CN1008684B - 蛋白质的分级分离方法 - Google Patents

Abstract

一种用于对大豆蛋白等植物蛋白进行分级分离的方法，该法包括使植物蛋白原料的水溶液系统接受还原条件的处理，例如经过亚硫酸盐化合物、谷胱甘肽化合物或半胱氨酸化合物的处理，或者在pH值位于中性或碱性范围的条件下接受电解还原处理，然后在20℃或更低的温度下将该系统的pH值调至5.5-7.0，使该系统分离成为可溶性或分散性的级分和不溶性或沉淀性的级分。

Description

本发明叙述一种蛋白质的分级分离方法，着重叙述大豆蛋白等食用植物蛋白的分级分离方法。

到目前为止，生产大豆分离蛋白的方法是对大豆蛋白原料的水溶液进行适当处理，使之分离成为水溶性或分散性的级分和不溶性或沉淀性级分（这种不溶性残渣称为“豆渣”或“大豆渣浆”），然后调节水溶性或分散性级分的pH值至4-5（通常是4.2-4.6）之间，进行等电点沉淀，再对沉淀进行中和和干燥等适当处理，制成符合需要的大豆蛋白级分。

值得顺便提到的是，大豆蛋白和其他许多植物蛋白一样，是由多种具有高级复杂结构的蛋白质级分所组成的。例如，依据不同蛋白质级分具有不同沉降常数的超速离心法对大豆蛋白进行分级分离的结果表明，大豆蛋白可分离成为2S、7S、11S和15S等多种蛋白质级分。这些级分的物理性质各不相同，而且是由多种亚基所组成，例如7S蛋白质级分有三个亚基，11S蛋白质级分有十二个亚基等。许多研究表明，这些蛋白质级分及其亚基的本质（即它们的高级结构和亚基之间的相互作用等等）会随环境条件（如离子强度、pH值、温度和浓度等等）的变化而变化，它们的性质也随之发生变化。

利用以上这些事实，人们对大豆蛋白和其他植物蛋白的分级分离提出了多种多样的方法。利用这 些方法分离得到的大豆蛋白，即使它们所处的条件（如离子强度、pH值、某些盐的存在、浓度、温度和操作步骤的差异等等）差别甚少，但它们在物理性质、功能特性和化学性质方面仍会有很大的差别。这些差别不仅来源于上述各种蛋白质级分（如7S、11S等）在数量比例方面的变化，而且来源于高级结构方面的变化以及蛋白质各个级分和或亚基相互作用的变化等等。

在这些已知的植物蛋白的分级分离方法中，有《日本特许公报》发表的第48-56843号专利，它透露了采用稀钙盐溶液分离大豆蛋白11S级分和7S级分的方法。《日本特许公报》第49-31843专利透露了制备大豆蛋白7S级分的方法，该方法是在pH值等于1.2-4.0的情况下利用氯化钠或氯化钾的作用把不溶性级分除去。《日本特许公报》第51-86149号专利透露了利用pH值约等于5.1-5.9的水对油料种子等植物蛋白原料的浆液进行处理，从而提取出一种热凝聚的带有粘性的蛋白质。《日本特许公报》第55-124457号专利透露了制备大豆蛋白7S级分的方法，该法是在pH值等于5.40-5.85时进行蛋白质的提取，并在pH值等于4.5时进行等电点沉淀。《日本特许公报》第55-153562号专利透露了制备大豆蛋白制品的方法，该方法是在pH值为6.0-7.0时从大豆蛋白分离出第一个级分，在pH值为5.0-5.6时分离出第二个级分，在pH值为4.0-4.8时分离出第三个级分，并对第二个级分和第三个级分再作进一步的分离。《日本特许公报》第56-64755号专利透露了制备蛋白质制品的一种方法，该法是采用pH值约等于6.5的水溶性提取介质对植物蛋白进行提取，在等电点的情况下使之沉淀，然后在115-145°F的温度下进行加热浓缩，使制品的干物质含量达到44%或者更多。《日本特许公报》第57-132844号专利透露了制备分离蛋白质的方法，该方法是在pH值为6.5-8.0和存在亚硫酸根离子的情况下从植物蛋白的水溶性浆液中提取出一种级分，然后进行干燥。《日本特许公报》第58-36345号专利透露了分离7S级分和11S级分的方法，该法是将等电点沉淀得到的植物蛋白水溶性浆液的pH值调节到5.0-5.6，同时将盐浓度调节为0.01-0.2M。

此外，关于大豆蛋白分级分离的实验性方法还有以下的文献报告：Roberts，R.C.和Briggs，D.R.发表的文章，载于Cereal    Chem.（谷物化学），42卷第71-85页（1965年），Eldrige，A.C.和Wolf，W.J.载Cereal    Chem.（谷物化学），44卷第645-652页（1967年）;Wolf，W.J.和Sly，D.A.载Cereal    Chem.（谷物化学），44卷第653-668页（1967年）;Tkanh，V.H.等，载Plant    Physiol.（植物生理学）56卷第19-22页（1975年）。特别值得提出的是关于Thanh    V.H.的报告，该报告透露了分离大豆蛋白的7S球蛋白的方法，它使用含有β-巯基乙醇（pH7.8）的三羟甲基氨基甲烷缓冲液来对大豆粉进行提取，然后在每分钟10000转的转速下进行离心，除去不溶性物质，将上清液的pH值调节至6.6，进行透析，在每分钟1000转的转速下离心，分离出粗制的11S级分和7S级分，将7S级分进行等电点沉淀并洗涤，然后冷冻干燥。Yamauchi，F.等人在Agric，Biol.Chem.（农业生物化学）第39卷（1975年）上发表的报告说，他们利用洗涤、中和和溶于缓冲溶液等方法从与Thanh等人同样的粗制11S级分中分离出大豆蛋白的11S级分。

但是，这些已知的植物蛋白的分级分离方法并不十分适用于工业方面的应用，特别是不大适用于大豆分离蛋白的工业化生产。

因此，为了克服这些已知方法的缺点，本专利发明者进行了深入的研究。根据本发明者的研究，这些已知方法尚存在着种种问题，例如：①仅仅采用无机酸等物质去调节三羟甲基氨基甲烷缓冲液的pH值是很难将粗制的11S级分与粗制的7S级分分离的;②象三羟甲基氨基甲烷缓冲液和β-巯基乙醇等化学试剂是不能用于食品工业的;③特别是β-巯基乙醇，由于具有强烈的不愉快气味，不可能用于食品工业;④使用离心力较低的连续式工业离心机（例如沉降式离心机）是很难将沉淀性浆状物质（粗制的11S级分）和溶液状物质（粗制的7S级分）成功地分离的，因为用离心法除去不溶性物质后将pH值调至6.6时所得到的溶液具有很大的粘性。

研究发现，这些问题可采用以下方法去解决：①在pH值为6.5或更高数值的条件下，用含有亚硫酸盐化合物、谷胱甘肽化合物或半胱氨酸化合物的水溶液系统处理植物蛋白原料;②在温度为20℃或者更低的温度下将该系统的pH值调到5.5-7.0，使之分离成可溶性或分散性的级分和不溶性或沉淀性的级分。使用这种操作步骤，可以制得风味和滋味均极为优良但性质上却各不相同的蛋白质制品。特别是在使用含有糖类的大豆蛋白时，可使用工业连续离心机（如沉降式离心机等）使各种级分容易 地分离开来。

除此以外，研究还发现，采用电解还原法处理植物蛋白原料的水溶液也可以容易而有效地将7S蛋白级分和11S蛋白级分分离开来，而不会出现上述的问题。在这一方面，虽然Komeyasu，M.等人在Nippon    Shokuhin    Kogyo    Gakkaishi（《日本食品工业学会志》）第三十卷第十期第589-598页（1983年）上透露了大豆蛋白的电解还原法，但他们并没有建议采用电解还原法来分离7S蛋白质级分和11S蛋白质级分。

本发明的目的之一是提供一种对大豆蛋白进行分级分离的新方法，这种方法可用于分离大豆蛋白的工业化生产。

本发明的又一个目的是提供一种新的可用于分离植物蛋白的7S级分与11S级分的方法。本发明的另一个目的是提供一种新的可用于其他植物蛋白的分级分离方法，此法可用于这类蛋白制品的工业化生产。

当人们熟练地掌握下述的带有附图说明的生产工艺以后，本发明的这些目的以及其他目的和它的优越性将会明显地表露出来。

图1说明在下文介绍的实例1中所获得的每一种蛋白质级分的水悬浮液的浊度和蛋白质浓度的关系。

图2说明在下文介绍的实例1中所获得的一种蛋白质级分的产率与亚硫酸钠和脱脂大豆比率之间的关系。

图3说明在下文介绍的实例4中所获得的11S蛋白质级分的产率与电解还原时间的关系。

图4是在下文介绍的实例4中所获得的蛋白质级分的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。

图5是在下文介绍的实例2中所获得的蛋白质级分的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。

图6是一种酸沉淀蛋白质级分的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。

本发明的第一部分就是提供一种对植物蛋白进行分级分离的方法，该法包括在pH值为6.5或更高数值的情况下用亚硫酸盐化合物、谷胱甘肽化合物或半胱氨酸化合物处理植物蛋白原料的水溶液系统，然后将所得混合物在温度为20℃或者更低的情况下将其pH值调节为5.5-7.0，使蛋白质分离成为两个级分：一个是可溶性或分散性级分（在下文中，有时把它简称为可溶性级分），另一个是不溶性或沉淀性级分（在下文中，有时把它简称为不溶性级分）。这些级分可以容易地采用以下的常规方法对它们进行分离：过滤法或离心法，特别是使用连续工业离心机（如沉降式离心机等）。分离得到的第一个级分可采用洗涤、等电点沉淀、中和与干燥等常规方法使之纯化。

本发明的第二个部分就是提供一种改进的将植物蛋白分离成为7S级分和11S级分的方法，这种方法是将含有7S和11S蛋白质级分的植物蛋白原料的水溶液系统进行电解还原，电解还原时的pH值最好是在中性或碱性的范围。电解还原可以象上面第一个部分所述的那样，在含有少量的亚硫酸盐化合物、谷胱甘肽化合物、半胱氨酸化合物或硫酸盐化合物的情况下进行。然后，可以将经过处理的混合物在温度为20℃或者更低的情况下将其pH值调节为5.5-7.0，使之分离成为主要是由7S蛋白质级分组成的可溶性级分和主要是由11S蛋白质级分组成的不溶性级分。和上述一样，这些级分可以容易地采用常规方法使之分离，分离得到的每一种级分也可用常规方法进行纯化。

从上述可以清楚地看出，本发明的第三个部分就是提供一种对植物蛋白进行分级分离的方法，该方法是在pH值位于中性或碱性的范围内对植物蛋白的水溶液系统进行电解还原，然后在温度为20℃的情况下将该混合物的pH值调至5.5-7.0，使混合物分离成为可溶性级分和不溶性级分。

在本发明中，任何含有一种或多种所需植物蛋白级分的物料均可用作植物蛋白的原料。可用作本发明的植物蛋白原料的具体例子有：大豆、油菜籽、花生和棉籽等油料种子，也包括来自这些油料种子的蛋白质饼粕。考虑到原料的供应和经济问题，最好能使用大豆或含有大豆其他物质的大豆蛋白质，如大豆片、脱脂大豆、豆乳（包括脱水豆乳）、大豆浓缩蛋白或大豆分离蛋白等。

特别要指出的是，本发明的第一部分所用的原料最好是既含有所需要的大豆蛋白质级分也含有不溶性碳水化合物的物料（如大豆本身、脱脂大豆、大豆浓缩蛋白等等，这些物料称为“okara”），因为这样的原料可以更容易地把可溶性级分与不溶性级分分离开来。在本发明的第二部分，所使用的原 料最好是含有较少不溶性碳水化合物的物料（如豆乳等）。不过，植物蛋白原料所含的不溶性物质均可在本发明方法的任何阶段中予以除去。举例来说，不溶性物质可以在使用本发明方法之前予以除去，也可以在将该水溶液系统的pH值调至5.5-7.0之后，把溶液分为可溶性级分和不溶性级分，然后把不溶性级分除去。

在本发明的第一部分中，我们是使用亚硫酸盐化合物、谷胱甘肽化合物或半胱氨酸化合物来处理植物蛋白原料的。

亚硫酸盐化合物可使用任何能在水溶液系统中释放出亚硫酸根离子的化合物，这些化合物的具体例子有：亚硫酸、碱性金属的亚硫酸盐（如亚硫酸钾和亚硫酸钠）、亚硫酸铵、碱性金属的亚硫酸氢盐（如亚硫酸氢钾和亚硫酸氢钠）、亚硫酸氢铵、碱性金属的焦亚硫酸盐（如焦亚硫酸钾、焦亚硫酸钠）焦亚硫酸铵、碱性金属的偏亚硫酸氢盐（如偏亚硫酸氢钾和偏亚硫酸氢钠）、偏亚硫酸氢铵、偏亚硫酸氢铵与二氧化硫的混合物等。亚硫酸盐化合物所使用的数量随原料的蛋白质含量而变化，但一般说来，亚硫酸盐化合物的用量宜为大豆原料重量的0.5%或者更多一点，最好能采用大豆蛋白原料重量的1.0%或者更多一点的数量，当亚硫酸盐化合物的用量少于0.5%（重量比）时，所制得的可溶性级分的蛋白质纯度（亦即所制得的可溶性级分的蛋白质专一性）就会下降。考虑到这种化合物的作用效果和经济成本，亚硫酸盐化合物的用量最多不超过大豆蛋白原料重量的1.0%即已足够。

关于谷胱甘肽化合物和半胱氨酸化合物的实际例子有：谷胱甘肽、谷胱甘肽盐类如盐酸谷胱甘肽、半胱氨酸、半胱氨酸盐类如盐酸半胱氨酸等。一般来说，这些化合物的用量为每100克大豆蛋白原料使用5毫摩尔或者更多一点，最好使用10毫摩尔或者更多一点。这些化合物的用量最多不超过每100克大豆蛋白原料50毫摩尔即已足够。与传统方法使用的巯基乙醇相比，这些化合物没有任何强烈的气味，它们能使蛋白质制品具有极优良的滋味和气味，而不存在任何卫生问题。

使用上述化合物对蛋白原料进行处理是在蛋白原料的分散液或悬浊液等水溶液系统中进行的，pH值为6.5或者更高，较好的是采用7.1-9，最好能采用7.5-8.5。该系统的pH值可采用常规方法进行调节，例如可采用氢氧化钠或碳酸钠等碱性化合物以及盐酸等酸类物质。当pH值低于6.5时，上述化合物将不发生任何作用，而且可溶性级分的产率下降。另一方面，如果pH值大于9，由于碱性条件的关系，可能会产生一种明显的异味。这种处理可以在适于溶解蛋白质或从蛋白原料中提取蛋白质的现有的混合器或搅拌器中进行。在该水溶液系统中，蛋白质原料的浓度并无特殊的限制，当浓度较低时，有利用于蛋白质的溶解和提取。不过，如果蛋白质原料浓度太低，就难以把不溶性级分与可溶性级分分离开来。因此，蛋白质原料的浓度最好是它的水溶液系统总重量的3%或者更多一点（重量比），在通常情况下，可采用8-20%的数值（重量比）。

在本发明的第二部分中提到了要对蛋白质原料的水溶液系统进行电解还原处理。这种处理就是把蛋白质原料置于还原的条件下，而这种条件是利用电解还原作用而在阴极附近产生的，所使用的水溶液系统可和本发明第一部分所采用的完全一样。

电解还原作业可使用已知的电解还原装置进行。这种装置通常是由装有阴极的阴极池和装有阳极的阳极池组成，在两个池之间，有一薄膜相隔或是把两者桥接起来。这个隔膜可使用任何能够让离子通过的材料，例如，可以使用超滤膜（UF）反向渗透膜（RO），半透膜，粘土板或陶土圆筒等陶磁材料，也可以使用制成凝胶状态的高分子材料或含有电解质的琼脂薄膜等等。将蛋白质原料的水溶液系统加入阴极池中，采用常规的方法即可使之发生还原反应。阴极池中水溶液系统的pH值最好位于中性至碱性的范围。

还原反应的程度和速度可以容易地采用调节电流密度、电极电位或电解还原时间来进行控制。例如，当还原反应是按每100毫升豆乳用100毫安的电流进行电解还原时，大约需要六小时就可获得所需的还原程度，在这种情况下，如果增加电流密度或提高电极电位，电解还原时间就可以减少。

除此而外，添加少量氧化还原电势低的物质或者在电解还原条件下能使氧化还原电势降低的物质也可以缩短电解还原时间。这些物质的具体例子有：上面提到的亚硫酸盐化合物、谷胱甘肽化合物、半胱氨酸化合物以及硫酸盐化合物（如硫酸钠）等，硫酸盐化合物在水溶液中能释放出硫酸根离子。举例来说，当每100毫升豆乳添加了10毫克亚硫酸氢 钠（SBS）时，只需要4小时就可以达到上述6小时电解还原时间所能达到的还原程度。如果SBS（亚硫酸氢钠）的添加量增加为60毫克，则可在2小时左右就可达到同样的还原程度。

本发明的第二部分内容具有以下优点：（1）可以在不使用或只使用少量的不宜在食品中使用的化学物质的情况对植物蛋白进行分级分离;（2）该水溶液系统的pH值可以在不添加任何碱性物质的情况下维持在中性或碱性的范围，因为在电解还原条件下，该系统的pH值将位于这个范围;（3）可以容易地对主要是由7S蛋白质级分构成的级分和主要是由11S蛋白质级分构成的级分进行分离。

从上述可以清楚地看出，在本发明所采用的方法中，植物蛋白原料是在水溶液系统中并在还原条件以及pH值最好位于中性或碱性的范围内受到处理的。

按照本发明第一部分或第二部分所述的步骤，在还原条件下经过上述处理的水溶液系统随后便在温度为20℃或者更低的情况下把它的pH值调到5.5-7.0，最好是6.0-6.9，从而使之分离成为主要由7S蛋白质级分构成的可溶性级分（以下简称为S-1级分）和主要由11S级分构成的不溶性级分（以下简称为P-1级分）。当pH值低于5.5时，S-1级分的产率下降。如果pH值大于7.0，P-1级分将难于沉淀，而且S-1级分的纯度下降。如果温度高于20℃，S-1级分与P-1级分的分离将变得困难。水溶液系统的温度必需保持在冻结点以上，因为如果发生冻结，就难以对各个级分进行分离。

对所得级分进行分离可采用已知的方法进行，如过滤、薄膜分离和离心分离等。特别是，可以采用连续式离心机（如沉降式离心机和喷嘴分离器等）等设备而容易地实现S-1级分和P-1级分的连续分离作业。当然，也可以采用分批作业式的离心机。如果在还原条件处理以后的水溶液系统的pH值未能调节到5.5-7.0，就很难把S-1级分与P-1级分分离，除非使用转速高达10000转/分的高速离心力才能使它们分离，这个转速比工业离心机的转速高得多（如沉降式离心机的转速为2000-2500转/分）。

由此制得的S-1级分还含有不是7S蛋白质级分的其他水溶性成分，如乳清（上层清液）等，这些成分可直接当作7S蛋白乳来使用。如果需要也可以采用现有的工艺对这些成分进行分离，以获得粗制的7S蛋白质级分。

当P-1级分含有“豆渣（okara）”等不溶性物质时，这些不溶性物质可以直接当作11S蛋白质浓缩物来使用，如果需要，也可以采用现有的工艺从这些不溶性物质中分离出粗制的11S蛋白质级分。比较理想的情况是，将由此制得的P-1级分制成温热的水溶液系统，从而获得11S蛋白质级分处于分散状态或溶解状态的级分（以下简称为S-2级分）。为了使S-2级分处于良好的分散状态或溶解状态，温热水溶液系统的温度应为11℃或者更高，较好的数值是21℃或者更高，最好是30°-60℃，该系统的pH值应为6或者更高，最好是6.7-9。S-2级分可直接当作粗制的11S蛋白质级分来使用。

除此而外，利用上法制得的S-1，P-1和S-2级分，还可采用已知的工艺使之浓缩和干燥，制成性质和普通分离蛋白不同的植物分离蛋白。例如，可以采用等电点沉淀法对每一个级分进行浓缩，回收所得的沉淀，必要时还可用水洗涤沉淀以除去各种杂质。也可以采用超滤薄膜来进行浓缩。另一种浓缩方法是，将每一个级分进行等电点沉淀，把所得沉淀中和后，再采用HTST（高温短时杀菌）和UHT（超高温杀菌）等已知工艺对沉淀进行灭菌处理，或者将所得沉淀进行酶学处理。在一般情况下，最好把所需的制品分离并制成无菌和干燥的产品。

下面介绍的实验将表明，利用上述方法制得的分离蛋白产品与普通制品相比，在性质上有许多不同的地方，因此，这些制品将会有广泛的应用。

下面叙述的实施例、参考例和实验将对本发明作出更详细的说明，但这决不意味着这是构成对本发明应用范围的限制。在以下的实施例、参考例和实验中，所有的“分”均是指重量分量，除非另有说明。

实例1

将脱脂大豆（90分）、水（900分）和亚硫酸氢钠（1.26分）混合，在pH值的7.8的条件下搅拌30分钟。向混合物中加入6N盐酸，使该混合物的pH值变为6.25，将混合物用水冷却，在5℃或更低的温度下让该混合物静置30分钟。用沉降式离心机在每分钟2500转的转速下将混合物离心，使混合物分离成为可溶性级分（S-1级分）和不溶性变分（P-1）。将S- 1级分的pH值调节为4.5，进行等电点沉淀，把沉淀分离出来，向沉淀中加入水500分，将混合物搅匀，用水洗涤，然后在和上述条件相同的情况下进行离心，收集沉淀下来的级分，将这个级分进行中和，在135℃下加热30秒钟，再进行喷雾干燥，制得一干燥制品（12.6分，以下简称D-1级分）。

另一方面，将上述获得的P-1级分加入温水（500份）中，水温要维持50℃，pH值为8.0，用沉降式离心机将所得沉淀除去，收集所得级分（以下简称S-2级分）。将S-2级分的pH值调至4.5，进行等电点沉淀，将所得沉淀中和、加热和喷雾干燥，得到一干燥产品（12.8分，以下简称D-2级分）。

在生产过程中以及所制得的产品，即S-1，S-2，D-1和D-2级分，均未察觉有任何不愉快的气味。

实验1

对实验1制得的D-1级分和D-2级分与常规方法制得的大豆分离蛋白（SPI）在性质方面进行比较。

大豆分离蛋白（SPI）的制备。

向实例1所用的脱脂大豆（1分）中加入水（10分），将混合物搅匀，用离心机把“豆渣”除去，将所得豆乳进行等电点沉淀，得到凝乳状沉淀，向沉淀内加入水（10份），用水洗涤该混合物，中和以后，按实例1的同样操作步骤进行加热和喷雾干燥，制得大豆分离蛋白（SPI）。

氮溶解度指数（NSI）的测定

将被测样品（3.5克）分散于水（100毫升）中，在40℃下搅拌（450转/分）60分钟。将所得混合物在2500转/分的转速下进行离心，收集第一次上清液，所得沉淀按同样的操作步骤再次进行处理，收集第二次上清液，将两部分上清液合并，用凯氏定氮法测定上清液和原来样品的粗蛋白含量。合并以后的上清液的粗蛋白含量与整个样品的粗蛋白含量的百分比，就是该样品的氮溶解度指数（NSI）。测定结果表明，D-1级分和D-2级分的氮溶解度指数分别为92和93，这些数值和大豆分离蛋白的氮溶解度指数一样高。

凝胶形成能力和粘度的测定

向粉状样品（12克）中加入水或2.5%的氯化钠溶液（88毫升），将混合物在1200转/分的转速下匀浆3分钟，用离心法在2500转/分的转速下离心去泡沫10分钟，然后在80℃下加热30分钟。使用凝乳测定仪（日本IIOK.K.公司制造）测定所得凝胶的强度（克/厘米²），或者使用Brookfield粘度计（日本东京KeiKi K.K.公司制造）测定所得凝胶的粘度（厘泊），结果如表1所示。

表1

级分名称    不加氯化钠的凝胶    加氯化钠的凝胶

D-1级分 61克/厘米²100，000厘泊

D-2级分 91克/厘米²4，480厘泊

大豆分离蛋白质 74克/厘米²100，000厘泊

从表1可知，D-1级分在加有氯化钠时其凝胶十分脆弱，如果不加氯化钠，则具有很高的粘度。另一方面，D-2级分在加有氯化钠时其凝胶的强度很高，如果不加氯化钠，其粘度甚低。

透明度的测定

在600毫微米处测定了含有D-1级分、D-2级分或大豆分离蛋白的各种浓度的水悬浊液的浊度（光密度），每一种级分或大豆分离蛋白的浊度与浓度的关系如图1所示。

这些试验的结果表明，与大豆分离蛋白相比，D-1级分和D-2级分在凝胶形成能力、粘度和透明度等方面是与大豆分离蛋白不同的。需要顺便指出的是，D-2级分能形成白色的较硬的凝胶，这种凝胶和日本一种典型的鱼糕制品（称为“Kamaboko”）十分相似。

实例2

按照与实例1完全相同的操作步骤制备D-2级分，但亚硫酸氢钠的重量与脱脂大豆的重量比例是变化的，图2表示出D-2级分的产率与该重量比例之间的关系。在图2中，D-2的产率采用相对数值表示，假定实例1中D-2级分的产率等于100。

从图2可以看出，亚硫酸氢钠与脱脂大豆的重量比至少应等于0.5%，最好是1.0%或者更多一些。此外，从图中还可清楚地看出，如果不使用亚硫酸氢钠，就很难将D-1与D-2级分分离开来。

实例3

按照实例1完全相同的操作步骤制备D-1与D-2级分，唯一的例外之处是按每100克脱脂大豆使用15毫摩尔的盐酸半胱氨酸或谷胱甘肽来取代亚硫酸氢钠。表2列出了D-2级分的产率。在表2中，产率采用相对数值表示，假定实例1中D-2级分的 产率等于100。

表2

D-2级分的产率

实例1    100

盐酸半胱氨酸    88

谷胱甘肽    97

参考实例1

向脱脂大豆（1份）内加入63毫克分子的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液，该缓冲液含有10毫克分子的β-巯基乙醇（pH7.8，15份），将此混合物搅拌并在10000转/分的转速下离心以除去不溶性杂质（“豆渣”）。用2N盐酸将可溶性级分的pH值调至6.6，用冰水冷却在2-3℃下静置3小时，再用沉降式离心机将该级分分离成为一个分散性级分和一个沉淀性级分，但未能成功。然后，使用分批作业式离心机（10000转/分）将该级分分离成为上清液（S-1级分）和沉淀两部分，将沉淀分散于磷酸缓冲液（pH7.6）中以制备S-2级分。结果发现，S-1和S-2级分由于含有巯基乙醇，两者都具有不愉快的气味，而且还含有缓冲液，因此，它们不宜用于食品方面的用途。

实例4

向脱脂大豆中加入体积为其15倍的水，在pH值为6.8的条件下将混合物搅拌1小时制成豆乳。将豆乳（300毫升）放入电解还原仪器的阴极池内，在阳极池内则加入0.4M氯化钠溶液（300毫升）。用含有0.4M氯化钠的1.5%琼脂桥接管将阴极池和阳极池联接起来。在阴极池中的液体不断受到搅拌的情况下进行电解还原8小时（电流数值：100毫安/100毫升豆乳）。

随着电解还原时间的增加，pH值也会上升（在两小时内，pH值由7上升为8.7），此时应加入2N盐酸使pH值位于7.0-7.5的范围内。

电解还原完成以后，将豆乳的pH值调至6.2，用冰冷却在10℃或更低的温度下静置2小时以形成沉淀，用2500转/分的离心法收集所得沉淀，测定沉淀的数量。图3表示出电解还原时间和沉淀回收数量的关系。在图3中，沉淀的数量是用相对数值表示的，假定电解还原6小时后所回收的沉淀数量等于100。

从图3可以看出，沉淀是在电解还原进行了2小时以后才开始形成的，如果不进行电解还原，就不会形成沉淀。

将沉淀分散于中性温水中，在pH4.5的条件下进行电等点沉淀，所得沉淀经水洗、中和、在140℃加热20秒钟，然后干燥，制得一种主要由11S蛋白质级分组成的分离蛋白。另一方面，在电解还原时获得的分散性级分也要在pH4.5的条件下进行等电点沉淀，所得沉淀经水洗、中和、在140℃加热20秒钟，然后干燥，制得一种主要是由7S蛋白质组成的分离蛋白。

参考实例2

用63mM（毫克分子）的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液对脱脂大豆进行提取，该缓冲液含有10mM（毫克分子）的β-巯基乙醇（pH7.8），提取是在搅拌状态下持续进行一小时，然后在10000转/分的转速下离心15分钟，把“豆渣”除去;用2N盐酸将提取液的pH值调至6.6，用冰水冷却使温度降为2-3℃维持3小时后，在10000转/分的转速下离心20分钟，以获得一种主要是由11S蛋白质级分组成的不溶性级分和一种主要是由7S蛋白质级分组成的可溶性级分。将不溶性级分溶于磷酸缓冲液中（pH7.6），然后进行等电点沉淀，所得沉淀经过水洗、中和、制得一种主要是由11S蛋白制级分组成的蛋白质级分。将可溶性级分进行等电点沉淀以便把上清液除去，所得沉淀经过水洗、中和、制得一种主要是由7S蛋白质级分组成的蛋白质级分。

实例2

将实例4制得的主要是由11S蛋白质级分组成的分离蛋白和参考实例2制得的主要是由11S蛋白质级分组成的级分进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺电泳，所用方法是按照Laemmiy    U.K.Nature，227，680，1970和Weber，K.与Osborn，M，J.B.C.244，4406，1969所发表的方法进行。所得电泳图谱如图4和图5所示。

作为参考比较，在实例4中利用等电点沉淀和水洗方法从豆乳制得的酸沉淀蛋白质的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺电泳图谱。

根据电泳图谱的着色情况并进行定量测定后得知，实例4的主要是由11S蛋白质级分组成的分离蛋白，其所含的11S蛋白质级分的数量为88%（重量比），而实例4的主要是由7S蛋白质级分组成的分离蛋白，其所含的7S蛋白质级分的数量为88%（重量比）。

实例5

按与实例4完全相同的操作步骤对豆乳进行处理，唯一的例外就是向豆乳加入亚硫酸氢钠。

当用相对的数值表示主要是由11S蛋白质级分组成的分离蛋白的产率时，我们是把实例4中电解还原进行6小时以后的产率作为100的。当每100毫升豆乳使用10毫克亚硫酸氢钠时，该分离蛋白的产率是：电解还原之前为14，电解还原2小时后为56，电解还原4小时后为100;如果每100毫升豆乳使用60毫克亚硫酸氢钠，则电解还原前为75，电解还原2小时后为100。这就是说，使用亚硫酸氢钠可以改善电解还原的效率，即便在电解还原时间减少的情况下也是如此。研究还进一步发现，电解还原处理可以减少亚硫酸氢钠的用量，因而也就减少了亚硫酸氢钠在产品中残留的数量。

实例6

按照实例4的步骤处理豆乳，唯一的例外是向豆乳加入半胱氨酸。当要使主要是由11S蛋白质级分组成的分离蛋白的产率达到实例4中电解还原6小时后的同样数值时，如果每100毫升豆乳使用10毫克半胱氨酸，则所需电解还原时间只有5小时，如果每100毫升豆乳使用30毫克半胱氨酸，则电解还原时间只需3小时。

Claims (12)

1、一种对植物蛋白进行分级分离的方法，其特征在于该方法包括在pH值最低为6.5及还原条件的情况下用按原料计至少0.5%(重量)的亚硫酸盐化合物、每100克原料至少5毫克摩尔的谷胱甘肽化合物或半胱氨酸化合物去处理含有不溶性的碳水化合物植物蛋白原料的水溶液，然后将所得混合物在最高20℃的温度下将其pH值调至5.5-7.0，将该混合物分离成为可溶性或分散性的级分和伴随不溶性碳水化合物的不溶性或沉淀性的级分。

2、一种按照权利要求1所叙述的方法，其中所指的植物蛋白是大豆蛋白。

3、一种按照权利要求1所叙述的方法，在该方法中，亚硫酸盐化合物从以下一组化合物中选择：亚硫酸、碱金属亚硫酸盐、亚硫酸铵、碱金属亚硫酸氢盐、亚硫酸氢铵、碱金属焦亚硫酸盐、焦亚硫酸铵、碱金属偏亚硫酸氢盐、偏亚硫酸氢铵和二氧化硫。

4、一种按照权利要求1所叙述的方法，在该方法中，谷胱甘肽化合物或半胱氨酸化合物从以下化合物中选择：谷胱甘肽、盐酸谷胱甘肽、半胱氨酸和盐酸半胱氨酸。

5、一种按照权利要求1所叙述的方法，在该方法中，还进一步包括对不溶性部分进行分离，把不溶性部分分散于温水中，以除去其中的沉淀。

6、一种按照权利要求1所叙述的方法，在该方法中，还进一步包括对可溶性部分进行分离，它对可溶性部分进行等电点沉淀处理，把沉淀分离出来，所得沉淀经过中和、加热、最后把它干燥。

7、一种对由7S和11S蛋白质部分组成的植物蛋白进行分级分离的方法，该方法包括对含有按该系统的总重量计算至少为3%（重量）的植物蛋白原料的水溶液进行电解还原处理，然后将该系统在pH值为5.5到7.0及最高温度为20℃时分离成为可溶性或分散性的级分和不溶性或沉淀性的级分。

8、一种按照权利要求7所叙述的方法，其中所指的植物蛋白是大豆蛋白。

9、一种按照权利要求7所叙述的方法，在该方法中，电解还原处理是在存在着亚硫酸盐化合物、硫酸盐化合物、谷胱甘肽化合物或半胱氨酸化合物的情况下进行的。

10、一种按照权利要求7所叙述的方法，在该方法中，亚硫酸盐化合物从以下一组化合物中选择：亚硫酸、碱金属亚硫酸盐、亚硫酸铵、碱金属亚硫酸氢盐、亚硫酸氢铵、碱金属焦亚硫酸盐、焦亚硫酸铵、碱金属偏亚硫酸氢盐、偏亚硫酸氢铵和二氧化硫。

11、一种按照权利要求7所叙述的方法，在该方法中，硫酸盐化合物、谷胱甘肽化合物或半胱氨酸化合物从以下化合物中选择：硫酸钠、谷胱甘肽、盐酸谷胱甘肽、半胱氨酸和盐酸半胱氨酸。

12、一种对植物蛋白进行分级分离的方法，该方法是使植物蛋白原料的水溶液在pH值位于中性或碱性范围的情况下接受还原条件的处理，然后在20℃或更低的温度下把该系统的pH值调至5.5-7.0，使该系统分离成为一个可溶性或分散性的级分和一个不溶性或沉淀性的级分。

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