CN100421680C - 银杏叶提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种银杏叶提取物的制备方法，其中包括：银杏叶粉碎成粗粉，用含水醇溶液加热回流提取，提取液减压挥去溶媒，加入氨水沉淀除去聚合多酚类物质，正己烷萃取除去银杏酸类成分；处理后的提取液通过大孔吸附树脂柱色谱，分离、精制，洗脱液采用陶瓷膜超滤技术进行超滤，进行除大分子杂质和有效成分富集，超滤液经喷雾干燥后得银杏叶提取物。该银杏叶提取物中有效成分总含量达到80%以上。本发明同时公开了由上述银杏叶提取物制备注射液和冻干粉针剂的方法。

Description

银杏叶提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及银杏叶提取物的生产工艺及药用制剂的制备方法，特别是涉及银杏叶提取物注射液和冻干粉针剂的制备方法。

背景技术

心脑血管、周边血管等血液循环障碍性疾病是临床最常见的疾病之一，是影响人民健康和长寿的一类主要疾病。银杏叶提取物及其制剂在心脑血管、周边血管疾病方面的作用越来越受到世界各国的重视。银杏(Ginkgo bilobaL.)为古代遗孑植物，又名白果树。银杏是我国的稀有物种，也是世界上珍贵的药用植物资源。尤其在最近四十年来，国内外相继对银杏化学成分、药理作用进行了深入研究，大量的药学、药理、药效、临床研究表明：银杏叶提取物的主要活性成分是银杏总黄酮醇苷类、萜内酯类化合物，这两类成分也是评判银杏叶提取物质量的重要指标。临床及药理研究发现银杏叶提取物具有增强心功能、改善微循环、降低血液粘稠性、拮抗血小板活化因子(PAF)，清除体内自由基及明显的纤维蛋白原溶解，抑制血流再灌注后的损伤，增强心脏细胞对缺血的耐受能力等。60-70年代，在国外尤其是德国、法国已有一定量银杏叶提取物应用于临床并证明了其效果，目前已发展到欧、亚、美等几十个国家。目前国内外利用银杏叶提取物开发出了许多能有效治疗与预防心脑血管、周边血管、神经系统、泌尿系统疾病的药物与保健食品，银杏叶提取物及其制剂已在临床与人们的生活中有了一定的应用，但应用程度不高，银杏制剂主要作为辅助药物用于临床，主要原因是银杏叶提取物质量标准中有效成分量偏低，影响了疗效。当前常用的用于治疗目的银杏叶提取物(

或Egb761)其质量标准中银杏黄酮苷24％、萜内酯6％，烷基酚类化合物低于10ppm。应用上述提取物所作的制剂已经是某些专利的主题，如欧洲专利EP431 535、EP 431 536和US 5,389,370。九十年代，各国的科研人员都尽最大努力提高银杏叶提取物中有效成分黄酮醇苷和银杏萜内酯的含量，同时尽量降低银杏酸的含量，银杏酸是银杏叶提取物毒性作用的主要因素，因其能产生严重的胃肠道副作用、头痛、皮肤刺激和引起水肿，临床应用可引起严重的过敏反应。美国专利(US4,428,965)涉及的主题即为对抗银杏酸所致过敏的脱敏物质和方法，中国专利CN1159022C的发明主题也是涉及高有效成分含量的银杏叶提取物得制备方法。

由于现有技术的提取方法得到的均属于低含量有效成分的银杏叶提取物，不能满足临床的疗效要求，尤其不适合用于注射制剂，造成银杏叶提取物有效成分含量偏低的原因同银杏叶提取物的生产工艺有很大关系，而银杏叶的制剂如片剂、口服液、胶囊等虽然在临床广泛应用，但口服制剂存在的缺点非常明显，如吸收不快、生物利用度不高等，影响疾病的治疗。例如99124228的专利披露的银杏叶提取物注射液，采用将提取物在注射剂的制备中加入金属离子络合物和聚砜或聚乙烯为材料的中空纤维超滤的方式除去杂质，该超滤除杂的方式的缺点是其以分离有机大分子物质，胶体，超微粒子，细菌为主，主要针对大分子物质。仅对深度降浊澄清和大分子物质的浓缩等具有效果，超滤后的提取物如果应用于注射剂还需要高温灭菌。

已经报道的银杏叶提取物现有工艺技术有：树脂吸附纯化法、热浸法、微波提取法、CO₂超临界提取法等。现有技术存在的主要问题：提取得有效成分总量不高、工艺路线不够合理或工业化条件不具备以及有效成分不能直接用于注射剂型等。

如何得到适合注射用的高纯度低杂质高含量有效成分的银杏叶提取物，成为业内研究热点。

发明内容

本发明的目的是提出一种高有效成分含量银杏叶提取物的制备方法，由该方法制备的提取物银杏总黄酮＞64％，银杏总内酯＞11％，同时具有较高抗氧化活性的原花青素类化合物含7-10％，毒性成分银杏酸类化合物＜5ppm。该发明的创新点在于把先进的陶瓷膜超滤技术应用在提取物的制备工艺中，不仅大大提高了有效成分含量，还有效的除去了植物药材中容易引起过敏反应的植物性大分子，增加了所开发制剂的有效性和安全性。

本发明的另一创新点在于提供了提取物中另一有效成分原花青素类化合物得含量测定方法，进一步确定了提取物中有效成分的组成，优化了不同有效成分的比例。

本发明的还提出了银杏叶提取物注射液和粉针剂的制备方法，通过该方法制得的制剂质量稳定，疗效确切。

本发明提供了一种银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：干燥银杏叶加入4-10倍量的50％-75％浓度的乙醇回流提取至少1次，将提取液合并过滤，减压回收除去乙醇得到浓缩液；向浓缩液中加入等体积的水，放置，过滤或离心除去沉淀；滤液或上清液调节PH至8-10，放置使沉淀完全，过滤或离心除去沉淀(鞣质和聚合多酚类杂质)；在滤液或上清液中加入酸调节PH至2.5-4.0(该PH值为加入氨水前提取液的PH值)，再加入正己烷萃取；萃取后的水液过大孔吸附树脂柱，先以去离子水洗脱，弃水洗液；再以60％-70％乙醇洗脱，收集醇洗脱液，减压挥去醇性溶媒，得到含醇5-10％的溶液；得到的溶液经过膜超滤，截留分子量为0.7-5万，超滤液经减压浓缩。

上述的制备方法，其中提取的乙醇优选为60％浓度的乙醇；水优选为去离子水；所述的浓氨水调PH值为9；调节PH值所采用的酸为盐酸或者硫酸，优选盐酸，PH值为3；所述的洗脱用的乙醇浓度为70％。

为了达到提高有效成分含量，有效的除去植物药材中容易引起过敏反应的植物性大分子(如银杏酸等)的含量，增加了所开发制剂的有效性和安全性，同时提高现有技术中公认作为杂质而在本发明中作为有效成分的丹宁特性的多酚类化合物(例如原花色素)的含量，上述银杏叶提取物的提取方法中所述的超滤优选为陶瓷膜超滤，截留分子量为1-3万，这样得到的提取物比其他膜超滤方法精制得到的提取物杂质少，分子量分布更加集中，药理药效更加明显，并且可以在制备针剂过程中不经过高温灭菌而达到药典规定的注射剂的要求，这是我们在试验筛选中发现的陶瓷膜应用于注射用的银杏叶提取物的一项优势，是其他膜超滤所不能替代的。

在本发明的优选实施例中，所述的银杏叶提取物的提取方法，包括以下步骤：

(1)取干燥银杏叶20-40目粗粉，加入4-10倍量的60％的乙醇回流提取2-4次，将提取液合并过滤，减压回收至总体积的1/10。

(2)浓缩液中加入相同体积的去离子水，阴凉环境中放置12hr，过滤或离心除去。

(3)充分搅拌，往(2)中得到的滤液或上清液中加入浓氨水，调节PH至8-10，放置1hr，过滤或离心除去沉淀杂质。

(4)向(3)中的滤液或上清液中加入盐酸调节PH至2.5-4.0，加正己烷萃取2-3次.

(5)经步骤(4)萃取后的水液过大孔吸附树脂柱，先以2倍柱床体积的去离子水洗脱，弃水洗液；再以3倍柱床体积的60％-70％乙醇洗脱，收集醇洗脱液，减压挥去醇性溶媒，得到含醇5-10％的溶液。

(6)经步骤(5)得到的溶液用陶瓷膜超滤，截留分子量为1-3万，超滤液经减压浓缩，浓缩液喷雾干燥后即得到银杏叶提取物。

本发明还提供了一种银杏叶提取物，该银杏叶提取物采用上述方法制得，其中银杏叶有效成分的总重量含量为80％以上(80％-95％，优选80％-85％)，该提取物至少包括总黄酮、萜内酯和原花青素，该总黄酮的含量为64％以上(例如64％-70％)，萜内酯的含量为11％以上(例如11％-15％)，原花青素的含量为7％(例如7％-10％)；其中，该银杏叶提取物还包括银杏酸，其重量含量不超过5ppm(例如2-4ppm)。

本发明还提供一种含有上述银杏叶提取物的药物组合物，其中，该组合物为注射用制剂，包括注射液和冻干粉针剂。

上述的注射用制剂包括1份银杏叶提取物，15-25份山梨醇或者甘露醇。

本发明还提供了银杏叶提取物中总黄酮的含测方法，其操作步骤如下：

(1)对照品溶液的制备：精密称取干燥芦丁适量，用70％乙醇定容于容量瓶中，得对照品储备溶液。

(2)标准曲线的绘制：取不同量的对照品储备液至容量瓶中，加入定量的水、pH为4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液、0.1mol/L的氯化铝溶液，然后用70％乙醇定容，在270nm处测定吸收度，绘制标准曲线。

(3)样品测定：精密称取适量样品，用70％乙醇定容于容量瓶中，按上述相同的方法处理，在270nm处测定吸收值，按无水物以芦丁计算总黄酮的量。应为标示量的90～110％。

本发明提供了银杏总内酯的含量测定方法，其操作步骤如下：

(1)对照品溶液的配制：精密称取银杏内酯A，B，C及白果内酯对照品，置于容量瓶中，加甲醇超声溶解后，冷至室温，以流动相稀至刻度，摇匀，为贮备液。精密量取0.5ml，1ml贮备液，移入5ml容量瓶，以流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

(2)样品溶液的制备：精密称取提取物适量，置于烧杯中，加乙醇超声使溶解，溶液精密转移至分液漏斗中，以水饱和乙酸乙酯萃取，共两次，分取乙酸乙酯层置蒸发皿中，水浴蒸干，残留物用少量甲醇溶解并转移至容量瓶中，以流动相稀释并定容至刻度，摇匀，备用。

(3)精密量取对照与供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪中，用两点法对数方程计算出供试品中总内酯的含量。

本发明提供了测定银杏叶提取物中总黄酮醇苷的方法，具体步骤如下：

(1)对照品溶液的制备：精密称取槲皮素适量，用甲醇溶解后定容到容量瓶中，作为对照品溶液。

(2)精密称取干燥的银杏叶标准提取物适量，置圆底磨口烧瓶中，用甲醇溶解，再加入25％盐酸，混匀，置沸水浴上回流水解1小时，放冷至室温，定量转移至容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

(3)分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，在上述色谱条件下注入液相色谱仪，测定，以下式计算总黄酮醇苷的含量。

总黄酮醇苷(mg)＝(Q×2.51+K×2.64×1.05+I×2.39×0.95)×R×稀释倍数/1000

Q＝槲皮素峰面积

K＝山奈素峰面积

I＝异鼠李素峰面积

本发明提供了测定银杏叶提取物中银杏酸的方法，具体步骤如下：

(1)对照品溶液的配制  精密称取银杏酸对照品适量以甲醇定容到适宜浓度浓度，作为对照品溶液。

(2)样品溶液的配制  精密称取提取物适量，置具塞试管中，加入无水乙醇，超声使溶解，冷却至室温后，加入适量正己烷和饱和硫酸钠(以硫酸调节pH值至3)及适量硅藻土。振荡，静置，待分层后，精密吸取上层有机相于另一试管中，在氮气的保护下除去萃取液，残渣溶于甲醇中，作为供试品溶液。

(3)采用液相色谱仪进行测定，记录色谱图，计算总银杏酸的含量不得过百万分之五。

药理药效学实验

1银杏叶提取物抗心肌缺氧的实验研究

对小鼠关闭气管心电消失时间的影响

取60只经检测合格的小鼠，随机分为六组，每组10只，1.5％浓度戊巴比妥钠腹腔注射30mg/kg麻醉，仰位固定于小鼠解剖台上，颈部剪毛、手术分离气管，用心电图电极插入小鼠四肢，采集标II导联心电图，小鼠尾静脉注射给药，第一组注射等容积生理盐水，第二组尾静脉注射金钠多注射液17.5mg/kg，第三～五组分别经小鼠尾静脉注射银杏叶20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg，第六组灌胃银杏叶提取物10mg/kg，注射药物后30分钟关闭小鼠气管(小动脉夹夹住小鼠气管)，记录每组每只小鼠关闭气管至小鼠心电消失的时间，试验资料显著性测定用组间t检验处理，结果表明银杏叶提取物对小鼠夹闭气管后，心电图消失时间与生理盐水组比较具明显差异，可以明显延长心电消失时间P＜0.05。金钠多注射液同样具有延长心电消失时间P＜0.05。同等剂量的银杏叶提取物组比较，差异不显著。灌胃银杏叶提取物10mg/kg组小鼠与生理盐水组比较，差异不显著。

2银杏叶提取物对缺血心肌的保护作用

银杏叶提取物对垂体后叶素诱发大鼠心肌缺血ECG的影响

取Wistar大鼠60只，雌雄各半，体重250-300g，平均体重271.3±18.0g，随机分为六组，每组10只。第一组大鼠由尾静脉注射等容积生理盐水；第二组大鼠注射金钠多注射液8.5mg/kg；第三～五组大鼠由尾静脉注射银杏叶提取物10mg/kg、5mg/kg和2.5mg/kg，第六组大鼠灌胃银杏叶提取物5mg/kg，连续注射2天，末次给药后30分钟，分别由尾静脉注射脑垂体后叶素0.6μ/kg，记录V₃，标II导联心电图在注垂体后叶素的第15、30、45秒，1、1.5、2、5分钟心电图变化，分析ST，T波变化，所得试验资料用t检验，比较给药组与生理盐水组的差异，结果表明大鼠静脉注射垂体后叶素后，ST段、T波有明显增高，而给予银杏叶提取物后，抬高的ST段有明显恢复，T波呈下降式恢复，在注射垂体后叶素2分钟后，ST段、T波基本趋于正常，给药组和对照组比较，无明显差异。

3银杏叶提取物对急性心肌梗塞大鼠心肌梗塞面积的影响

Wistar大鼠，雌雄各半，体重240-290g，随机分为七组，每组10只，在手术后随时去除冠脉分布异常和在结扎前出现病理性Q波者以及24小时内死亡鼠，最后保证有70只大鼠供试验用。

试验时分别由尾静注射生理盐水或银杏叶提取物，连续给药两天，末次给药后30分钟，腹腔注射1.5％戊巴比妥钠30mg/kg，仰位固定于手术台上，取正中切口，切开皮肤，沿胸骨正中向左，纯性分离肌肉，暴露第3、4肋骨，贴胸骨左缘切断，以小型开胸器扩开切口使心脏暴露良好，以眼科镊轻轻提起心包，小心剪开，用止血钳提起左心耳，用眼科缝针于冠脉前降支距冠脉出口下方3.0mm处和5mm处，双重结扎冠脉前降支，然后迅速将心脏送回胸腔，缝合关胸，断头处死大鼠，取血，测其血清中FFA、CPK含量，见表6。摘取心脏，在生理盐水液中洗静余血，沿冠状沟剪去心房及大血管，在扭力天平上称心室重量，然后将心室切成4-5片，置N-BT(硝基四氮唑蓝染色液中37℃恒温条件下染色15分钟(正常心肌染成暗蓝色，梗塞心肌不着色)，用剪刀或手术刀剪去着色部分，剩下为梗塞心肌，计算梗塞区占心脏面积的百分率。将给药组与生理盐水组进行比较，用统计学计算差异的显著性。结果表明银杏叶制剂可保护受损心肌，无论是心肌梗塞重量或是心肌梗塞面积，与生理盐水组比较均有显著性差异P＜0.01。

4银杏叶提取物对血小板聚集和体内血栓的影响

银杏叶提取物对兔血小板聚集的影响

取禁食12小时的家兔，用戊巴比妥钠30mg/kg耳静脉注射麻醉，手术分离颈总动脉，剪口插入聚乙烯管放血到事先装有3.8％枸橼酸钠溶液硅化试管中，血与抗凝剂的比例为9∶1，将血液与抗凝剂轻轻混匀，1000rpm离心4分钟，吸取上层米黄色的液体，得到富血小板血浆(PRP)，将剩余的血液再离心3000rpm10分钟，吸取上清液，得到贫血小板血浆(PPP)。

接通血小板聚集仪和记录仪电源，使之予热30分钟，同时调节聚集仪恒温旋钮，使之恒温在37±0.5℃，先将PPP予温3-5分钟，观察指针在70-90之间，不得超过100Abs，按下“E”键，“Z”键灯亮，取出PPP管，将PRP管置于测试孔中，加入搅拌棒，按下“STIRRER”键，听到沙沙搅拌声后，按下“E”键，机器开始打印实验报告图，打印完毕后，先加入银杏叶提取物20μg、10μg、5μg和金钠多注射液10μg，1分钟后加入ADP液200μl(20μg)，按下“START”键，5分钟后即打印出实验曲线及数据。

各组试验结束后，根据数据中A(max)最大聚集率，计算出抑制百分率(％)，给药组与生理盐水组比较并进行t检验。结果见下表

表银杏叶提取物对兔血板聚集的影响

注：样本数n＝10

^**与生理盐水对照组比较P＜0.01

^***与生理盐水对照组比较P＜0.001

由上表试验数据表明，银杏叶提取物对兔血小板聚集有非常明显的抑制作用P＜0.001。

本发明提出了银杏叶提取物冻干粉针的制备方法，包括以下步骤：

配液：准确称取处方量的山梨醇加5％的乙醇4500ml，搅拌使完全溶解，加入处方量的银杏叶提取物，搅拌使完全溶解，以20％NaOH适量，调pH约为5.5，最后补加5％的乙醇溶液至规定体积，搅拌使混合均匀。

过滤：分别经0.45μm和0.2μm微孔滤膜加压滤过。

灌装：将滤过的药液按每支5.1-5.2ml无菌灌装于已处理过的安瓿瓶中。

本发明银杏叶提取物注射液的制备方法，包括以下步骤：

配液：准确称取处方量的甘露醇加5％的乙醇适量，搅拌使完全溶解，加入处方量的银杏叶提取物，搅拌使完全溶解，再加入处方量的十二水磷酸氢二钠，以20％NaOH适量，调pH约为6.0，最后补加5％的乙醇溶液至规定体积，搅拌使混合均匀。

过滤：分别经0.45μm和0.2μm微孔滤膜加压滤过。

灌装：将滤过后的药液按每支3.1ml灌装于已经处理过的西林瓶中。

冻干：本品的上述溶液我们通过测定其的共熔点温度为-23℃。所以我们在低于共熔点温度-30℃预冻5小时，可以将本品充分冷冻完全。在放置真空冻干机中，冻干机真空度控制约为0.1～0.3毫巴，冷凝器温度为-40℃。隔板温度为-30℃保持5小时后升温至-10℃保持15小时，再将温度升至30℃保持8小时。压盖出箱。

本发明提出的银杏叶提取物注射液和粉针剂的制备方法，银杏叶提取物的提取工艺路线更合理，提取、除杂、纯化、萃取、分离与精制过程符合大生产要求；生产成本低；有效成分提取率高(该生产工艺得到的银杏叶提取物总黄酮苷＞64％，萜内酯＞11％，原花青素≥7％，银杏酸类成分＜5ppm，达到中药注射用原料的要求)；具备工业化生产的条件。本发明的银杏叶提取物注射液和粉针剂的制备方法，经稳定性试验研究表明，制备工艺稳定可行，增加了剂型，满足了临床需要。安全性试验表明本发明的银杏叶提取物注射液和粉针剂均无过敏反应和溶血作用，静脉注射对血管无刺激性。在心血管疾病领域具有广泛的作用。

本发明也做了大量对比实验，证明以现有文献记载的制备方法得到的银杏叶提取物中总有效成分均低于80％，对原花青素的含量没有明确记载，如果达到了过敏物质银杏酸类成分＜5ppm，则产物中的铅离子即超标，根本无法用于注射用制剂的成分；而本发明采用筛选过的浓度的乙醇提取，系列除杂，以及上大孔吸附树脂的精制，和陶瓷膜过滤，得到的提取物中总黄酮苷＞64％，萜内酯＞11％，原花青素≥7％，银杏酸类成分＜5ppm，完全达到中药注射用原料的要求。

具体实施方式

实施例1：银杏叶提取物的制备

将试验量的干燥银杏叶粉碎过40目筛子，得到药材粗粉，加入8倍量的60％乙醇，加热回流1.5hr，滤出提取液，加入相同体积的60％乙醇进行第2次提取，合并2次提取液过滤，减压回收挥去溶媒，至浓缩液体积为总体积的1/10(即固体物含量为20～30％的浓缩液)，加入相同体积的去离子水，阴凉环境中放置12hr，充分析出不溶物，过滤或离心除去沉淀；在充分搅拌的条件下往滤液或上清液中加入浓氨水，调节PH至9，阴凉环境中放置1hr，过滤或离心除去沉淀；往滤液或上清液中加入硫酸调节PH至3(该PH值加入氨水前提取液的PH值)，V/3体积的正己烷萃取，萃取3次；水相挥去溶媒即得银杏叶粗提物。D101型大孔吸附树脂上样，1.5kg(银杏叶药材)/kg(树脂)；上样后先以2倍柱床体积的去离子水洗脱，弃水洗液；再以3倍柱床体积的70％乙醇洗脱，收集醇洗脱液，减压挥去溶媒，再经过陶瓷膜超滤，截留分子量为1-3万，得到银杏叶提取物。

实施例2：银杏叶提取物注射液的制备

称取200g山梨醇加5％的乙醇4500ml，搅拌使完全溶解，加入10g银杏叶提取物，搅拌使完全溶解，以20％NaOH适量，调pH约为5.5，最后补加5％的乙醇溶液至规定体积，搅拌使混合均匀。

过滤：分别经0.45μm和0.2μm微孔滤膜加压滤过。

灌装：将滤过药液按每支5.1-5.2ml无菌灌装于已经处理过的安剖瓶中。

实施例3：银杏叶提取物粉针剂的制备

称取150g甘露醇加5％的乙醇适量，搅拌使完全溶解，加入10g银杏叶提取物，搅拌使完全溶解，再加入26g十二水磷酸氢二钠，以20％NaOH适量，调pH约为6.0，最后补加5％的乙醇溶液至规定体积，搅拌使混合均匀。

过滤：分别经0.45μm和0.2μm微孔滤膜加压滤过。

灌装：将滤过后的药液按每支3.1ml灌装于已经处理过的西林瓶中。

冻干：本品的上述溶液共熔点温度为-23℃。在低于共熔点温度-30℃预冻5小时，可以将本品充分冷冻完全。在放置真空冻干机中，冻干机真空度控制约为0.1～0.3毫巴，冷凝器温度为-40℃。隔板温度为-30℃保持5小时后升温至-10℃保持15小时，再将温度升至30℃保持8小时。压盖出箱。

实施例4：银杏叶提取物注射液处方

银杏叶提取物     8.0-12.0g

山梨醇           300-500g

5％乙醇          加至5000ml

                                 

                 共制1000支

(1)称取处方量的山梨醇加5％的乙醇4500ml，搅拌使完全溶解，加入处方量的银杏叶提取物，搅拌使完全溶解，以20％NaOH适量，调pH约为5.0-6.0，最后补加5％的乙醇溶液至规定体积，搅拌使混合均匀。

(2)过滤：分别经0.45μm和0.2μm微孔滤膜加压滤过。

(3)灌装：将滤过后的药液按每支5.1-5.2ml无菌灌装于已经处理过的安剖瓶中。

实施例5：银杏叶提取物注射粉针剂处方：

银杏叶提取物         8.0-12.0g

甘露醇               120-180g

十二水磷酸氢二钠     20-30g

5％乙醇              加至3000ml

                                       

                     共制1000瓶

(1)称取处方量的甘露醇加5％的乙醇适量，搅拌使完全溶解，加入处方量的银杏叶提取物，搅拌使完全溶解，再加入处方量的十二水磷酸氢二钠，以20％NaOH适量，调pH约为5.5-7.0，最后补加5％的乙醇溶液至规定体积，搅拌使混合均匀。

(2)过滤：分别经0.45μm和0.2μm微孔滤膜加压滤过。

(3)灌装：将滤过后的药液按每支3.1ml灌装于已经处理过的西林瓶中。

(4)冻干：在低于共熔点温度预冻一定时间，将本品充分冷冻完全。在放置真空冻干机中，冻干机真空度控制约为0.1～0.5毫巴，冷凝器温度为-30--50℃。隔板温度为-20--30℃保持4-6小时后升温至-5--10℃保持12-18小时，再将温度升至25-30℃保持8小时，压盖出箱。

Claims (10)

1. 一种银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，通过以下步骤制备：

(1)干燥银杏叶加入4-10倍量的50％-75％浓度的乙醇回流提取至少1次，将提取液合并过滤，减压回收除去乙醇得到浓缩液；

(2)向浓缩液中加入等体积的水，放置，过滤或离心除去沉淀；

(3)滤液或上清液调节pH至8-10，放置使沉淀完全，过滤或离心除去沉淀；

(4)在滤液或上清液中加酸调节pH至2.5-4.0，再加入正己烷萃取；

(5)萃取后的水液过大孔吸附树脂柱，先以去离子水洗脱，弃水洗液；再以60％-70％乙醇洗脱，收集醇洗脱液，减压挥去醇性溶媒，得到含醇5％-10％的溶液；

(6)经步骤(5)得到的溶液经过膜超滤，截留分子量为0.7-5万，超滤液经减压浓缩。

2. 如权利要求1所述的银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的水醇混和液为60％浓度的乙醇；步骤(2)中的水为去离子水；步骤(3)中用浓安水调pH值为9；步骤(4)中所述的酸为盐酸，pH值为3；步骤(5)中所述的洗脱用的乙醇浓度为70％。

3. 如权利要求1所述的银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述的超滤为陶瓷膜超滤，截留分子量为1-3万。

4. 如权利要求1所述的银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，通过以下步骤制备：

(1)取干燥银杏叶20-40目粗粉，加入4-10倍量的60％的乙醇回流提取2-4次，将提取液合并过滤，减压回收至总体积的1/10；

(2)浓缩液中加入相同体积的去离子水，阴凉环境中放置12hr，过滤或离心除去；

(3)充分搅拌，往(2)中得到的滤液或上清液中加入浓氨水，调节pH至8-10，放置1hr，过滤或离心除去沉淀杂质；

(4)向(3)中的滤液或上清液中加入盐酸调节pH至2.5-4.0，加正己烷萃取2-3次；

(5)经步骤(4)萃取后的水液过大孔吸附树脂柱，先以2倍柱床体积的去离子水洗脱，弃水洗液；再以3倍柱床体积的60％-70％乙醇洗脱，收集醇洗脱液，减压挥去醇性溶媒，得到含醇5％-10％的溶液；

(6)经步骤(5)得到的溶液用陶瓷膜超滤，截留分子量为1-3万，超滤液经减压浓缩，浓缩液喷雾干燥后即得到银杏叶提取物。

5. 一种银杏叶提取物，其特征在于，该银杏叶提取物采用权利要求1所述的方法制得，其中银杏叶有效成分的总重量含量为80％以上，该提取物至少包括总黄酮、萜内酯和原花青素。

6. 如权利要求5所述的银杏叶提取物，其特征在于，所述的总黄酮的含量为64％以上，萜内酯的含量为11％以上，原花青素的含量为7％。

7. 如权利要求5所述的银杏叶提取物，其特征在于，所述的银杏叶提取物还包括银杏酸，其重量含量不超过5ppm。

8. 一种含有权利要求5-7任一项所述银杏叶提取物的用于治疗心血管疾病的药物组合物，其中，该组合物的剂型为注射用制剂。

9. 如权利要求8所述的用于治疗心血管疾病的药用组合物，其中，所述的注射用制剂为注射液和冻干粉针剂。

10. 如权利要求8所述的用于治疗心血管疾病的药用组合物，其中，所述的注射用制剂包括1份银杏叶提取物，15-25份山梨醇或者甘露醇。