CN100447158C

CN100447158C - 可中和的hgf表位和与其结合的中和抗体

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Publication number: CN100447158C
Application number: CNB2004800331649A
Authority: CN
Inventors: 郑埈昊; 许英美
Original assignee: National Cancer Center Korea
Current assignee: National Cancer Center Korea
Priority date: 2003-11-11
Filing date: 2004-11-09
Publication date: 2008-12-31
Anticipated expiration: 2024-11-09
Also published as: AU2004287743A1; EP1694700A1; JP4446393B2; ATE476992T1; JP2007532097A; US7408043B2; EP1694700B1; HK1098769A1; KR20050045419A; ES2346887T3; KR100556660B1; WO2005044848A1; AU2004287743B2; CN101434654A; US20090023894A1; DE602004028651D1; CN1878790A; US20070036789A1; EP1694700A4

Abstract

本发明涉及结合本发明HGF可中和的表位的抗HGF的中和抗体能够作为单独试剂中和HGF，并可以有效的用于预防和治疗由HGF与其受体Met结合所引起的顽固疾病和癌症。

Description

可中和的HGF表位和与其结合的中和抗体

发明领域

本发明涉及抑制HGF(肝细胞生长因子)与其受体结合的HGF的可中和表位，以及抗HGF的中和抗体，其作为单独试剂通过与所述的可中和的HGF表位结合而能够中和HGF。

发明背景

HGF(肝细胞生长因子)是由间质细胞产生的多功能的异二聚体多肽。HGF由含有N端结构域和连接到丝氨酸蛋白酶样β链C端结构域的4个Kringle结构域的α链组成(参见图1)。人HGF以无生物活性的单链前体形式合成，其由728个氨基酸组成，该氨基酸具有在成熟蛋白中不存在的29氨基酸信号肽。生物学活性的HGF通过特异的细胞外血清丝氨酸蛋白酶在R494残基切割而获得。这样获得的活性HGF是具有全部活性的异源二聚体，其由二硫键连接的69kDa的α链和34kDa的β链组成。然而，目前还不清楚HGF全面的三级结构，并且也没有阐明究竟是这些结构中的哪一个对HGF的特异功能起作用(Maulik等，Cytokine&Growth Factor Reviews 13(1)：1-59，2002)。

HGF与其受体Met的结合诱导多种细胞类型的生长和分布，介导上皮间质细胞的转移以及管和腔的形成，并促进血管发生。Met和HGF基因敲除的小鼠都是胚胎致死的并表现出在胎盘，胎肝和肢/肌肉形成的发育缺陷(Cao等，PNAS 98(13)：7443-7448，2001，Gmyrek等，AmericanJournal of Pathology 159(2)：579-590，2001)。

Met首先作为人致癌基因trp-met的产物而被分离，其编码具有转化活性的修饰的(altered)组成型活性的蛋白激酶。Met活性还体现在能显著增强癌症物质从其刺激影响的突起处转移扩散，例如血管发生，细胞迁移以及细胞表面蛋白酶调控(Wielenga等，American Journal ofPathology 157(5)：1563-1573，2000)。由于Met被报道在多种人肝、前列腺、结肠、乳腺、脑和皮肤的癌症中过量表达(Maulik等，见上)，其被视为重要的预防和治疗癌症的靶分子。而且，据报道，疟疾的感染通过分泌的HGF而依赖于HGF受体的活性，因此，HGF及其受体被认为是预防疟疾的新方法的潜在的靶分子(Carrolo M等，Nat.Med.9(11)：1363-1369，2003)。还发现这样的可能性，即HGF可能与阿尔茨海默症中发生的病理改变相关(Fenton H等，Brain Res.779(1-2)：262-270，1998)。此外，还发现HGF明确的参与了增强皮肤伤口愈合的过程，包括再生上皮形成，新生血管和颗粒组织形成(Yoshida S等，J.Invest.Dermatol.120(2)：335-343，2003)。

同时，在癌症的发展和扩散中发挥关键作用的肿瘤相关生长因子或细胞因子及其受体的选择性中和是具有吸引力的开发抗肿瘤药物的策略。最近，使用诸如组合的抗体文库的噬菌体展示的重组抗体技术已经开发了用于这些靶分子的多种治疗单克隆抗体(mAbs)，例如赫赛汀Herceptin，以及抗促血管生成素(angiopoietin)人单抗。

众所周知，抗HGF的多克隆抗体封闭了HGF的多种生物学功能。另外，最近报道，在动物模型中，抗HGF的中和单抗的混合物显示出抗肿瘤的活性(Cao等，PNAS 198(13)：7443-7448，2001)。特别的，Cao等发现为了在体内和体外抑制HGF活性，需要阻断三或更多的表位，可能两个用于Met受体并且一个用于肝磷脂，在体外实验中，至少3个单抗的混合物能够中和HGF。

然而，作为单一试剂的能中和HGF并在体外抑制细胞扩散的单克隆抗体还未见报道。

发明概述

因此，本发明的目的是提供抑制HGF和其受体结合的可中和的HGF表位。

本发明其它的目的还提供：

编码所述可中和表位的多聚核苷酸；

抗HGF的中和抗体，其作为单一试剂通过与所述可中和表位的结合而能够中和HGF；

所述中和抗体在预防和治疗顽固疾病和癌症中的用途；

用于预防和治疗顽固疾病和癌症的包括所述中和抗体和药学可接受载体的药学组合物；

用于预防和治疗顽固疾病和癌症的方法，其包括将所述中和抗体给药于患者。

根据本发明的一个方面，提供含有SEQ ID NO：32或33的氨基酸序列的可中和的HGF表位。

根据本发明的另一个方面，提供抗HGF的与所述可中和的表位结合的中和抗体，其包括含有SEQ ID NO：27或29的氨基酸序列的V_H区和含有SEQ ID NO：28或30的氨基酸序列的V_L区。

附图说明

当通过下述说明书与附图联合描述时，本发明的上述和其它目的和特征将变得显而易见，所述附图分别表示：

图1：HGF的结构

图2：用于抗体文库构建的噬菌粒载体pComb3X的基因图谱

A：在噬菌粒表面展示Fab的情况

B：在噬菌粒表面展示scFv或微型双功能抗体(Diabody)的情况，

图3：在培养HGF结合克隆的过程中，通过淘选(panning)富集展示特异结合HGF的Fab的噬菌体库，

图4：用考马斯亮兰检测的纯化的Fab片段的结果，

1：标记，

2：非还原克隆68抗体(50,000Da)

3.还原克隆68抗体(25,000Da)

图5：蛋白印迹分析的结果，以检测纯化的Fab片段是否表达，

图6：含有本发明的可中和的表位的噬菌体与c-MET结合的水平，

1.含有SEQ ID NO：32肽的噬菌体，

2.含有SEQ ID NO：33肽的噬菌体，

3和4.不含有SEQ ID NO：32或33肽的对照噬菌体，

图7：克隆61和68Fabs分别与HGF的特异结合，

图8：克隆61和68分别限定的本发明的可中和的表位的构象依赖性

A：克隆61

B：克隆68，

泳道1：非还原HGF，

泳道2：还原HGF

图9a：表示范围为1级到6级的细胞扩散水平的标准

图9b：扩散鉴定的结果，显示随着加入的HGF浓度，抗HGF Fab和抗人Fab抗体的扩散水平的改变，

图10：随着注入克隆68抗体的量，与固定在CM5传感器芯片上的HGF结合的克隆68抗体的量增加

I：非特异Fab的注入

II：注入50nM克隆68抗体

III：注入100nM克隆68抗体

IV：注入200nM克隆68抗体

V：注入400nM克隆68抗体

VI：注入600nM克隆68抗体

图11：克隆68抗体抑制HGF与c-Met的结合，

I：注入50nM的HGF

II：注入与50nM克隆68抗体混合的50nM的HGF

III：注入与250nM克隆68抗体混合的50nM的HGF

IV：注入与500nM克隆68抗体混合的50nM的HGF

V：注入与1uM克隆68抗体混合的50nM的HGF

VI：注入与1.5uM克隆68抗体混合的50nM的HGF

图12：可溶的c-Met抑制HGF与c-Met的结合

I：注入50nM的HGF

II：注入与50nM可溶的c-Met混合的50nM的HGF

III：注入与100nM可溶的c-Met混合的50nM的HGF

IV：注入与200nM可溶的c-Met混合的50nM的HGF

V：注入与400nM可溶的c-Met混合的50nM的HGF

VI：注入与600nM可溶的c-Met混合的50nM的HGF

发明详述

如这里所使用的，术语“可中和的表位”包括任何蛋白决定簇，其能够抑制HGF与其受体c-Met的结合。表位决定簇通常由诸如氨基酸或糖侧链的具有化学活性的表面分子基团组成，并通常具有特异的三级结构特征，以及特异的电荷特点。优选，本发明的可中和的表位是包含SEQ ID NO：32或33的氨基酸序列的多肽。

术语“中和抗体”指能够特异结合HGF可中和的表位的抗体，并且充分地抑制或消除HGF的生物活性。典型的中和抗体将能至少抑制此HGF生物活性的大约50％，优选大于80％。本发明的中和抗体在治疗应用，即预防或治疗顽固疾病和癌症中特别有用。

本发明提供含有SEQ ID NO：32或33的氨基酸序列的多肽，其功能是作为HGF的可中和的表位。

为了制备根据本发明的HGF的可中和的表位，实施ELISA方法检测是否来自用HGF免疫的动物的抗血清能够与重组的人HGF结合；并且该方法显示来自HGF免疫动物的抗血清特异地与HGF结合。然后，提取HGF免疫动物的总RNA并进行cDNA合成。

为了扩增含有兔轻链(V_L)(V_κ，V_λ)和重链(V_H)的可变区以及含有人C_κ和C_H1的保守区，通过使用合成的cDNA作为模板和结合SEQ ID NO：1到20的引物而实施PCRs，然后，通过使用上述获得的PCR产物作为模板而扩增兔/人轻和重链的嵌合抗体。在扩增的兔V_L和V_H序列与扩增的人C_κ和C_H1序列结合之后，最终编码抗体片段(Fab)文库的PCR产物克隆进表达载体，并将得到的载体转染宿主细胞，例如大肠杆菌，以构建嵌合的兔/人Fab文库。本发明中使用的载体和宿主细胞包括本领域中常规使用的所用的表达载体和大肠杆菌菌株而没有限制，但优选使用噬菌粒载体pComb3X(Scripps研究中心，CA，USA)作为表达载体和大肠杆菌ER2537(NEB)作为宿主细胞。

使用HGF包被的ELISA板和抗人山羊Fab多克隆抗体而通过EIA方法选择含有抗HGF Fab的噬菌体克隆。上述选出的噬菌体克隆命名为H61(克隆61)和H68(克隆68)。

分别对H61和H68克隆进行核酸测序，并通过分析核酸序列确定其氨基酸序列。在本发明一个优选的实施方案中，根据染料标记引物测序方法实施核酸测序(Chung等，J.Cancer Res.Clin.Oncol.128：641-649，2002)。结果发现，H61克隆包括分别含有SEQ ID NOs：23和24核苷序列的V_H和V_L区；而H68克隆包括分别含有SEQ ID NOs：25和26核苷序列的V_H和V_L区。

从分析的核苷序列得出的H61和H68克隆的V_H和V_L区分别的氨基酸序列提示H61克隆包括含有SEQ ID NOs：28的氨基酸序列的V_H区和含有SEQ ID NOs：28的氨基酸序列的V_L区，而H68克隆，V_H区含有SEQID NOs：29的氨基酸序列和V_L区含有SEQ ID NOs：30的氨基酸序列。

对H61和H68克隆的氨基酸序列中结构区(FR)和互补决定区(CDR)分析显示，H61和H68克隆的每个V_H和V_L区含有4个FRs和3CDRs(参见表2)。

为了确定HGF的可中和的表位，通过使用组合肽文库的噬菌体展示通过淘选富集H61和H68克隆，使用抗HGF H61 Fab或抗HGF H68

Fab和抗HGF H61 Fab-或抗HGF H68 Fab-包被的ELISA板对如此扩增的噬菌体库进行EIA检测。然后选择对抗HGF H61和H68 Fabs显示有结合亲和性的噬菌体克隆。在本发明的优选实施方案中，使用PHD肽库(New England Biolab)作为肽库。

选出的噬菌体克隆进行核苷测序，而从分析的核苷测序推断出的氨基酸序列含有SEQ ID NO：32和33的氨基酸序列，其被发现与c-MET结合(参见图6)。这些结果提示抗HGF抗体H61或H68的抗原结合位点模仿了c-MET的HGF结合位点，结合抗HGF抗体H61或H68的SEQID NO：32和33的肽模仿了HGF的c-MET结合位点。因此，本发明的SEQID NO：32和33的肽能够具有作为HGF可中和的表位的功能。

另外，本发明提供编码所述可中和的表位的多聚核苷酸。特别地，所述可中和的表位含有SEQ ID NO：34或35的核苷序列。

此外，本发明提供抗HGF的中和抗体，其通过结合作为HGF可中和的表位的SEQ ID NO：32或33的肽而能够中和HGF。

本发明的中和抗体可以是嵌合抗体，单克隆抗体或人源化抗体。

嵌合抗体是包含人或非人部分的免疫球蛋白分子。特别地，嵌合抗体的抗原结合区(可变区)来自非人源(例如小鼠、兔、家禽)，而赋予免疫球蛋白生物效应器功能的嵌合抗体的保守区来自人源。嵌合抗体应该含有非人抗体分子的抗原结合特异性和由人抗体分子赋予的效应器功能。

一般而言，用于制备嵌合抗体的方法包括下述步骤：

鉴定和克隆编码抗体分子抗原结合区的正确的基因片段，(对于重链已知为V_DJ，可变区，多变区和连接区，或对于轻链已知为V_J，可变区和连接区或对于可变区简单的为V的上述片段)可以是cDNA或基因组形式；

b克隆编码保守区或其期望片段的基因片段；

c连接可变区和可变区，以便完整的嵌合抗体以能够转录和翻译的形式编码；

d将构建子连接到含有选择性标记和诸如启动子、增强子和poly(A)附加信号的载体；

e扩增载体并将其导入真核细胞(转染)，通常为哺乳动物淋巴细胞；

f选择表达选择标记的细胞

g筛选表达期望嵌合抗体的细胞

h检测抗体的适合的结合特异性和效应器功能。

单克隆抗体指分离自单个克隆的抗体，包括任何真核、原核或噬菌体克隆。单克隆抗体可以包括或由两个蛋白组成，即重链和轻链。可以使用本领域已知的多种技术中的一种制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。

人源抗体指分子的CDRs(互补决定区)来自非人物种免疫球蛋白，并且抗体分子的其余部分主要来自人免疫球蛋白。这里使用的术语“抗体”，除非特别指明，广泛的用作指抗体分子和抗体衍生的分子。这些抗体衍生的分子包括至少一个可变区(可变区的重链或轻链)并包括分子，例如Fab片段，Fab’片段，F(ab’).sub.2片段，Fd片段，Fab’片段，Fd片段，Fabc片段，Sc抗体(单链抗体)，双功能抗体，个体抗体轻链，个体抗体重链，在抗体链和其它分子中嵌合的融合。

特别地，本发明提供作为抗HGF的中和抗体的兔/人嵌合抗体。本发明的中和抗体包含SEQ ID NO：27的V_H区和SEQ ID NO：28的V_L区或SEQ ID NO：29的V_H区和SEQ ID NO：30的V_L区。

可以采用MDCK2扩散方法检测中和抗体是否发挥中和活性(Cao等，PNAS 98(13)：7443-7448，201)。在用2ng/ml的HGF(29pM)处理的MDCK2细胞情况中，本发明的中和抗体显示出当抗HGF Fab与HGF的摩尔比为50∶1，抗人Fab与HGF的摩尔比的范围为50∶1到100∶1时，获得最高的扩散抑制活性(参见图9)。这些结果第一次显示至少在体外，仅仅对一个表位的封闭对于中和HGF是充分的，而区别于Cao的抑制MDCK2细胞扩散需要中和至少三个表位的报道(Cao等，见上)。另外，本发明显示这样的事实，即仅仅当结合可中和表位的抗体是二价或更高时，中和抗体发挥其中和活性，这提示同样的可中和表位可以存在于HGF的两个或更多个的位点。

也可以用EIA检测抗HGF Fab对HGF的结合亲和性，68克隆对HGF与c-Met结合的的抑制活性和可溶的c-Met对HGF与c-Met结合的抑制活性。随着注入克隆68抗体的量，与固定在传感器芯片上的HGF结合的克隆68抗体的量增加(参见图10)，并且随着克隆68抗体的浓度的增加，HGF与c-Met结合的量减少(参见图11)。另外，随着可溶c-Met浓度的增加，与固定在传感器芯片上的c-Met结合的HGF的量减少(图12)。

上述结果显示本发明的中和抗体可作为能中和HGF的单一试剂。

因此，本发明进一步提供包括有效剂量的本发明中和抗体和药学可接受载体的药物组合物，其用于预防和治疗由HGF与其受体结合所引起的顽固的疾病和癌症。此外，本发明提供通过使用本发明中和抗体而用于预防和治疗顽固疾病和癌症的方法。优选地，癌症包括但不局限于，多种人肝，前列腺，结肠，乳腺，脑和皮肤的癌症，并且顽固疾病包括那些通过HGF与其受体c-Met结合引起的疾病，包括但不局限于疟疾，阿尔兹海默症等等。

本发明的药物配方可以结合任何一个常规的方法而制备。在制备配方中，有效成份优选使用载体混合的或稀释的。合适的载体，赋性剂或稀释剂是乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，淀粉，阿拉伯树胶，藻酸盐，白明胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羟基苯甲酸甲酯(Methylhydroxybenzoate)，羟基苯甲酸丙酯(propyl hydroxybenzoate)，滑石，硬脂酸镁和矿物油。配方还可以包括填充料，抗粘剂，润滑剂，湿润剂，芳香剂，乳化剂，防腐剂等等。本发明的组合物通过使用本领域熟知的任何一种方法配制，以便当其对患者给药后，能构提供活性成份迅速，持续或延迟的释放。

本发明的药学配方可以通过注射给药(例如肌肉注射，静脉注射，腹腔注射，皮下注射)，或通过其它方法，例如灌注以便确保以有效的形式递送到血流。药物配方还可以通过瘤内，瘤周，病灶内或病灶旁途径给药，以发挥局部和全身治疗效果。局部或静脉注射是优选的方式。

为了治疗人类患者，作为有效成份的本发明中和抗体的典型一日剂量的范围是大约0.1到100mg/kg体重，优选1到10mg/kg体重，其可以作为一次剂量或均分的剂量给药。然而，可以理解的是实际上活性成份的给药剂量应该根据多种相关因素而决定，这些因素包括治疗的疾病，选择的给药途径，年龄，性别和个体患者的体重，以及患者症状的严重性，因此，上述剂量将不会在任何方面限制本发明的范围。

本发明进一步提供下述实施例进行说明。需要理解的是，显示本发明优选实施方案的这些实施例，仅仅以说明本发明的方式给出。从上述讨论和这些实施例，本领域技术人员能够在不偏离其领域和范围下确定本发明的必要特征，能对本发明进行多种改变和修饰以适合不同的用途和条件。

实施例1：HGF免疫和抗体文库构建

经过4到5个月的时间，通过间隔3周的5次HGF皮肤注射免疫2只新西兰白兔(R&D系统，USA)，HGF分散在MPL(单磷酰脂A，分离自″S.minnesota再次突变(remutants)的高度精练的无毒脂A)+TDM(合成的海藻糖(dicorynomycolate)，来自结核杆菌索状因子(Cord factor)的海藻糖双分枝菌酸的类似物)+CWS(细胞壁骨架，来自分枝杆菌去蛋白和去脂质额细胞壁)佐剂中(Sigma)。通过使用辣根过氧化物酶偶联的抗兔Fc山羊多克隆抗体(Pierce)的ELISA方法检测来自免疫动物的抗血清对重组人HGF的结合(R&D系统或Research DiagnosticsInc.)。结果发现，虽然在HGF免疫之前获得的抗血清基本不与HGF结合，然而在5次皮肤注射后获得的抗血清特异的与HGF结合。

在最后增强之后的几天，从免疫动物分离脾脏和骨髓，并使用TRI试剂(Molecular Reaserch Center，Cincinnati，USA)和氯化锂沉淀制备总RNA。使用SUPERSCRIPT Preamlification系统和寡(dT)引物(LifeTechnologies，Inc.)合成第一链cDNA。

根据Rader等描述的方法构建兔/人嵌合抗体库(Rader C等，J.Biol.Chem.275：13668-13676，2000)。

实施例2：兔源抗体可变区和人源抗体保守区的扩增

(2-1)兔源抗体可变区的扩增

为了扩增兔V_L(V_κ，V_λ)和重链(V_H)，通过使用表1描述的引物组合进行PCR.

表1

PCR反应溶液如下制备：混合1μl实施例1合成的cDNA模板(大约0.5μg)，60pmol每种引物，10μl 10×PCR缓冲液，8μl 2.5mMdNTP混合物和0.5μl Taq聚合酶，并将终体积调整为100μl。PCR条件是在94℃10分钟预变性后，94℃15秒，56℃30秒，72℃90秒共30个循环，最后在72℃延伸10分钟。将扩增DNA进行琼脂糖凝胶电泳并使用Qiaex凝胶提取试剂盒从凝胶中纯化。

(2-2)人源抗体保守区的扩增

扩增人源抗体保守区的C_κ区的PCR如下实施：制备PCR反应溶液，即混合20ng1μl pComb3XTT载体(Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA15：88(18)，7978-82，1991)，60pmol每种引物(SEQ ID NO：14和15)，10μl 10×PCR缓冲液，8μl 2.5mMdNTP混合物和0.5μl Taq聚合酶，并将终体积调整为100μl。PCR条件是在94℃ 10分钟预变性后，94℃15秒，56℃30秒，72℃90秒共20个循环，最后在72℃延伸10分钟。

同时，扩增人源抗体保守区的C_H1区的PCR如下实施：制备PCR反应溶液，即混合20ng 1μl pComb3XTT载体(Barbas等，同上)，60pmol每种引物(SEQ ID NO：16和17)，10μl 10×PCR缓冲液，8μl 2.5mMdNTP混合物和0.5μl Taq聚合酶，并将终体积调整为100μl。PCR条件是在94℃10分钟预变性后，94℃15秒，56℃30秒，72℃90秒共20个循环，最后在72℃延伸10分钟。

将扩增DNA进行琼脂糖凝胶电泳并使用Qiaex凝胶提取试剂盒从凝胶中纯化。

实施例3：扩增嵌合抗体的轻重链

(3-1)轻链扩增

扩增人轻链的PCR如下实施：制备PCR反应溶液，即混合100ng实施例(2-1)纯化的每个PCP产物V_L(V_κ，V_λ)和实施例(2-2)纯化的PCR产物C_κ，60pmol每种引物(SEQ ID NO：18和15)，10μl 10×PCR缓冲液，8μl 2.5mMdNTP混合物和0.5μl Taq聚合酶，并将终体积调整为100μl。PCR条件是在94℃10分钟预变性后，94℃15秒，56℃30秒，72℃120秒共20个循环，最后在72℃延伸10分钟。

(3-2)重链扩增

扩增重链的Fd区域(V_H和CH1)的重叠PCR如下实施：制备PCR反应溶液，即混合100ng实施例(2-1)纯化的每个PCP产物V_H和实施例(2-2)纯化的PCR产物V_H1，60pmol每种引物(SEQ ID NO：19和17)，10μl 10×PCR缓冲液，8μl 2.5mMdNTP混合物和0.5μl Taq聚合酶，并将终体积调整为100μl。PCR条件是在94℃10分钟预变性后，94℃15秒，56℃30秒，72℃120秒共20个循环，最后在72℃延伸10分钟。

实施例4：制备嵌合Fab文库

扩增嵌合兔/人Fab基因的PCR如下实施：制备PCR反应溶液，即混合100ng实施例(3-1)纯化的每个嵌合轻链产物和实施例(3-2)纯化的嵌合重链产物，60pmol每种引物(SEQ ID NO：18和20)，10μl 10×PCR缓冲液，8μl 2.5mMdNTP混合物和0.5μl Taq聚合酶，并将终体积调整为100μl。PCR条件是在94℃10分钟预变性后，94℃15秒，56℃30秒，72℃180秒共20个循环，最后在72℃延伸10分钟。

在编码兔V_L和V_H序列的PCR产物与编码人C_κ和C_H1序列的PCR产物结合之后，编码抗体片段文库的终PCR片段进行SfiI消化并克隆到噬菌粒载体pComb3X(Scripps研究中心，CA，USA)(图2)。通过电转化将噬菌粒转化入大肠杆菌ER2537菌株(NEB)。作为融合在噬菌体包被蛋白pIII的导入的噬菌体展示Fab融合蛋白与其DNA形成噬菌体颗粒

(基因和多肽作为一个单位)存在于噬菌体DNA。

实施例5：选择含有抗HGF Fab的噬菌体克隆

当96孔板(Costar No.3690)每孔包被浓度为10μl/ml的溶解在25μl的TBS的HGF之后，实施例4制备的噬菌体展示Fab加入孔板，孔板在室温保持2小时，并淘选在孔板中的抗免疫的HGF抗原。使用PBS中的0.5％(v/v)Tween 20洗涤孔板并用0.1M HCl-甘氨酸(PH2.2)洗脱。洗涤步骤从第一个循环的5次增加到第二个循环的10次和随后循环的15次。实施典型的7循环淘选。随着淘选进行，特异结合HGF的抗HGF Fab的噬菌体展示库增加，其在使用HRP-偶联的抗-M13噬菌体抗体(Pharmacia)和HGF-包被的ELISA板的EIA检测中，导致显示HGF结合Fab的吸光率的增加(图3)。在最后一个淘选循环之后，通过分别使用HGF包被的ELISA板和山羊抗人Fab多克隆抗体(Pierce)EIA方法选择含有抗HGF Fab的噬菌体克隆。选出的噬菌体克隆命名为H61(克隆61)和H68(克隆68)。相对于背景具有强信号的H61和H68克隆(图7)进一步进行核苷测序分析。

实施例6：筛选噬菌体的核苷测序分析

使用SEQ ID NO：21和22的两个测序引物，通过染料标记引物测序方法实施核酸测序(Chung等，J.Cancer Res.Clin.Oncol.128：641-649，2002)。结果发现，H61克隆编码由含有SEQ ID NOs：23核苷序列的V_H区和含有SEQ ID NOs：24的核苷序列的V_L区组成的抗HGF Fab；而H68克隆编码由含有SEQ ID NOs：25核苷序列的V_H区和含有SEQ ID NOs：26的核苷序列的V_L区组成的抗HGF Fab组成。

从分析的核苷序列分别得出H61和H68克隆的氨基酸序列。结果发现H61克隆的V_H区和V_L区分别含有SEQ ID NOs：27和SEQ ID NOs：28，而H68克隆的V_H区和V_L区分别含有SEQ ID NOs：29和SEQ ID NOs：30的氨基酸序列。

根据Harris(Harris等，Protein Science4(2)：306-10，1995)描述的方法，作为对H61和H68克隆的氨基酸序列中结构区(FR)和互补决定区(CDR)分析结果，H61和H68克隆含有表2描述的区。

表2

区	H61克隆V<sub>H</sub>	H61克隆V<sub>L</sub>	H61克隆V<sub>H</sub>	H61克隆V<sub>L</sub>
区	H61克隆V<sub>H</sub>	H61克隆V<sub>L</sub>	H61克隆V<sub>H</sub>	H61克隆V<sub>L</sub>	FR1	1-30	1-23	1-30	1-23
CDR1	31-35	24-34	31-35	24-34	FR1	1-30	1-23	1-30	1-23
CDR1	31-35	24-34	31-35	24-34	FR2	36-49	35-49	36-49	35-49
CDR2	50-66	50-56	50-66	50-56	FR2	36-49	35-49	36-49	35-49
CDR2	50-66	50-56	50-66	50-56	FR3	67-98	57-88	67-98	57-88
CDR3	99-105	89-97	99-105	89-97	FR3	67-98	57-88	67-98	57-88
CDR3	99-105	89-97	99-105	89-97	FR4	106-116	98-109	106-116	98-109

实施例7：用于体外实验的抗HGF Fab的表达和纯化

将实施例5筛选的克隆的噬菌粒DNAs转化无抑制因子的大肠杆菌菌株HB2151。克隆生长到A600nm吸光值为0.5到1.0时，使用IPTG(1mM)诱导抗HGF Fab表达20至24小时。使用实验级TFF系统(Millipore)浓缩培养上清。使用抗HA标签小鼠单克隆抗体通过亲和层析的方法纯化浓缩的抗HGF Fab。使用考马斯亮兰染色和蛋白质印迹分析纯化的Fab片段。

首先，通过加样到NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上对纯化的H68抗体Fab(大约1-3ug)进行电泳。负载的凝胶在考马斯亮兰凝胶染色溶液中浸泡(Invitrogen)，摇动30分钟，转移至考马斯亮兰脱色液中，摇动直到能够观察到蛋白条带。图4显示考马斯亮兰染色的结果。如图4所示，在非还原的H68抗体(泳道2)中，大部分的Fab抗体在分子量为50000Da的位置处检测到；而在还原的H68抗体(泳道3)中，Fab抗体被分别分离在Fd区域的轻链和重链，因此在分子量为25000Da的位置处检测到条带；而其它非抗体的条带没有检测到。由于H68抗体Fab的轻重链的大小分别约为25000Da，而通过轻重链间的二硫键共价连接形成的Fab的大小为大约50000Da的事实，H68抗体Fab被成功的分离并获得满意的纯度。然而，在泳道2中25000Da位置处的弱带是由于存在彼此没有连接的自由的Fab轻重链。

同时，为了进行蛋白质印迹，过加样到NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上对纯化的抗HGFFab(大约1-3ug)进行电泳。根据分子量分离的Fab印迹到BioTrace硝化纤维膜上(PALL)。使用5％脱脂奶粉/TBS封闭处理30分钟。辣根过氧化物酶偶联的抗人山羊Fab多克隆抗体(Pierce)使用3％脱脂奶粉/TBS按1∶1000的比例稀释，并与膜摇动反应1小时。使用TBS洗涤膜30分钟并用等体积的Supersignal West Pico稳定过氧化物溶液(Pierce)和Supers ignal WestPico氨基苯二酰一肼/增强溶液(Pierce)的混合溶液基本润湿膜。在暗室中将膜曝光于X-射线(Kodak)。

图5显示了分析纯化的Fab片段的表达的蛋白质印迹结果，其中左边泳道是大小标记，而另一泳道是纯化的Fabs。如图5所示，在相应于50000Da的位置检测到大量的Fab，在相应于25000Da的位置检测到游离的轻重链Fd区。

实施例8：核苷序列分析和HGF可中和的表位的特点

(8-1)核苷测序

96孔板(Costar No.3690)每孔包被浓度为10μl/ml的溶解在25μl的TBS的抗HGF H61Fab或抗HGF H68Fab。PHD肽文库(重组肽的噬菌体展示文库)(New England Biolab)加入孔板，然后孔板在室温保持2小时。使用PBS中的0.5％(v/v)Tween 20洗涤孔板并用0.1M HCl-甘氨酸(PH2.2)洗脱。洗涤步骤从第一个循环的5次增加到第二个循环的10次和随后循环的15次。实施典型的7循环淘选。在最后一个淘选循环之后，通过使用抗HGF H61 Fab或抗HGF H68 Fab包被的ELISA板和辣根过氧化物藕联的抗-M13噬菌体山羊单克隆抗体(Roche)的EIA方法选择含有抗HGF H61Fab或抗HGF H68Fab的噬菌体克隆。选出的克隆进行核苷测序，并且从分析的核苷序列确定氨基酸序列。

使用SEQ ID NO：31的测序引物，根据染料标记引物测序方法实施核酸测序(Chung等，同上)。结果发现，从分析的核苷序列推导的编码抗HGF H61和H68 Fabs的肽分别含有SEQ ID NOs：32和33的氨基酸序列。

然后，96孔板(Costar No.3690)每孔包被浓度为10μl/ml的溶解在25μl的TBS的c-Met，并且含有SEQ ID NOs：32和33的肽的克隆也每个加入。使用PBS中的0.5％(v/v)Tween 20洗涤孔板，辣根过氧化物藕联的抗-M13噬菌体山羊单克隆抗体(Roche)也加入。

如图6所示，当分别含有SEQ ID NOs：32和33的肽(1和2)的噬菌体与c-Met结合，两个没有所述肽的对照噬菌体(3和4)没有结合。这些结果提示因为抗HGF抗体H68的抗原结合位点模仿了c-MET的HGF结合位点，以及结合克隆68的SEQ ID NO：32和33的肽模仿了HGF的c-MET结合位点，所以SEQ ID NO：32和33的肽能够具有作为HGF可中和的表位的功能。

(8-2)特点

为了表征抗HGF抗体的抗原结合位点，如下实施蛋白质印迹。通过加样到NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上对1-3ug HGF进行电泳。此时，一些在经过还原剂处理之后上样，而其它则不经过上述处理而上样。根据分子量分离的蛋白印迹到BioTrace硝化纤维膜上(PALL)。使用5％脱脂奶粉/TBS封闭处理膜30分钟。将抗HGFH61和H68Fabs加到膜上，然后膜摇动1小时。辣根过氧化物酶偶联的抗人山羊Fab多克隆抗体(Pierce)使用3％脱脂奶粉/TBS按1∶1000的比例稀释，并与膜摇动反应1小时。使用TBS洗涤膜30分钟并用等体积的Supersignal West Pico稳定过氧化物溶液(Pierce)和Supersignal WestPico氨基苯二酰一肼/增强溶液(Pierce)的混合溶液基本润湿膜。在暗室中将膜曝光于X-射线(Kodak)。

图8显示了H61和H68限定的可中和的表位的构象依赖性，其中箭头代表大小标记；A，克隆61；B，克隆68；泳道1，非还原HGF，泳道2：还原HGF。结果发现，克隆61和68与非还原的HGF结合，而不与还原的HGF结合。这些结果提示作为克隆61和68结合位点的抗原决定簇的三级结构，例如表位，对于抗原-抗体反应是关键的，并且本发明的可中和的表位具有非线性的结构。

实施例9：MDCK扩散试验

MDCK细胞(Madine Darby犬肾细胞；ATCC CCL 34)在补充有5％FCS的DMEM培养基中，37℃，95％空气和5％二氧化碳的潮湿空气培养箱中培养。以2×10³细胞/孔的浓度将细胞接种于96孔板中，并与新鲜培养基中的2ng/ml(29pM)的HGF孵育过夜。然后，以不同浓度将抗HGF Fab和抗人Fab抗体加入孔板。通过光学显微镜监控扩散效果，结果在图9显示。图9a表示范围为1级到6级的细胞扩散水平的标准，其中6级指HGF引起的扩散效果100％的抑制；5级指HGF引起的扩散效果为从90-100％的抑制；4级指HGF引起的扩散效果为从60-90％的抑制；3级指HGF引起的扩散效果为从30-60％的抑制；2级指HGF引起的扩散效果为从10-30％的抑制；1级指HGF引起的扩散效果为10％以及更少的抑制。图9b显示根据加入的HGF浓度，抗HGF Fab和抗人Fab抗体的扩散水平可能改变。

结果发现，当抗HGF Fab与HGF的摩尔比为50∶1，以及时抗人Fab抗体与HGF的摩尔比范围为50∶1到100∶1时，可以获得预料的最有效的扩散效果。

实施例10：BIAcore检测

(10-1)抗HGF Fab与HGF的亲和分析

使用BIAcore 3000(BIAcore AB，Uppsala，Sweden)通过SPR(表面等离子共振技术)检测抗HGF Fab与HGF的结合亲和性。

大约，通过胺偶联方法将HGF的1069共振单位(RU)耦合到CM5传感器芯片(BIAcore AB)。在含有0.005％表面活性剂P20，25℃流速为30μl/分钟的PBS缓冲液中进行结合相互作用。用1M NaCl/50mMNaOH再生表面。检测了动力速率常数(K_on和K_off)以及平衡离解常数(K_d)。图10显示抗HGF H68Fab与HGF的结合亲和性。结果发现，随着抗HGF H68Fab的浓度，与固定在传感器芯片上的HGF结合的抗HGFH68Fab的量增加。

(10-2)抗HGF的克隆68抗体的HGF结合抑制活性的分析

为了在实时确定抗HGF H68Fab能抑制HGF与c-Met结合的事实，通过胺偶联方法将c-Met耦合到CM5传感器芯片。然后，分别将HGF以50nM的浓度单独，与5个不同浓度(50nM，250nM，500nM，1μM和1.5μM)的抗HGF H68Fab和可溶的5个不同浓度(50nM，100nM，200nM，400nM和600nM)的c-Met预混合注入。在含有0.005％表面活性剂P20，25℃流速为30μl/分钟的PBS缓冲液中进行结合相互作用。用1M

NaCl/50mM NaOH再生表面。

图11显示抗HGF H68Fab抑制HGF与c-Met的结合。结果是，在注入50nM的HGF时，HGF与c-Met的结合为455.5RU(I)，当50nM的HGF与5个不同浓度：50nM(II)，250nM(III)，500nM(IV)，1μM(V)和1.5μM(VI)的抗HGF H68Fab注入时，HGF与c-Met的结合分别为406.5，328，260，111.1和71RU。这些结果提示随着抗HGF H68 Fab浓度的增加，HGF与c-Met的结合减少。当抗HGF H68 Fab单独注入时，HGF没有结合。

(10-3)可溶的c-Met抗c-Met与HGF结合的抑制活性

检测可溶的c-Met是否抑制HGF与c-Met的结合如下进行。通过胺偶联方法将2979RU的c-Met耦合到CM5传感器芯片。在含有0.005％表面活性剂P20，25℃流速为30μl/分钟的PBS缓冲液中进行结合相互作用。用1M NaCl/50mM NaOH再生表面。

图12显示可溶c-Met抑制HGF与c-Met的结合。如图12所示，在注入50nM的HGF时，HGF与c-Met的结合为455.5RU(I)，当50nM的HGF与5个不同浓度：50nM(II)，100nM(III)，200nM(IV)，400nM(V)和600nM(VI)的可溶c-Met注入时，HGF与c-Met的结合分别为310.3，225.7，167.4，93.7和70.9RU。这些结果提示随着可溶c-Met浓度的增加，HGF与耦合到传感器芯片上的c-Met的结合逐渐减少。

尽管本发明主题的实施方案已经做过描述和解释，显而易见的是，在不脱离仅仅被权利要求的范围所限定的本发明的精神的前题下，可以进行多种改变和修饰。

序列表

<110>国立癌中心

<120>可中和的HGF表位和与其结合的中和抗体

<130>PCA31170/NCC

<160>35

<170>Kopatentin 1.71

<210>1

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Vkappa 5′正向引物RSCVK1

<400>1

gggcccaggc ggccgagctc gtgmtgaccc agactcca 38

<210>2

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Vkappa 5′正向引物RSCVK2

<400>2

gggcccaggc ggccgagctc gatmtgaccc agactcca 38

<210>3

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Vkappa 5′正向引物RSCVK3

<400>3

gggcccaggc ggccgagctc gtgatgaccc agactgaa 38

<210>4

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Vkappa 3′反向引物RHybK1-B

<400>4

agatggtgca gccacagttc gtttgatttc cacattggtg cc 42

<210>5

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Vkappa 3′反向引物RHybK2-B

<400>5

agatggtgca gccacagttc gtaggatctc cagctcggtc cc 42

<210>6

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Vkappa 3′反向引物RHybK3-B

<400>6

agatggtgca gccacagttc gtttgacsac cacctcggtc cc 42

<210>7

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Vlambda 5′正向引物RSCIambda1

<400>7

gggcccaggc ggccgagctc gtgctgactc agtcgccctc 40

<210>8

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Vlambda 3′反向引物RHybL-B

<400>8

agatggtgca gccacagttc ggcctgtgac ggtcagctgg gtccc 45

<210>9

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VH 5′正向引物RHyVH1

<400>9

gctgcccaac cagccatggc ccagtcggtg gaggagtccr gg 42

<210>10

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VH 5′正向引物RHyVH2

<400>10

gctgcccaac cagccatggc ccagtcggtg aaggagtccg ag 42

<210>11

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VH 5′正向引物RHyVH3

<400>11

gctgcccaac cagccatggc ccagtcgytg gaggagtccg gg 42

<210>12

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VH 5′正向引物RHyVH4

<400>12

gctgcccaac cagccatggc ccagsagcag ctgrtggagt ccgg 44

<210>13

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VH 3′反向引物RHyIgGCH1-B

<400>13

cgatgggccc ttggtggagg ctgargagay ggtgaccagg gtgcc 45

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于从克隆的人Fab扩增人Ckappa区和pelB引导区序列的正向引物HKC-F

<400>14

cgaactgtgg ctgcaccatc tgtc 24

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于从克隆的人Fab扩增人Ckappa区和pelB引导区序列的反向引物Lead-B

<400>15

ggccatggct ggttgggcag c 21

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于从克隆的人Fab扩增人CH1链的正向引物HIgGCH1-F

<400>16

gcctccacca agggcccatc ggtc 24

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于从克隆的人Fab扩增人CH1链的反向引物dpseq

<400>17

agaagcgtag tccggaacgt c 21

<210>18

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于兔VL序列与人Ckappa PCR产物连接的PCR正向引物RSC-F

<400>18

gaggaggagg aggaggaggc ggggcccagg cggccgagct c 41

<210>19

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于兔VH序列与人CH1 PCR产物连接的PCR正向引物LeadVH

<400>19

gctgcccaac cagccatggc c 21

<210>20

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于嵌合的轻链序列与嵌合的重链序列(Fd)连接的PCR反向引物dp-EX

<400>20

gaggaggagg aggaggagag aagcgtagtc cggaacgtc 39

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>测序引物

<400>21

agaaacacaa agtctacgcc 20

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>测序引物

<400>22

gttgggcagc gagtaataac 20

<210>23

<211>348

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码克隆61的VH区的核苷酸序列

<400>23

caggagcagc tgatggagtc cgggggtcgc ctggtcaatc ctggcgaatc cctgacactc 60

acctgcaaag cctctggatt caccttcagt agctactaca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg gatcggatac attggtacta gtagtggtac cacttactac 180

gcgaactctg tgaagggccg attcaccatc tccagcgaca acgcccagaa taccgtattt 240

ctgcgaatga ccagtctcac agactcggac acggccacct atttctgtgc aagagggctg 300

ggcagaatca acttgtgggg cccaggcacc ctggtcaccg tctcttca 348

<210>24

<211>327

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码克隆61的VL区的核苷酸序列

<400>24

gagctcgtgc tgacccagac tccatcctct atgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60

atcaattgcc aggccagtca gagtgttagc aactacttag cctggtatca gcagaaacca 120

gggcagcctc ccaagctcct gatctacagg gcatccactc tggcatctgg ggtcccatcg 180

cgtttcagcg gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagtgg catgaaggct 240

gaagatgctg ccacttatta ctgtcaaagt ggttattata gtgctggtgc gacttttgga 300

ggtggcacca atgtggaaat caaacga 327

<210>25

<211>348

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码克隆68的VH区的核苷酸序列

<400>25

cagcagcagc tggtggagtc cgggggtcgc ctggtcaatc ctggcgaatc cctgacactc 60

acctgcaaag cctctggatt caccttcagt acctactaca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctagagtg gatcggatac attggtacta gtagtggtac cacttactac 180

gcgaactctg tgaagggccg attcaccatc tccagcgaca acgcccagaa taccgtattt 240

ctgcaaatga ccagtctgac agactcggac acggccacct atttctgtgc aagagggctg 300

ggcagaatta acttgtgggg cccaggcacc ctggtcaccg tctcctca 348

<210>26

<211>327

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码克隆68的VL区的核苷酸序列

<400>26

gagctcgatc tgacccagac tccatcctct gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60

atcaattgcc aggccagtca gagtgttagc aacctcttag cctggtatca gcagaaacca 120

gggcagcctc ccaagctcct gatttatggt gcatccaatc tggaatctgg ggtcccatcg 180

cgtttccgtg gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagtgg catgaaggct 240

gaagatgctg ccacttatta ctgtcaaagt ggttattata gtgctggtgc gacttttgga 300

gctggcacca atgtggaaat caaacga 327

<210>27

<211>116

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆61的VH区的氨基酸序列

<400>27

Gln Glu Gln Leu Met Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Asn Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Gly Thr Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Phe

65 70 75 80

Leu Arg Met Thr Ser Leu Thr Asp Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Leu Gly Arg Ile Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210>28

<211>109

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆61的VL区的氨基酸序列

<400>28

Glu Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Met Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Met Lys Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Tyr Tyr Ser Ala Gly

85 90 95

Ala Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210>29

<211>116

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆68的VH区的氨基酸序列

<400>29

Gln Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Asn Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Gly Thr Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Asp Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Leu Gly Arg Ile Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210>30

<211>109

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>克隆68的VL区的氨基酸序列

<400>30

Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Leu

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Met Lys Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Tyr Tyr Ser Ala Gly

85 90 95

Ala Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210>31

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>测序引物

<400>31

ccctcatagt tagcgtaacg 20

<210>32

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>neutralizable epitope of HGF

<400>32

His His Pro His Phe Lys Pro Val Ser Asn Ser Arg

1 5 10

<210>33

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>HGF可中和的表位

<400>33

Lys Ser Leu Ser Arg His Asp His Ile His His His

1 5 10

<210>34

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码SEQ.ID.No.32的核苷酸序列

<400>34

catcatccgc attttaagcc tgtgtctaat agtcgt 36

<210>35

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码SEQ.ID.No.33的核苷酸序列

<400>35

aagtctctta gtcggcatga tcatattcat catcat 36

Claims

1、分离的中和抗体，其特征在于，其中所述抗体包括含有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的V_H区和含有SEQ ID NO：28的氨基酸序列的V_L区，并且其中所述抗体抑制肝细胞生长因子结合到cMet。

2、分离的中和抗体，其特征在于，其中所述抗体包括含有SEQ ID NO：29的氨基酸序列的V_H区和含有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的V_L区，并且其中所述抗体抑制肝细胞生长因子结合到cMet。

3、根据权利要求1或2所述的分离的中和抗体在制备用于预防或治疗由HGF与cMet结合引起的疾病的药物中的用途。

4、根据权利要求3所述的用途，其中的疾病是肝癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、脑癌、皮肤癌、疟疾和阿尔兹海默症。

5、根据权利要求1或2所述的分离的中和抗体，其选自嵌合抗体、单克隆抗体或人源抗体。

6、根据权利要求1或2所述的分离的中和抗体，其是Fab。