CN100374197C - 用于从复杂混合物中选择性吸附的固体组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种当复杂混合物的至少一种化学组分能够被选择性吸附时可用于分离该混合物中的化学组分的固体和方法。本发明固体包含无机物质和位于所述无机物质的至少一个表面上的部分(R10),其中所述无机物质是无机氧化物和表面部分选自CH2OH,-CH(OH)2,-CH(OH)CH3,-CH2CH2OH,-C(OH)2CH3,-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。视需要通过连接剂连接到无机物质上的连接部分也可位于该固体的表面上。
Description
本发明的领域
本发明涉及可用于分离复杂混合物(complex mixture)中的化学组分的固体组合物和方法,在所述混合物中,至少一种化学组分能够被选择性地吸附。本发明还涉及减少该混合物中的其它组分的非特定连接的方法。
本发明的背景
混合物中的组分的分离在许多科学领域,如化学,生物化学和分子生物学中已变得重要。混合物中的组分的分离使得分离出有价值的组分即分析物。在分析物分离之后,分析物的性能可被研究或利用。如果没有分离,可能难以确定分析物的性能,因为无论使用何种测量技术,所述组分的性能可被该混合物中的其它组分所掩盖或受到影响。因此,分离技术可被认为是科学研究的基础。
如果包含分析物的混合物是一种复杂混合物,组分难以分离。复杂混合物的合适例子包括生物发酵介质,细胞培养物,转基因技术制造的乳品,或转基因植物物质的淤浆,其中特定分析物是所需的且需要被分离和纯化。复杂混合物中的组分的分离通常通过亲和性分离技术而实现。亲和性分离技术通常包括,将混合物与具有特定地设计成与分析物结合的官能度,但基本上不与混合物中的其它组分反应的固体相接触,这样留下其它组分以被自由去除。在如通过将固体相用水或缓冲剂洗涤而去除非键接组分之后,分析物被留下键接到固体相上,这样分析物从非键接组分中分离。随后通过将分析物从固体相中分离,通常通过缓冲剂改变而分离分析物,这样将分析物回收成游离分子。
已经开发出多种用于纯化的有价值的″亲和性″技术。这些技术具有许多名称,亲和性色谱,亲和性沉淀,免疫亲和性分离,等,但它们都依赖于相同的原理,即,特定官能度或连接部分被化学连接到固体载体上,而后者非常选择性地结合到目标分析物上。用于蛋白质纯化的最常用连接部分是其它蛋白质如蛋白质A或蛋白质G,或单克隆抗体,螯合的金属离子,多肽,或小有机分子。单克隆抗体可尤其有吸引力地用于蛋白质纯化,因为它们可对于目标蛋白质高度选择。如上所述,可使包含分析物的混合物与结合有连接部分的亲和性固体载体接触。分析物结合到载体上的连接部分上,而混合物中的其余组分被去除。分析物随后通过洗脱从连接部分中去除,这通常通过改变溶剂而实现。可实现非常高的纯化系数。在亲和性技术方面有进一步的文献1-8。
在选择和生产单克隆抗体方面的最新进展已使得基于作为连接部分的单克隆抗体的亲和性技术成为一种非常有力地用于纯化蛋白质和生物药物的技术。单克隆抗体本身是蛋白质,通常使用其中蛋白质A或蛋白质G用作配体的亲和性纯化技术而从细胞培养物或发酵物中纯化。新的小有机蛋白质A拟似物也被描述为可用于单克隆抗体纯化的配体。
尽管亲和性纯化已被证实为一种有力的技术,但其全部潜力还没有被充分利用。最常见的是,载体成型为约0.05-0.5mm左右量级的小珠粒,并将通常被称作介质的这些珠粒装载到色谱柱中。所要纯化的混合物随后经过该柱,然后分析物结合到与介质连接的连接部分上。该柱随后被充分洗涤以去除包合的混合物。洗脱溶剂随后经过该柱以释放溶液中的分析物。在大规模时,该工艺要求介质具有良好的物理强度以经受在柱应用时所遇到的重量和湍流。
无论作为柱色谱或一些其它体系,目前用于亲和性分离的某些载体是低表面积材料,如碳水化合物基材料或聚合物。这些低表面积载体可具有低容量。由于低容量,介质需要相对大的加载量以回收目标物质。但对于介质的大加载量,柱的流速由于压降因素而局限于低速率。柱色谱也可在高压下进行,其中使用较小珠粒以增加介质容量。因为这些珠粒必须具有较高强度以经受压力,碳水化合物凝胶被交联,这样降低所得珠粒的容量。因此,需要提供具有高容量和进一步在用于高压液体色谱时物理性质强健的亲和性载体。
开发高表面积载体是一种得到高容量亲和性分离介质的途经。有了较高容量材料,需要较小量的亲和性载体以回收目标物质,柱压降较低,流速较高,且包合的加料污染物较少。高表面积可以是10-500m2/g。可提供高表面积的材料是硅胶,硅石,矾土,氧化锆,碳水化合物,和聚合物材料如大孔丙烯酸珠粒。在硅胶的情况下,表面积可以从非常低即1m2/g变至非常高即超过800m2/g,同时孔尺寸形态从非常低即低于25埃变至超过1500埃。另外,无机氧化物基材料通常比基于较软的碳水化合物的载体物理性质强健得多。
如果作为介质与所连接的连接部分一起用于亲和性分离技术,这些氧化物基材料尽管具有必需的高表面积,但可遇到非所需材料的高度非选择性连接的问题。不是所有的表面积用于亲和性分离;某些实际上提供用于非选择性吸附的表面区域。众所周知的是,蛋白质例如有时不可逆地和非选择性地非常牢固地结合到硅石上。因此,尽管连接部分可以是非常选择性的,表面的未使用区域是非选择性的。净作用是降低高表面积材料的选择性,从而减小总体工艺的纯化系数。许多氧化物载体、尤其是硅石如硅胶的这种非选择性吸附是这些材料目前没有被广泛用作亲和性分离载体的原因。
本发明的一个目的是描述一种要应用于高表面积材料的表面组合物,所述材料改善了非选择性吸附,同时保持用于选择性的亲和性连接的高容量。
这些组合物在从复杂生物混合物进行″亲和性分离″时具有极大的价值,其中特定生物物质,如蛋白质通过基因工程化有机体而生成。例如该复杂混合物可以是用于目标蛋白质的细胞或细菌生产的发酵培养液。发酵培养液是支持有机体生长的蛋白质、碳水化合物等以及通过发酵而产生的副产物的复杂混合物。目标物质也可发酵制成和通过有机体被制成培养液。在一些情况下,目标物质在细胞中产生。因此回收的复杂之处在于,细胞需要匀化且目标需要溶解。这些混合物对于目标物质分离和纯化是尤其困难的。用于分离和纯化发酵培养液中的目标物质的分离和纯化方案是非常复杂的和昂贵的。分离和纯化的成本在大规模生产时特别显著。由于该问题在性质上具有挑战性,纯化和分离的领域是广泛的。
本发明的综述
本发明固体组合物包含无机物质和位于所述无机物质的至少一个表面上的部分R10,其中所述无机物质是无机氧化物,所述R10基团选自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。
如果R10选自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH),固体载体具有的一个明显特征在于具有降低的对复杂混合物中的任何非分析物组分的非特定连接。R10成分具有一个共同性能,即具有零电荷和亲水性。不局限于任何特殊理论,据信当固体载体具有位于其表面上的任何R10,即-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)时,混合物中的非分析物组分与表面的连接具有低于混合物水相中的剩余非分析物组分的熵变。来自溶液的任何组分,如,非分析物或分析物组分与表面的结合包括熵由于非分析物在表面上的定位化而降低。为了对连接有利,非分析物和表面之间必须存在一种相互作用,如库仑电荷相互作用或憎水相互作用,以克服由于表面定位化而造成的熵下降。但用R10类中的任何一种或任何混合物进行覆盖产生亲水表面以及具有零净电荷的表面,这降低了用于降低熵所需的相互作用,并从而降低了非分析物的非连接。
另外,包含无机物质、位于该无机物质的至少一个表面上的部分R10和至少一个能够连接分析物的连接部分的固体也落入本发明的范围内。该部分R10优选位于一部分无机氧化物的表面上,而连接部分位于剩余的表面上。选择连接部分以提供与特殊分析物的键接和提供用于亲和性分离的高度选择性连接,同时覆盖有R10基团的表面降低了其它物质的非选择性连接。在优选的实施方案中,显著的(如果不是大多数的)无机氧化物表面被R10基团例如以约1-10个基团/nm2基材的浓度覆盖,且其余为连接部分所覆盖。
另外,包含无机物质的固体在本发明的范围内,其中连接部分任选地通过连接剂位于无机氧化物表面上。连接剂可通过使连接剂化合物与无机氧化物反应,并随后使连接剂与连接部分反应而位于无机氧化物表面上。因此,本发明涉及包含连接剂基团和位于其表面上的R10部分的无机物质。该固体又可被转移至最终用户,后者可将特定设计的连接部分连接到连接剂上用于分离。
附图的简要描述
图1示意性描绘了包含无机物质、R10表面部分、任选性的连接剂、连接部分和分析物的本发明的组合物。
图2给出了实施例1和2的结果,其中栏数2和7表示Pharmacia3.6-9.3宽pI标准,栏数3和4表示实施例1,栏数5和6表示实施例2。该图说明未处理的常规无机氧化物的非特定连接。
图3给出了实施例3-5的结果。
图4给出了实施例6-8的结果并用于说明本发明。
图5-8包含为了定性描述本发明的特定实施方案(实施例8)而进行的分析的结果,其中图5给出了实施例8的漫反射IR光谱,图6为了对比给出了在实施例7中制成的组合物的同一光谱,图7给出了实施例8的MAS Si29NMR光谱,图8给出了实施例8的X-射线光电子光谱XPS。
图9给出了实施例7的XPS光谱。
图10给出了在连接上连接部分之后使用本发明在实施例9中制成的柱的加载、洗涤和洗脱时的色谱图。
图11描绘了纯化兔多克隆IgG的尺寸排阻色谱的流出液在280nm处的吸光率,所述IgG得自在实施例9中进行的亲和性色谱的洗脱液。
图12描绘了被加入实施例9的细胞培养液的起始兔多克隆IgG的尺寸排阻色谱流出物在280nm处的吸光率。
图13描绘了覆盖剂的制备,该覆盖剂由图14所示反应得到-CH2OH作为R10。
图14示出了通过不是硅石一部分的硅原子而连接有R10的硅石的制备,其中R10是-CH2OH,这样-Si-CH2OH直接连接到硅石上(HO-Si---表示硅石表面上的硅烷醇基团)。
图15描绘了覆盖剂的制备,该覆盖剂由图16所示反应得到-CH2OH作为R10。
图16示出了通过不是硅石一部分的硅原子而间接连接有R10的硅石的制备,这样-Si-R10基团被连接到硅石表面上,其中R10是-CH(OH)2(HO-Si---表示硅石表面上的硅烷醇基团)。
图17给出了覆盖剂的制备,该覆盖剂由图18所示反应得到羟基乙基作为R10。
图18给出了一种用于制备包含硅石和连接到硅石表面上的-Si-R10基团的固体的方法,即R10通过不是硅石一部分的硅原子间接连接到硅石表面上,其中R10是1,2-二羟基乙基。
图19给出了另一种用于制备包含硅石和连接到硅石表面上的-Si-R10基团的固体的方法,即R10通过不是硅石一部分的硅原子间接连接到硅石表面上,其中R10是1,2-二羟基乙基。
图20给出了本发明的一个实施方案,其中-Si-R10基团在连接到硅石表面上时被交联,其中R10是羟基甲基(HO-Si---表示硅石表面上的硅烷醇基团)。
图21给出了得到在单个点上连接到硅石表面上的-Si-R10基团的覆盖剂的制备,其中R10是羟基甲基,得自图22所示的反应。
图22描绘了本发明的一个实施方案,其中Si-R10基团在单个点上连接到硅石表面上,其中R10是羟基甲基(HO-Si---表示硅石表面上的硅烷醇基团)。
本发明的详细描述
无机物质
适用于本发明的无机物质包括作为色谱介质购得的那些产品。这些物质可使用本领域已知的方法而制成。无机物质也可被认为是一种用于以下将要描述的连接部分的载体,且无机物质有时在本文中称作″载体″。一般来说,本发明的无机物质是一种无机氧化物,更合适地是无机金属氧化物、硅酸盐或硅铝酸盐。无机金属氧化物是优选的。适用于本发明的无机氧化物具有能够键接至其它化学官能度或与其反应的游离羟基基团。正是通过那些羟基基团,R10表面部分和连接部分和/或连接剂进行反应或键接。一般来说,合适的无机氧化物包括具有约1-约10个羟基基团/平方纳米固体无机氧化物的那些。
优选的无机金属氧化物的例子包括硅石如色谱级硅石或硅胶,矾土,硅石-矾土,氧化锆,锆酸盐,受控孔玻璃或二氧化钛。无机金属氧化物优选是硅石,更优选色谱级硅石或硅胶。磁响应无机金属氧化物,如公开于WO 98/31461(其公开内容作为参考并入本发明)的硅氧化物涂覆磁性颗粒也是合适的。也可使用混合无机金属氧化物,如硅石和矾土的共凝胶,或共沉淀物。由硅酸钠制成的固体是合适的硅酸盐的例子,沸石是合适的铝硅酸盐的一个例子。本发明固体的物理形式可以是颗粒、纤维和板。
表面部分(R10)
如上所述,R10基团选自-CH2OH,-CH(OH)2,-CH(OH)CH3,-CH2CH2OH,-C(OH)2CH3,-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。R10优选选自-CH2OH,-CH(OH)CH3,-CH2CH2OH,和-CH(OH)CH2(OH)。更优选,R10选自-CH2OH,-CH(OH)CH3和-CH2CH2OH。最优选R10是-CH2OH。
部分R10位于无机物质的至少一个表面上。″位于″是指R10可直接连接到起始无机物质的表面上的官能团上。R10可位于存在于无机物质外周的表面区域上,或位于存在于孔中的表面区域上,所述孔进入到无机物质的内部和在物质的外周上具有(孔)开口。
R10也可通过二价部分或原子(-X-)连接到无机物质表面上而″位于″无机物质的表面上,这样形成具有式-X-R10的基团。该实施方案中连接R10的二价部分或原子在起始无机物质与反应物反应之前不存在于该物质的组成中。该部分或原子可来自用于产生R10的反应物,如,来自硅烷反应物的残余金属原子(如硅原子)。该残余部分或原子直接连接到所述无机物质上,并优选通过无机物质表面上的羟基基团连接。这些反应物中的-X-基团对于不同的反应物是不同的,但可以是金属原子或其它化学部分。例如,X可衍生自金属原子如硅,铝,锆或类似物。所选的无机物质也可决定对-X-和其相关反应物的选择。一般,包含-X-的任何反应物可与无机物质上的反应性官能度反应。在无机氧化物的情况下,合适的反应物通常是能够与羟基基团反应的那些。
化合物,如,能够产生R10的那些,与无机物质反应的化学过程是本领域已知的,如,Smith,Organic Synthesis,John Wiley&Sons,1994;March,Advanced Organic Chemistry,John Wiley&Sons,第四版,1992;Larock,Comprehensive Organic Transformations,John Wiley&Sons,第二版,1999;Greene等人,Protective Groupsin Organic Chemistry,John Wiley&Sons,第三版,1999;Brook,Silicon in Organic,Organometallic,and Polymer Chemistry,JohnWiley&Sons,2000;Hermanson等人,Immobilized Affinity LigandTechiniques,1992;Weetall,″用于无机载体材料的共价偶联方法″,Methods in Enzymology,vol.XLIV,由K.Mosbach编辑,第134-148页,1976;Abbott,US 4,298,500;和Arkles,US 5,371,262;这些文件的公开内容在此作为参考并入本发明。例如,包含位于无机物质的表面上的R10基团的固体可由带有R10的前体基团的反应物或覆盖剂如烷氧基硅烷、二烷氧基硅烷或三烷氧基硅烷制成。例如,乙酰氧基甲基可以是羟基甲基的前体基团。然后使覆盖剂与无机物质的表面反应,随后前体水解得到连接有R10基团的无机物质。
一种制备具有-CH2OH作为位于硅石表面上的R10的硅石的方法在图13和14中给出。图13描绘了覆盖剂乙酰氧基甲基三乙氧基硅烷(参见化合物(2))的制备,该物质用于将Si-R10基团引入硅石表面上的硅烷醇基团,即HO-Si---,其中R10是羟基甲基(参见在图14中给出的反应,其中化合物(5)是具有直接连接在表面上的Si-R10的硅石,其中R10是羟基甲基)。换句话说,在图14中,给出了一种通过Si原子将R10基团引入至硅石表面的方法,而Si原子是上述残余部分或原子X的一个例子,它是来自反应物的残余物且不是起始无机物质的一部分。
图15和16给出了一种用于制备包含R10的硅石的方法,其中R10是-CH(OH)2。图15描绘了覆盖剂二乙酰氧基甲基三乙氧基硅烷(参见化合物(7))的制备,用于将-CH(OH)2基团作为R10基团引入到硅石的表面(参见在图16中给出的反应和化合物(9))。
图17给出了一种用于制备覆盖剂乙酰氧基乙基三乙氧基硅烷(参见化合物(11))的方法,用于将2-羟基乙基引入到硅石的表面。
图18和19给出了两种用于制备包含硅石和作为R10基团连接到硅石表面上的1,2-二羟基乙基的固体的方法。
另外,在本发明范围内的固体包括具有通过来自硅烷反应物的残余金属(如Si)连接到固体表面上的R10基团的无机物质,其中每个所得Si-R10基团通过三个共价键连接到无机物质上(如参见图14、16、18和19中的反应方案的最终产物,它得自具有三个硅烷醇基团的覆盖剂的反应)。
从图21和22可以看出,另外据信可选择覆盖剂以使得残余原子也可通过一个或两个共价键连接到无机物质上,或某些实施方案包括Si原子的交联。这些交联可以是Si-O-Si键或另一键如Si-O-C(O)-O-Si、Si-O-亚烷基-O-Si或Si-O-C(O)-亚烷基-O-Si)。图22中的反应方案的最终产物即化合物(20)说明本发明固体的一个实施方案,其中Si-R10基团具有与硅石表面的单个连接点。该具体形式由固体无机物质和单乙氧基硅烷的反应制成(关于为一种单乙氧基硅烷的覆盖剂的制备,参见图21)。
连接部分
本发明固体可进一步包含至少一个任选地通过连接剂连接在所述无机物质的表面或以其它方式位于所述无机物质的表面上的连接部分。该连接部分是能够连接至另一部分或分子基分析物(如通过憎水相互作用、共价键接或库仑相互作用而连接)的任何分子或分子片段。这些部分是分离工业的熟练技术人员所熟知的。通常用于生物分离工业的部分包括(如生物素、抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素),天然或非天然蛋白质,肽,抗原和核酸。作为本发明固体的连接部分,蛋白质优选为受体或抗体。
另外优选的是,在本发明的固体中,连接部分是配体,受体,抗体,抗原,DNA或RNA,包括用于核酸的杂化探头。如果配体是抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素,则分析物可以是生物素或被生物素化,反之亦然。
连接部分使用本领域已知的方法连接到无机物质上(如Hermanson等人,Immobilized Affinity Ligand Techniques,Academic Press,1992和较早引用的有关连接R10部分的其它参考文件)。在包含无机氧化物的固体中,连接部分可通过与起始无机氧化物上的表面官能团如羟基反应而连接。
或者,连接部分可通过连接剂连接到无机物质上。连接剂可以是任选地被取代的二价化学基团。该任选地被取代的二价化学基团可包含n个-R-基团,其中n是-R-基团的数目,n是至少为1,优选不大于30,和更优选不高于15的整数。更通常,从连接部分至无机物质度量的二价化学基团的长度是约1-约30原子,优选约1-约20原子,更优选约5-约15原子。化学基团-R-可选自-C(R1)H-,-C(R2)=C(R3)-和-C≡C-,其中R1、R2和R3独立地是H,烷基,取代的烷基,环烷基,取代的环烷基,链烯基,取代的链烯基,环链烯基,取代的环链烯基,炔基,取代的炔基,环炔基,取代的环炔基,芳基,取代的芳基,芳烷基或取代的芳烷基,所述-R-基团任选地被替代为-O-,-S-,羰基,硫代羰基,-OC(O)-,-C(O)O-,-SC(O)-,-C(O)S-,-OC(S)-,-C(S)O-,-C(S)S-,-SC(S)-,-N(R4)-,-N(R4)C(O)-,-C(O)N(R4)-,-C(R5)=N-,-N=C(R5)-,-C(R5)=NO-,-ON=C(R5)-,-P-,-P(OH)O-,亚芳基,取代的亚芳基,亚环烷基,取代的亚环烷基,亚环链烯基,取代的亚环链烯基,二价杂环基或二价取代的杂环基,其中R4和R5独立地是H,烷基,取代的烷基,环烷基,取代的环烷基,链烯基,取代的链烯基,环链烯基,取代的环链烯基,炔基,取代的炔基,环炔基,取代的环炔基,芳基,取代的芳基,芳烷基或取代的芳烷基。化学基团的例子是包含n个-R-基团的″烃基″且其中n如上所述,至少-个-R-基团是-CH2-,且(n-1)个-R-基团任选地被替代为上述的R基团,如,-O-,-S-,等。
″取代的″在本文中用于表示包含不改变取代的R基团的主要化学性质,如,烃基的烃性质的侧取代基基团。
术语″烷基″是指饱和的支化或未支化烃基基团,优选具有1-30,更优选1-20和甚至更优选1-6个碳原子的那些。″烷基″的例子包括甲基,乙基,正丙基,异丙基,正丁基,仲丁基,异丁基,叔丁基,正戊基,1-甲基丁基,2-甲基丁基,异戊基,新戊基,1,1-二甲基丙基,正己基,1-甲基戊基,2-甲基戊基,3-甲基戊基,1,1-二甲基丁基,2,2-二甲基丁基,异己基和新己基。术语″环烷基″是指饱和环状烃基基团,优选具有3-10,和更优选3-6个碳原子。″环烷基″的例子包括环丙基,环丁基,环戊基,环己基,双环庚基和十氢萘。″链烯基″是具有至少一个C=C键的支化或未支化烃基基团,其中烃基基团优选具有2-30,更优选2-20和甚至更优选2-6个碳原子。″链烯基″的例子包括乙烯基,烯丙基,1-丙烯基,异丙烯基,2-丁烯基,1,3-丁二烯基,3-戊烯基和2-己烯基。″环链烯基″是指具有至少一个C=C键的环状烃基基团,优选具有3-10,优选3-6个碳原子。″炔基″是具有至少一个-C≡C-键的支化或未支化烃基基团,优选具有2-30,更优选2-20和甚至更优选2-6个碳原子。″炔基″的例子包括乙炔基,1-丙炔基,2-丙炔基,2-丁炔基,3-丁炔基和2-戊烯-4-炔基。″环炔基″是优选具有3-10,更优选3-6个碳原子的具有至少一个-C≡C-键的环状烃基基团。″环炔基″的例子包括戊炔基和己炔基。″芳基″是优选具有6-14个碳原子的芳族环状烃基基团。″芳基″的例子包括苯基,萘基,蒽基和菲基,其中苯基是优选的芳基。″芳烷基″是被一个或多个芳基基团取代的烷基基团。
″芳烷基″的例子包括苄基,苯乙基,二苯基甲基和三苯甲基,其中苄基是优选的芳烷基。″二价杂环基″通常是具有3-10,优选3-7,更优选4-6个环原子的二价环状基团,其中1-4个环原于是O,S或N原子,或O,S和/或N原子的混合物。二价杂环基的例子包括硫杂丙烯环,环氧乙烷,氮丙啶,1H-azirine,2H-azirine,2H-thiete,thietane,2H-氧杂环丁二烯,氧杂环丁烷,氮杂环丁二烯,氮杂环丁烷,1,2-氧氮杂环丁烷,噻吩,呋喃,吡咯,咪唑,唑,异唑,噻唑,异噻唑,吡唑,1,3-二氧戊环,1,2,3-噻二唑,1,3,4-噻二唑,1,2,4-噻二唑,1,2,3-二唑,1,2,4-二唑,1,3,4-二唑,1,2,5-二唑,1,2,3-三唑,1,2,4-三唑,四唑,二唑,吡啶,喹啉,异喹啉,喹嗪,喹唑啉,蝶啶,咔唑,苯并唑,1,3-嗪,2H-1,3-嗪,吩嗪,吩噻嗪,哒嗪,嘧啶,吡嗪,苯并[b]呋喃,苯并[b]噻吩,吲哚,异吲哚,吲唑,嘌呤,异苯并呋喃,四氢呋喃,1,4-二烷,吡咯烷,四氢吡喃,1,2-二氢吡啶,1,4-二氢吡啶,哌啶,哌嗪,吗啉,硫代吗啉,苯并二氢吡喃,异苯并二氢吡喃,苯并吡喃,1H-氮杂,3H-氮杂,1,2-二氮杂,1,3-二氮杂,1,4-二氮杂,三氮杂和吖辛因的二价基团。
″杂芳基″是指芳族杂环基团。″亚烷基″、″亚链烯基″、″亚炔基″、″亚环烷基″,″亚环链烯基″和″亚芳基″相应是烷基、链烯基、炔基、环烷基、环链烯基和芳基基团的二价等同物。
″取代的烷基″是被1-5,优选1-3个选自羟基,巯基,烷氧基,烷基硫代,氨基,烷基氨基,二烷基氨基,芳基氨基,N,N-芳基烷基氨基,二芳基氨基,叠氮基,脒基,脲基,氟,氯,溴,碘,硝基,氰基,酰基(优选乙酰基和苯甲酰基),硫代酰基,烷基亚硫酰基,烷基磺酰基,烷基磺酰氨基,烷基氨磺酰基,羧基,烷基羰基氧基(优选乙酰氧基),芳基羰基氧基(优选苯甲酰基氧基),烷氧基羰基氧基,芳基氧基羰基氧基,氨基甲酰基,芳基(优选苯基),苯乙烯基,环烷基,环链烯基和杂环基(优选杂芳基)的取代基所取代的烷基。
″取代的链烯基″是被1-5,优选1-3个选自羟基,巯基,烷氧基,烷基硫代,氨基,烷基氨基,二烷基氨基,芳基氨基,N,N-芳基烷基氨基,二芳基氨基,叠氮基,脒基,脲基,氟,氯,溴,碘,硝基,氰基,酰基(优选乙酰基和苯甲酰基),硫代酰基,烷基亚硫酰基,烷基磺酰基,烷基磺酰氨基,烷基氨磺酰基,羧基,烷基羰基氧基(优选乙酰氧基),芳基羰基氧基(优选苯甲酰基氧基),烷氧基羰基氧基,芳基氧基羰基氧基,氨基甲酰基,芳基(优选苯基),苯乙烯基,环烷基,环链烯基和杂环基(优选杂芳基)的取代基所取代的链烯基。
″取代的炔基″是被1-5,优选1-3个选自羟基,巯基,烷氧基,烷基硫代,氨基,烷基氨基,二烷基氨基,芳基氨基,N,N-芳基烷基氨基,二芳基氨基,叠氮基,脒基,脲基,氟,氯,溴,碘,硝基,氰基,酰基(优选乙酰基和苯甲酰基),硫代酰基,烷基亚硫酰基,烷基磺酰基,烷基磺酰氨基,烷基氨磺酰基,羧基,烷基羰基氧基(优选乙酰氧基),芳基羰基氧基(优选苯甲酰基氧基),烷氧基羰基氧基,芳基氧基羰基氧基,氨基甲酰基,芳基(优选苯基),苯乙烯基,环烷基,环链烯基和杂环基(优选杂芳基)的取代基所取代的炔基。
″取代的环烷基″是被1-5,优选1-3个选自烷基,链烯基,炔基,芳烷基,羟基,巯基,烷氧基,烷基硫代,氨基,烷基氨基,二烷基氨基,芳基氨基,N,N-芳基烷基氨基,二芳基氨基,叠氮基,脒基,脲基,氟,氯,溴,碘,硝基,氰基,酰基(优选乙酰基和苯甲酰基),硫代酰基,烷基亚硫酰基,烷基磺酰基,烷基磺酰氨基,烷基氨磺酰基,羧基,烷基羰基氧基(优选乙酰氧基),芳基羰基氧基(优选苯甲酰基氧基),烷氧基羰基氧基,芳基氧基羰基氧基,氨基甲酰基,芳基(优选苯基),苯乙烯基,环烷基,环链烯基和杂环基(优选杂芳基)的取代基所取代的环烷基。
″取代的环链烯基″是被1-5,优选1-3个选自烷基,链烯基,炔基,芳烷基,羟基,巯基,烷氧基,烷基硫代,氨基,烷基氨基,二烷基氨基,芳基氨基,N,N-芳基烷基氨基,二芳基氨基,叠氮基,脒基,脲基,氟,氯,溴,碘,硝基,氰基,酰基(优选乙酰基和苯甲酰基),硫代酰基,烷基亚硫酰基,烷基磺酰基,烷基磺酰氨基,烷基氨磺酰基,羧基,烷基羰基氧基(优选乙酰氧基),芳基羰基氧基(优选苯甲酰基氧基),烷氧基羰基氧基,芳基氧基羰基氧基,氨基甲酰基,芳基(优选苯基),苯乙烯基,环烷基,环链烯基和杂环基(优选杂芳基)的取代基所取代的环链烯基。
″取代的环炔基″是被1-5,优选1-3个选自烷基,链烯基,炔基,芳烷基,羟基,巯基,烷氧基,烷基硫代,氨基,烷基氨基,二烷基氨基,芳基氨基,N,N-芳基烷基氨基,二芳基氨基,叠氮基,脒基,脲基,氟,氯,溴,碘,硝基,氰基,酰基(优选乙酰基和苯甲酰基),硫代酰基,烷基亚硫酰基,烷基磺酰基,烷基磺酰氨基,烷基氨磺酰基,羧基,烷基羰基氧基(优选乙酰氧基),芳基羰基氧基(优选苯甲酰基氧基),烷氧基羰基氧基,芳基氧基羰基氧基,氨基甲酰基,芳基(优选苯基),苯乙烯基,环烷基,环链烯基和杂环基(优选杂芳基)的取代基所取代的环炔基。
″取代的芳基″是被1-5,优选1-3个选自烷基,链烯基,炔基,芳烷基,羟基,巯基,烷氧基,烷基硫代,氨基,烷基氨基,二烷基氨基,芳基氨基,N,N-芳基烷基氨基,二芳基氨基,叠氮基,脒基,脲基,氟,氯,溴,碘,硝基,氰基,酰基(优选乙酰基和苯甲酰基),硫代酰基,烷基亚硫酰基,烷基磺酰基,烷基磺酰氨基,烷基氨磺酰基,羧基,烷基羰基氧基(优选乙酰氧基),芳基羰基氧基(优选苯甲酰基氧基),烷氧基羰基氧基,芳基氧基羰基氧基,氨基甲酰基,苯乙烯基,环烷基,环链烯基,芳基(优选苯基)和杂环基(优选杂芳基)的取代基所取代的芳基。
″取代的杂环基″是被1-5,优选1-3个选自烷基,链烯基,炔基,芳烷基,羟基,巯基,烷氧基,烷基硫代,氨基,烷基氨基,二烷基氨基,芳基氨基,N,N-芳基烷基氨基,二芳基氨基,叠氮基,脒基,脲基,氟,氯,溴,碘,硝基,氰基,酰基(优选乙酰基和苯甲酰基),硫代酰基,烷基亚硫酰基,烷基磺酰基,烷基磺酰氨基,烷基氨磺酰基,羧基,烷基羰基氧基(优选乙酰氧基),芳基羰基氧基(优选苯甲酰基氧基),烷氧基羰基氧基,芳基氧基羰基氧基,氨基甲酰基,芳基(优选苯基),苯乙烯基,环烷基,环链烯基和杂环基(优选杂芳基)的取代基所取代的杂环基基团。
″取代的亚芳基″、″取代的亚环烷基″、″取代的亚环链烯基″、″取代的二价杂环基″和″取代的芳烷基″是″取代的芳基″、″取代的环烷基″,″取代的环链烯基″和″取代的杂环基″的二价等同物。
连接连接剂的化学基团-R-和无机物质的键取决于用于使连接剂和无机物质反应的化学原理。该键可以是醚,硫醚,酯,硫代酯,碳酸酯,氨基甲酸酯,磷酸酯,膦酸酯,磷酯,氨基磷酸酯,胺,酰胺,酰亚胺,脲,硫脲,磺酰胺,亚砜,砜,二硫化物,肟,O-酰基肟,O-氨基甲酰基肟,O-酰基氧基烷基肟,O-酰基氧基烷基氧基肟,O-肟基磷酸盐,O-肟基膦酸盐,O-肟基氨基磷酸酯或-C=C-键。连接化学基团-R-和连接部分的键也可是前述键之一。
连接剂与物质(如,无机物质)反应的化学原理在文献中得到很好描述(参见Hermanson等人,Immobilized Affnity LigandTechniques,1992和Weetall,Methods in Enzymology,vol.XLIV,第134-148页,1976)。连接剂与无机物质反应的具体化学原理取决于所用的无机物质和连接剂。同样,连接剂与连接部分反应的化学原理取决于所用的连接剂和连接部分。合适的连接剂/连接部分偶联化学的具体例子在表1中给出。根据表1,连接部分可通过氨基,巯基,羰基或羟基基团或连接部分上的活性氢原子偶联到连接剂上。
表1
常规连接剂/连接部分偶联化学的例子
由下列形成的连接剂 连接部分偶联基团
溴化氰(CNBr) 氨基
N-羟基琥珀酰亚胺酯 氨基
羰基二咪唑 氨基
还原胺化 氨基
FMP活化* 氨基
EDC媒介的酰胺键形成** 氨基
有机磺酰氯:甲苯磺酰氯和tresyl氯化物 氨基
二乙烯基砜 氨基
二氢唑酮 氨基
氰尿酰氯(三氯-s-三嗪) 氨基
碘乙酰基或溴乙酰基活化方法 巯基
马来酰亚胺 巯基
吡啶基二硫化物 巯基
二乙烯基砜 巯基
环氧 巯基
TNB-硫醇*** 巯基
酰肼 羰基
还原胺化 羰基
环氧(二环氧乙烷) 羟基
二乙烯基砜 羟基
氰尿酰氯 羟基
重氮化合物 活性氢
Mannich缩合 活性氢
*FMP是指2-氟-1-甲基-吡啶甲苯-4-磺酸盐
**EDC是指1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
***TNB-硫醇是指2-亚氨基硫代戊环5,5-二硫代-二-(2-硝基苯甲酸)
在制造包含连接剂基团的固体载体时,可以改变产生连接剂基团以及将R10基团加入无机物质的顺序。R10可在连接连接剂之后在无机表面上产生,或它可在连接剂反应之前产生。或者,可产生和/或连接R10或连接剂或两者的前体,且前体随后反应以产生最终的R10和/或连接剂。
可以改变连接剂基团在无机表面上的浓度。在本发明某些实施方案中,连接部分包含可″遮蔽″大部分载体表面区域的大蛋白质分子。结果,连接剂位在载体表面上的浓度无需较高。该浓度可根据所考虑的连接部分/分析物配合物的尺寸进行优化。
决定R10和连接部分的浓度的因素包括R10基团和连接部分的特性、在无机物质上活性位的浓度、连接剂基团的浓度、和分析物的特性。
一般来说,R10的浓度可以是约1-约10个基团/平方纳米(nm2)载体表面积,基于通过BET测定的表面积计。在某些实施方案中,连接部分浓度主要取决于在使用该组合物时所要回收的分析物。如上所述,连接部分的浓度也可取决于所用的任何任选性的连接剂的浓度。但一般来说,连接部分的浓度可以是0.04-约4个基团/平方纳米。另外,连接部分并不总是以1比1的化学计量连接到连接剂上。在某些实施方案中,如,当连接部分由大蛋白质分子制成时,连接部分可通过几个连接剂基团连接。在采用较小键接剂部分的其它实施方案中,使用低于化学计量量的连接部分,且当本发明用于分离时任何未反应的连接剂基团被″封端″以避免干扰。
R10和连接部分的量也可表示为起始无机物质上有多少官能团被R10、连接部分、和/或任选性的连接剂反应或″覆盖″。例如,所述无机物质的约50%-约99%的表面羟基基团可被R10表面部分覆盖,约1%-约50%的表面羟基基团可被通过连接剂任选地连接到无机物质上的连接部分覆盖。
在本发明固体的某些实施方案中,所述无机物质的约75%-约99%的表面羟基基团被R10表面部分覆盖,约1%-约25%的表面羟基基团被直接或通过连接剂间接连接到无机物质上的连接部分覆盖。
如上所述,包含至少一个连接部分和R10的本发明固体可用于分离已知结合到连接部分上的分析物。因此,本发明包括一种分离与混合物中的至少一种其它组分混合的分析物的方法,所述方法包括以下步骤:
1.将本发明固体与所述混合物接触,其中至少一个连接部分具有对所述分析物的特定亲和性;
2.使所述分析物结合到所述至少一个连接部分上;
3.从其上键接有所述分析物的固体中去除所述至少一种其它组分;
4.回收所述固体;和
5.从固体中分离分析物。
在本发明方法的一个实施方案中,连接部分以足以提供与所需分析物的特定连接的量存在。所述至少一种其它组分在步骤(3)中通过用流体洗涤固体并丢弃洗涤液而去除;并且其中所述分析物在步骤(5)中通过将洗脱剂放在固体上和收集洗脱剂而分离。
在分离分析物的方法中,优选的是,所述无机物质表面的约50%-约99%的羟基基团被表面部分覆盖,约1%-约50%的表面羟基基团被直接或通过连接剂间接连接到无机物质上的连接部分覆盖。
分离分析物的方法进一步优选使所述无机物质的约75%-约99%表面羟基基团被表面部分覆盖,约1%-约25%表面羟基基团被直接或通过连接剂间接连接到无机物质上的连接部分覆盖。
在分离分析物的方法的优选实施方案中,所述无机物质是硅胶或色谱级硅石。更优选无机物质是硅胶。
本发明还包括一种减少杂质(杂质是包含分析物的混合物中的非分析物组分,即除分析物之外的物质)与包含无机物质的固体的非特定连接的方法,其中所述无机物质包含至少一个其上发生非特定连接或以其它方式引起非特定连接的官能团。无机物质包括前述无机氧化物,且所述方法包括以下步骤:
1.提供所述固体;
2.使所述至少一个官能团与反应物反应,以在无机物质的至少一个表面上产生部分R10,其中R10选自-CH2OH,-CH(OH)2,-CH(OH)CH3,-CH2CH2OH,-C(OH)2CH3,-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。
在减少非特定连接的方法中,R10优选选自-CH2OH,-CH(OH)CH3,-CH2CH2OH,和-CH(OH)CH2(OH)。更优选,R10选自-CH2OH,-CH(OH)CH3和-CH2CH2OH。最优选,R10是-CH2OH。R10在无机物质表面上以足量存在,以使得当无机物质与包含杂质的混合物接触时,杂质与固体的非特定连接得到降低。
该方法尤其可用于减少与具有位于其表面上的羟基官能度的无机金属氧化物、硅酸盐或硅铝酸盐的非特定连接。它尤其可用于无机金属氧化物如硅石(硅胶和色谱级硅石)、矾土、硅石-矾土、氧化锆、锆酸盐、受控孔玻璃、二氧化钛、它们的共沉淀物和混合物。该方法也可用于磁响应性无机氧化物(如含硅氧化物涂覆的磁性颗粒)。
必须考虑到蛋白质或其它物质与载体表面的三种连接,以使与固体载体的非选择连接最小。
载体的表面电荷在吸附操作pH下应该理想地是零。这是由于,蛋白质由于蛋白质中的-COOH或-NH2基团过量而携带净电荷。对于在约pH7下的蛋白质复杂混合物,如果混合物中的蛋白质的等电点<7,它就具有净负电荷,而相反,如果混合物中的蛋白质的等电点>7,它就具有净正电荷。未反应的硅石表面具有等电点约2,因此如果它与复杂混合物在pH=7左右接触,它就会具有强负电荷,因此带正电荷的蛋白质就非选择性地吸附到硅石表面上。这解释了蛋白质与硅石表面的强非选择连接。因此,如上所述,载体的表面电荷在吸附操作pH下应该理想地是零。
应该最小化的第二种连接相互作用是憎水键接。尽管在单个位上弱于静电或偶极相互作用,但憎水相互作用如果在许多相邻位之间聚集就变得可观。如果溶剂的盐浓度较高,憎水相互作用变得占主导。盐的离子可与带电表面相互作用,从而自蛋白质″屏蔽电荷″。尽管高盐的存在减少了与表面的静电相互作用,但如果表面具有憎水性质,那么憎水相互作用变得占主导。因此,应该在载体上避免憎水表面组合物,以使该相互作用最小化。
蛋白质与表面的第三种连接相互作用是氢键,或偶极相互作用。有趣的是,如果溶剂是水,该相互作用由于熵的原因而相对表面来说有利于溶剂。即,如果蛋白质在水体系中能够″选择″通过氢键结合到表面上或留在溶液中(也是一种氢键相互作用),那么由于其较高熵态而有利于溶液情形。因此,为了从水溶液中进行蛋白质纯化,具有偶极组成的表面对于非选择连接的最小化有利。这种表面在低静电电荷密度下通常是亲水的。
据信,本发明涉及这三种相互作用中的每种,且本发明的新特点之一是一种为了从水基体系中纯化蛋白质而提供具有非常低表面电荷密度的亲水表面的表面组合物。该表面组成通过用覆盖表面的前述R10基团如-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH),优选-CH2OH化学改性无机氧化物基载体,如硅石、优选硅胶而实现。这些R10基团是亲水的,仍是非常弱的酸,这意味着这些R10基团在低于约12左右的pH下基本上不离解,并因此不带电。如果蛋白质的复杂混合物具有该表面组合物,则电荷相互作用被最小化,但氢键相互作用由于溶剂化蛋白质的较高熵态而有利于水溶剂的氢键,胜过键接到表面上的蛋白质氢。该表面组合物因此使非所需蛋白质与高容量亲和性载体的非选择性连接最小化,得到在高容量下的高纯化因子。
包含R10部分和至少一种位于无机物质的表面上的连接剂的固体也在本发明的范围内。这些固体可被认为是一种可″原样″销售给所述固体的使用者的中间体。在分离所需分析物之前,使用者可随后使连接部分与连接剂基团反应。连接剂基团也可任选地被封端或以其它方式成为前体形式,这样在它与连接部分反应之前需要进一步的化学处理。
以下工作实施例用于说明本发明的一些方面,且不应理解为对本发明范围的限定。本发明可以以没有通过实施例说明的实施方式实施,而不背离本文所公开的本发明的主旨或基本特征。例如,本发明可由本领域熟练技术人员如权利要求所述进行实践,且内容上与权利要求书所述相当的任何实施方案包括在所要求的发明范围内。
实施例1和2
在常规硅石介质上的非特定连接
这些实施例表明,现有技术的净未涂覆带电硅石表面强烈吸附蛋白质,这主要是基于等电点和硅石的表面积。测试了两种硅石:实施例1和2。实施例1是在150摄氏度下4小时热处理之后具有表面积=161m2/g的低表面积硅胶(微孔=73m2/g;中孔=88m2/g,孔体积=0.373cc/g,平均孔直径=93埃)。实施例2是在150摄氏度下4小时热处理之后的较高表面积/孔体积硅胶,表面积=253m2/g(微孔=35m2/g;中孔=218m2/g,孔体积=2.445cc/g,平均孔直径=387埃)。以下实施例描述一个步骤,其中净硅石样品与蛋白质在水溶液中的复杂混合物接触。对所得上层清液随后通过用于蛋白质吸附的等电聚焦凝胶电泳进行分析。
将一小瓶(325μg蛋白质/小瓶)Pharmacia 3.6-9.3宽pI校正成套工具(目录#17-0471-01)溶解在eppendorf管中的200μl DI H2O中。加入0.005g实施例1。在另一eppendorf管中,将一小瓶(325μg蛋白质/小瓶)Pharmacia 3.6-9.3宽pI校正成套工具(目录#17-0471-01)溶解在200μl DI H2O中,并随后加入0.005g实施例2。将这两种样品抄底搅拌1小时。这些样品在Pharmacia PhastGel装置上进行3-9等电聚焦凝胶电泳。结果示于图2。
栏 描述
2,7 Pharmacia 3.6-9.3宽pI标准
3,4 实施例1
5,6 实施例2
图2表明,带(蛋白质)从与实施例1和2接触的样品上消失,意味着这些蛋白质被吸附到硅石表面上。高表面积硅石,实施例2,吸附等电点大于5.9的所有蛋白质,而较低表面硅石,实施例1,仅吸附具有较高pI的蛋白质。数据清楚地表明,未涂覆硅石主要通过强静电相互作用连接蛋白质,且表面在该pH(假设为约5.5左右)下带负电。
实施例3、4和5
在经憎水处理的载体上的非选择性连接
这些实施例表明,如果硅石覆盖有憎水基团,甲基或辛基基团,则出现强吸附,尤其在溶剂的中等离子强度(约0.1M盐)下。实施例3是来自W.R.Grace&Co.的未涂覆净商业宽孔硅石,XWP-gel P005,SA=72m2/g,具有50nm的孔中值,已在150摄氏度下活化2小时。
实施例4是以下描述的已覆盖有甲基基团的实施例3硅石。实施例5是以下描述的已覆盖有辛基基团的实施例3硅石。实施例4制备如下。在250ml圆底烧瓶中,加入50ml甲苯和6.16g甲基三乙氧基硅烷。随后将10.1g实施例3加入甲苯/甲基三乙氧基硅烷溶液中。N2流动5分钟以去除空气并在整个反应中连续流动。样品在110摄氏度下回流和搅拌4小时。随后过滤样品并用50毫升甲苯洗涤3次。样品被再制浆到50ml甲苯中,随后过滤并用50毫升甲苯洗涤3次。样品随后被再制浆到50ml甲苯中,随后过滤并用50毫升甲苯洗涤3次。样品在110摄氏度下干燥并随后在150摄氏度下煅烧4小时。
实施例5制备如下。将10.1g实施例3用溶解在13.25g作为溶剂的甲苯中的0.53g辛基三乙氧基硅烷浸渍至初始湿度。样品随后在通风橱中空气干燥2小时,在110摄氏度下干燥1小时并随后在150摄氏度下煅烧4小时。
在0.1M NaCl中的蛋白质吸附测定如下。因为实施例4和5是憎水的,所以需要润湿步骤以确保与蛋白质溶液的良好接触。向eppendorf管中加入0.014g实施例3作为对照物。随后加入1ml乙醇,搅拌并离心处理以去除上层清液。加入0.5ml乙醇和0.5ml DI H2O,搅拌并离心处理以去除上层清液。加入0.25ml乙醇和0.75ml DI H2O,搅拌并离心处理以去除上层清液。加入1ml DI H2O,搅拌并离心处理以去除上层清液。DI H2O洗涤重复4次以上。加入1ml 0.1M NaCl+0.02M PBS pH=7.4,搅拌并离心处理以去除上层清液。重复用0.1M NaCl+0.02M PBS pH=7.4洗涤4次以上。将两小瓶的Sigma IEF Mix 3.6-9.3等电聚焦标识物(目录#I-3018)溶解到500μl 0.1M NaCl+0.02M PBS pH=7.4中。将溶解的IEF Mix加入eppendorf管中。
向另一eppendorf管中加入0.014g实施例4。针对实施例4进行与实施例3相同的润湿步骤和蛋白质加入。
向第三个eppendorf管中加入0.014g实施例5。针对实施例5进行与实施例3相同的润湿步骤和蛋白质加入。
将一小瓶的Sigma IEF Mix 3.6-9.3等电聚焦标识物(目录#I-3018)溶解到250μl 0.1M NaCl+0.02M PBS pH=7.4中。这是标准的未处理蛋白质混合物。
对所有的样品抄底搅拌1小时。样品在Pharmacia PhastGel装置上进行3-9等电聚焦凝胶电泳。结果示于图3。
栏 描述
1,8 标准蛋白质混合物
2,3 实施例3
4,5 实施例4
6,7 实施例5
从图3可以看出,尽管硅石的表面电荷被溶解的盐即0.1M NaCl所″屏蔽″,且没有出现蛋白质连接,但甲基、尤其辛基基团的憎水相互作用非常强,且许多带消失。这些数据清楚地表明,在以上条件下,憎水表面组合物可导致非选择性连接。
实施例6、7和8
本发明的实施例
这些实施例显示采用根据本发明的R10基团用于降低与硅石表面的非选择性蛋白质连接的优点。实施例6与实施例3相同,只是它在200摄氏度下活化2小时。实施例7是中间体表面组合物,其中硅石表面连接有Si-R基团,其中R是乙酰氧甲基。实施例8是本发明表面组合物的一个例子,其中硅石表面连接有Si-R10基团,其中R10是甲基羟基。另外显示了具有高和低离子强度溶剂的实施例8的优点。
实施例7制备如下。在250ml圆底烧瓶中,加入50ml甲苯和20.42g乙酰氧基甲基三乙氧基硅烷。将15.05g实施例6加入甲苯/乙酰氧基甲基三乙氧基硅烷溶液中。N2流动5分钟以去除空气并在整个反应中持续流动。样品在110摄氏度下回流和搅拌16小时。然后,过滤样品并用50毫升甲苯洗涤3次。样品被再制浆到50ml甲苯中,过滤并用50毫升甲苯洗涤5次。样品随后被再制浆到50ml甲苯中,过滤并用50毫升甲苯洗涤5次。在110摄氏度下对其进行干燥,随后在150摄氏度下煅烧4小时。
实施例8的制备描述如下。在250ml圆底烧瓶中加入10g实施例7和100ml 0.01M H2SO4。N2流动5分钟以去除空气并在整个反应中持续流动。样品在100摄氏度下回流和搅拌18小时。然后,过滤样品并用100ml80摄氏度DI H2O洗涤2次。样品被再制浆到100ml 80摄氏度DI H2O中;过滤并用100ml 80摄氏度DI H2O洗涤2次;在110摄氏度下干燥并随后在150摄氏度下煅烧4小时。
向eppendorf管中加入0.007g实施例7。将一小瓶的Sigma IEF Mix3.6-9.3等电聚焦标识物(目录#I-3018)溶解到250μl 0.14M NaCl+0.02M PBS pH=7.2中并随后加入eppendorf管中。将样品标为实施例7高盐。
向第二个eppendorf管中加入0.007g实施例8。将一小瓶Sigma IEFMix 3.6-9.3等电聚焦标识物(目录#I-3018)溶解到250μl 0.14M NaCl+0.02M PBS pH=7.2中并随后加入eppendorf管中。将该样品标为实施例8高盐。
向第三个eppendorf管中加入0.007g实施例7。将一小瓶的SigmaIEF Mix 3.6-9.3等电聚焦标识物(目录#I-3018)溶解到250μl 0.02MPBS pH=7.4中并随后加入eppendorf管中。将该样品标为实施例7低盐。
向第四个eppendorf管中加入0.007g实施例8。将一小瓶的SigmaIEF Mix 3.6-9.3等电聚焦标识物(目录#I-3018)溶解到250μl 0.02MPBS pH=7.4中并随后加入eppendorf管中。将该样品标为实施例8低盐。
向第五个eppendorf管中,将一小瓶的Sigma IEF Mix 3.6-9.3等电聚焦标识物(目录#I-3018)溶解到250μl DI H2O中并随后加入eppendorf管中。将该样品标为蛋白质混合物标准。
所有的样品被抄底搅拌1小时。所有的样品随后在PharmaciaPhastGel装置上进行3-9等电聚焦凝胶电泳。结果示于图4。
栏 描述
1,8 蛋白质混合物标准
实施例 7高盐
实施例 8高盐
实施例 7低盐
实施例 8低盐
该实验的结果清楚地表明,用于拒绝对硅石表面的非特定吸附的实施例8(本发明的一个实施方案)的优点在于,在″高盐″和″低盐″两种条件下存在所有的蛋白质带,参见栏3和7。
实施例8的表征
本发明的表面组合物通过以下描述的分析进行表征。
图5给出了实施例8从1400-4000cm-1的漫反射红外光谱,该实施例具有包含-CH2OH基团的表面组合物。红外数据在Nicolet Magna 550上使用Spectra-Tech漫反射附件而获得。样品在KBr中稀释成1∶20,进行512次扫描,在4cm-1分辨率下收集。在2937和2897cm-1处的峰清楚地表明-CH2基团的存在。-OH共振带被包埋在3483cm-1处的宽峰中。为了对比,图6给出了实施例7的光谱,其表面组合物包含-CH2OCOCH3基团。新的共振出现在1726、1421、和1374cm-1处,这些是与乙酰氧基基团有关的特征共振。
图7给出了实施例8的MAS Si29NMR光谱。单脉冲29Si核磁共振实验在共振频率为39.76MHz下操作的Chemagnetics CMX 200上进行。样品被填充在14mm笔式转子中。对应于22度脉冲的4μs脉冲长度与60s弛豫延迟一起使用。在-62ppm处的清晰共振已被确认为O3Si-CHx-,参见Vicic,D.,和Maciel,J.Am.Chem.Soc.105(1983),第3767-3776页。
图8给出了实施例8的X-射线光电子光谱。样品用双面胶带安装在样品桩上并进行2小时的碳、氧、和硅扫描。光谱被拟合成两个峰,被确认为污染物C,284.7eV,和醇C原子,286.7eV,参见″Handbook ofX-ray Photoelectron Spertroscopy″,Moulder,J.F.,Sticke,W.F.,Sobol,P.E.,和Bomben,K.D.,Perkin-Elmer Corp,Eden Prairie,MN,1992。为了对比,实施例7的XPS光谱在图9中给出。在这种情况下,还观察到与羧基碳有关的在289eV处的峰。这些研究表明,实施例8(本发明的一个实施方案)的表面组合物包含甲基羟基基团-CH2OH,如,本文定义的R10。
R10基团(-CH2OH)在实施例8产物上的浓度是2.01个基团/nm2,并由硅石载体(72m2/g)的表面积和最终产物的碳含量(1.907%)计算得到。表面积使用常规BET表面积方法测定,碳含量(%重量)使用C-144LECO型碳分析器测定。
实施例9(连接部分的连接和对使用本发明时非特定连接减少的
说明)
将842g甲苯和3.11g 3-氨基丙基三乙氧基硅烷加入2000ml圆底烧瓶中。然后,将200g在200摄氏度下煅烧2小时的Grace Davison XWP 500埃硅石加入该圆底烧瓶,随后加入15个沸腾碎片。将圆底烧瓶放在加热套中并连接冷凝器。将加热套连接到在速度115rpm下操作的轨道振荡器的顶部。在整个反应过程中将N2通入圆底烧瓶和冷凝器以去除空气。将样品加热至沸腾(约110摄氏度)4小时。将样品过滤并用2×200ml甲苯洗涤,在115摄氏度下干燥并随后在150摄氏度下煅烧2小时。该样品被标为中间体A。所得-CH3H6NH2基团的浓度计算为0.54并基于载体的表面积(BET)(88m2/g)、中间体的碳含量(LECO)(0.321%)和氮含量(0.11%)计。氮含量(%重量)在Carlo Erba NA 1500分析器上并使用基于改性的Dumas方法的方法,使用含氧气氛和热传导检测而测定。参见ASTM D5373(用于煤)和ASTM 5291。
将800ml 1M NaCl与中间体A在烧杯中混合并用磁性搅拌器搅拌。起始pH是4.79。滴加1M HCl,直至pH变成2。pH在2.0下保持15分钟。将样品过滤并用5×200ml DI H2O洗涤,在115摄氏度下干燥并随后在200摄氏度下煅烧2小时。该样品被标为中间体B。
将680g甲苯和177.25g乙酰氧基甲基三乙氧基硅烷与中间体B在圆底烧瓶中混合。将15个沸腾碎片放入圆底烧瓶中,所述烧瓶被放在加热套中并连接有冷凝器。将加热套连接到在速度115rpm下操作的轨道振荡器上。在整个反应过程中将N2通入圆底烧瓶和冷凝器以去除空气。将样品加热至沸腾(约110摄氏度)24小时,过滤,用3×200ml甲苯洗涤,在115摄氏度下干燥并随后在150摄氏度下煅烧2小时。该样品被标为中间体C。
将900ml二烷和100ml 0.1M H2SO4与中间体C在圆底烧瓶中混合。将15个沸腾碎片放在圆底烧瓶中,所述烧瓶被放在加热套中并连接有冷凝器。将加热套连接到在速度115rpm下操作的轨道振荡器顶部。在整个反应过程中将N2通入圆底烧瓶和冷凝器以去除空气。将样品加热至沸腾(约100摄氏度)4小时,过滤,用2×200ml甲苯洗涤,在115摄氏度下干燥并随后在150摄氏度下煅烧2小时。该样品被标为中间体D。该产物的R10基团(-CH2OH)的浓度是5.65,且是通过计算中间体D的碳含量并随后减去可归属于C3H6NH2基团的碳的量,并随后进行实施例8中的计算而测定的。这样,C3H6NH2基团的浓度计算为0.39并低于由中间体A在进行化学处理以连接R10基团之前的数据的计算值。不局限于特殊理论,氮含量的些许变化(0.11对0.08)据信是由于标准偏差或可能是由于如果产生R10基团时C3H6NH2基团的些许浸析。
将20.75g中间体D和400ml偶联缓冲剂(0.1M Na2PO4+0.15M NaCl;pH=7.0)在1000ml烧杯中混合并搅拌5分钟。将样品过滤以形成湿滤饼,放在1000ml烧杯中并随后将587.66g 50wt.%戊醛和5.91g NaCNBH3加入烧杯。将样品搅拌4小时,过滤,用400ml偶联缓冲剂洗涤并在400ml偶联缓冲剂中再制浆,以得到新样品,然后过滤,用400ml偶联缓冲剂洗涤和在400ml偶联缓冲剂中再制浆2次。将重新洗涤和再制浆的样品过滤并随后用400ml偶联缓冲剂洗涤。该样品被标为中间体E。
将75.44g偶联缓冲剂和24.56g来自Repligen的蛋白质A(浓度为50g蛋白质A/升)加入250ml圆底烧瓶中。将2.52g NaCNBH3和中间体E加入该烧瓶并在振荡器上混合4小时。将样品过滤并4次用100ml偶联缓冲剂洗涤。随后将75.44g偶联缓冲剂、2.52g NaCNBH3和0.44g乙醇胺加入250ml圆底烧瓶,并随后在振荡器上混合4小时。将样品过滤并4次用100ml偶联缓冲剂洗涤。将样品放在20%乙醇中并在4摄氏度下储存。该样品被标为实施例9。由LECO碳,确定实施例9是34.67mg蛋白质A/克硅石。
将填充了直接连接有-Si-CH2OH的硅石的0.66×2cm I.D.亲和性柱首先用20mM磷酸盐缓冲剂(pH7.4)平衡。将5ml的0.5mg/ml兔多克隆IgG在Teredinobacter turnirae培养液的上层清液中的加料样品加载到柱上。随后用磷酸盐缓冲剂洗涤亲和性柱,直至在280nm处的UV吸光率回归至基线。将IgG用0.1M乙酸,pH3.0在流速1ml/min下从亲和性柱中洗脱(参见图9中的窄峰)。图10给出了通过监控在280nm处的吸光率而得到的加载、洗涤和从亲和性柱洗脱时的色谱图。
将100μl来自图10所示亲和性纯化的洗脱剂的纯化IgG注入到尺寸排阻色谱柱上,用0.1M Na2SO4和0.05M NaH2PO4的洗脱缓冲剂(pH5)在流速1毫升/min下洗脱。来自尺寸排阻色谱柱的洗脱剂的A280分布描绘于图11,其中给出了具有非常少的来自细胞培养液的杂质的IgG的单个峰。通过对比,图12给出了被加入细胞培养液的起始兔多克隆IgG的使用相同的条件的尺寸排阻色谱图。根据对图11和12的比较可明显看出,由使用实施例9的细胞培养液纯化的IgG(图11)比起始IgG(图12)更纯。因此,图11和12表明,与硅石介质的非选择性连接通过本发明固体被最小化。
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Claims (54)
1.一种包含无机物质和位于所述无机物质的至少一个表面上的部分R10的固体,其中所述无机物质是无机氧化物、硅酸盐或硅铝酸盐,所述R10基团选自 -CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH).
2.权利要求1的固体,其中R10通过二价部分或原子连接到所述无机物质的至少一个表面.
3.权利要求1的固体,其中R10选自-CH2OH、-CH(OH)CH3和-CH2CH2OH.
4.权利要求1的固体,其中R10是-CH2OH.
5.权利要求1的固体,其中所述无机物质是无机金属氧化物.
6.权利要求1的固体,其中无机物质是磁响应的.
7.权利要求1的固体,其中无机物质是硅石、矾土、硅石-矾土、氧化锆、二氧化钛、受控孔玻璃或其混合物.
8.权利要求1的固体,其中无机物质是色谱级硅石.
9.权利要求1的固体,其中无机物质是硅胶.
10.一种固体,包含(i)无机物质,(ii)位于所述无机物质的至少一个表面上的部分R10,和(iii)至少一个能够连接分析物的连接部分,其中所述无机物质是无机氧化物、硅酸盐或硅铝酸盐,所述R10选自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH).
11.权利要求10的固体,其中所述至少一个连接部分选自配体、蛋白质、肽、抗原和核酸.
12.权利要求10的固体,其中所述至少一个连接部分通过至少一个连接剂连接到分析物上.
13.权利要求10的固体,其中所述至少一个连接部分通过至少一个连接剂连接到所述无机物质上,其中所述至少一个连接部分是受体、抗体、抗原、DNA或RNA.
14.权利要求10的固体,其中所述至少一个连接剂是任选地被取代的二价化学基团.
15.权利要求10的固体,包含1-10个R10部分/nm2固体.
16.权利要求15的固体,包含0.04-4个连接部分/nm2固体.
17.权利要求16的固体,其中所述无机物质是硅石,R10是-CH2OH.
18.权利要求17的固体,其中所述无机物质是硅胶.
19.权利要水17的固体,其中所述无机物质是色谱级硅石.
20.权利要求14的固体,其中任选地被取代的化学基团是包含n个-R-基团的烃基,其中n是-R-基团的数目,且n是至少为2的整数,其中n-1个-R-基团任选地被-O-、-S-、羰基、硫代羰基、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(S)-、-C(S)O-、-C(S)S-、-SC(S)-、-N(R4)-、-N(R4)C(O)-、-C(O)N(R4)-、-C(R5)=N-、-N=C(R5)-、-C(R5)=NO-、-ON=C(R5)-、-P-、-P(OH)O-、亚芳基、取代的亚芳基、亚环烷基、取代的亚环烷基、亚环链烯基、取代的亚环链烯基、二价杂环基或取代的杂环基所替代,其中R4和R5独立地是H、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、链烯基、取代的链烯基、环链烯基、取代的环链烯基、炔基、取代的炔基、环炔基、取代的环炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基.
21.权利要求12的固体,其中所述至少一个连接剂是具有从连接部分度量至无机物质的长度为1-30原子的二价任选地被取代的化学基团,其中该化学基团包含至少一个-R-基团,其中所述-R-基团选自-CH2-、-C(R1)H-、-C(R2)=C(R3)-和-C≡C-,其中R1、R2和R3独立地是H、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、链烯基、取代的链烯基、环链烯基、取代的环链烯基、炔基、取代的炔基、环炔基、取代的环炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基,所述-R-基团任选地被-O-、-S-、羰基、硫代羰基、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(S)-、-C(S)O-、-C(S)S-、-SC(S)-、-N(R4)-、-N(R4)C(O)-、-C(O)N(R4)-、-C(R5)=N-、-N=C(R5)-、-C(R5)=NO-、-ON=C(R5)-、-P-、-P(OH)O-、亚芳基、取代的亚芳基、亚环烷基、取代的亚环烷基、亚环链烯基、取代的亚环链烯基、二价杂环基或取代的杂环基所替代,其中R4和R5独立地是H、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、链烯基、取代的链烯基、环链烯基、取代的环链烯基、炔基、取代的炔基、环炔基、取代的环炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基.
22.权利要求12的固体、其中所述至少一个连接剂独立地通过醚、硫醚、酯、硫代酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、磷酸酯、膦酸酯、磷酯、氨基磷酸酯、胺、酰胺、酰亚胺、脲、硫脲、磺酰胺、亚砜、砜、二硫化物、肟、O-酰基肟、O-氨基甲酰基肟、O-酰基氧基烷基肟、O-酰基氧基烷基氧基肟、O-肟基磷酸酯、O-肟基膦酸酯、O-肟基氨基磷酸酯或C=C键连接到所述至少一个连接部分和无机物质上。
23.权利要求12的固体,其中所速至少一个连接剂由溴化氰,N-羟基琥珀酰亚胺酯,羰基二咪唑,还原胺化化合物,2-氟-1-甲基-吡啶甲苯-4-磺酸盐活化化合物,1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亚胺媒介的酰胺键形成化合物,甲苯磺酰氯,2,2,2-三氟乙烷磺酰氯,二乙烯基砜,二氢唑酮,氰尿酰氯,碘乙酰基或溴乙酰基活化化合物,马来酰亚胺,吡啶基二硫化物,环氧化合物,2-亚氨基硫代戊环5,5-二硫代-二-(2-硝基苯甲酸),酰肼,重氮盐或曼尼希缩合化合物而形成.
24.一种分离在混合物中与至少一种其它组分混合的分析物的方法,所述方法包括:
(1)将权利要求10的固体与所述混合物接触,其中所述至少一个连接部分具有对所述分析物的特定亲和性;
(2)使所述分析物结合到所述至少一个连接部分上;
(3)从具有键接到其上的所述分析物的固体中去除所述至少一种其它组分;
(4)回收所述固体;和
(5)从固体中分离分析物.
25.权利要求24的方法,其中所述至少一种其它组分在步骤(3)中通过用流体洗涤固体,得到洗涤液并丢弃该洗涤液而去除;其中所述分析物在步骤(5)中通过将洗脱剂放在固体上和收集洗脱剂而分离.
26.权利要求24的方法,其中所述固体包含1-10个R10部分/nm2.
27.权利要求26的方法,其中所述固体包含0.04-4个连接部分/nm2固体.
28.权利要求24的方法,其中所述无机物质是无机金属氧化物.
29.权利要求28的方法,其中无机物质是磁响应的.
30.权利要求24的方法,其中无机物质是硅石、矾土、硅石-矾土、氧化锆、二氧化钛、受控孔玻璃或其混合物.
31.权利要求24的方法,其中无机物质是色谱级硅石.
32.权利要求24的方法,其中无机物质是硅胶.
33.权利要求24的方法,其中所述无机物质是硅石,R10是-CH2OH.
34.权利要求33的方法,其中所述硅石是硅胶.
35.权利要求33的方法,其中所述硅石是色谱级硅石.
36.权利要求24的方法,其中所述连接部分是生物素,所述分析物是抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、连接到抗生物素蛋白上的物质或连接到抗生蛋白链菌素上的物质.
37.权利要求24的方法,其中所述连接部分是抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素,所述分析物是生物素或被生物素化.
38.一种减少杂质与包含无机物质的固体的非特定连接的方法,其中无机物质包含至少一个其上发生非特定连接或造成非特定连接发生的官能团,另外其中所述无机物质是无机氧化物,所述方法包括:
(1)提供所述固体;
(2)使无机物质的所述至少一个官能团与反应物反应,以在无机物质的至少一个表面上产生部分R10,其中R10选自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH),且R10以足够的量存在于所述无机物质的表面上,使得当无机物质与包含杂质的混合物接触时,所述杂质与所述固体的非特定连接得到减少.
39.权利要求38的方法,其中R10在步骤(2)之前通过不存在于无机物质的组成中的部分或原子连接到所述无机物质上.
40.权利要求38的方法,其中R10选自-CH2OH、-CH(OH)CH3和-CH2CH2OH.
41.权利要求40的方法,其中R10是-CH2OH.
42.权利要求38的方法,其中所述无机物质是无机金属氧化物.
43.权利要求42的方法,其中无机金属氧化物是磁响应的.
44.权利要求38的方法,其中无机物质是硅石、矾土、硅石-矾土、氧化锆、二氧化钛、受控孔玻璃,且其上的官能团包括羟基.
45.权利要求38的方法,其中所述无机物质是色谱级硅石.
46.权利要求38的方法,其中所述无机物质是硅胶.
47.一种固体,包含(i)无机物质,(ii)位于所速无机物质的至少一个表面上的部分R10,和(iii)至少一个连接剂,其中所述无机物质是无机氧化物,所述R10选自-CH2OH、CH(OH2)、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH2)CH3、-CH2CH(OH2)和CH(OH)CH2(OH).
48.权利要求47的固体,其中所述至少一个连接剂是任选地被取代的二价化学基团.
49.权利要求48的固体,其中任选地被取代的化学基团是包含n个-R-基团的烃基,其中n是-R-基团的数目且n是至少为2的整数,其中n-1个-R-基团任选地被-O-、-S-、羰基、硫代羰基、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(S)-、-C(S)O-、-C(S)S-、-SC(S)-、-N(R4)-、-N(R4)C(O)-、-C(O)N(R4)-、-C(R5)=N-、-N=C(R5)-、-C(R5)=NO-、-ON=C(R5)-、-P-、-P(OH)O-、亚芳基、取代的亚芳基、亚环烷基、取代的亚环烷基、亚环链烯基、取代的亚环链烯基、二价杂环基或取代的杂环基所替代,其中R4和R5独立地是H、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、链烯基、取代的链烯基、环链烯基、取代的环链烯基、炔基、取代的炔基、环炔基、取代的环炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基.
50.权利要求47的固体,其中所述至少一个连接剂是具有从所述基团端部度量至无机物质的长度为1-30原子的二价任选地被取代的化学基团,其中所述化学基团包含至少一个-R-基团,其中所述-R-基团选自-CH2-、-C(R1)H-、-C(R2)=C(R3)-和-C≡C-,其中R1、R2和R3独立地是H、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、链烯基、取代的链烯基、环链烯基、取代的环链烯基、炔基、取代的炔基、环炔基、取代的环炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基,所述-R-基团任选地被-O-、-S-、羰基、硫代羰基、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(S)-、-C(S)O-、-C(S)S-、-SC(S)-、-N(R4)-、-N(R4)C(O)-、-C(O)N(R4)-、-C(R5)=N-、-N=C(R5)-、-C(R5)=NO-、-ON=C(R5)-、-P-、-P(OH)O-、亚芳基、取代的亚芳基、亚环烷基、取代的亚环烷基、亚环链烯基、取代的亚环链烯基、二价杂环基或取代的杂环基所替代,其中R4和R5独立地是H、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、链烯基、取代的链烯基、环链烯基、取代的环链烯基、炔基、取代的炔基、环炔基、取代的环炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基.
51.权利要求47的固体,其中所述至少一个连接剂通过醚、硫醚、酯、硫代酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、磷酸酯、膦酸酯、磷酯、氨基磷酸酯、胺、酰胺、酰亚胺、脲、硫脲、磺酰胺、亚砜、砜、二硫化物、肟、O-酰基肟、O-氨基甲酰基肟、O-酰基氧基烷基肟、O-酰基氧基烷氧基肟、O-肟基磷酸酯、O-肟基膦酸酯、O-肟基氨基磷酸酯或C=C键连接到无机物质上.
52.权利要求47的固体,其中所述至少一个连接剂由溴化氰,N-羟基琥珀酰亚胺酯,羰基二咪唑,还原胺化化合物,2-氟-1-甲基-吡啶甲苯-4-磺酸盐活化化合物,1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亚胺媒介的酰胺键形成化合物,甲苯磺酰氯,2,2,2-三氟乙烷磺酰氯,二乙烯基砜,二氢唑酮,氰尿酰氯,碘乙酰基或溴乙酰基活化化合物,马来酰亚胺,吡啶基二硫化物,环氧化合物,2-亚氨基硫代戊环5,5-二硫代-二-(2-硝基苯甲酸),酰肼,重氮盐或曼尼希缩合化合物而形成.
53.权利要求47的固体,包含1-10个R10部分/nm2固体.
54.权利要求53的固体,其中所述无机物质是硅石,R10是-CH2OH.
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