CN100459987C - 一种黄芪有效部位及其制备方法和在制药中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄芪有效部位及其制备工艺和在制药中的应用。公开的黄芪有效部位主要含有黄芪总皂甙，有机酸，黄芪黄酮甙。制备方法通过将黄芪饮片用乙醇加热回流提取，合并提取液，回收醇浓缩得流浸膏；流浸膏加等体积的水稀释后通过大孔树脂柱至流出液皂甙反应阴性，再以水洗脱至洗脱液糖反应阴性，最后用乙醇洗脱至洗脱液糖反应阴性；乙醇洗脱液经回收醇、干燥、研碎，即可。本发明还提供了该黄芪有效部位在制备多种药物中的应用。本发明提供的黄芪有效部位中总皂甙的含量可达65%，质量可靠、稳定性良好，毒性低，提供的制备方法简单、能有效去除杂质、最大限度保留黄芪有效部位，得率可达1.20-2.0%。
Description
技术领域
本发明属中药制药领域，具体地说是涉及一种黄芪有效部位及其制备方法和在制药中的应用。
背景技术
黄芪(Radix astragli)为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。秋季采挖，除去根须及根头，晒干。味甘，性温，归肺、脾经。现代化学研究证明，黄芪药材中含有多类成分，如皂甙，多糖，黄酮，氨基酸，有机酸及微量元素等。
目前，对黄芪总提物及不同有效部位的化学及其生物活性的研究非常活跃，现代研究证明，具有免疫调节，以及对心血管系统、消化系统等多方面的药理作用。近年来对黄芪总甙的兴趣主要在其对心血管系统及抗病毒性心肌炎的药理活性。
黄芪总甙为黄芪中的主要有效部位，包含皂甙和黄酮甙。现有黄芪总甙的制备方法，主要有水提法、醇提法、水提醇沉法、树脂吸附法、正丁醇萃取法等，但这些方法有的比较复杂，有的提取物得率较低、稳定性差，有的则去除了许多有效成分，不能很好地有效发挥黄芪的药用价值。
发明内容
本发明的目的在于避免上述现有技术中的不足之处，从而提供一种质量可靠、稳定性良好的黄芪有效部位。
本发明的另一个目的是提供一种相对简单、能有效去除杂质、最大限度保留上述黄芪有效部位的制备方法。
本发明还有一个目的是提供上述黄芪有效部位在制药中的应用。
本发明的目的可以通过以下措施来达到：
一种黄芪有效部位，它含有下列重量百分比的物质：
黄芪总皂甙50-65％，有机酸10-20％，黄芪黄酮甙10-20％。
所述的黄芪有效部位，它是通过下列步骤制备得到：
a.黄芪饮片以6-10倍量65-90％乙醇加热回流提取1-3次，每次1-2小时，过滤去药渣，提取液合并，回收乙醇后浓缩至50℃热测相对比重为1.10-1.45，得流浸膏；
b.流浸膏加等体积的水稀释后通过大孔树脂柱，流浸膏与树脂用量的重量比为1：5-10，流出液应对皂甙反应阴性；再以水洗脱至洗脱液糖反应阴性；最后用70-90％乙醇洗脱，至洗脱液糖反应阴性；
c.乙醇洗脱液经回收醇、干燥、研碎，即得该黄芪有效部位，得率为1.20-2.0％。
本发明的目的还可以通过以下措施来达到：
所述的黄芪有效部位在制备时用的大孔树脂型号可以是D-101，AB-8，SIP-1300。
所述的黄芪有效部位，其剂型为口服制剂。
一种黄芪有效部位的制备方法，包含下列步骤：
a.黄芪饮片以6-10倍量65-90％乙醇加热回流提取1-3次，每次1-2小时，过滤去药渣，提取液合并，回收乙醇后浓缩至50℃热测相对比重为1.10-1.45，得流浸膏；
b.流浸膏加等体积的水稀释后通过大孔树脂柱，流浸膏与树脂用量的重量比为1：5-10，流出液应对皂甙反应阴性；再以水洗脱至洗脱液糖反应阴性；最后用70-90％乙醇洗脱，至洗脱液糖反应阴性；
c.乙醇洗脱液经回收醇、干燥、研碎，即可。
所述的制备方法中大孔树脂型号可以是D-101，AB-8，SIP-1300。
一种黄芪有效部位在制备治疗和预防免疫介导的慢性炎症性疾病的药物中的应用。
一种黄芪有效部位在制备治疗和预防类风湿关节炎和/或红斑狼疮的药物中的应用。
本发明的优点：
本发明提供的黄芪有效部位中总皂甙的含量不低于50％，可达65％，其中黄芪甲甙可达10％，质量可靠、稳定性良好，毒性低，提供的制备方法相对简单、能有效去除杂质、最大限度保留黄芪有效部位，平均得率可达1.20-2.0％，所提供的黄芪有效部位具有多种药用效果。
本发明的药效学试验：
试验中本发明药物(以下称为黄芪总甙)按实施例1制备，体内用药，用1％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配制；体外用药，用稀乙醇溶解，再用营养液稀释至所需浓度(乙醇终浓度低于1‰)。
数据用均数±标准差(X±S)表示。计量资料组间样本均数比较采用t检验；计数资料的组间比较用x2检验。
动物：Wistar大鼠，♀、♂兼用，2-3月龄，体重160±s10g；BALB/C小鼠，♀、♂兼用，6-8周龄，体重18±s2g；C57BL/6J小鼠，♂，6～8周龄，体重18±s2g；昆明种小鼠，7～8周龄，体重20±s2g。
剂量设置、给药方法与试验对照：
实验一般设正常对照、模型对照、阳性对照和受试药3个剂量组(个别例外)。整体实验的剂量范围为5～100mg·kg-1，按1∶2～1∶4剂距分为低、中、高三个剂量组，灌胃(ig)给药，正常和模型对照组ig 1％ CMC-Na，容量相等。剂量与给药时间的选择视不同模型而定。阳性对照药有吲哚美辛(Indo)；地塞米松(Dex)。黄芪甲甙(ASI)；雷公藤多甙(TS)；绞股蓝总甙(GPS)；人参皂甙(GS)等，其选择亦视不同模型而定。
下述实验数据中d0为造模当日，d-n～n或d-n～+n中-n为造模前n天，n或+n为造模后n天。
实验1：黄芪总甙对大鼠的抗炎作用试验
试验方法：
1.1 大鼠佐剂性关节炎(AA)模型的制备
将卡介苗(BCG)80℃ 1h灭活，用灭菌液体石蜡配成10mg·ml-1，振荡混匀制成福氏完全佐剂(FCA)。于每鼠左后足跖皮内注射0.1ml致炎。测量注射侧与非注射侧后足爪容积。致炎前后容积的变化，分别代表原发和继发性炎症反应。
1.2 大鼠胶原性关节炎(CIA)的制备
用0.1mol·L-1醋酸少许溶解鸡II型胶原(CC II)，再用0.1mol·L-1PBS配制，按1∶1(V∶V)与福氏不完全佐剂(GIBCO产品)混合，使CC II终浓度为2.5mg·ml-1。于每鼠左后足跖皮内注射0.1ml致炎，1周后加强1次。大鼠多发性关节炎的评分标准如下：0＝正常，1＝仅红，2＝红+轻肿，3＝严重肿，4＝关节变型、强直；每一动物的关节分数为四肢分数之和。
1.3 角叉菜胶诱导大鼠足肿胀模型
于每鼠左后足跖皮下注射1％角叉菜胶(NS配制)0.1ml致炎。致炎前和致炎后1，3，5和7h分别检测足爪容积，以致炎前后容积之差作为肿胀度。
1.4 大鼠巴豆油气囊肉芽肿增生模型
于大鼠背部肩胛区皮下注射(sc)20ml空气形成气囊，随即向气囊内注入1％巴豆油1ml，立即将鼠背朝下转动，使其均匀地与囊壁组织接触。24h后抽出囊内空气，d8处死大鼠，剥离囊壁肉芽肿，称湿重，再用NS漂洗干净后，置80℃烤箱6h，称干重，以g/100g体重表示结果。
1.5 血清II型胶原抗体的检测
用20μg·ml-1的II型胶原(C II)包被酶标板，每孔100μl。4℃过夜，洗涤3次，用2％ BSA 37℃温育1h，洗涤3次，加入1∶40稀释的待检血清，37℃温育1h，洗涤3次，加入1∶200稀释的羊抗大鼠IgG-HRP100μl，37℃温育1h，洗涤3次；加入底物液，室温避光20min，用2mol·L-1H2SO4终止反应。于酶标仪492nm波长处测定，以3个复孔的平均A值表示结果。
1.6 外周血淋巴细胞OX19，W3/35及OX8亚群的检测
将每鼠抗凝的尾静脉血分成4管，每管0.1ml。分别加入0.1ml OX21(抗人C3b，空白对照)、OX19(CD3)、W3/25(CD4)及OX8(CD8)单克隆抗体(英国牛津大学Puklavec教授惠赠)，用2％FCS-RPMI 1640作1∶5稀释，4℃温育40min。加入细胞洗液(2％ FCS-RPMI 1640培养液)。每管3ml，充分混匀，离心(1500rpm，5min)，共洗涤3次。每管加入0.1ml羊抗鼠IgG-FITC(用2％ FCS-PBS作1∶10稀释)，4℃温育40min。用上述细胞洗液洗涤，离心一次后，加入红细胞溶解液破坏红细胞，同法洗涤后，将细胞用洗液1ml重悬，检测活性(>96％)。在FACS 420流式细胞仪(美国BD公司)上进行测定。并用BD公司提供的软件程序进行荧光强度分析，结果用阳性细胞百分率表示。
1.7 滑膜细胞的分离和培养
无菌取出大鼠双侧膝关节滑膜，分别用II型胶原酶和胰蛋白酶分解制成单个细胞。用含有5μg·ml-1LPS的DMEM培养液配制滑膜细胞悬液(5×105·ml-1)，加入24孔培养板内，每孔1ml，于37℃、5％CO2培养48h，分别收集细胞培养上清，检测IL-1活性和NO2 -含量。
1.8 滑膜细胞培养上清液中NO2-含量测定
用Griess试剂(内含1％对氨基苯磺酸，0.1％萘乙烯二胺盐酸盐和2.5％磷酸)检测NO2 -水平(以此表示NO含量)。
实验结果：
(1)对角叉菜胶诱导大鼠足肿胀的影响
按表1分组与给药。致炎前1h ig药物或溶剂。结果表明，AST三个剂量组均可明显抑制大鼠角叉菜胶性足肿胀。中剂量组的作用强度与雷公藤多甙(TS)相似。
表1 黄芪总甙(AST)对角叉菜胶诱导大鼠足肿胀的影响
TS：雷公藤多甙。角叉菜胶致炎前1h ig药物或溶剂，x±S，n＝10，*p<0.05，**p<0.01，与对照组相比
(2)对佐剂(FCA)诱导大鼠原发性炎症反应的影响
按表2分组与给药。致炎后d1～5测量致炎侧足爪容积。结果表明，AST(30和90mg·kg-1)对FCA引起的原发急性炎症反应有明显的抑制作用。
表2 AST对佐剂性关节炎(AA)大鼠原发炎症反应的影响
Indo：吲哚美辛。do用FCA致炎，do～4ig溶剂或药物。
x±S，n＝10，*p<0.05，**p<0.01，与AA对照相比
(3)对大鼠巴豆油气囊肉芽肿增生的影响
按表3分组与ig给药，每天1次，持续7d(d-1～d5)。结果表明，AST三个剂量(20、40和80mg·kg-1)组与TS对巴豆油引起的大鼠气囊肉芽肿增生均有明显抑制作用。
表3 对大鼠巴豆油气囊肉芽肿增生的影响
d0用1％巴豆油致炎，d—1～d5ig药物或溶剂。x±S，n＝10～12，*p<0.05，**p<0.01，与对照组相比
(4)治疗给药对AA大鼠继发炎症反应的治疗作用和免疫功能的影响
将多发性关节炎鼠按表4分组与给药(d12～d19)，自d12起测量非致炎侧足爪容积，每隔4天一次，连续观察12天。d24同时检测下列指标：(1)腹腔巨噬细胞(Mφ)产生IL-1 (2)脾淋巴细胞的ConA增殖反应 (3)滑膜细胞分泌功能(IL-1、NO的含量) (4)大鼠双侧膝、踝关节的病理组织学检查。表4结果表明，AST三种剂量(20，40与80mg·kg-1)治疗给药，可明显抑制AA大鼠非致炎侧足肿胀，其中以大剂量作用较好。病理组织学报告表明，与正常大鼠相比，AA大鼠双侧膝和踝关节均有严重的滑膜炎(滑膜组织充血、水肿和炎细胞浸润以及滑膜组织增生)、关节软骨损伤(萎缩、变薄或消失)，以及骨髓炎(骨髓腔内有炎细胞浸润)。AST可明显减轻上述病理变化，Dex虽抑制AA大鼠继发炎症反应的作用较AST强，但病变减轻的程度不如后者。表5结果表明，AST治疗给药后对AA大鼠胸腺系数有恢复作用，对脾脏系数无明显影响。表6结果表明，AST可使AA大鼠脾细胞过低的ConA增殖反应以及腹腔Mφ过高的IL-1分泌恢复正常水平；Dex则使两个指标均降低。表7结果表明，AST可明显降低AA大鼠滑膜细胞过高分泌IL-1和NO，而Dex使两者均降至正常水平以下。
表4 AST治疗给药对AA大鼠继发炎症反应的影响
do用FCA致炎，d12～19ig溶剂或药物。x±S，n＝10，*p<0.05，**p<0.01，与AA对照相比
表5 AST治疗给药对AA大鼠免疫器官重量的影响
注：△脏器系数为：g脏器重/100g体重，d0用FCA致炎，d12～19ig溶剂或药物，d24取出各组每只大鼠胸腺和脾脏称重。x±S，n＝10。*p<0.05，**p<0.01，与正常对照组相比；##p<0.01，与AA对照相比。
表6 AST治疗给药对AA太鼠脾细胞ConA增殖反应和腹腔巨噬细胞分泌IL—1活性的影响
do用FCA致炎，d12～19ig溶剂或药物，d24体外检测脾淋巴细胞ConA增殖反应和腹腔Mφ产生IL-1。x±S，n＝4，**p<0.01与正常对照相比；##p<0.01，与AA对照相比
表7 AST对AA大鼠滑膜细胞分泌功能的影响
d0 用FCA致炎，d12～19ig溶剂或药物.d24体外检测关节滑膜细胞分泌IL-1与NO含量。x±S，n＝4，**p<0.01，与正常对照相比；#p<0.05，##p<0.01与AA对照相比
(5) 预防给药对佐剂性关节炎(AA)大鼠继发炎症反应的影响
按表8分组与给药(d0～d12)。d15起测量非致炎侧足爪容积，每隔3天一次，连续观察12天。结果表明，AST(30和90mg·kg-1)预防给药可明显抑制AA大鼠非致炎侧的足肿胀。
表8 AST预防给药对AA大鼠继发炎症反应的影响
do用FCA致炎，do～12ig溶剂或药物。x±S，n＝8～9，*p<0.05，**p<0.01，与AA对照相比
(6) 对大鼠胶原性关节炎(CIA)的治疗作用和免疫功能的影响
致炎后d18将已发生关节炎的大鼠随机按表9分组与ig给药，每天1次，连续8天。结果表明，AST(中、高剂量组)均有明显的治疗作用，同时可显著抑制II型胶原抗体的产生(表10)以及恢复CIA大鼠外周血淋巴细胞亚群的失衡(表13—11)。
表9 AST对大鼠胶原性关节炎(CIA)的治疗作用
#最高分数为16
x±S，n＝6。△p<0.05，△△p<0.01，与关节炎对照组相比。
表10 AST对CIA大鼠血清I型胶原抗体的影响
x±S，n＝6。△p<0.05，△△p<0.01，与关节炎对照组相比
表11 AST对CIA大鼠外周血淋巴细胞亚群的影响
x±S，n＝6，△p<0.05，△△p<0.01，与关节炎对照组相比
实验2：黄芪总甙对小鼠的免疫调节作用
实验方法：
2.1 小鼠迟发超敏反应(DTH)的建立
以1％二硝基氟苯(DNFB)丙酮溶液25μl涂于小鼠腹壁致敏，翌日强化一次。d4于右耳涂1％DNFB 10μl攻击，24h后处死小鼠，各取直径8mm的左、右耳片称重，以两耳片重量之差为肿胀度。小鼠致敏后立即ip环磷酰胺(Cy，180mg·kg-1)或致敏前3天(d-3)ip Cy(250mg·kg-1)，可分别诱导小鼠DTH反应的低下和增高。
2.2 免疫功能低下小鼠溶血素抗体(IgM)的诱生与检测
BALB/C小鼠ip 10％SRBC悬液0.2ml(4×108细胞/鼠)致敏，同时每鼠sc Cy 80mg·kg-1诱导小鼠免疫功能降低。d5按改良的Simpson法，用分光光度计(λ＝413nm)检测脾细胞的IgM生成量，结果以吸光度A表示。
2.3鼠脾淋巴细胞致分裂素反应
常规制备脾细胞悬液(107·ml-1细胞)。在96孔培养板上，每孔加入100μl细胞悬液(终浓度5×106·ml-1)，50μl ConA(终浓度3μg·ml-1)或LPS(终浓度6μg·ml-1)，和不同浓度AST或营养液，置37℃，5％ CO2及饱和湿度条件下培养48h，终止前6h，每孔加入[3H]TdR(1.4×104Bq)。培养结束后收获细胞，用FJ-2107型液体闪烁计数仪(西安262厂生产)测定放射性，以3个复孔cpm的均值表示结果。
2.4 IL-1的诱生与检测
以RPMI 1640培养液常规制备大鼠腹腔细胞悬液(2×106·ml-1)。加入24孔培养板中，1ml/孔，置37℃、5％ CO2培养2h，得单层巨噬细胞(Mφ)后，分别加入0.8ml RPMI 1640培养液，100μl LPS(终浓度6μg·ml-1)以及不同浓度AST或营养液100μl，置37℃、5％ CO2培养6h。弃去含药物和LPS的营养液，用预温的营养液洗细胞二次。重新加入营养液至原量，继续培养48h，收集上清，-20℃保存待测。采用小鼠胸腺细胞增殖法，以[3H]TdR掺入量表示IL-1的活性。
2.5 IL-2的诱生与检测
常规制备大鼠脾细胞悬液(1×107·ml-1)。在24孔培养板上，每孔加入0.5ml细胞悬液，0.25ml ConA(终浓度3μg·ml-1)，以及不同浓度药物或营养液(终体积1ml)。置37℃、5％ CO2培养6h。用含5％小牛血清的Hank′s液洗细胞二次，以除去药物和ConA，重新配成细胞悬液，每孔1ml，继续培养48h。培养结束后，收集上清，-20℃保存待测。采用活化小鼠脾细胞法，以[3H]TdR掺入量表示IL-2的活性。
实验结果：
(1) 对正常小鼠脾淋巴细胞致分裂素反应的影响
按表12分组与ig给药，连续7天，d8体外检测各组脾淋巴细胞的ConA和LPS增殖反应。结果表明，AST三种剂量对正常小鼠脾细胞的ConA和LPS增殖反应均无明显影响。
表12 AST对正常小鼠脾淋巴细胞致分裂素反应的影响
x±S.n＝8，*p>0.05，与溶剂对照组相比
(2) 对环磷酰胺(Cy)降低小鼠DTH反应的影响
按表13分组与给药(d0～d4)，d5检测各组小鼠耳肿胀度。结果表明，AST三种剂量对Cy降低的DTH反应有不同程度的拮抗作用，且随AST剂量增高而恢复至正常水平。
表13 AST对Cy降低小鼠迟发超敏反应(DTH)的影响
AS1：黄芪皂甙甲，d0 ip Cy 180mg·kg-1；d0～4 ig溶剂或药物。
x±S，**p<0.01，与溶剂组相比；##p<0.01，与Cy组相比
(3) 对Cy增高小鼠DTH反应的影响
按表14分组与给药(d-3～d+4)，d5检测各组小鼠耳肿胀度。结果表明，AST三种剂量呈浓度依赖性地降低Cy增高小鼠DTH反应，高剂量组与人参皂甙(100mg·kg-1)的作用相近。
表14 AST对Cy增高小鼠DTH的影响
GS：人参皂甙，d—3 ip Cy 250mg·kg-1；d—3～d+4ig溶剂或药物。
x±S，**p<0.01，与溶剂组相比；#p<0.05，##p<0.01，与Cy组相比
(4) 对Cy降低小鼠脾细胞IgM生成的影响
按表15分组与给药(d-2～d+4)，d5检测各组小鼠脾细胞产生IgM量。结果表明，AST对Cy抑制小鼠IgM生成有剂量依赖性拮抗作用，高剂量组的作用明显优于绞股蓝总甙(GPS)。
表15 AST对Cy降低小鼠脾细胞IgM生成的影响
GPS：绞股蓝总甙。d0 sc Cy 80mg·kg-1；d—2～4ig溶剂或药物。
x±S，n＝8，**p<0.01与溶剂组相比；##p<0.01，与Cy组相比
(5) 对体外主要免疫细胞功能的影响
在1～25μg·ml-1范围内，AST可明显促进亚适量ConA(3μg·ml-1)和LPS(6μg·ml-1)分别诱导小鼠脾淋巴细胞的增殖反应以及促进亚适量LPS诱导大鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1，和亚适量ConA诱导大鼠脾细胞产生IL-2。它们的量效曲线呈钟罩形。表明AST对三种免疫细胞的增殖或分泌功能具有浓度依赖性双向调节作用。
实验3：黄芪总甙对小鼠的镇痛作用实验
实验方法：
3.1 小鼠热板实验
将筛选合格的♀小鼠分别置于55±0.5℃水浴的金属板上，以小鼠舔后足为疼痛反应的信号，以痛反应的潜伏期作为痛阈的指标。
3.2 小鼠扭体实验
ig 给药后3h，ip0.6％冰醋酸，每鼠0.2ml，立即记录15min内小鼠扭体反应的次数。
实验结果：
(1)热板法 按表16分组与给药。分别测定小鼠给药前和给药后2，4与6h的痛反应潜伏期。AST的三个剂量均可显著延长痛潜伏期，给药后2h出现作用，4h达峰，其后降低。
表16 AST的镇痛作用(小鼠热板法)
x±S，n＝10，*p<0.05，**p<0.01，与对照组相比
(2)扭体法 表17结果表明，AST三个剂量组均可明显抑制小鼠的扭体次数，高剂量组的抑制率与Indo相当。
表17 AST的镇痛作用(小鼠扭体法)
ig药物或溶剂后3h，ip 0.6％冰醋酸每鼠0.2ml，立即观察15min内小鼠扭体反应次数，x±S，n＝10，**p<0.01，与对照组相比
小结：
黄芪总甙(AST)对角叉菜胶或佐剂引起的急性炎症和巴豆油气囊肉芽肿增生以及大鼠胶原性关节炎(CIA)与大鼠佐剂性关节炎(AA，发展中的与已发生的关节炎)均有明显的抗炎作用，并能纠正CIA鼠和AA鼠的异常免疫功能；还可使AA大鼠滑膜细胞的过度分泌IL-1和NO的能力恢复正常；对Cy降低或增高的小鼠DTH反应和Cy降低IgM生成，AST均使它们恢复或接近正常水平而对正常小鼠免疫功能无明显影响。此外，AST对热(热板法)与醋酸(扭体法)引起的小鼠疼痛模型亦有明显的镇痛作用。这些表明AST既具有抗炎和镇痛作用，又具有机能依赖性双向免疫调节作用。主要免疫细胞功能的体外实验表明，AST对亚适量ConA和LPS诱导小鼠脾淋巴细胞增殖反应以及大鼠腹腔Mφ产生IL-1和脾细胞产生IL-2均有促进作用，它们的量效曲线呈钟罩形。表明AST对上述免疫细胞的增殖与分泌功能具有浓度依赖性的双向调节作用。
研究表明，AST是一种既具有免疫调节作用又有抗炎、镇痛作用的抗炎免疫调节药。AST的上述作用特征，不仅预示其可用作类风湿性关节炎等免疫介导的慢性炎症性疾病的治疗，而且可广泛用于各种免疫功能失调的纠正。
本发明的毒理学试验：
实验1：小鼠对黄芪总甙的最大耐受量测定。
1.2 受试药物
AST，含量54.40％，用1％羧甲基纤维素钠溶液边加边磨配成最大浓度为125mg·ml-1的混悬液，供ig给药。AST用稀乙醇配制，最大溶解浓度为10mg·ml-1，乙醇浓度低于10％，供ip给药。
1.2 试验方法
昆明种小白鼠40只，体重20±1g，♂♀各半，分为2组，每组20只。一组小鼠(20只，♂♀各半)禁食14小时，不禁水，称重，每鼠按0.4ml·10g-1ig125mg·ml-1的AST溶液，AST的剂量为5g·kg-1(按AST得率为1.5％计算，相当于333g生药·kg-1，为临床每日口服有效量的666倍)。另一组小鼠(20只，♂♀各半)，每鼠ip 0.25mg·10g-1，AST溶液10mg·ml-1。一次ip AST的剂量为250mg·kg-1(相当于生药16.65g·kg-1)给药后立即并连续观察14天小鼠外观、行为活动、精神状态、呼吸、体温、粪便以及每日饲料的消耗量。
1.3 结果
ig AST 5g·kg-1或ip AST250mg·kg-1对小鼠7天和14天的体重增长无明显影响，且体态正常，毛发光泽、行为活动、精神状态、呼吸、体温、粪便均正常。无一动物死亡。
1.4 小结
小鼠一次ig黄芪总甙(AST)最大耐受量5g·kg-1(折合生药为333g·kg-1，相当于成人每日口服量的500倍以上)，观察14天，无毒性反应与死亡。另小鼠一次ip AST最大耐受量为250mg·kg-1(折合生药为16.65g·kg-1)，观察14天，无毒性反应与死亡。说明本发明毒性很小。
实验2：黄芪总甙对大鼠的长期毒性试验。
2.1 药物：黄芪总甙粉，含量54.52％，用1％羧甲基纤维素钠混悬成所需浓度。
2.2 实验方法：
Wistar大鼠60只，7～8周龄，雌性大鼠体重150±s15g雄性大鼠体重170±s15g。大鼠随机均分为3组，每组20只，♀♂各半，即本发明低、高剂量组(分别ig黄芪总甙90mg·kg-1·d-1和900mg·kg-1·d-1)和一个对照组(ig等容量1％羧甲基纤维素钠溶液)。每日上午8:00开始ig给药或溶媒，连续90d。试验期间，每日观察大鼠的行为、活动、毛发、肤色、粪便、呼吸情况，每天称进食量一次，每周称体重一次，按体重变化调整给药量。给药90d后，每组取1/2大鼠采血检查血常规，股动脉放血处死大鼠，收集血液测定血液生化指标。取心、肝、肾、脾、肺、肾上腺、甲状腺、睾丸或卵巢、子宫或前列腺、全脑、胸腺等11个脏器，称重并计算脏器系数(g/100g体重，用％表示)。取以下脏器做组织形态学检查：心、肝、肾、脾、肺、肾上腺、甲状腺、胃、胸腺、睾丸(带附睾)或卵巢、前列腺或子宫。胃于幽门部、贲门部、胃小弯和胃大弯分别取四块组织，其它各脏器均取一块相同部位的组织。固定于10％中性福尔马林溶液，常规包埋、切片、染色。先观察高剂量组和对照组。高剂量组有阳性病变，再观察低剂量组有关器官，以了解受试物的剂量—毒性关系。另1/2动物停药观察2wk后，按上述分法检测各项指标。
2.3 实验结果：
(1)一般情况观察 用药组和对照组大鼠在90d试验期内进食与活动正常、毛发光润，末见粪便异常。
(2)体重 三组大鼠体重均有增长，组间无显著性差别，结果见表18。
表18 黄芪总甙ig 90d对大鼠体重的经时变化(x±s，g)
t检验：与对照组比较P>0.05，*为停药后(♂♀各5只)体重的变化.
(3) 血液学检查 给药结束和恢复期分别检测血液学指标，高、低剂量组大鼠的血液学指标均无异常，与对照组比较无显著性差异(表19～表20)。
表19 黄芪总甙ig 90d对大鼠血液学指标的影响(停药24h)
n＝10，x±s.T检验：与对照组相比较p>0.05
表20 恢复期大鼠血液学指标的变化
n＝10，x±s.t检验：与对照组相比较p>0.05.AST，黄芪总甙.
(4) 血液生化学检查 给药结束和恢复期，高、低剂量组大鼠的血液生化学指标与对照组无显著性差别(表21～表22)。
表21 黄芪总甙ig 90天对大鼠血液生化学指标的影响(停药24h)
n＝10，x±s.与对照组比较，p>0.05。
AST：天门冬氨酸氨基转移酶； ALT：丙氨酸氨基转移酶；
ALP：碱性磷性酶； BUN：尿素氮；
TP：总蛋白； ALB：白蛋白；
GLU：血糖； T—BIL：总胆红素；
Grea：肌酐； T—CHO：总胆固醇。
表22 恢复期大鼠血液生化学指标的变化
n＝10，x±s，与对照组比较，p>0.05.
(5) 脏器系数 给药结束和恢复期，高、低剂量组大鼠的11种脏器系数与对照组比较无显著性变化(表23～表24)。
表23 黄芪总甙ig 90d对大鼠脏器系数*的影响(停药24h)
n＝10.x±s.与对照组比较，p>0.05.
表24 恢复期大鼠脏器系数的变化
n＝10.x±s.与对照组比较，p>0.05.
(6) 肉眼检查三种动物的11种脏器或组织的外观正常，病理组织学检查均未见异常变化。
2.4小结
黄芪总甙二个剂量(90和900mg·kg-1·d-1)连续ig 90d，大鼠的外观、行为、进食量、体重增长、血液学指标、血液生化指标、11种重要脏器系数和11种重要脏器的组织形态学检查，均未发现异常变化；停药恢复期未见延迟性反应。结果示，黄芪总甙90和900mg·kg-1·d-1灌胃给药90d对大鼠无明显毒性反应，表明本发明长期服用安全。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
黄芪饮片以6倍量65％乙醇加热回流提取2次，每次1.5小时，过滤去药渣，提取液合并，回收乙醇后浓缩至50℃热测相对比重为1.25，得流浸膏；流浸膏加等体积的水稀释后通过大孔树脂柱，流浸膏与树脂用量的重量比为1：7，流出液皂甙反应阴性；再以水洗脱至洗脱液糖反应阴性，最后用70％乙醇洗脱，至洗脱液糖反应阴性；乙醇洗脱液经回收醇、干燥、研碎，即得该黄芪有效部位，得率为1.85％。黄芪有效部位含有黄芪总皂甙51.20％，有机酸20％，黄芪黄酮甙15％。
实施例2：
黄芪饮片以8倍量75％乙醇加热回流提取2次，每次1小时，过滤去药渣，提取液合并，回收乙醇后浓缩至50℃热测相对比重为1.15，得流浸膏；流浸膏加等体积的水稀释后通过大孔树脂柱，流浸膏与树脂用量的重量比为1：5，流出液皂甙反应阴性；再以水洗脱至洗脱液糖反应阴性，最后用80％乙醇洗脱液糖反应阴性；乙醇洗脱液经回收醇、干燥、研碎，即得该黄芪有效部位，得率为1.61％。黄芪有效部位含有黄芪总皂甙53％，有机酸20％，黄芪黄酮甙10％。
实施例3：
黄芪饮片以10倍量90％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，过滤去药渣，提取液合并，回收乙醇后浓缩至50℃热测相对比重为1.35，得流浸膏；流浸膏加等体积的水稀释后通过大孔树脂柱，流浸膏与树脂用量的重量比为1：10，流出液皂甙反应阴性；再以水洗脱至洗脱液糖反应阴性，最后用90％乙醇洗脱液糖反应阴性；乙醇洗脱液经回收醇、干燥、研碎，即得该黄芪有效部位，得率为1.33％。黄芪有效部位含有黄芪总皂甙60％，有机酸15％，黄芪黄酮甙15％。
实施例4：
黄芪饮片以10倍量85％乙醇加热回流提取3次，每次2小时，过滤去药渣，提取液合并，回收乙醇后浓缩至50℃热测相对比重为1.45，得流浸膏；流浸膏加等体积的水稀释后通过大孔树脂柱，流浸膏与树脂用量的重量比为1：10，流出液皂甙反应阴性；再以水洗脱至洗脱液糖反应阴性，最后用80％乙醇洗脱液糖反应阴性；乙醇洗脱液经回收醇、干燥、研碎，即得该黄芪有效部位，得率为2.0％。黄芪有效部位含有黄芪总皂甙65％，有机酸13％，黄芪黄酮甙20％。
Claims (7)
1.一种黄芪有效部位，其特征在于它含有下列重量百分比的物质：
黄芪总皂甙50-65％，有机酸10-20％，黄芪黄酮甙10-20％；
并通过下列步骤制备得到：
a.黄芪饮片以6-10倍量65-90％乙醇加热回流提取1-3次，每次1-2小时，过滤去药渣，提取液合并，回收乙醇后浓缩至50℃热测相对比重为1.10-1.45，得流浸膏；
b.流浸膏加等体积的水稀释后通过大孔树脂柱，流浸膏与树脂用量的重量比为1：5-10，流出液应对皂甙反应阴性，再以水洗脱至洗脱液糖反应阴性，最后用70-90％乙醇洗脱，至洗脱液糖反应阴性；
c.乙醇洗脱液经回收醇、干燥、研碎，即得该黄芪有效部位，得率为1.20-2.0％。
2.根据权利要求1所述的黄芪有效部位，其特征在于大孔树脂型号是D-101，AB-8，SIP-1300。
3.根据权利要求1或2所述的黄芪有效部位，其特征在于其剂型为口服制剂。
4.如权利要求1所述的黄芪有效部位的制备方法，其特征在于包含下列步骤：
a.黄芪饮片以6-10倍量65-90％乙醇加热回流提取1-3次，每次1-2小时，过滤去药渣，提取液合并，回收乙醇后浓缩至50℃热测相对比重为1.10-1.45，得流浸膏；
b.流浸膏加等体积的水稀释后通过大孔树脂柱，流浸膏与树脂用量的重量比为1：5-10，流出液应对皂甙反应阴性，再以水洗脱至洗脱液糖反应阴性，最后用70-90％乙醇洗脱，至洗脱液糖反应阴性；
c.乙醇洗脱液经回收醇、干燥、研碎，即可。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于大孔树脂型号是D-101，AB-8，SIP-1300。
6.如权利要求1所述的黄芪有效部位在制备治疗和预防免疫介导的慢性炎症性疾病的药物中的应用。
7.如权利要求1所述的黄芪有效部位在制备治疗和预防类风湿关节炎和/或红斑狼疮的药物中的应用。
Priority Applications (2)
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| 黄区总甙治疗类风湿关节炎临床研究. 徐建华等.中国药物与临床，第2卷第3期. 2002 * |
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