CN116349769A - 一种利用中强电场提高大豆11s球蛋白聚集特性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种利用中强电场(MEF)提高大豆11S球蛋白聚集特性的方法。MEF是频率范围和电场强度(EFI)分别为1Hz‑1MHz和1‑1000V/cm的交流电场,主要受EFI、频率及物质的电导率等方面的影响,是一种能够减少热损害的蛋白质改性方法,为调节和改善蛋白质的功能特性提供了一种新颖的选择。利用MEF处理大豆11S球蛋白,能够使11S蛋白结构展开,二级结构发生变化,内部疏水侧链暴露,从而改变其功能特性和聚集行为。在控制EFI为4V/cm时,MEF处理下的11S蛋白会发生适度聚集,得到均一性、功能性好的11S聚集体。本研究能够在一定程度上反映MEF在改善蛋白质结构和功能特性方面的独特优势,对食品工业中开发优异的蛋白聚集体功能性原料而言具有重要的现实意义。

Description

一种利用中强电场提高大豆11S球蛋白聚集特性的方法
技术领域
本发明涉及植物蛋白加工技术,具体涉及通过中强电场提高大豆11S球蛋白聚集特性的方法。
背景技术
大豆蛋白是食品工业中常用的植物蛋白之一,具有良好的营养价值和功能特性。大豆蛋白中两种主要的球蛋白为β-伴球蛋白(7S)和球蛋白(11S),大豆11S球蛋白是一种分子质量为300-380kDa的六聚体,通常由六个亚基组成,其结构主要通过疏水相互作用维持,因此高级结构对pH、离子强度、冷冻、干燥、加热等条件的变化非常敏感。
蛋白质的受控变性和聚集可以极大地改变生物学结果以及与乳化、凝胶和起泡能力相关的功能特性。中强电场(MEF)是频率范围和电场强度(EFI)分别为1Hz-1MHz和1-1000V/cm的交流电场,主要受EFI、频率及物质的电导率等方面的影响,是一种能够减少热损害的蛋白质改性方法,为调节和改善蛋白质的功能特性提供了一种新颖的选择。电场可以促进蛋白质构象的改变,从而使蛋白分子内和分子间相互作用形成自然平衡状态,这可以极大地影响从分子到宏观尺度形成蛋白质聚集体的能力,进一步影响凝胶体系的构建。传统加热(COV)方法能量损耗高,且普遍存在加热不均匀的弊端,具有较高的热侵蚀性,容易导致局部过度聚集现象的发生。因此,明晰并定向控制特定条件下电场对大豆11S球蛋白的热聚集行为,对开发优异的蛋白聚集体功能性原料而言,在食品工业中有很重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用MEF提高大豆11S球蛋白聚集特性的方法,通过MEF和热处理使大豆11S球蛋白结构展开,二级结构发生变化,内部的疏水侧链和巯基暴露,从而定向调控蛋白的聚集特性。
利用MEF提高大豆11S球蛋白聚集特性的方法通过以下步骤实现:
一、大豆11S组分的分离;
二、11S分散体溶液制备;
三、MEF处理:将80mL11S分散体溶液放入石英反应池中,将反应池置于集热式恒温磁力搅拌器中,维持体系均匀混合。分别在4-10V/cm的EFI下升温3min并保持27min,共30min。MEF处理结束后蛋白质样品立即在冰浴中冷却20min,得到经MEF处理的11S分散体溶液。
与现有传统加热(COV)技术及天然11S球蛋白相比,本发明的效果在于:
(1)经MEF处理后的11S分散体的粒径随着EFI的增加逐渐向大粒径方向偏移。这意味着随着EFI的增加,11S分散体不断形成较大粒径的聚集体,见图1。
(2)经MEF处理后,11S蛋白的Zeta电位绝对值显著增大,Zeta电位绝对值越大,11S球蛋白粒子之间的静电斥力越强,导致蛋白质分子聚集成更大的聚集体,见图2。
(3)11S分散体经MEF处理后溶解度显著降低,随着EFI的逐渐增加大,在电场的定下移动和热效应的共同作用下加剧了11S蛋白分子的运动,通过疏水相互作用和二硫键形成了不溶性的聚集体,导致其溶解度降低发生沉淀,见图3。
(4)MEF处理使11S分散体的浊度显著增加。蛋白质聚集物的增多和增大会影响光的散射,阻碍光的透射,从而增加蛋白质的浊度,见图4。
(5)经MEF处理的11S分散体在SDS-PAGE非还原条件下,高分子量处和凝胶顶部的聚集物随着EFI的增加有轻微增加的趋势。11S蛋白在50kDa和100-180kDa以及>180kDa处出现了高分子量的聚集体条带,见图5。
(6)经MEF处理的11S随着EFI的增加,α-螺旋、β-转角均呈现先增大后降低的趋势,β-折叠总体呈现先减小后增大的趋势。表明电场和温度场的协同作用可以破坏分子间的相互作用,使11S分散体结构的展开,并由无序结构向有序结构变化,见图6。
(7)MEF处理暴露了球蛋白内部的疏水侧链,使蛋白展开,荧光光谱最大荧光强度对应的波长先红移后蓝移,同时荧光强度先下降后增高。表明MEF处理引起了11S三级结构的变化,见图7。
(8)MEF处理使11S分散体的H0增加,11S分散体经MEF4V/cm处理后其H0最大,MEF处理诱导11S分子展开。随着EFI的增加逐渐降低。在较高的EFI下,分子内部会形成更大的团聚体,而更多的疏水团簇则在疏水侧链内卷的过程埋藏在分子内部,见图8。
(9)经MEF处理的11S分散体的总巯基含量随EFI的增加而降低。总巯基含量随着EFI的变化而变化,说明交变电场的存在影响了11S蛋白中的-S-S和-SH的相互转换作用。这是由于电场的定向移动加速了蛋白质分子碰撞,因而促进了蛋白分子间和分子内的二硫键形成,促进交联反应和聚集体的形成,见图9。
(10)经MEF处理的11S分散体在电场强度4V/cm-8V/cm的范围内表现出较传统加热处理更高的G′值,这表明一定条件的MEF处理改善了11S的流变性能(即弹性行为),见图10。
(11)经MEF处理的11S产物中,随着EFI的增加,11S对应的SEC洗脱峰的面积逐渐减小,说明11S在MEF处理过程中逐渐变性并参与聚集,形成分子量较大的聚集体。此外,随着EFI的增加,排阻峰的位置没有发生变化,但其强度明显增大,说明聚集体的大小相似,但数量随着EFI的增加而增加。相比之下,排阻峰的比例随着11S洗脱峰的下降而增长,说明在8V/cm和10V/cm的较高EFI能够引起形成的蛋白聚集体的增长,形成分子量较大的聚集体,见图11。
附图说明
图1是不同电场条件下11S分散体的粒径分布图;图2是不同电场条件下11S分散体的Zeta电位变化图;图3是不同电场条件下11S分散体的溶解度变化图;图4是不同电场条件下11S分散体的浊度变化图;图5是不同电场强度下11S分散体的SDS-PAGE图谱;图6是不同电场条件下11S分散体的FTIR图;图7是不同电场条件下11S分散体的荧光光谱图;图8是不同电场条件下11S分散体的H0变化图;图9是不同电场条件下11S分散体的SHT变化图;图10是不同电场条件下11S分散体的流变特性图;图11是不同电场条件下11S分散体的SEC图。
具体实施方式:
具体实施方式一:
(1)大豆11S组分的分离:脱脂豆粉按照1:15(w/v)料液比与去离子水混合,用2mol/LNaOH调pH值至7.5,室温下低速搅拌2h。然后在4℃条件下,以10,000×g转速离心20min,取上清液。向所得上清液中按照0.98g/L加入亚硫酸氢钠粉末,搅拌1h,用2mol/LHCl调节溶液pH至6.4,然后在4℃条件下静置16h以上。在4℃条件下,以6500×g离心20min,所得沉淀即为11S大豆球蛋白。11S沉淀用去离子水洗涤两次后,以1:10的量加入去离子水,用2mol/LNaOH调pH至7.5,搅拌使其充分溶解;并在4℃下用去离子水透析48h脱盐,经冷冻干燥后室温保存备用。
(2)11S分散体溶液制备:11S分散体(1%,w/v)的制备方法是将11S溶解在pH7.0的10mM磷酸盐缓冲液中,在25℃磁力搅拌2h,于4℃下静止过夜,使其充分水化。将水化后的11S分散体分别在10,000×g离心20min,去除少量不溶性蛋白,得到单独的11S分散体的上清液。将11S蛋白上清液分别用于MEF热处理。
(3)MEF处理:将80mL11S分散体溶液放入石英反应池中,将反应池置于集热式恒温磁力搅拌器中,维持体系均匀混合。在4V/cm的EFI下升温(3min)并保持(27min)共30min。MEF处理结束后蛋白质样品立即在冰浴中冷却20min,得到经MEF处理后具有尺寸较小且分布较均匀的11S聚集体,此时聚集体的Zeta电位绝对值、表面疏水性、总巯基含量较高。

Claims (1)

1.一种利用MEF提高大豆11S球蛋白聚集特性的方法,本方法通过以下步骤实现:
步骤一:大豆11S组分的分离;脱脂豆粉按照1:15(w/v)料液比与去离子水混合,用2mol/LNaOH调pH值至7.5,室温下低速搅拌2h;在4℃条件下,以10,000×g转速离心20min,取上清液;向所得上清液中按照0.98g/L加入亚硫酸氢钠粉末,搅拌1h,用2mol/L HCl调节溶液pH至6.4,然后在4℃条件下静置16h以上;在4℃条件下,以6500×g离心20min,所得沉淀即为11S大豆球蛋白;11S沉淀用去离子水洗涤两次后,以1:10的量加入去离子水,用2mol/LNaOH调pH至7.5,搅拌使其充分溶解;并在4℃下用去离子水透析48h脱盐,经冷冻干燥后室温保存备用;
步骤二:11S分散体溶液制备;11S分散体(1%,w/v)的制备方法是将11S溶解在pH 7.0的10mM磷酸盐缓冲液中,在25℃磁力搅拌2h,于4℃下静止过夜,使其充分水化;将水化后的11S分散体分别在10,000×g离心20min,去除少量不溶性蛋白,得到单独的11S分散体的上清液;将11S蛋白上清液分别用于MEF热处理;
步骤三:MEF处理;将80mL11S分散体溶液放入石英反应池中,将反应池置于集热式恒温磁力搅拌器中,维持体系均匀混合;分别在4-10V/cm的EFI下升温3min并保持27min,共30min;MEF处理结束后蛋白质样品立即在冰浴中冷却20min,得到经MEF处理的11S分散体溶液。
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