RU2354696C1 - Способ получения карбоксипептидазы b из поджелудочной железы свиньи - Google Patents
Способ получения карбоксипептидазы b из поджелудочной железы свиньи Download PDFInfo
- Publication number
- RU2354696C1 RU2354696C1 RU2007129960/13A RU2007129960A RU2354696C1 RU 2354696 C1 RU2354696 C1 RU 2354696C1 RU 2007129960/13 A RU2007129960/13 A RU 2007129960/13A RU 2007129960 A RU2007129960 A RU 2007129960A RU 2354696 C1 RU2354696 C1 RU 2354696C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- carboxypeptidase
- chromatography
- tris hcl
- protein
- extraction
- Prior art date
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в биотехнологии при получении генно-инженерных продуктов. Для выделения карбоксипептидазы В из поджелудочной железы свиньи экстракцию, осаждение сульфатом аммония и очистку проводят в буферных растворах, содержащих 0,001-0,005 М хлорида цинка. При этом очистку проводят двукратной хроматографией на Q-сефарозе, а в процессе хроматографии используют элюцию 0,07-0,08 М NaCl в 0,005 М трис HCl буфере, рН 7,6. Изобретение обеспечивает упрощение способа получения карбоксипептидазы В при сохранении высокой удельной активности конечного препарата и стабильности карбоксипептидазы В.
Description
Изобретение относится к биохимии, точнее к способу получения карбоксипептидазы В (кВ) из поджелудочной железы свиньи, и может быть использовано в биотехнологии при получении генно-инженерного инсулина, а также в научных исследованиях при сиквенировании белков и синтезе пептидов.
Известен способ получения кВ из поджелудочной железы свиньи, включающий механическую гомогенизацию исходного сырья, автолиз, получение ацетонового порошка из автолизата, экстракцию, осаждение сульфатом аммония и последующую очистку целевого продукта двумя последовательными хроматографиями на ДЕАЕ-целлюлозе (А.с. №1551742 МКИ C12N 9/48, 1987).
Недостатком способа является использование на первом этапе органических растворителей (ацетон, диэтиловый эфир) и относительно низкая удельная активность конечного препарата (107-155 ед/мг белка).
Известен способ получения кВ из поджелудочной железы млекопитающих, предлагающий механическую гомогенизацию исходного сырья, автолиз, экстракцию при 50-75°С и дробное осаждение сульфатом аммония 320-416 г/л и диализ (патент RU №1487817, МКИ C12N 9/48, 1989).
Недостатком способа является недостаточно высокий выход конечного препарата.
Известен способ получения кВ из поджелудочной железы северных оленей (патент SU №1833427, МКИ C12N 9/64, 1991), включающий гомогенизацию, экстракцию, двухступенчатое подкисление до рН 5,2-5,5, затем до рН 3,8-4,2, осаждение ацетоном, повторное осаждение этанолом, лиофилизацию.
Недостатком способа является сложность получения исходного сырья.
Известен способ получения кВ из поджелудочной железы свиньи (патент RU №2177997, МПК C12N 9/14, 2002), включающий механическую гомогенизацию исходного сырья, автолиз, экстракцию при 60°С, двухступенчатое осаждение сульфатом аммония, повторную термообработку, хроматографию на оксиапатите, повторное осаждение сульфатом аммония, диализ, хроматографию на ДЕАЕ-сефарозе.
Недостатком способа является многоступенчатость (10 стадий) и длительность процесса.
Задача изобретения - упрощение способа получения карбоксипептидазы В при сохранении удельной активности конечного препарата на уровне от 200 ед/мг белка и выхода не менее 40%.
Поставленная задача решается за счет того, что в способе получения карбоксипептидазы В из свиной поджелудочной железы, включающем гомогенизацию, автолиз, экстракцию исходного сырья, осаждение сульфатом аммония, диализ и очистку целевого продукта двукратной хроматографией на Q-сефарозе, все этапы очистки проводят в буферных растворах, содержащих 0,001-0,005 М хлорида цинка, при этом экстракцию проводят при 65°С в течение 15 минут, а в процессе хроматографии используют ступенчатую элюцию 0,07-0,08 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6 буфере.
Отличием предлагаемого способа является, во-первых, применение экстракции при 65°С в течение 15 минут, позволяющей освободиться от значительного количества термолабильных белков и липидов; во-вторых, использование в процессе хроматографии на Q-сефарозе ступенчатой элюции 0,07-0,08 М хлорида натрия в 0,005 М трис HCl рН 7,6, позволяющей получать белковые пики с высокой концентрацией и, соответственно, высокой удельной активностью при минимальных трудозатратах; в-третьих, использование в качестве стабилизатора активности карбоксипептидазы В хлорида цинка, который добавляют в рабочий буфер до концентрации 0,001-0,005 М на всех этапах процесса.
Пример 1.
1. Гомогенизация и автолиз.
Одну железу (~0,3 кг) дважды гомогенизируют в бытовой мясорубке, помещают в пластиковую емкость и инкубируют в течение ночи на шейкере при комнатной температуре.
2. Экстракция.
К полученному автолизату добавляют 2 объема (600 мл) 0,01 М КН2PO4, рН 6,5, 0,001 М ZnCl2 и экстрагируют в предварительно нагретом до 65°С водном термостате в течение 15 минут при перемешивании механической мешалкой. Полученный экстракт охлаждают в ванне с проточной холодной водой и центрифугируют при 12000 об/мин, 4°С, 30 минут. Супернатант собирают, осадок отбрасывают.
3. Фракционирование сульфатом аммония.
К полученному супернатанту добавляют сульфат аммония из расчета 350 г на литр экстракта, поддерживая рН 6,5 с помощью сухого карбоната натрия.
Осадок формируют при +4°С в течение ночи. Затем осаждают центрифугированием при 8000 об/мин 30 минут и растворяют в 100 мл 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2.
Полученный осадок диализуют против частых смен 0,005 М трис HCl, рН 7,6 до полного удаления сульфата аммония. Не растворившийся осадок осаждают центрифугированием, супернатант используют для хроматографии.
4. Хроматография на Q-сефарозе.
Супернатант, полученный на предыдущем этапе, наносят на колонку с Q-сефарозой объемом 50 мл, предварительно уравновешенную 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2 со скоростью 100 мл/ч. Колонку промывают последовательно тремя объемами стартового буфера, тремя объемами рабочего буфера с 0,005 М NaCl и элюируют целевой белок раствором 0,08 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2. Собирают белковые фракции с удельной активностью более 100 ед./мг белка, помещают в диализный мешок и диализуют в течение ночи против 2-х смен 10-кратных объемов 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2.
5. Повторная хроматография на Q-сефарозе.
Отдиализованную фракцию целевого фермента наносят на колонку объемом 10 мл, предварительно уравновешенную 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2. Промывают 3 колоночными объемами рабочего буфера, тремя объемами рабочего буфера с 0,005М NaCl. Элюируют целевой белок 0,08 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2. Собирают белковые фракции с удельной активностью более 170 ед./мг. Готовый препарат хранят замороженным при - 20°С.
Выход составляет 143 мг фермента с удельной активностью 235 ед./мг белка.
Пример 2.
1. Гомогенизация и автолиз.
Одну железу (~0,3 кг) дважды гомогенизируют в бытовой мясорубке, помещают в пластиковую емкость и инкубируют в течение ночи на шейкере при комнатной температуре.
2. Экстракция.
К полученному автолизату добавляют 2 объема (600 мл) 0,01 М КН2PO4, рН 6,5, 0,001 М ZnCl2 и экстрагируют в предварительно нагретом до 65°С водном термостате в течение 15 минут при перемешивании механической мешалкой. Полученный экстракт охлаждают в ванне с проточной холодной водой и центрифугируют при 12000 об/мин, 4°С, 30 минут. Супернатант собирают, осадок отбрасывают.
3. Фракционирование сульфатом аммония.
К полученному супернатанту добавляют сульфат аммония из расчета 350 г на литр экстракта, поддерживая рН 6,5 с помощью сухого карбоната натрия.
Осадок формируют при +4°С в течение ночи. Затем осаждают центрифугированием при 8000 об/мин 30 минут и растворяют в 100 мл 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2. Полученный осадок диализуют против частых смен 0,005 М трис HCl, рН 7,6 до полного удаления сульфата аммония. Нерастворившийся осадок осаждают центрифугированием, супернатант используют для хроматографии.
4. Хроматография на Q-сефарозе.
Супернатант, полученный на предыдущем этапе, наносят на колонку с Q-сефарозой объемом 50 мл, предварительно уравновешенную 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2 со скоростью 100 мл/ч. Колонку последовательно промывают тремя объемами стартового буфера, тремя объемами рабочего буфера с 0,005 М NaCl и элюируют целевой белок 0,08 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2. Собирают белковые фракции с удельной активностью более 100 ед./мг белка, помещают в диализный мешок и диализуют в течение ночи против двух смен 10-кратных объемов 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2.
5. Повторная хроматография на Q-сефарозе.
Отдиализованную фракцию целевого фермента наносят на колонку объемом 10 мл, предварительно уравновешенную 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2. Промывают тремя колоночными объемами рабочего буфера, тремя объемами рабочего буфера с 0,005М NaCl. Элюируют целевой белок 0,07 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2. Собирают белковые фракции с удельной активностью более 170 ед./мг. Готовый препарат хранят замороженным на - 20°С.
Выход составляет 133 мг фермента с удельной активностью 245 ед./мг белка.
Пример 3.
1. Гомогенизация и автолиз.
Одну железу (~0,3 кг) дважды гомогенизируют в бытовой мясорубке, помещают в пластиковую емкость и инкубируют в течение ночи на шейкере при комнатной температуре.
2. Экстракция.
К полученному автолизату добавляют 2 объема (600 мл) 0,01 М КН2PO4, рН 6,5, 0,001 М ZnCl2 и экстрагируют в предварительно нагретом до 65°С водном термостате в течение 15 минут при перемешивании механической мешалкой. Полученный экстракт охлаждают в ванне с проточной холодной водой и центрифугируют при 12000 об/мин, 4°С, 30 минут. Супернатант собирают, осадок отбрасывают.
3. Фракционирование сульфатом аммония.
К полученному супернатанту добавляют сульфат аммония из расчета 350 г на литр экстракта, поддерживая рН 6,5 с помощью сухого карбоната натрия.
Осадок формируют при +4°С в течение ночи. Затем осаждают центрифугированием при 8000 об/мин 30 минут и растворяют в 100 мл 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2. Полученный осадок диализуют против частых смен 0,005 М трис HCl, рН 7,6 до полного удаления сульфата аммония. Не растворившийся осадок осаждают центрифугированием, супернатант используют для хроматографии.
4. Хроматография на Q-сефарозе.
Супернатант, полученный на предыдущем этапе, наносят на колонку с Q-сефарозой объемом 50 мл, предварительно уравновешенную 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2 со скоростью 100 мл/ч. Колонку последовательно промывают тремя объемами стартового буфера, тремя объемами рабочего буфера с 0,005 М NaCl и элюируют целевой белок 0,07 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2. Собирают белковые фракции с удельной активностью более 100 ед./мг белка, помещают в диализный мешок и диализуют в течение ночи против 2-х смен 10-кратных объемов 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2.
5. Повторная хроматография на Q-сефарозе.
Отдиализованную фракцию целевого фермента наносят на колонку объемом 10 мл, предварительно уравновешенную 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2.
Промывают 3-колоночными объемами рабочего буфера, тремя объемами рабочего буфера с 0,005М NaCl. Элюируют целевой белок 0,07 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2. Собирают белковые фракции с удельной активностью более 170 ед./мг белка. Готовый препарат хранят замороженным при - 20°С.
Выход составляет 123 мг фермента с удельной активностью 250 ед./мг белка.
Пример 4.
Все делают как в примере 3, но хлорид цинка добавляют до концентрации 0,005 М.
Выход целевого белка составляет 120 мг с удельной активностью 242 ед./мг белка.
Пример 5.
Все делают как в примере 3, но хлорид цинка не добавляют.
Выход целевого белка составляет 123 мг с удельной активностью 193 ед./мг белка.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать 410-476 мг препарата карбоксипептидазы В с удельной активностью 235-250 ед/мг (в прототипе 220 ед./мг) или 111860-102500 единиц с 1 кг исходного сырья при сокращении числа стадий очистки до 7 по сравнению с 10 в прототипе. Это достигается за счет применения ступенчатой элюции в процессе хроматографии на Q-сефарозе и использования 0,001-0,005 М хлорида цинка в качестве стабилизатора.
Claims (1)
- Способ получения карбоксипептидазы В из поджелудочной железы свиньи, включающий гомогенизацию животного сырья, автолиз и экстракцию в присутствии буферного раствора, осаждение сульфатом аммония и последующую очистку целевого продукта двукратной хроматографией, отличающийся тем, что экстракцию, осаждение и очистку проводят в буферных растворах, содержащих 0,001-0,005 М хлорида цинка, при этом экстракцию проводят при 65°С, а очистку проводят хроматографией в два этапа на Q-сефарозе, применяя элюцию 0,07-0,08 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6 буфере.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2007129960/13A RU2354696C1 (ru) | 2007-08-07 | 2007-08-07 | Способ получения карбоксипептидазы b из поджелудочной железы свиньи |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2007129960/13A RU2354696C1 (ru) | 2007-08-07 | 2007-08-07 | Способ получения карбоксипептидазы b из поджелудочной железы свиньи |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2354696C1 true RU2354696C1 (ru) | 2009-05-10 |
Family
ID=41019964
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2007129960/13A RU2354696C1 (ru) | 2007-08-07 | 2007-08-07 | Способ получения карбоксипептидазы b из поджелудочной железы свиньи |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2354696C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011088383A1 (en) * | 2010-01-14 | 2011-07-21 | Colgate-Palmolive Company | Dentifrice compositions comprising carboxypeptidase |
RU2658757C1 (ru) * | 2017-04-10 | 2018-06-22 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ) | Способ получения карбоксипептидазы В из поджелудочной железы свиньи |
-
2007
- 2007-08-07 RU RU2007129960/13A patent/RU2354696C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
КУПЕНКО О.Г. и др. Карбоксипептидаза гепатопанкреаса камчатского краба-аналог карбоксипептидазы В. Тезисы докладов III симпозиума «Химия протеолитических ферментов». - М., 26-28 апреля 1993, с.46. * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011088383A1 (en) * | 2010-01-14 | 2011-07-21 | Colgate-Palmolive Company | Dentifrice compositions comprising carboxypeptidase |
AU2011205692B2 (en) * | 2010-01-14 | 2013-07-04 | Colgate-Palmolive Company | Dentifrice compositions comprising carboxypeptidase |
RU2658757C1 (ru) * | 2017-04-10 | 2018-06-22 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ) | Способ получения карбоксипептидазы В из поджелудочной железы свиньи |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Lau et al. | Novel angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from an edible mushroom, Pleurotus cystidiosus OK Miller identified by LC-MS/MS | |
CN101182495B (zh) | 以猪小肠为原料联产生产碱性磷酸酶和肝素钠的联产工艺 | |
CN103772734A (zh) | 高纯度胶原蛋白海绵的制备方法 | |
CN103882083B (zh) | 一种抗氧化胶原肽的制备方法 | |
CN104357522B (zh) | 一种利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法 | |
CN105087728A (zh) | 一种金枪鱼鱼骨胶原蛋白源硒螯合胶原肽的制备方法 | |
CN1946290A (zh) | 对镍和铜的亲和力下降了的改良血清白蛋白 | |
RU2354696C1 (ru) | Способ получения карбоксипептидазы b из поджелудочной железы свиньи | |
CN105420325A (zh) | 一种胎盘多肽的制备方法 | |
KR101700927B1 (ko) | 고순도 마린콜라겐의 제조 방법 | |
PL140807B1 (en) | Method of obtaining a protein capable of lovering cholesterol level in blood | |
CN108396047A (zh) | 一种小公鱼免疫调节肽的制备方法 | |
CN107496465A (zh) | 基于球藻提取物的复配物及其制备方法 | |
CN101768582B (zh) | 一种sod修饰生产方法 | |
CN103981245A (zh) | 利用螺旋藻泥制备高活性小肽的方法 | |
JP2011050350A (ja) | エルゴチオネインの製造方法 | |
CN112457377A (zh) | 美洲大蠊多肽及其应用 | |
CN101085814A (zh) | 一种工业化提取纯化兔肝锌金属硫蛋白的方法 | |
CN107011464A (zh) | 一种高效的粗品肝素钠生产工艺 | |
CN108117589B (zh) | 一种低值鱼抗氧化肽的分离纯化方法 | |
US2663668A (en) | Process for producing arginase | |
CN111418700A (zh) | 一种金枪鱼肽、其提取方法及作为降压剂的应用 | |
CN104628889A (zh) | 一种肝素钠的提取方法 | |
EP2511288B1 (en) | Method of obtaining inhibitors of cysteine peptidases with an electrophoretic purity from biological materials | |
CN101704887A (zh) | 基于珠母贝外套膜分泌物的珍珠质基质蛋白及其制备方法 |