CN100503646C - 一种两亲性壳聚糖衍生物及其制备方法和在药剂学中的应用 - Google Patents
一种两亲性壳聚糖衍生物及其制备方法和在药剂学中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于高分子材料技术领域，具体为一种两亲性壳聚糖衍生物及其制备方法和在药剂学中的应用。将酰氯化的长链脂肪酸与壳聚糖的羟基通过酯化反应连接，再将末端活化的聚苹果酸苄基酯与O-长链烷基壳聚糖通过酰胺键相连，最后催化加氢脱去保护基，制得两亲性的O-长链烷基-N-聚苹果酸壳聚糖接枝共聚物。其在水溶液中可形成100～300nm的纳米粒。与现有技术相比，该聚合物完全可生物降解、生物相容性良好、且具有易修饰的官能团。
Description
技术领域
本发明属高分子材料技术领域，具体涉及一种两亲性壳聚糖衍生物及其制备方法和在药剂学中的应用。
背景技术
近年来，纳米给药系统因具有靶向给药、增加药物的生物利用度、增加难溶性药物的溶解性、提高药物的稳定性、体内长循环及减少被网状内皮细胞的吞噬等多种优势，而成为给药系统的研究热点。纳米给药系统所用的聚合物材料一般是具有亲水组分和疏水组分的嵌段或接枝共聚物，以便形成内部疏水核心外部亲水壳的胶束结构。目前生物可降解聚合物胶束其疏水性组分的研究通常有下列几种：聚羟基酸酯类，如聚L-乳酸(PLLA)、聚D，L-乳酸、聚乙醇酸(PLG)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚ε羟基己酸内酯(PCL)等，这类聚合物结晶度高、降解周期较长、力学韧性较差；聚氰基丙烯酸酯/聚氰基丙烯酸烷基酯类，如聚氰基丙烯酸甲酯(PMCA)、聚氰基丙烯酸乙酯(PECA)、聚氰基丙烯酸丁酯(PBCA)、聚氰基丙烯酸异丁酯(PIBCA)、聚氰基丙烯酸己酯(PHCA)、聚氰基丙烯酸异己酯(PIHCA)等，这类聚合物初步降解形成的聚氰基丙烯酸链较难进一步降解，有体内蓄积的可能；亲水性组分应用最广泛的是聚乙二醇(PEG)及其衍生物如PEO、泊洛沙玛(PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物)/泊洛沙敏(泊洛沙玛的乙二胺衍生物)等。
壳聚糖是一种无毒、来源丰富、具有良好生物相容性及生物可降解性的天然多糖，具有许多独特的物理化学特性和生物功能。将壳聚糖应用于纳米载体的研究，是20世纪90年代逐渐发展起来的新兴领域。对于壳聚糖结构改性研究较多。Jae Hyung Park等将5β-胆烷酸化学键合到乙二醇壳聚糖主链上制得一种自组合纳米粒，通过简单混合、超声、溶剂蒸发法将荧光标记的RGD肽载入纳米粒，载药率超过75％，释药时间达1天(J Control release，2004，95：579)。平其能等(中国专利，申请号：03112981.1，授权公告日2006年8月16日)发明了N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖衍生物，在水中可形成100～400nm的纳米粒，并将一些难溶性药物如紫杉醇、环孢素A等包裹在其中，起到较强的增溶作用，N-长链烷基和壳聚糖衍生物经—C—N键连接，其降解机制尚不明确。
发明内容
本发明所需解决的技术问题之一是提供一种两亲性壳聚糖衍生物；本发明所需解决的技术问题之二是本发明所需解决的技术问题之二是提供一种两亲性壳聚糖衍生物的制备方法；本发明所需解决的技术问题之三是提供一种两亲性壳聚糖衍生物的应用，以克服现有技术的不足和缺陷。
本发明的构思如下：
用可生物降解的天然来源的壳聚糖作为原料，分别对其羟基和氨基进行修饰，使其具有两亲性，即一端含亲水基、另一端含亲脂基。本发明以壳聚糖为原料，在其6-OH上接入长链脂肪酸(链长为12～18C)，2-NH2上接入亲水性聚苹果酸链。聚苹果酸(PMLA)是一种特殊的脂肪族聚酯，其除具有良好的水溶性、可生物降解性、生物相容性和生物可吸收性外，还具有下列两个优点：(1)易代谢性。由于苹果酸是生物体内三羧酸循环的中间体，生物体内聚苹果酸易通过正常的三羧酸循环代谢途径去除；(2)易修饰性。聚苹果酸具有悬挂羧基，易与其它官能团(如羟基和氨基)反应而制得聚苹果酸衍生物，或引入功能基团或小分子药物，从而制得许多具有特殊功能的产物。通过共聚或悬挂羧基的修饰来调节聚苹果酸及其衍生物大分子链的结构或组成，从而可实现可控释放。
本发明的技术方案如下：
本发明的两亲性壳聚糖衍生物，其通式如下：
其中R为—CxH2x-y，x为10～16的整数，y为0，2或4；n为50～500的整数；脱乙酰度为90％～99％；O-烷基取代度为80％～150％；聚苹果酸取代度为10％～30％；壳聚糖的分子量为5×104～1×106。其中优选x为16，y＝2，脱乙酰度为95％～98％；O-烷基取代度为100％～120％；聚苹果酸取代度为15％～20％。
本发明的两亲性壳聚糖衍生物，其制备方法如下：
(1)于氮气氛下将长链脂肪酸溶于二氯甲烷中，冰浴下搅拌，滴加草酰氯二氯甲烷溶液，室温搅拌1～8小时，纯化，得脂肪酸酰氯；
(2)将分子量为5×104～1×106，脱乙酰度90％以上的壳聚糖加入甲基磺酸中，脂肪酸酰氯与壳聚糖的摩尔比为5～1:1，20～80℃和N2保护下反应1～12h，终止反应。透析，调节pH值至5～9，纯化，得O-长链烷基壳聚糖；
(3)将分子量为2×103～5×104的聚苹果酸苄酯加入无水DMSO中，按聚苹果酸苄酯计，加入摩尔比为0.5～2的N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和摩尔比为0.5～2的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及100～500μL三乙胺，反应2～24h，过滤；取步骤(2)制得的O-长链烷基壳聚糖加入无水DMSO中，搅拌均匀后，滴入上述聚苹果酸苄酯的DMSO溶液中，0～60℃下反应1～12h，纯化，得O-长链烷基-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖；
(4)将步骤(3)中的O-长链烷基-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖溶解，按O-长链烷基-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖计，加入重量百分比为10～20％的Pd/C催化剂，催化氢解，得O-长链烷基-N-聚苹果酸壳聚糖。
步骤(1)中优选的反应时间为4～6小时，时间过短则反应不完全，时间过长脂肪酸可能会被氧化变质。
步骤(2)中优选的壳聚糖分子量为1×105～2×105，壳聚糖的分子量过低，反应过程中发生降解，得率较低；分子量过大，则O-长链烷基取代度较低。脂肪酸酰氯与壳聚糖单元优选的摩尔比为3～1.5:1，脂肪酸酰氯与壳聚糖单元的摩尔比过低，则羟基的取代度较低；脂肪酸酰氯与壳聚糖单元的摩尔比过高，则过量的脂肪酸在后续纯化处理中较难除净。
步骤(3)中优选的聚苹果酸苄酯分子量为5×103～2×104，聚苹果酸苄酯的分子量过小，则修饰后共聚物的亲水性较低，降解速度也较快；分子量过大，则空间位阻增加，氨基的取代度较小。
步骤(4)中优选的Pd/C催化剂的量为15％(按O-长链烷基-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖重量计)，Pd/C催化剂的浓度是影响脱保护基速度的主要因素。
聚苹果酸苄基酯的制备：(参见文献：Sandrine Cammas，Isabelle Renard，Valerie Langlois，etal.Polymer，1996，37(18)：4215-4220.余文兵，周华，龚大春等.化学试剂，2005，27(12)：735～736；741.)
将DL天冬氨酸与NaBr按摩尔比1:5.5溶于2N的H2SO4。冰浴下，将1.2当量的NaNO2缓缓地加入上述混合溶液中。冰浴下搅拌反应30min。将尿素加入到混合液中，室温搅拌反应15min。经纯化得(RS)-溴代丁二酸。将(RS)-溴代丁二酸真空干燥后放入三口烧瓶中，乙酰氯加至刚好将固体淹没，等固体开始溶解时升温至40℃，滴加剩余的乙酰氯，回流，溶液变澄清后继续搅拌2h。经纯化后得到白色针状晶体。圆底烧瓶中加入摩尔比1:1的酸酐和苄醇，25℃搅拌反应12h。所得液体溶于乙醚，水洗，无水MgSO4/活性炭干燥2h，过滤后减压蒸掉溶剂得亮黄色油状物。将油状混合物置于烧杯中。加入水和NaOH溶液(2N)，使pH达到7.2。45℃下水相被加入到苯中，混合液激烈搅拌3h。经纯化得到β-苄氧羰基-β-丙内酯。将处理过的四丁氨苯甲酸溶液置于烧瓶中，真空除去乙醇。四丁氨苯甲酸再在室温下真空干燥2h。然后停止真空，充入N2。β-苄氧羰基-β-丙内酯先在N2氛下放2h，然后在N2保护下转移至含有引发剂的烧瓶中。聚合反应在37℃下进行3天。经纯化得苹果酸苄酯。
由本发明制备的两亲性壳聚糖衍生物可用于纳米粒给药系统中。
本发明的优点在于：
(1)组成共聚物的三种材料均为天然可生物降解的材料，其降解产物或为人体本身具有的物质或为人体必需的物质，不会产生蓄积和毒副作用。因此具有无毒性、无免疫原性和抗原性、生物相容性良好的特点；
(2)本发明聚合物在水中可自发聚合形成疏水核亲水壳的纳米粒，亲水壳上是柔性的聚苹果酸链，能够减少网状内皮细胞和巨噬细胞的吞噬，实现体内的长循环；
(3)本发明聚合物的降解速度可以通过改变聚苹果酸链的长度和侧链羧基脱保护的程度来调节，从而对包封的药物进行控释；
(4)本发明聚合物形成的纳米粒表面带有易修饰的羧基，可进一步与特异性配体结合，从而提供主动靶向给药系统。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步描述本发明。但它们不是对本发明的限定。
实施例1：O-油酸-N-聚苹果酸壳聚糖纳米粒的制备
一、油酸酰氯的制备
于氮气氛下将油酸(2.82g)溶于20mL干燥的二氯甲烷中，冰浴下搅拌，缓慢滴加2mL草酰氯溶于10mL干燥二氯甲烷的溶液，继续常温搅拌5小时，干燥塔保护减压脱去过量的草酰氯和溶剂，得油酸酰氯3g。
二、O-油酸壳聚糖的制备
取分子量为2×105，脱乙酰度90％以上的壳聚糖(0.8g)加入溶剂中搅拌至完全溶解。按油酸酰氯与壳聚糖单元的摩尔比3:1投料，在室温和N2保护下反应8h，然后加入20g碎冰终止反应。将此混合液透析1天除去大部分的溶剂，再用NaHCO3调节pH值至8。沉淀过滤，水、丙酮各洗2次，最后真空干燥。得O-油酸壳聚糖1.54g。
三、O-油酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖的制备
取分子量为1×104的聚苹果酸苄酯2g加入无水DMSO中，再加入1.2eq.的DCC和1eq.的NHS及300μL三乙胺，反应12h，过滤除去反应副产物二环己基脲(DCU)。取O-油酸壳聚糖0.44g加入无水DMSO中，搅拌均匀后，逐滴滴入上述聚苹果酸苄酯的DMSO溶液中，在45℃下反应12h。使用MW＝14000的透析袋透析1天，过滤，除杂，干燥滤饼得O-油酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖1.96g。
四、O-油酸-N-聚苹果酸壳聚糖的制备
将O-油酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖溶解，再加入15wt.-％的Pd/C催化剂，室温下催化氢解过夜。减压除去溶剂，真空干燥后得到O-油酸-N-聚苹果酸壳聚糖。
FT-IR：3328，2928，2851(油酸的亚甲基)，2655，1736(聚苹果酸的羧酸)，1660，1628，1575，1437(酰胺键)，1312，1245，1088(酯键)，892.
1H-NMR(DMSO)：δ(ppm)：0.86(s，CH3 of油酸)，1.23(s，CH2 of油酸)，1.61(s，CH2 of油酸)，1.9(m，NHAc of壳聚糖)，3.3-5.2(m，H-1，2，3，4，5，6 and OH of壳聚糖)，2.9(s，CH2 of聚苹果酸)，5.3(s，CH of聚苹果酸)，6.2(s，COOH of聚苹果酸).
实施例2：O-油酸-N-聚苹果酸壳聚糖纳米粒的制备
一、油酸酰氯的制备
于氮气氛下将油酸(2.82g)溶于20mL干燥的二氯甲烷中，冰浴下搅拌，缓慢滴加2mL草酰氯溶于10mL干燥二氯甲烷的溶液，继续常温搅拌1小时，干燥塔保护减压脱去过量的草酰氯和溶剂，得油酸酰氯3g。
二、O-油酸壳聚糖的制备
取分子量为5×104，脱乙酰度90％以上的壳聚糖(0.8g)加入溶剂中搅拌至完全溶解。按油酸酰氯与壳聚糖单元的摩尔比5:1投料，在室温和N2保护下反应8h，然后加入20g碎冰终止反应。将此混合液透析1天除去大部分的溶剂，再用NaHCO3调节pH值至8。沉淀过滤，水、丙酮各洗2次，最后真空干燥。得O-油酸壳聚糖1.54g。
三、O-油酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖的制备
取分子量为2×103的聚苹果酸苄酯1g加入无水DMSO中，再加入1.2eq.的DCC和1eq.的NHS及300μL三乙胺，反应12h，过滤除去反应副产物二环己基脲(DCU)。取O-油酸壳聚糖0.44g加入无水DMSO中，搅拌均匀后，逐滴滴入上述聚苹果酸苄酯的DMSO溶液中，在45℃下反应12h。使用MW＝14000的透析袋透析1天，过滤，除杂，干燥滤饼得O-油酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖1.06g。
四、O-油酸-N-聚苹果酸壳聚糖的制备
将O-油酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖溶解，再加入10wt.-％的Pd/C催化剂，室温下催化氢解过夜。减压除去溶剂，真空干燥后得到O-油酸-N-聚苹果酸壳聚糖。
实施例3：O-油酸-N-聚苹果酸壳聚糖纳米粒的制备
一、油酸酰氯的制备
于氮气氛下将油酸(2.82g)溶于20mL干燥的二氯甲烷中，冰浴下搅拌，缓慢滴加2mL草酰氯溶于10mL干燥二氯甲烷的溶液，继续常温搅拌8小时，干燥塔保护减压脱去过量的草酰氯和溶剂，得油酸酰氯3g。
二、O-油酸壳聚糖的制备
取分子量为1×106，脱乙酰度90％以上的壳聚糖(0.8g)加入溶剂中搅拌至完全溶解。按油酸酰氯与壳聚糖单元的摩尔比1:1投料，在室温和N2保护下反应8h，然后加入20g碎冰终止反应。将此混合液透析1天除去大部分的溶剂，再用NaHCO3调节pH值至8。沉淀过滤，水、丙酮各洗2次，最后真空干燥。得O-油酸壳聚糖1.5g。
三、O-油酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖的制备
取分子量为5×104的聚苹果酸苄酯5g加入无水DMSO中，再加入1.2eq.的DCC和1eq.的NHS及300μL三乙胺，反应12h，过滤除去反应副产物二环己基脲(DCU)。取O-油酸壳聚糖0.44g加入无水DMSO中，搅拌均匀后，逐滴滴入上述聚苹果酸苄酯的DMSO溶液中，在45℃下反应12h。使用MW＝14000的透析袋透析1天，过滤，除杂，干燥滤饼得O-油酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖1.96g。
四、O-油酸-N-聚苹果酸壳聚糖的制备
将O-油酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖溶解，再加入20wt.-％的Pd/C催化剂，室温下催化氢解过夜。减压除去溶剂，真空干燥后得到O-油酸-N-聚苹果酸壳聚糖。
实施例4：O-亚油酸-N-聚苹果酸壳聚糖纳米粒的制备
一、亚油酸酰氯的制备
于氮气氛下将亚油酸(2.80g)溶于20mL干燥的二氯甲烷中，冰浴下搅拌，缓慢滴加2mL草酰氯溶于10mL干燥二氯甲烷的溶液，继续常温搅拌5小时，干燥塔保护减压脱去过量的草酰氯和溶剂，得亚油酸酰氯3g。
二、O-亚油酸壳聚糖的制备
取分子量为2×105，脱乙酰度90％以上的壳聚糖(0.8g)加入溶剂中搅拌至完全溶解。按亚油酸酰氯与壳聚糖单元的摩尔比3:1投料，在室温和N2保护下反应8h，然后加入20g碎冰终止反应。将此混合液透析1天除去大部分的溶剂，再用NaHCO3调节pH值至8。沉淀过滤，水、丙酮各洗2次，最后真空干燥。得O-亚油酸壳聚糖1.54g。
三、O-亚油酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖的制备
取分子量为1×104的聚苹果酸苄酯2g加入无水DMSO中，再加入1.2eq.的DCC和1eq.的NHS及300μL三乙胺，反应12h，过滤除去反应副产物二环己基脲(DCU)。取O-亚油酸壳聚糖0.44g加入无水DMSO中，搅拌均匀后，逐滴滴入上述聚苹果酸苄酯的DMSO溶液中，在45℃下反应12h。使用MW＝14000的透析袋透析1天，过滤，除杂，干燥滤饼得O-亚油酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖1.92g。
四、O-亚油酸-N-聚苹果酸壳聚糖的制备
将O-亚油酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖溶解，再加入15wt.-％的Pd/C催化剂，室温下催化氢解过夜。减压除去溶剂，真空干燥后得到O-亚油酸-N-聚苹果酸壳聚糖。
FT-IR：3325，2922，2850(亚油酸的亚甲基)，2650，1740(聚苹果酸的羧酸)，1670，1623，1573，1430(酰胺键)，1310，1240，1095(酯键)，890.
1H-NMR(DMSO)：δ(ppm)：0.88(s，CH3 of亚油酸)，1.21(s，CH2 of亚油酸)，1.60(s，CH2 of亚油酸)，1.95(m，NHAc of壳聚糖)，3.3-5.2(m，H-1，2，3，4，5，6and OH of壳聚糖)，2.95(s，CH2 of聚苹果酸)，5.2(s，CH of聚苹果酸)，6.25(s，COOH of聚苹果酸).
实施例5：O-亚油酸-N-聚苹果酸壳聚糖纳米粒的制备
一、亚油酸酰氯的制备
于氮气氛下将亚油酸(2.80g)溶于20mL干燥的二氯甲烷中，冰浴下搅拌，缓慢滴加2mL草酰氯溶于10mL干燥二氯甲烷的溶液，继续常温搅拌1小时，干燥塔保护减压脱去过量的草酰氯和溶剂，得亚油酸酰氯3g。
二、O-亚油酸壳聚糖的制备
取分子量为5×104，脱乙酰度90％以上的壳聚糖(0.8g)加入溶剂中搅拌至完全溶解。按亚油酸酰氯与壳聚糖单元的摩尔比5:1投料，在室温和N2保护下反应8h，然后加入20g碎冰终止反应。将此混合液透析1天除去大部分的溶剂，再用NaHCO3调节pH值至8。沉淀过滤，水、丙酮各洗2次，最后真空干燥。得O-亚油酸壳聚糖1.54g。
三、O-亚油酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖的制备
取分子量为2×103的聚苹果酸苄酯1g加入无水DMSO中，再加入1.2eq.的DCC和1eq.的NHS及300μL三乙胺，反应12h，过滤除去反应副产物二环己基脲(DCU)。取O-亚油酸壳聚糖0.44g加入无水DMSO中，搅拌均匀后，逐滴滴入上述聚苹果酸苄酯的DMSO溶液中，在45℃下反应12h。使用MW＝14000的透析袋透析1天，过滤，除杂，干燥滤饼得O-亚油酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖1.06g。
四、O-亚油酸-N-聚苹果酸壳聚糖的制备
将O-亚油酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖溶解，再加入10wt.-％的Pd/C催化剂，室温下催化氢解过夜。减压除去溶剂，真空干燥后得到O-亚油酸-N-聚苹果酸壳聚糖。
实施例6：O-亚油酸-N-聚苹果酸壳聚糖纳米粒的制备
一、亚油酸酰氯的制备
于氮气氛下将亚油酸(2.80g)溶于20mL干燥的二氯甲烷中，冰浴下搅拌，缓慢滴加2mL草酰氯溶于10mL干燥二氯甲烷的溶液，继续常温搅拌8小时，干燥塔保护减压脱去过量的草酰氯和溶剂，得亚油酸酰氯3g。
二、O-亚油酸壳聚糖的制备
取分子量为1×106，脱乙酰度90％以上的壳聚糖(0.8g)加入溶剂中搅拌至完全溶解。按亚油酸酰氯与壳聚糖单元的摩尔比1:1投料，在室温和N2保护下反应8h，然后加入20g碎冰终止反应。将此混合液透析1天除去大部分的溶剂，再用NaHCO3调节pH值至8。沉淀过滤，水、丙酮各洗2次，最后真空干燥。得O-亚油酸壳聚糖1.5g。
三、O-亚油酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖的制备
取分子量为5×104的聚苹果酸苄酯5g加入无水DMSO中，再加入1.2eq.的DCC和1eq.的NHS及300μL三乙胺，反应12h，过滤除去反应副产物二环己基脲(DCU)。取O-油酸壳聚糖0.44g加入无水DMSO中，搅拌均匀后，逐滴滴入上述聚苹果酸苄酯的DMSO溶液中，在45℃下反应12h。使用MW＝14000的透析袋透析1天，过滤，除杂，干燥滤饼得O-亚油酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖1.96g。
四、O-亚油酸-N-聚苹果酸壳聚糖的制备
将O-亚油酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖溶解，再加入20wt.-％的Pd/C催化剂，室温下催化氢解过夜。减压除去溶剂，真空干燥后得到O-亚油酸-N-聚苹果酸壳聚糖。
实施例7：O-月桂酸-N-聚苹果酸壳聚糖纳米粒的制备
一、月桂酸酰氯的制备
于氮气氛下将月桂酸(2g)溶于20mL干燥的二氯甲烷中，冰浴下搅拌，缓慢滴加2mL草酰氯溶于10mL干燥二氯甲烷的溶液，继续常温搅拌5小时，干燥塔保护减压脱去过量的草酰氯和溶剂，得月桂酸酰氯2.2g。
二、O-月桂酸壳聚糖的制备
取分子量为2×105，脱乙酰度90％以上的壳聚糖(0.8g)加入溶剂中搅拌至完全溶解。按月桂酸酰氯与壳聚糖单元的摩尔比3:1投料，在45℃和N2保护下反应8h，然后加入20g碎冰终止反应。将此混合液透析1天除去大部分的溶剂，再用NaHCO3调节pH值至8。沉淀过滤，水、丙酮各洗2次，最后真空干燥。得O-月桂酸壳聚糖1.35g。
三、O-月桂酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖的制备
取分子量为1×104的聚苹果酸苄酯2g加入无水DMSO中，再加入1.2eq.的DCC和1eq.的NHS及300μL三乙胺，反应12h，过滤除去反应副产物二环己基脲(DCU)。取O-月桂酸壳聚糖0.36g加入无水DMSO中，搅拌均匀后，逐滴滴入上述聚苹果酸苄酯的DMSO溶液中，在45℃下反应12h。使用MW＝14000的透析袋透析1天，过滤，除杂，干燥滤饼得O-月桂酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖1.86g。
四、O-月桂酸-N-聚苹果酸壳聚糖的制备
将O-月桂酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖溶解，再加入15wt-％的Pd/C催化剂，室温下催化氢解过夜。减压除去溶剂，真空干燥后得到O-月桂酸-N-聚苹果酸壳聚糖。
FT-IR：3325，2918，2849(月桂酸的亚甲基)，2660，1740(聚苹果酸的羧酸)，1660，1630，1565，1435(酰胺键)，1310，1235，1095(酯键)，887.
1H-NMR(DMSO)：δ(ppm)：0.85(s，CH3 of月桂酸)，1.22(s，CH2 of月桂酸)，1.62(s，CH2 of月桂酸)，2.0(m，NHAc of壳聚糖)，3.3-5.2(m，H-1，2，3，4，5，6and OH of壳聚糖)，2.92(s，CH2 of聚苹果酸)，5.28(s，CH of聚苹果酸)，6.23(s，COOH of聚苹果酸).
实施例8：O-月桂酸-N-聚苹果酸壳聚糖纳米粒的制备
一、月桂酸酰氯的制备
于氮气氛下将月桂酸(2g)溶于20mL干燥的二氯甲烷中，冰浴下搅拌，缓慢滴加2mL草酰氯溶于10mL干燥二氯甲烷的溶液，继续常温搅拌1小时，干燥塔保护减压脱去过量的草酰氯和溶剂，得月桂酸酰氯2.2g。
二、O-月桂酸壳聚糖的制备
取分子量为5×104，脱乙酰度90％以上的壳聚糖(0.8g)加入溶剂中搅拌至完全溶解。按月桂酸酰氯与壳聚糖单元的摩尔比5:1投料，在45℃和N2保护下反应8h，然后加入20g碎冰终止反应。将此混合液透析1天除去大部分的溶剂，再用NaHCO3调节pH值至8。沉淀过滤，水、丙酮各洗2次，最后真空干燥。得O-月桂酸壳聚糖1.35g。
三、O-月桂酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖的制备
取分子量为2×103的聚苹果酸苄酯1g加入无水DMSO中，再加入1.2eq.的DCC和1eq.的NHS及300μL三乙胺，反应12h，过滤除去反应副产物二环己基脲(DCU)。取O-月桂酸壳聚糖0.36g加入无水DMSO中，搅拌均匀后，逐滴滴入上述聚苹果酸苄酯的DMSO溶液中，在45℃下反应12h。使用MW＝14000的透析袋透析1天，过滤，除杂，干燥滤饼得O-月桂酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖0.92g。
四、O-月桂酸-N-聚苹果酸壳聚糖的制备
将O-月桂酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖溶解，再加入10wt.-％的Pd/C催化剂，室温下催化氢解过夜。减压除去溶剂，真空干燥后得到O-月桂酸-N-聚苹果酸壳聚糖。
实施例9：O-月桂酸-N-聚苹果酸壳聚糖纳米粒的制备
一、月桂酸酰氯的制备
于氮气氛下将月桂酸(2g)溶于20mL干燥的二氯甲烷中，冰浴下搅拌，缓慢滴加2mL草酰氯溶于10mL干燥二氯甲烷的溶液，继续常温搅拌8小时，干燥塔保护减压脱去过量的草酰氯和溶剂，得月桂酸酰氯2.2g。
二、O-月桂酸壳聚糖的制备
取分子量为1×106，脱乙酰度90％以上的壳聚糖(0.8g)加入溶剂中搅拌至完全溶解。按月桂酸酰氯与壳聚糖单元的摩尔比1:1投料，在45℃和N2保护下反应8h，然后加入20g碎冰终止反应。将此混合液透析1天除去大部分的溶剂，再用NaHCO3调节pH值至8。沉淀过滤，水、丙酮各洗2次，最后真空干燥。得O-月桂酸壳聚糖1.3g。
三、O-月桂酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖的制备
取分子量为5×104的聚苹果酸苄酯5g加入无水DMSO中，再加入1.2eq.的DCC和1eq.的NHS及300μL三乙胺，反应12h，过滤除去反应副产物二环己基脲(DCU)。取O-月桂酸壳聚糖0.36g加入无水DMSO中，搅拌均匀后，逐滴滴入上述聚苹果酸苄酯的DMSO溶液中，在45℃下反应12h。使用MW＝14000的透析袋透析1天，过滤，除杂，干燥滤饼得O-月桂酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖1.82g。
四、O-月桂酸-N-聚苹果酸壳聚糖的制备
将O-月桂酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖溶解，再加入20wt.-％的Pd/C催化剂，室温下催化氢解过夜。减压除去溶剂，真空干燥后得到O-月桂酸-N-聚苹果酸壳聚糖。
实施例10：O-硬脂酸-N-聚苹果酸壳聚糖纳米粒的制备
一、硬脂酸酰氯的制备
于氮气氛下将硬脂酸(2.84g)溶于20mL干燥的二氯甲烷中，冰浴下搅拌，缓慢滴加2mL草酰氯溶于10mL干燥二氯甲烷的溶液，继续常温搅拌5小时，干燥塔保护减压脱去过量的草酰氯和溶剂，得硬脂酸酰氯3g。
二、O-硬脂酸壳聚糖的制备
取分子量为2×105，脱乙酰度90％以上的壳聚糖(0.8g)加入溶剂中搅拌至完全溶解。按硬脂酸酰氯与壳聚糖单元的摩尔比3:1投料，在70℃和N2保护下反应8h，然后加入20g碎冰终止反应。将此混合液透析1天除去大部分的溶剂，再用NaHCO3调节pH值至8。沉淀过滤，水、丙酮各洗2次，最后真空干燥。得O-硬脂酸壳聚糖1.58g。
三、O-硬脂酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖的制备
取分子量为1×104的聚苹果酸苄酯2g加入无水DMSO中，再加入1.2eq.的DCC和1eq.的NHS及300μL三乙胺，反应12h，过滤除去反应副产物二环己基脲(DCU)。取O-硬脂酸壳聚糖0.44g加入无水DMSO中，搅拌均匀后，逐滴滴入上述聚苹果酸苄酯的DMSO溶液中，在45℃下反应12h。使用MW＝14000的透析袋透析1天，过滤，除杂，干燥滤饼得O-硬脂酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖1.96g。
四、O-硬脂酸-N-聚苹果酸壳聚糖的制备
将O-硬脂酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖溶解，再加入15wt.-％的Pd/C催化剂，室温下催化氢解过夜。减压除去溶剂，真空干燥后得到O-硬脂酸-N-聚苹果酸壳聚糖。
FT-IR：3332，2926，2848(硬脂酸的亚甲基)，2650，1730(聚苹果酸的羧酸)，1665，1625，1576，1437(酰胺键)，1313，1244，1090(酯键)，890.
1H-NMR(DMSO)；δ(ppm)：0.85(s，CH3 of硬脂酸)，1.22(s，CH2 of硬脂酸)，1.62(s，CH2 of硬脂酸)，1.9(m，NHAc of壳聚糖)，3.3-5.2(m，H-1，2，3，4，5，6and OH of壳聚糖)，2.93(s，CH2 of聚苹果酸)，5.23(s，CH of聚苹果酸)，6.21(s，COOH of聚苹果酸).
实施例11：O-硬脂酸-N-聚苹果酸壳聚糖纳米粒的制备
一、硬脂酸酰氯的制备
于氮气氛下将硬脂酸(2.84g)溶于20mL干燥的二氯甲烷中，冰浴下搅拌，缓慢滴加2mL草酰氯溶于10mL干燥二氯甲烷的溶液，继续常温搅拌1小时，干燥塔保护减压脱去过量的草酰氯和溶剂，得硬脂酸酰氯3g。
二、O-硬脂酸壳聚糖的制备
取分子量为5×104，脱乙酰度90％以上的壳聚糖(0.8g)加入溶剂中搅拌至完全溶解。按硬脂酸酰氯与壳聚糖单元的摩尔比5:1投料，在70℃和N2保护下反应8h，然后加入20g碎冰终止反应。将此混合液透析1天除去大部分的溶剂，再用NaHCO3调节pH值至8。沉淀过滤，水、丙酮各洗2次，最后真空干燥。得O-硬脂酸壳聚糖1.58g。
三、O-硬脂酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖的制备
取分子量为2×103的聚苹果酸苄酯1g加入无水DMSO中，再加入1.2eq.的DCC和1eq.的NHS及300μL三乙胺，反应12h，过滤除去反应副产物二环己基脲(DCU)。取O-硬脂酸壳聚糖0.44g加入无水DMSO中，搅拌均匀后，逐滴滴入上述聚苹果酸苄酯的DMSO溶液中，在45℃下反应12h。使用MW＝14000的透析袋透析1天，过滤，除杂，干燥滤饼得O-硬脂酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖1.06g。
四、O-硬脂酸-N-聚苹果酸壳聚糖的制备
将O-硬脂酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖溶解，再加入10wt-％的Pd/C催化剂，室温下催化氢解过夜。减压除去溶剂，真空干燥后得到O-硬脂酸-N-聚苹果酸壳聚糖。
实施例12：O-硬脂酸-N-聚苹果酸壳聚糖纳米粒的制备
一、硬脂酸酰氯的制备
于氮气氛下将硬脂酸(2.84g)溶于20mL干燥的二氯甲烷中，冰浴下搅拌，缓慢滴加2mL草酰氯溶于10mL干燥二氯甲烷的溶液，继续常温搅拌8小时，干燥塔保护减压脱去过量的草酰氯和溶剂，得硬脂酸酰氯3g。
二、O-硬脂酸壳聚糖的制备
取分子量为1×106，脱乙酰度90％以上的壳聚糖(0.8g)加入溶剂中搅拌至完全溶解。按硬脂酸酰氯与壳聚糖单元的摩尔比1:1投料，在70℃和N2保护下反应8h，然后加入20g碎冰终止反应。将此混合液透析1天除去大部分的溶剂，再用NaHCO3调节pH值至8。沉淀过滤，水、丙酮各洗2次，最后真空干燥。得O-硬脂酸壳聚糖1.58g。
三、O-硬脂酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖的制备
取分子量为5×104的聚苹果酸苄酯5g加入无水DMSO中，再加入1.2eq.的DCC和1eq.的NHS及300μL三乙胺，反应12h，过滤除去反应副产物二环己基脲(DCU)。取O-硬脂酸壳聚糖0.44g加入无水DMSO中，搅拌均匀后，逐滴滴入上述聚苹果酸苄酯的DMSO溶液中，在45℃下反应12h。使用MW＝14000的透析袋透析1天，过滤，除杂，干燥滤饼得O-硬脂酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖1.96g。
四、O-硬脂酸-N-聚苹果酸壳聚糖的制备
将O-硬脂酸-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖溶解，再加入20wt.-％的Pd/C催化剂，室温下催化氢解过夜。减压除去溶剂，真空干燥后得到O-硬脂酸-N-聚苹果酸壳聚糖。
实施例13 O-油酸-N-聚苹果酸壳聚糖纳米粒的制备
将O-油酸-N-聚苹果酸壳聚糖200mg溶解于10mL水中于45℃搅拌30min，然后室温超声15min后，用Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvem，UK)测定纳米粒的粒径为150～300nm。
实施例14 O-亚油酸-N-聚苹果酸壳聚糖纳米粒的制备
将O-亚油酸-N-聚苹果酸壳聚糖200mg溶解于10mL水中于45℃搅拌30min，然后室温超声15min后，用Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)测定纳米粒的粒径为150～300nm。
实施例15 O-月桂酸-N-聚苹果酸壳聚糖纳米粒的制备
将O-月桂酸-N-聚苹果酸壳聚糖200mg溶解于10mL水中于45℃搅拌30min，然后室温超声15min后，用Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)测定纳米粒的粒径为150～300nm。
实施例16 O-硬脂酸-N-聚苹果酸壳聚糖纳米粒的制备
将O-硬脂酸-N-聚苹果酸壳聚糖200mg溶解于10mL水中于45℃搅拌30min，然后室温超声15min后，用Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)测定纳米粒的粒径为150～300nm。
Claims (9)
1、一种两亲性壳聚糖衍生物，其特征在于以壳聚糖为原料，在其6-OH上接入链长为12～18C的脂肪酸，2-NH2上接入亲水性聚苹果酸链而组成，其通式如下：
其中R为—CxH2x-y，x为10～16的整数，y为0，2或4；n为50～500的整数；脱乙酰度为90％～99％；O-烷基取代度为80％～150％；聚苹果酸取代度为10％～30％；壳聚糖的分子量为5×104～1×106。
2、根据权利要求1所述的两亲性壳聚糖衍生物，其特征在于x为16，y＝2，脱乙酰度为95％～98％，O-烷基取代度为100％～120％，聚苹果酸取代度为15％～20％。
3、一种如权利要求1所述的两亲性壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)于氮气氛下将链长为12～18C的脂肪酸溶于二氯甲烷中，冰浴下搅拌，滴加草酰氯二氯甲烷溶液，室温搅拌1～8小时，纯化，得脂肪酸酰氯；
(2)将分子量为5×104～1×106，脱乙酰度90％以上的壳聚糖加入甲基磺酸中，脂肪酸酰氯与壳聚糖的摩尔比5～1:1，20～80℃和N2保护下反应1～12h，终止反应；透析，调节pH值至5～9，纯化，得O-长链烷基壳聚糖；
(3)将分子量为2×103～5×104的聚苹果酸苄酯加入无水DMSO中，按聚苹果酸苄酯计，加入摩尔比为0.5～2的N，N-二环己基碳二亚胺和摩尔比为0.5～2的N-羟基琥珀酰亚胺及100～500μL三乙胺，反应2～24h，过滤；取步骤(2)制得的O-长链烷基壳聚糖加入无水DMSO中，搅拌均匀后，滴入上述聚苹果酸苄酯的DMSO溶液中，0～60℃下反应1～12h，纯化，得O-长链烷基-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖；
(4)将步骤(3)中的O-长链烷基-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖溶解，按O-长链烷基-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖计，加入重量百分比为10～20％的Pd/C催化剂，催化氢解，得O-长链烷基-N-聚苹果酸壳聚糖。
4、根据权利要求3所述的两亲性壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于步骤(1)中反应时间为4～6小时。
5、根据权利要求3所述的两亲性壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于步骤(2)中壳聚糖分子量为1×105～2×105。
6、根据权利要求3所述的两亲性壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于步骤(2)中脂肪酸酰氯与壳聚糖单元摩尔比为3～1.5:1。
7、根据权利要求3所述的两亲性壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于步骤(3)中聚苹果酸苄酯分子量为5×103～2×104。
8、根据权利要求3所述的两亲性壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于步骤(4)中Pd/C催化剂的用量为15％，按O-长链烷基-N-聚苹果酸苄酯壳聚糖重量计。
9、权利要求1-2中任一项的两亲性壳聚糖衍生物在纳米粒给药系统中的应用。
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