CN100473658C - 乌蕨荭草苷和牡荆素提取纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了乌蕨荭草苷和牡荆素提取纯化方法，涉及从植物中分离纯化有效成分的一种方法。目的是简便、安全、经济、有效地从乌蕨中得到单体化合物荭草苷和牡荆素，其特征是先从乌蕨地上部分获得粗黄酮析出物，再将粗黄酮用碱水助溶，酸中和，经过反相硅胶柱层析，得到目标产物荭草苷和牡荆素，纯度达98%以上。
Description
技术领域
本发明涉及从植物中分离纯化有效成分的一种方法，具体是从乌蕨的地上部分提取纯化黄酮类化合物荭草苷和牡荆素。
背景技术
乌蕨(Stenoloma chusanum(Linn.)Ching)为陵齿蕨科(Lindsaeaceae)乌蕨属植物，别称乌韭，又称大叶金花草，是一种民间中草药，有“万能解毒药”之称。乌蕨对小鼠砷中毒、乐果中毒具有解毒作用，对小鼠CC14肝损伤具防治作用，可治疗家畜肝炎，临床上还用于治疗腹泻、下肢顽固性溃疡、慢性肾衰等疾病。近来作者从乌蕨的地上部分分离得到了荭草苷(Orientin)、牡荆素(Vitexin)等黄酮类化合物。
植物中的荭草苷通常用乙醇提取，再以正丁醇萃取，正丁醇萃取物经多次硅胶柱层析，氯仿-甲醇溶剂系统洗脱而获得，也有将乙醇提取物用乙酸乙酯萃取，上聚酰胺柱，乙酸乙酯：乙醇：水(6：3：1)洗脱而获得荭草苷。
牡荆素的提取分离纯化方法与荭草苷基本相同，多采用硅胶、大孔树脂、聚酰胺等层析手段，用氯仿-甲醇溶剂系统或苯-丙酮-甲醇溶剂系统洗脱，有时尚需结合制备TLC，方可得到纯化的牡荆素。
经中华人民共和国国家知识产权局专利检索，查得有关牡荆素的提取分离的专利文件一条，专利名称为“牡荆素的提取方法、用途及制剂”，公开(公告)号：CN1683386公开(公告)日：2005.10.19申请(专利)号：CN200510038041.0，该专利特征在于将山楂叶的粗提取物在强酸性条件下水溶液中水解，析出结晶后，再进行重结晶，得到目标产物牡荆素。纯度达到98％以上，可制成小水针滴注液、冻干粉及片剂、胶囊剂或滴丸剂，应用于心血管疾病冠心病、心肌梗死，心绞痛的治疗。
目前未见从乌蕨中同时提取纯化荭草苷和牡荆素的报道。已有的荭草苷或牡荆素的分离方案，均采用硅胶、聚酰胺、大孔树脂等多次柱层析，操作步骤繁多，洗脱液含氯仿、苯、丙酮、乙酸乙酯等，氯仿和苯具有较大毒性，丙酮、乙酸乙酯等价格偏高。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作安全、工艺简单、成本低、效率高的方法，从乌蕨的地上部分同时分离纯化荭草苷和牡荆素。本发明的目的是通过如下技术方案来达到的：
(1)由乌蕨的乙醇提取物制备正丁醇部分。
(2)从正丁醇部分得到粗黄酮析出物。
(3)将析出物配制成均一的中性溶液。
(4)中性溶液进行反相硅胶柱层析。
(5)检识洗脱液成分，合并成分相同部分。
(6)重复步骤(3)-(5)，直至得到纯度达98％以上的荭草苷和牡荆素。
具体操作过程如下：
(1)乌蕨的乙醇粗提物是指用50-90％乙醇冷浸乌蕨地上部分1-3次，加入的乙醇体积为药材重量的10-20倍，每次浸提2-10天，过滤浓缩浸提液，挥去乙醇，得到粗提物。
(2)制备正丁醇部分是指将乙醇粗提物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取2-8次，合并正丁醇萃取液，在55-75℃减压浓缩，所得到的浓缩物为正丁醇部分。
(3)从正丁醇部分得到粗黄酮析出物，是将浓缩的正丁醇部分在4℃冰箱中放置5-20天，有黄色颗粒状物质析出。
(4)将析出物配制成均一的中性溶液，是将正丁醇中的析出物制备成水的悬浊液，滴加碱溶液，至析出物溶解，溶液澄清，此时加入20-80倍于析出物重量的水稀释，再在稀释液中滴加酸溶液，将溶液酸碱度调至中性，该溶液在0.5-1小时内保持澄清，不出现沉淀。
(5)将析出物配制成均一的中性溶液，所用的碱的种类为Na2CO3、NaHCO3、Ca(OH)2、KOH、NaOH，浓度为0.5-10％，酸的种类为HAc、H3PO4、HCl、H2SO4，浓度为0.5-10％。
(6)中性溶液进行反相硅胶柱层析，是将50-100ml的中性溶液注入床体积为20-80ml的反相硅胶柱，用水-甲醇或水-乙醇或水-丙酮系统梯度洗脱，收集洗脱液，每份10-20ml。
(7)检识洗脱液成分，合并成分相同部分，是用聚酰胺薄膜层析检识洗脱液各部分中黄酮分离情况，采用的展开剂为氯仿：甲醇＝2-10:1，显色剂为1-2％AlCl3乙醇溶液，在365.0nm，253.7nm紫外灯下观测，合并斑点相同部分。
实施例：
(1)用70％乙醇冷浸乌蕨地上部分2次，加入的乙醇体积为药材重量的15倍，每次浸提7天。过滤并浓缩浸提液，挥去乙醇，得到粗提取物。
(2)粗提取物依次用石油醚萃取4次、乙酸乙酯萃取3次、正丁醇萃取5次，正丁醇萃取液在60℃减压浓缩，得正丁醇部分。
(3)浓缩的正丁醇部分在4℃冰箱中放置10天，有黄色颗粒状沉淀析出，析出物微溶于水、乙醇、乙酸乙酯、氯仿等溶剂，难以用重结晶方法加以分离纯化。
(4)将析出物制备成水悬浊液，滴加1％NaOH至溶液澄清，此时加入50倍于析出物重量的水稀释，再在稀释液中滴加1％HCl，将溶液酸碱度调到中性，广范试纸测试显示pH7，该溶液在0.5h内保持澄清，不出现沉淀。
(5)将100ml溶液注入16mm×150mm的Lichroprep RP-18(40-63μM)反相硅胶柱，(柱材料为MERCK公司产品)，依次用水100ml、20％甲醇100ml、30％甲醇300ml、40％甲醇150ml、50％甲醇150ml、100％甲醇150ml洗脱，收集20％-50％甲醇洗脱部分，每份15ml。
(6)用聚酰胺薄膜(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂出品)薄层层析检测各部分中黄酮分离情况，展开剂为氯仿：甲醇＝3.5:1，显色剂为1％AlCl3乙醇溶液，在365.0nm，253.7nm紫外灯下观测，可见亮黄色荧光斑点，合并斑点相同部分，按以上方法(3)-(5)重复上柱，可分别获得纯度达98％以上的2种黄酮类化合物。化合物1为淡黄色粉末(甲醇-水)，mp264℃，化合物2为黄色粉末(甲醇-水)，mp 258-260℃(熔点用BüCHI Melting Point B-540熔点测定仪测定)。经理化性质和波谱技术测试分析，确定化合物1为荭草苷，化合物2为牡荆素。
Claims (1)
1.乌蕨荭草苷和牡荆素的提取纯化方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)用70％乙醇冷浸乌蕨地上部分2次，加入的乙醇体积为药材重量的15倍，每次浸提7天，过滤并浓缩浸提液，挥去乙醇，得到粗提取物；
(2)粗提取物依次用石油醚萃取4次、乙酸乙酯萃取3次、正丁醇萃取5次，正丁醇萃取液在60℃减压浓缩，得正丁醇部分；
(3)浓缩的正丁醇部分在4℃冰箱中放置10天，有黄色颗粒状沉淀析出，析出物微溶于水、乙醇、乙酸乙酯或氯仿，难以用重结晶方法加以分离纯化；
(4)将析出物制备成水悬浊液，滴加1％NaOH至溶液澄清，此时加入50倍于析出物重量的水稀释，再在稀释液中滴加1％HCl，将溶液酸碱度调到中性，广泛试纸测试显示pH为7，该溶液在0.5h内保持澄清，不出现沉淀；
(5)将100ml溶液注入16mm×150mm的Lichroprep RP-18 40-63μM反相硅胶柱，柱材料为MERCK公司产品，依次用水100ml、20％甲醇100ml、30％甲醇300ml、40％甲醇150ml、50％甲醇150ml、100％甲醇150ml洗脱，收集20％-50％甲醇洗脱部分，每份15ml；
(6)用聚酰胺薄膜薄层层析检测各部分中黄酮分离情况，展开剂为氯仿∶甲醇＝3.5∶1，显色剂为1％AlCl3乙醇溶液，在365.0nm，253.7nm紫外灯下观测，可见亮黄色荧光斑点，合并斑点相同部分，按以上方法(3)-(5)重复上柱，可分别获得纯度达98％以上的2种黄酮类化合物，化合物1为淡黄色粉末，m.p.264℃，化合物2为黄色粉末，m.p.258-260℃，熔点用BüCHI Melting Point B-540熔点测定仪测定，经理化性质和波谱技术测试分析，确定化合物1为荭草苷，化合物2为牡荆素。
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