CN103397003B - 一种动物血液中超氧化物歧化酶提取技术新工艺 - Google Patents

一种动物血液中超氧化物歧化酶提取技术新工艺 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种动物血液中超氧化物歧化酶提取技术新工艺，其特征在于，所述工艺包括以下步骤，（1）分离血球，（2）除血红蛋白，（3）热变性，上清液加热到65℃，保温10min，然后迅速冷却到室温，3000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清液；（4）沉淀，清液在盐冰浴中冷却，然后在-5℃以下的操作温度下，加入1.5倍量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，即有白色沉淀产生，（5）SOD的纯化，采用热变性—等电点—丙酮分级沉淀合用的方法，首先将SOD粗提液先在55℃下处理15min,然后调节pH值至其等电点3~4,最后加入终体积为1.0%的丙酮,收集沉淀。向沉淀中加入去离子水,溶液即为SOD提纯液；采用DEAE Sepha-dexA-50层析柱进行纯化,纯化产物即为SOD精品液。

Description

一种动物血液中超氧化物歧化酶提取技术新工艺
技术领域
本发明涉及一种超氧化物歧化酶（SOD）的提取工艺，特别是一种动物血球液中提取超氧化物歧化酶（SOD）的新工艺。
背景技术
SOD是一种源于生命体的活性物质，由蛋白质和金属离子组成，机体细胞抵御氧化损伤最重要的关键金属酶，具有抗氧化、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤、抗辐射、提高免疫功能、降低血压血脂、预防和辅助治疗糖尿病、预防前列腺炎、预防慢性病及其并发症、化疗副作用的消除剂、避免手术的二次伤害、防治皮肤病和加快创面愈合等功效。SOD具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、增强人体免疫力等多种功能，现广泛应用于医药、食品、保健品、化妆品等行业，市场前景十分广阔。传统的SOD制备工艺采用丙酮进行沉淀分离，由于丙酮具有毒性，在SOD中会有残留，进入人体后会沉淀积累，对人体损伤较大，因此研究配置一种无毒害作用的有机溶剂对SOD粗酶液进行沉淀从而将SOD分离成为亟待解决的技术。
发明内容
本发明的内容在于克服常规方法提取SOD在工业化生产中工艺复杂、生产设备多、成本高昂的不足，提出一种工艺简捷、成本低廉、操作方便，适合工业化生产的新工艺。
1、为了实现上述目的，本发明的技术方案如下，一种动物血液中超氧化物歧化酶提取技术新工艺，其特征在于，所述工艺包括以下步骤，（1）分离血球,取新鲜动物血，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜动物血与抗凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min离心20min，收集红血球；（2）除血红蛋白, 红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4 000r/min离心20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入1～1.1倍体积去离子水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后 4 000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取清液，过滤，收集滤液；（3）热变性, 上清液加热到65℃，保温10min，然后迅速冷却到室温，3 000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清液；（4）沉淀, 清液在盐冰浴中冷却，然后在-5℃以下的操作温度下，加入1.5倍量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，即有白色沉淀产生，静置2～3min，迅速抽滤，弃去滤液得肉色沉淀;沉淀物用少量蒸馏水溶解，4 000r/min离心20min，除去不溶物，用pH7.6的 2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液透析，即得粗SOD溶液；（5）SOD的纯化，采用热变性—等电点—丙酮分级沉淀合用的方法，首先将SOD粗提液先在55℃下处理15min,然后调节pH值至其等电点3~4,最后加入终体积为1.0%的丙酮,收集沉淀。向沉淀中加入去离子水,溶液即为SOD提纯液；采用DEAE Sepha-dexA-50层析柱进行纯化,纯化产物即为SOD精品液。
作为本发明的一种改进，：所述步骤（1）进行抗凝处理时，所使用的柠檬酸钠，添加量为2.0—3.0g/Kg动物血，搅拌溶血时间20-30min。
相对于现有技术，本发明的优点如下，（1）该方法简单、易于操作，降低了生产成本；（2）采用热变性去除血红蛋白，溶血过程能在常温下进行，使操作更简便，降低能耗；（3）在以往的SOD提取中，往往通过添加大量金属盐来保持SOD的活性，但是很容易造成金属离子超标，且得的SOD不纯净；本工艺不添加过渡金属盐，既控制了金属盐离子的超标，又节约了大量的成本；（4）采用热变性—等电点—丙酮分级沉淀合用的方法，既能有效的对SOD进行一定程度的纯化，又极大的压缩了浓缩液的体积，使得丙酮的用量大幅度的减少，操作起来方便快捷，适合大规模工业化生产。
具体实施方式
 为了加深对本发明的理解和认识，下面结合具体实施方式对本发明作出详细的说明和介绍。
2、实施例1：一种动物血液中超氧化物歧化酶提取技术新工艺，其特征在于，所述工艺包括以下步骤，（1）分离血球,取新鲜动物血，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜动物血与抗凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min离心20min，收集红血球；（2）除血红蛋白, 红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4 000r/min离心20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入1～1.1倍体积去离子水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后 4 000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取清液，过滤，收集滤液；（3）热变性, 上清液加热到65℃，保温10min，然后迅速冷却到室温，3 000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清液；（4）沉淀, 清液在盐冰浴中冷却，然后在-5℃以下的操作温度下，加入1.5倍量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，即有白色沉淀产生，静置2～3min，迅速抽滤，弃去滤液得肉色沉淀;沉淀物用少量蒸馏水溶解，4 000r/min离心20min，除去不溶物，用pH7.6的 2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液透析，即得粗SOD溶液；（5）SOD的纯化，采用热变性—等电点—丙酮分级沉淀合用的方法，首先将SOD粗提液先在55℃下处理15min,然后调节pH值至其等电点3~4,最后加入终体积为1.0%的丙酮,收集沉淀。向沉淀中加入去离子水,溶液即为SOD提纯液；采用DEAE Sepha-dexA-50层析柱进行纯化,纯化产物即为SOD精品液。
实施例2：作为本发明的一种改进，：所述步骤（1）进行抗凝处理时，所使用的柠檬酸钠，添加量为2.0—3.0g/Kg动物血，搅拌溶血时间20-30min。其余步骤与实施例1完全相同。
需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例并没有用来限定本发明的保护范围，在上述技术方案的基础上所作出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (1)

1.一种动物血液中超氧化物歧化酶提取技术新工艺，其特征在于，所述工艺包括以下步骤，
（1）分离血球，取新鲜动物血，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜动物血与抗凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min离心20min，收集红血球； （2）除血红蛋白 红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4 000r/min离心20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入1～1.1倍体积去离子水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后 4 000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取清液，过滤，收集滤液； （3）热变性 上清液加热到65℃，保温10min，然后迅速冷却到室温，3 000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清液； （4）沉淀 清液在盐冰浴中冷却，然后在-5℃以下的操作温度下，加入1.5倍量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，即有白色沉淀产生，静置2～3min，迅速抽滤，弃去滤液得肉色沉淀;沉淀物用少量蒸馏水溶解，4 000r/min离心20min，除去不溶物，用pH7.6的 2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液透析，即得粗SOD溶液；
（5）SOD的纯化，采用热变性—等电点—丙酮分级沉淀合用的方法，首先将SOD粗提液先在55℃下处理15min,然后调节pH值至其等电点3~4,最后加入终体积为1.0%的丙酮,收集沉淀；向沉淀中加入去离子水,溶液即为SOD提纯液；采用DEAE Sepha-dexA-50层析柱进行纯化,纯化产物即为SOD精品液。
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