CN100392076C - 一种超氧化物歧化酶提取修饰方法 - Google Patents

一种超氧化物歧化酶提取修饰方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种超氧化物歧化酶提取修饰方法，其步骤是：取动物血红细胞，离心洗浮、溶血后；再用-15℃至-25℃的乙醇及氯仿沉淀去除血红蛋白，并加热除去热变性蛋白后，再用温度为-10℃至-20℃的丙酮沉淀收集超氧化物歧化酶；然后进行透析、吸附、洗脱、超滤即得超氧化物歧化酶；最后将超氧化物歧化酶用右旋糖苷进行化学修饰。它提取出的超氧化物歧化酶纯度高、活力强；酶活力的稳定性大大增强，可在45℃条件存放5个月酶活力不降低，常温条件下存放4年酶不失活。

Description

一种超氧化物歧化酶提取修饰方法
技术领域
本发明涉及一种超氧化物歧化酶的提取与修饰方法。
背景技术
超氧化物歧化酶(SOD，Superoxide dismutace)属于肽链大分子金属酶，它能专一消除人体内的超氧阴离子O2 -，以解除超氧阴离子氧化体内成分造成对机体的损害。医学研究和临床证明，它具有美容抗衰老，延年益寿的保健作用。并可用于治疗：1、全身红斑痕癔、皮肤炎、硬皮病、类风湿性关节炎，自身免疫性溶血性贫血，血小板减少等自身免疫性疾病；2、治疗心肌缺血与缺血再灌注综合症；3、也可用于断肢再植、整形、美容及肾、肝、心脏等器官的保护和移植等手术过程。但是采用现有方法提取制备的超氧化物歧化酶的活力不稳定，尤其是常温保存时间很短，仅为1个月左右，使含超氧化物歧化酶产品的有效期很短，其储存、运输、销售、使用周期也相应变短，严重阻碍了含超氧化物歧化酶产品的开发、生产与推广。
本发明的目的就是提供一种超氧化物歧化酶提取修饰方法，用该种方法提取修饰的超氧化物歧化酶的活力稳定性明显提高，存活期大大增长，从而有利于含超氧化物歧化酶产品的开发、生产与推广，具有很好的经济效益和社会效益。
发明内容
本发明解决其技术问题，所采用的技术方案为：一种超氧化物歧化酶提取修饰方法，其步骤是：
a、取动物血红细胞，用其2-4倍体积量的0.7-0.9％的生理盐水，离心洗浮2-3次；再将血红细胞用0.5-1.5倍体积的去离子水，在4-8℃温度下溶血18-21小时，得溶血液；
b、往a步的溶血液中加入0.2-0.3倍体积，且温度为-25℃的乙醇及0.12-0.14倍体积的氯仿，产生稳定的沉淀后，取上清液；然后，将上清液加热到60-80℃，静置15-25分钟，除去不溶物，收集上清液，重复2-3次；
c、在b步制得的上清液中，加入3倍体积且温度为-10℃至-20℃的丙酮，得到超氧化物歧化酶沉淀；
d、将c步的超氧化物歧化酶沉淀加去离子水溶解后，动态透析得到透析液，将透析液加到已用pH7.6的2.5mmol/L磷酸缓冲液平衡好的色谱柱上吸附，并用pH7.6的2.5mmol/L磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱，将洗脱液超滤即得超氧化物歧化酶；
e、将d步的超氧化物歧化酶加入去离子水溶解后，将温度降到7℃，再加入右旋糖苷混匀，在5-10℃温度下，静置40-60小时，制得修饰后的超氧化物歧化酶；
f、将e步的超氧化物歧化酶，用75-85％的食用酒精灭菌24-28小时，再冷冻干燥、密封后即制得成品。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：用低温乙醇、氯仿去掉血红细胞中的血红蛋白，再经过热变性处理去掉热变性蛋白，再用低温丙酮得到的超氧化物歧化酶沉淀，最后采用螺旋洗度法得到超氧化物歧化酶，其提取经过低温、高温，溶解、沉淀多种方式组合的去杂、汇聚，提取出的超氧化物歧化酶纯度高、活力强。高纯度高活力的超氧化物歧化酶再经右旋糖苷修饰后，酶中的铜、锌等金属辅基与右旋糖苷结合而不易解离，从而使酶活力的稳定性大大增强；实验证明：用本发明方法提取修饰得到的超氧化物歧化酶可在45℃条件存放5个月酶活力不降低，常温条件下存放4年酶不失活。因此，本发明将大大延长超氧化物歧化酶产品的保质期，必将有力的促进含超氧化物歧化酶的各种医疗与保健产品的开发与应用。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
实施例一
本例的具体实施方式为：一种超氧化物歧化酶提取修饰方法，其步骤是：a、取动物血红细胞，用其3倍体积量的0.8％的生理盐水，离心洗浮3次；再将血红细胞用1倍体积的去离子水，在5℃温度下溶血21小时，得溶血液；b、往a步的溶血液中加入0.25倍体积，且温度为-25℃的乙醇及0.14倍体积的氯仿，产生稳定的沉淀后，取上清液；然后，将上清液加热到72℃，静置21分钟，除去不溶物，收集上清液，重复3次；c、在b步制得的上清液中，加入3倍体积且温度为-20℃的丙酮，得到超氧化物歧化酶沉淀；d、将c步的超氧化物歧化酶沉淀加去离子水溶解后，动态透析得到透析液，将透析液加到已用pH7.6的2.5mmol/L磷酸缓冲液平衡好的色谱柱上吸附，并用pH7.6的2.5mmol/L磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱，将洗脱液超滤即得超氧化物歧化酶；e、将d步的超氧化物歧化酶加入去离子水溶解后，将温度降到7℃，再加入右旋糖苷混匀，在7℃温度下，静置48小时，制得修饰后的超氧化物歧化酶；f、将e步的超氧化物歧化酶，用85％的食用酒精灭菌28小时，再冷冻干燥、密封后即制得成品。
实施例二
本例的具体作法是：a、取动物血红细胞，用其4倍体积量的0.9％的生理盐水，离心洗浮2次；再将血红细胞用0.5倍体积的去离子水，在4℃温度下溶血20小时，得溶血液；b、往a步的溶血液中加入0.20倍体积，且温度为-15℃的乙醇及0.12倍体积的氯仿，产生稳定的沉淀后，取上清液；然后，将上清液加热到60℃，静置15分钟，除去不溶物，收集上清液，重复3次；c、在b步制得的上清液中，加入2倍体积且温度为-10℃的丙酮，得到超氧化物歧化酶沉淀；d、将c步的超氧化物歧化酶沉淀加去离子水溶解后，动态透析得到透析液，将透析液加到已用pH7.6的2.5mmol/L磷酸缓冲液平衡好的色谱柱上吸附，并用pH7.6的2.5mmol/L磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱，将洗脱液超滤即得超氧化物歧化酶；e、将d步的超氧化物歧化酶加入去离子水溶解后，将温度降到4℃，再加入右旋糖苷混匀，在4℃温度下，静置40小时，制得修饰后的超氧化物歧化酶；f、将e步的超氧化物歧化酶，用75％的食用酒精灭菌24小时，再冷冻干燥、密封后即制得成品。
实施例三
本例的具体作法是：a、取动物血红细胞，用其2倍体积量的0.7％的生理盐水，离心洗浮2次；再将血红细胞用1.5倍体积的去离子水，在8℃温度下溶血18小时，得溶血液；b、往a步的溶血液中加入0.30倍体积，且温度为-20℃的乙醇及0.13倍体积的氯仿，产生稳定的沉淀后，取上清液；然后，将上清液加热到80℃，静置25分钟，除去不溶物，收集上清液，重复2次；c、在b步制得的上清液中，加入2.5倍体积且温度为-15℃的丙酮，得到超氧化物歧化酶沉淀；d、将c步的超氧化物歧化酶沉淀加去离子水溶解后，动态透析得到透析液，将透析液加到已用pH7.6的2.5mmol/L磷酸缓冲液平衡好的色谱柱上吸附，并用pH7.6的2.5mmol/L磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱，将洗脱液超滤即得超氧化物歧化酶；e、将d步的超氧化物歧化酶加入去离子水溶解后，将温度降到10℃，再加入右旋糖苷混匀，在10℃温度下，静置60小时，制得修饰后的超氧化物歧化酶；f、将e步的超氧化物歧化酶，用75％的食用酒精灭菌24小时，再冷冻干燥、密封后即制得成品。

Claims (1)

1.一种超氧化物歧化酶提取修饰方法，其步骤是：
a、取动物血红细胞，用其2-4倍体积量的0.7-0.9％的生理盐水，离心洗浮2-3次；再将血红细胞用0.5-1.5倍体积的去离子水，在4-8℃温度下溶血18-21小时，得溶血液；
b、往a步的溶血液中加入0.2-0.3倍体积，且温度为-15℃至-25℃的乙醇及0.12-0.14倍体积的氯仿，产生稳定的沉淀后，取上清液；然后，将上清液加热到60-80℃，静置15-25分钟，除去不溶物，收集上清液，重复2-3次；
c、在b步制得的上清液中，加入2-3倍体积且温度为-10℃至-20℃的丙酮，得到超氧化物歧化酶沉淀；
d、将c步的超氧化物歧化酶沉淀加去离子水溶解后，动态透析得到透析液，将透析液加到已用pH7.6的2.5mmol/L磷酸缓冲液平衡好的色谱柱上吸附，并用pH7.6的2.5mmol/L磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱，将洗脱液超滤即得超氧化物歧化酶；
e、将d步的超氧化物歧化酶加入去离子水溶解后，将温度降到4℃-10℃，再加入右旋糖苷混匀，在4℃-10℃温度下，静置40-60小时，制得修饰后的超氧化物歧化酶；
f、将e步的超氧化物歧化酶，用75-85％的食用酒精灭菌24-28小时，再冷冻干燥、密封后即制得成品。
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猪血超氧化物歧化酶的研究（II） 右旋糖苷对猪血超氧化物歧化酶的共价修饰. 张元亮等.河北大学学报（自然科学版），第1期. 1987
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