JP4446393B2 - Hgfの中和可能エピトープ及びこれに結合する中和抗体 - Google Patents
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Description
その受容体であるMetに対するHGFの結合は、多様な細胞類型の成長及び分散を誘導し、上皮間葉転移及び細管(tubule)と内腔(lumen)の形成を媒介し、また、血管形成を促進する。MetとHGFが共にノックアウット(knock−out)されたマウスは胚芽段階で死亡率が高く、胎盤、胎児の肝及び手足/筋肉形成において分化欠陥を示す(Cao et al., PNAS 98(13): 7443-7448, 2001; Gmyrek et al., American Journal of Pathology 159(2): 579-90, 2001)。
しかし、今まで単剤としてHGFを中和してin vitroで細胞分散活性(cell scattering activity)を制御できるモノクローナル抗体は報告されたことがない。
前記中和可能エピトープをコードするポリヌクレオチド;
前記中和可能エピトープに結合し、単剤としてHGFを中和させることができるHGFに対する中和抗体;
難治病及び癌を予防・治療するための前記中和抗体の用途;
難治病及び癌を予防・治療するための前記中和抗体及び薬剤学的に許容可能な担体を含む薬学組成物;及び
患者に前記中和抗体を投与することを含む、難治病及び癌を予防・治療する方法。
本発明の中和抗体はキメラ抗体、モノクロナール抗体またはヒト化抗体である。
一般的に、キメラ抗体の生産に用いられる過程は次の段階を含む。
(a)抗体分子の抗原結合部をコードする正確な遺伝子切片を定めてクローニングする段階であって、前記遺伝子切片(VDJとして知られている重鎖についての可変的、多様性及び連結領域、VJとして知られている軽鎖についての可変的、連結領域、または単にVとして知られている可変領域)はcDNAまたはゲノムの形態であり得、
(b)不変領域またはその目的する部位をコードする遺伝子切片をクローニングする段階、
(c)前記可変領域を前記不変領域と連結し、これが転写・翻訳できる形態に構造して完全なキメラ抗体としてコードされる段階;
(d)前記構造物を選別可能マーカー及びプローモーター、エンハンサー及びポリ(A)付加信号を含むベクター内に導入する段階、
(e)前記ベクターを増幅して真核細胞(通常は哺乳動物リンパ球内)に導入(形質感染)させる段階、
(f)前記選別可能マーカーを発現する細胞を選別する段階、
(g)目的するキメラ抗体を発現する細胞をスクリーニングする段階、及び
(h)前記抗体をその適切な抗原特異性及びエフェクター機能(effector factor)に対して前記抗体を調査する段階。
モノクローナル抗体は、任意の真核、原核、またはファージクローンを含む単一クローンから誘導された抗体を称する。前記モノクローナル抗体は、二つのタンパク質、すなわち重鎖及び軽鎖を含む。前記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイ技術を含む当分野に公知の多様な技術中の一つまたはこれらの組合せを用いて製造できる。
ヒト患者を治療するために、有効成分として本発明の中和抗体の通常的な投与量は、0.1〜100mg/kg体重であり、好ましくは1〜10mg/kg体重の範囲であり、1日1回または数回に分けて投与することができる。しかし、活性成分の実際投与量は、治療条件、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、及び癌の種類及び症状の重症度などの多様な関連因子に照らして決定するべきであるので、前記投与量はどの方法でも本発明の範囲を限定するものではない。
但し、下記の実施例は、本発明を例示することだけであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
HGF免疫化及び抗体ライブラリ製造
4〜5ヶ月にわたって、ニュージーランドホワイト種のラビット2匹にMPL(Monophosphoryl Lipid A, highly-refined non-toxic Lipid A isolated from remutants of S.minnesota)+TDM(synthetic Trehalose Dicorynomycolate, an analogue of trehalose dimycolate from the cord factor of the tubercle bacillus)+CWS(Cell Wall Skeleton, from deproteinized and delipidated cell walls of mycobacteria)補助剤(Sigma社)のエマルジョンに分散させたHGF(R&D systems、USA)を3週の間隔で5回皮下注射して免疫させた。西洋ワサビペルオキシダーゼが結合された抗ラビットFcゴート多クローン抗体(Pierce社)を用いたELISAを通じて前記免疫ラビットの抗血清と組換えヒトHGF(R&D systems or Research Diagnostics, Inc.)との結合有無を分析した。その結果、 HGF免疫前に得た血清はHGFにほとんど結合しない一方、5回皮下注射後に得た血清はHGFに特異的に結合することが判明した。
ラビット−由来Ab可変領域及びヒト−由来Ab不変領域の増幅
(2−1)
ラビット−由来Ab可変領域の増幅
ラビットVL(Vκ、Vλ)及びVHの可変領域を増幅するために、下記表1のプライマー組合せを用いてPCR反応を行った。
ヒト−由来Ab不変領域の増幅
ヒト−由来Ab不変領域のCκ領域を、PCRを利用して次のように増幅した。PCR反応溶液を20ngのpComb3XTTベクター(Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 15:88(18), 7978-82, 1991)、配列番号14及び15のプライマーをそれぞれ60pmol、10μlの10×PCR緩衝溶液、8μlの2.5mM dNTP混合物及び0.5μlのTaqポリメラーゼを混合し、蒸留水で最終体積を100μlにした。PCR条件は、94℃で10分間初期変性させ、94℃で15秒、56℃で30秒及び72℃で90秒の反応を20回繰り返した後、72℃で10分間最終延長させた。
キメラ抗体の軽鎖及び重鎖の増幅
(3−1) 軽鎖の増幅
軽鎖を増幅するためのPCRを次のように行った。PCR反応溶液をそれぞれ100ngの前記実施例(2−1)で精製されたVL(Vκ、Vλ)PCR産物と前記実施例(2−2)で精製されたCκPCR産物、配列番号18及び15のプライマーをそれぞれ60pmol、10μlの10×PCR緩衝溶液、8μlの2.5mM dNTP混合物及び0.5μlのTaqポリメラーゼを混合し、蒸留水で最終体積を100μlにした。PCR条件は、94℃で10分間初期変性させ、94℃で15秒、56℃で30秒及び72℃で120秒の反応を20回繰り返した後、72℃で10分間最終延長させた。
増幅されたDNAをアガロースゲル電気泳動させた後、クィアエクスゲル抽出キット(Qiagen社)を用いてゲルから精製した。
重鎖のFd領域(VH及びCH1)を増幅するためのオーバーラップ延長PCR(overlap extension PCR)を次のように行った。PCR反応溶液をそれぞれ100ngの前記実施例(2−1)で精製されたVH PCR産物と前記実施例(2−2)で精製されたCH1 PCR産物、配列番号19及び17のプライマーをそれぞれ60pmol、10μlの10×PCR緩衝溶液、8μlの2.5mM dNTP混合物及び0.5μlのTaqポリメラーゼを混合し、蒸留水で最終体積を100μlにした。PCR条件は、94℃で10分間初期変性させ、94℃で15秒、56℃で30秒及び72℃で120秒の反応を20回繰り返した後、72℃で10分間最終延長させた。増幅されたDNAをアガロースゲル電気泳動させた後、クィアエクスゲル抽出キット(Qiagen社)を用いてゲルから精製した。
キメラFabライブラリの製造
キメララビット/ヒトFab遺伝子を増幅するためにPCRを次のように行った。PCR反応溶液をそれぞれ100ngの前記実施例(3−1)で精製されたキメラ軽鎖産物と前記実施例(3−2)で精製されたキメラ重鎖産物、配列番号18及び20のプライマーをそれぞれ60pmol、10μlの10×PCR緩衝溶液、8μlの2.5mM dNTP混合物及び0.75μlのTaqポリメラーゼを混合し、蒸留水で最終体積を100μlにした。PCR条件は、94℃で10分間初期変性させ、94℃で15秒、56℃で30秒及び72℃で180秒の反応を20回繰り返した後、72℃から10分間最終延長させた。
抗HGF Fabを含むファージクローンの選別
96−ウェルプレート(costar No.3690)を25μlのTBS溶液に溶解されたHGFで各ウェル当り10μl/mlの濃度でコーティングした後、実施例 4で製造したFabを表面発現するファージを前記ウェルプレートに添加して室温で 2時間放置した後、前記ウェルプレートに固定されたHGF抗原に対してパニング(panning)を実施した。前記ウェルプレートをPBSの0.5%(v/v)ツイン20溶液で洗浄した後、0.1M HCl−グリシン(pH2.2)で湧出した。洗浄段階は、一番目のパニングでは5回、二番目のパニングでは10回、三番目のパニングでは15回と増加させ、全体として7回のパニングを行った。パニングが進行されるによりHGFに特異的に結合するFabを表面発現するファージ群が増加したが、この現像はHRP−結合された抗M13ファージ抗体(HRP−conjugated anti−M13 phage antibody、Pharmacia)及びHGF−コーティングされたELISAプレートを用いたEIAでFabに結合するHGFを示す吸光度における増加をもたらす(図3)。最後回のパニング後に、HGF−コーティングされたELISAプレート及び抗ヒトゴートFab多クローン抗体(Pierce)を用いたEIAを用いて抗HGF Fabを含むファージクローンを選別し、これらのクローンをH61(クローン61)及びH68(クローン68)で命名した。基準値以上の強い信号を示す(図7)H61及びH68クローンの塩基配列分析を次のように行った。
選別されたファージの塩基配列を分析
塩基配列を分析は、配列番号21及び22の2種シーケンシングプライマーを用いた染料−標識プライマーシーケンシング方法(dye labeled primer sequencing method)(Chung et al., J.Cancer Res.Clin.Oncol.128:641-649, 2002)を用いて行った。その結果、H61クローンは、配列番号23の塩基配列を有するVH領域及び配列番号24の塩基配列を有するVL領域で構成される抗HGF Fabをコードし、H68クローンは、配列番号25の塩基配列を有するVH領域及び配列番号26の塩基配列を有するVL領域で構成される抗HGF Fabをコードすることを確認した。
抗HGF Fab発現及びin vitro分析のための精製
実施例5で選別されたファージミドDNAのクローンを非抑制性大腸菌HB2151に形質転換させた。600nmでの吸光度が0.5〜1になるまでクローンを培養し、IPTG(1mM)を添加して20〜24時間、抗HGF Fabの発現を誘導した。培養上澄液をラブスケールTFFシステム(Labscale TFF system、Millipore)で濃縮した。抗HA標示マウスモノクローナル抗体を用いた親和クロマトグラフィを行って濃縮された抗HGF Fabを精製した。このFab切片をクマシ染色及びウエスタンブロットティング分析した。
HGFの中和可能エピトープの塩基配列を及び特性分析
(8−1) 塩基配列の分析
96−ウェルプレート(costar No.3690)に25μlのTBS溶液に溶解された抗HGF H61Fabまたは抗HGF H68Fabを各ウェル当り10μg/mlの濃度でコーティングした。PHDペプチドライブラリTM(phage display of combinatorial peptide library)(New England Biolob)を前記ウェルプレートに加えた後、室温で2時間放置した。前記ウェルプレートをPBS内に0.5%(v/v)ツイン20で洗浄した後、0.1M HCl−グリシン(pH2.2)で湧出した。洗浄段階は、一番目のパニング(panning)で5回、二番目のパニングで10回、三番目のパニングで15回増加させ、全体として7回のパニングを行った。最終回のパニング後に、抗HGF H61Fabあるいは抗HGF H61FabでコーティングされたELISAプレート及び西洋ワサビペルオキシダーゼで結合された抗M13ファージゴートモノクローナル抗体(Roche)を用いたEIAを通じて、抗HGF H61FabあるいはH68 Fabを含むファージクローンを選別した。このように選別されたクローンの塩基配列を分析してそのアミノ酸配列を決めた。
抗HGF抗体の抗原結合部の特性を把握するために、次のようにウエスタンブロットティングを行った。1〜3μgのHGFをNuPAGE Novex4−12%ビス−トリスゲル(Invitrogen)にローディングして電気泳動を行った。この時、一部は還元剤を処理した後ゲルにローディングし、一部は還元剤を処理しないでゲルにローディングした。分子量によって分離したタンパク質をニトロセルローズ膜(BioTrace Nitrocellulose membrane, PALL)に固定化させた。前記膜を遮断するために5%乾燥スキムミルク/TBSで30分間処理した。前記膜に抗HGF H61FabとH68Fabとを添加して1時間撹拌した。西洋ワサビペルオキシダーゼが結合された抗ヒトゴートFab多クローン抗体(Pierce)を3%乾燥スキムミルク/TBSで1:1000の比率で希釈し、前記膜に添加した後、1時間膜を撹拌した。前記膜をTBSで30分間洗浄し、スーパーシグナルウェストピコ安定化ペルオキシダーゼ溶液(Supersignal West Pico stable peroxide solution, Pierce)と、スーパーシグナルウェストピコルミノール/エンハンサー溶液(Supersignal West Pico Luminol/Enhancer solution, Pierce)との同量混合液で前記膜を均等に濡らした。前記膜を暗室でX−rayフィルム(Kodak)に感光させた。
MDCK分散(scattering)の分析
MDCK細胞(Madine Darby canine kidney cell; ATCC CCL 34)を5%FCSが添加されたDMEM培地において37℃、95% 湿度及び5%CO2の存在下で培養した。この細胞を96−ウェルプレートにウェル当り2×103個の細胞の濃度で分株し、新鮮な培地内で2ng/ml(29pM)のHGFの濃度で一晩露出させてから、抗HGF Fabと抗ヒトFab抗体を前記ウェルプレートにそれぞれ異なる濃度で添加した。それによって発生する効果は光学顕微鏡で観察し、その結果を図9に示した。図9aは等級1〜6の範囲を有する細胞の分散程度を示す基準を示したものであって、等級6はHGFによる分散効果の100%抑制を、等級5はHGFによる分散効果の100〜90%抑制、等級4はHGFによる分散効果の90〜60%抑制、等級3はHGFによる分散効果の60〜30%抑制、等級2はHGFによる分散効果の30〜10%の抑制、等級1はHGFによる分散効果の10%以下抑制をそれぞれ意味する。図9bは、抗HGF Fabと抗ヒトFab抗体の分散程度が添加されたHGF濃度により変化し得ることを示す。
その結果、HGFに対する抗HGF Fabのモル比(molar ratio)が50:1であり、HGFに対する抗ヒトFab抗体のモル比が50:1〜100:1の範囲である時、最も効果的な分散抑制効果を期待できた。
BIAcore分析
(10−1) HGFに対する抗HGF Fabの親和力の分析
HGFに対する抗HGF Fabの親和力は、BIAcore 3000(BIAcore AB、Uppsala、Sweden)を用いるSPR(surface plasmon resonance)によって決定した。
抗HGF H68 Fabがc−Metに対するHGFの結合を抑制することを実時間で確認するために、c−Metをアミン結合方法を通じてCM5センサーチップに結合させた。その後、HGFを50nMの濃度でそのまま注入し、それを5個の異なる濃度を有する(50nM、250nM、500nM、1μM及び1.5μM)抗HGF H68 Fabと5個の異なる濃度を有する(50nM、100nM、200nM、400nM及び600nM)水溶性c−Metとそれぞれ予め混合した。これらの結合相互作用は、25℃で30μl/分の流速で0.005%界面活性剤P20を含有するPBS緩衝溶液内で行われ、その結果生じる表面は、1M NaCl/50mM NaOHで再生した。
c−Metに対するHGFの結合が水溶性c−Metにより抑制されるか否かを次のように調べた。2979RUのc−Metを、アミン結合方法を通じてCM5センサーチップに固定し、それらの結合相互作用を25℃で30μl/分の流速で0.005%界面活性剤P20を含有するPBS緩衝溶液内で誘導し、その結果生じる表面を1M NaCl/50mM NaOHで再生した。
Claims (6)
- 配列番号27のアミノ酸配列を有するV H 領域と配列番号28のアミノ酸配列を有するV L 領域を含み、HGF(肝細胞増殖因子hepatocyte growth factor)がc−Metに結合することを抑制する単離した中和抗体。
- 配列番号29のアミノ酸配列を有するV H 領域と配列番号30のアミノ酸配列を有するV L 領域を含み、HGF(肝細胞増殖因子hepatocyte growth factor)がc−Metに結合することを抑制する単離した中和抗体。
- キメラ抗体、モノクローナル抗体及びヒト化抗体で構成された群から選ばれる、請求項1に記載の単離した中和抗体。
- キメラ抗体、モノクローナル抗体及びヒト化抗体で構成された群から選ばれる、請求項2に記載の単離した中和抗体。
- Fabである、請求項1に記載の単離した中和抗体。
- Fabである、請求項2に記載の単離した中和抗体。
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