脱液;

采用氯仿、甲醇、甲酸、水、甲醛和正丁醇的比例为160∶53∶6∶9∶3∶3的混合物（溶剂系统Ⅵ）作为洗脱液;

用15份（重量）氯代乙酸溶解到氯仿、甲醇、水甲醛和正丁醇的比例为125∶53∶9∶3∶3的混合物中（溶剂系统Ⅶ）作为洗脱液;

用溶剂系统Ⅲ，氯仿和甲醇的比为15∶2∶1的混合物（溶剂系统Ⅷ）作为洗脱液。

9、权利要求1-3的任一方法，其中包括通过加入除硫酸外的有机或无机酸的钡盐，从普瑞霉素组分的硫酸盐中，以非硫酸盐的形式分离普瑞霉素各组分，或通过加入硫酸使不是以硫酸盐形式回收的普瑞霉素各组分形成硫酸盐。