KR20040023751A - 복합 혼합물에서 선택적 흡착을 위한 고체 조성물 - Google Patents

복합 혼합물에서 선택적 흡착을 위한 고체 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 복합 혼합물의 적어도 하나의 화학적 성분이 선택적으로 흡착될 수 있는 경우 복합 혼합물에서 화학적 성분을 분리하는데 유용한 고체 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 고체는 무기 물질, 및 이 무기 물질의 적어도 한 표면에 위치하는 잔기(R10)를 포함하고, 이 때 무기 물질은 무기 산화물이고, 표면 잔기는 -CH2OH, -CH(OH)2, -CH(OH)CH3, -CH2CH2OH, -C(OH)2CH3, -CH2CH(OH)2및 -CH(OH)CH2(OH)로 구성된 군에서 선택된다. 또한, 연결기를 통해 무기 물질에 임의로 부착될 수 있는 결합 잔기는 고체의 표면에 위치할 수 있다.

Description

복합 혼합물에서 선택적 흡착을 위한 고체 조성물{SOLID COMPOSITIONS FOR SELECTIVE ADSORPTION FROM COMPLEX MIXTURES}
혼합물 중의 성분 분리는 화학, 생화학 및 분자생물학과 같은 많은 과학 분야에서 중요하다. 혼합물 중의 성분 분리는 관심있는 성분, 즉 분석물의 단리를 가능하게 한다. 분석물을 단리한 후, 이 분석물의 특성을 연구하거나 이용할 수 있다. 분리 없이는 분석물의 특성을 결정하기 어려울 수 있는데, 이는 사용되는 측정 기법이 무엇이든지 간에 관심있는 성분의 특성이 혼합물 중의 기타 성분에 의해 차단되거나 영향을 받을 수 있기 때문이다. 따라서, 분리 기법은 과학적 연구의 초석으로서 간주될 수 있다.
분석물을 함유하는 혼합물이 복합 혼합물인 경우에는 성분 분리가 어렵게 된다. 복합 혼합물의 좋은 예로는 특정 분석물을 분리 및 정제할 것이 요구되고 필요한, 생물학적 발효 배지, 세포 배양물, 유전자변형 기술로 생산된 우유, 또는 유전자변형 식물의 슬러리가 포함된다. 복합 혼합물 중의 성분 분리는 일반적으로 친화성 분리 기법에 의해 달성된다. 일반적으로 친화성 분리 기법은 분석물과는 결합하지만 혼합물 중의 기타 성분과는 실질적으로 반응하지 않도록 특이적으로 설계된 작용기를 갖는 고체상과 혼합물을 접촉시킴으로써 기타 성분을 자유롭게 제거되도록 남겨두는 것을 포함한다. 예컨대 고체상을 물 또는 완충액으로 세척함으로써 비결합 성분이 제거된 후, 분석물은 고체상과 결합된 채로 남아서 비결합 성분으로부터 분리된다. 이어서, 일반적으로 완충액 교환에 의해 분석물을 고체상으로부터 분리하여 분석물을 유리된 분자로서 회수함으로써 분석물이 단리된다.
정제에 유용한 "친화성" 기법의 부류가 개발되어 왔다. 이들 기법은 친화성 크로마토그래피, 친화성 침전, 면역친화성 분리 등 많은 명칭을 갖고 있지만, 모두 동일한 원리, 즉 특정 작용기 또는 결합 잔기가, 표적 분석물과 매우 선택적으로 결합하는 고체 지지체에 화학적으로 부착되는 원리에 의존하고 있다. 단백질 정제를 위한 가장 통상적인 결합 잔기는 프로틴 A 또는 프로틴 G와 같은 기타 단백질, 또는 단일클론성 항체, 킬레이트화된 금속 이온, 폴리펩티드 또는 작은 유기 분자이다. 단일클론성 항체는 표적 단백질에 대해 고도로 선택적일 수 있기 때문에 단백질 정제에 특히 매력적일 수 있다. 전술한 바와 같이, 분석물을 함유하는 혼합물을 결합 잔기가 부착되어 있는 친화성 고체 지지체와 접촉시킨다. 분석물은 지지체상의 결합 잔기와 결합되고, 혼합물의 나머지는 제거된다. 이어서, 분석물은용매를 교체함으로써 일반적으로 달성되는 용출에 의해 결합 잔기로부터 제거된다. 매우 높은 정제 지수가 실현될 수 있다. 친화성 기법에 관한 광범위한 문헌이 있다1-8.
단일클론성 항체의 선택 및 제조에 있어서의 최근의 발전으로, 결합 잔기로서의 단일클론성 항체에 기초한 친화성 기법이 단백질 및 생물약제의 정제를 위한 매우 유력한 기법이 되어 왔다. 단일클론성 항체는 프로틴 A 또는 프로틴 G를 리간드로서 사용하는 친화성 정제를 이용하여 세포 배양물 또는 발효물로부터 흔히 정제되는 단백질 자체이다. 새로운 작은 유기 프로틴 A 유사체도 또한 단일클론성 항체 정제에 유용한 리간드로서 기술된 바 있다.
친화성 정제는 유력한 기법인 것으로 입증되었지만, 이의 풍부한 잠재성은 충분히 인식되어 오지 못하였다. 이러한 친화성 정제가 가장 통상적으로 실시되고 있으며, 이 때 지지체는 0.05 내지 0.5mm 정도의 소형 비드로 형성되고, 종종 매질이라고 지칭되는 이 비드가 크로마토그래피 컬럼에 충전된다. 이어서, 정제할 혼합물을 컬럼에 통과시키고, 분석물을 매질에 부착된 결합 잔기와 결합시킨다. 이어서, 컬럼을 철저하게 세척하여 폐색된 혼합물을 제거한다. 이어서, 용출 용매를 컬럼에 통과시켜 용액 중의 분석물을 유리시킨다. 대규모에서 이러한 공정은 컬럼 적용시 직면하는 중량 및 난류 문제를 처리하도록 매질이 양호한 물리적 강도를 가질 것을 필요로 한다.
컬럼 크로마토그래피로서든 몇몇 다른 시스템으로서든 친화성 분리에 현재사용되고 있는 일정한 지지체는 탄수화물계 물질 또는 중합체와 같은 저표면적 물질이다. 이들 저표면적 지지체는 저용량을 가질 수 있다. 저용량 때문에, 표적 종을 회수하기 위해서는 매질을 비교적 많이 충전시킬 것이 요구된다. 그러나, 매질을 많이 충전시키면 컬럼상의 유량이 압력 강하 문제로 인해 낮은 유량으로 제한된다. 컬럼 크로마토그래피는 또한 고압하에 실시될 수도 있는데, 이 때는 보다 작은 비드가 매질의 용량을 증가시키는데 사용된다. 이들 비드는 압력을 다루기 위해 보다 높은 강도를 가져야 하기 때문에 탄수화물 겔이 가교결합되어, 생성되는 비드의 용량을 저하시킨다. 따라서, 고용량을 갖고 고압 액체 크로마토그래피에서 사용되는 경우 더욱 물리적으로 강한 친화성 지지체를 제공할 필요가 있다.
고표면적 지지체의 개발은 고용량 친화성 분리 매질을 수득하기 위한 한가지 접근법이다. 보다 높은 용량의 물질을 사용하면, 표적 종을 회수하는데 보다 적은 양의 친화성 지지체가 필요하고, 컬럼 압력 강하가 보다 적으며, 유량이 보다 높고, 폐색된 공급물 오염이 보다 적다. 고표면적은 10 내지 500m2/g의 범위일 수 있다. 고표면적을 제공할 수 있는 물질은 실리카 겔, 실리카, 알루미나, 지르코니아, 탄수화물, 및 거대 공극 아크릴 비드 같은 중합체 물질이다. 실리카 겔의 경우, 표면적은 매우 낮은 1m2/g으로부터 매우 높은 800m2/g 초과까지 변화될 수 있고, 공극 크기 모드는 매우 낮은 25Å 미만으로부터 1500Å 초과까지 변화될 수 있다. 또한, 무기 산화물계 물질은 일반적으로 보다 연성의 탄수화물계 지지체보다 물리적으로 훨씬 더 강하다.
부착된 결합 잔기에 의한 친화성 분리 기법에서 매질로서 사용되는 경우, 이들 산화물계 물질은 필수적인 넓은 표면적을 갖지만, 원하지 않는 물질의 비선택적 결합도가 높을 수 있다. 표면적의 전부가 친화성 분리에 사용되는 것은 아니고, 일부는 실제로 비선택적 흡착을 위한 표면 영역을 제공한다. 단백질은 예컨대 실리카와, 때로는 비가역적으로 그리고 비선택적으로 매우 강하게 결합하는 것으로 널리 공지되어 있다. 따라서, 결합 잔기는 매우 선택적일 수 있지만, 사용되지 않는 표면 영역은 비선택적일 것이다. 이의 순효과는 고표면적 물질의 선택성을 저하시켜 전체 공정의 정제 지수를 감소시키는 것이다. 많은 산화물 지지체, 특히 실리카 겔과 같은 실리카에 의한 이러한 비선택적 흡착은 이들 물질이 친화성 분리 지지체로서 현재 광범위하게 사용되지 않는 이유이다.
본 발명의 목적 중 하나는 비선택적 흡착을 개선시키면서 높은 선택적 친화성 결합 능력을 보유하는 고표면적 물질에 적용되는 표면 조성물을 기술하는 것이다.
이러한 조성물은 단백질과 같은 특정 생물학적 종이 유전공학적으로 처리된 유기물에 의해 합성되는 경우 생물학적 복합 혼합물로부터의 "친화성 분리"에서 큰 가치를 가질 것이다. 예컨대, 상기 복합 혼합물은 표적 단백질의 세포 또는 박테리아 생산을 위한 발효 액체배지(broth)일 수 있다. 발효 액체배지는 유기물 성장을 뒷받침하는 단백질, 탄수화물 등 뿐만 아니라 발효에 의해 생성되는 부산물의 복합 혼합물이다. 표적 종도 또한 발효로부터 생성될 수 있고, 유기물에 의해 액체배지 내에 생성된다. 몇몇 경우에는 표적 종이 세포에서 생성된다. 따라서, 세포를 균질화하고 표적을 용해시킬 필요가 있다는 사실에 의해 회수가 복잡해진다. 이들 혼합물은 표적 종 단리 및 정제를 위해서는 특히 방심할 수 없는 것이다. 발효 액체배지로부터 표적 종을 단리 및 정제하기 위한 분리 및 정제 계획은 매우 복잡하고 고가이다. 단리 및 정제 비용은 대규모 제조일 때 특히 상당하다. 이러한 문제의 간단하지 않은 속성 때문에 정제 및 단리의 분야는 광범위하다.
발명의 요약
본 발명의 고체 조성물은 무기 물질 및 이 무기 물질의 적어도 한 표면상에 위치한 잔기 R10을 포함하고, 이 때 무기 물질은 무기 산화물이며, R10기는 -CH2OH, -CH(OH)2, -CH(OH)CH3, -CH2CH2OH, -C(OH)2CH3, -CH2CH(OH)2및 -CH(OH)CH2(OH)로 구성된 군에서 선택된 것이다.
R10이 -CH2OH, -CH(OH)2, -CH(OH)CH3, -CH2CH2OH, -C(OH)2CH3, -CH2CH(OH)2및 -CH(OH)CH2(OH)로 구성된 군에서 선택된 것일 때, 고체 지지체는 복합 혼합물 중의 임의의 비분석물 성분의 비특이적 결합을 감소시키는 독특한 특징을 갖는다. R10의 일원은 0의 전하를 갖고 친수성이라는 공통적인 성질을 갖는다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않고, 고체 지지체가 그의 표면상에 위치한 R10, 즉 -CH2OH, -CH(OH)2, -CH(OH)CH3, -CH2CH2OH, -C(OH)2CH3, -CH2CH(OH)2및 -CH(OH)CH2(OH) 중의 어느 것을 갖는 경우, 상기 표면에 대한 혼합물 중의 비분석물 성분의 결합은 혼합물의 수성상 중에 잔존하는 비분석물 성분보다 낮은 엔트로피 변화를 갖는다. 표면에 대한, 용액으로부터의 임의의 성분, 예컨대 비분석물 또는 분석물 성분의 결합은 표면상에 비분석물이 국소화됨으로 인한 엔트로피 저하를 수반한다. 결합을 유리하도록 하기 위해서는, 비분석물과 표면 사이의 상호작용, 예컨대 쿨롱(Columbic) 전하 상호작용 또는 소수성 상호작용이 존재하여 표면 국소화로 인한 엔트로피 저하를 극복해야 한다. 그러나, R10의 임의의 혼합물 중 어느 하나에 의한 코팅은 친수성 표면 뿐만 아니라, 엔트로피를 감소시키는데 필요한 상호작용을 감소시켜 비분석물의 비결합을 감소시키는 0의 순전하를 가진 표면을 생성한다.
또한, 무기 물질, 이 무기 물질의 적어도 한 표면상에 위치한 잔기 R10, 및 분석물을 결합시킬 수 있는 1개 이상의 결합 잔기를 포함하는 고체도 본 발명의 범주 내에 있다. 잔기 R10은 바람직하게는 무기 산화물 표면의 일부에 위치하고, 나머지 표면상에는 결합 잔기가 위치한다. 결합 잔기는 특정 분석물과의 결합을 제공하도록 선택되고 친화성 분리를 위한 고도로 선택적인 결합을 제공하는 한편, R10기에 의해 코팅된 표면은 기타 종의 비선택적 결합을 감소시킨다. 바람직한 실시태양에서는, 무기 산화물 표면의 상당한 부분(대부분이 아니라면)이 R10기에 의해, 예컨대 기질 1nm2당 약 1 내기 10개 기의 농도로 피복되고, 나머지는 결합 잔기에 의해 피복된다.
또한, 결합 잔기가 연결기를 통해 무기 산화물 표면상에 임의적으로 위치한무기 물질을 포함하는 고체도 본 발명의 범주 내에 있다. 연결기는 연결기 화합물을 무기 산화물과 반응시키고, 이어서 연결기를 결합 잔기와 반응시킴으로써 무기 산화물 표면상에 위치될 수 있다. 따라서, 본 발명은 표면상에 연결기 기 및 R10잔기를 포함하는 무기 물질을 고려한다. 차례로, 이러한 고체는 특이적으로 설계된 결합 잔기를 분리용 연결기를 부착시킬 수 있는 최종 사용자에게 전달될 수 있다.
본 발명은 복합 혼합물 중의 화학 성분 중 1종 이상을 선택적으로 흡착할 수 있는, 복합 혼합물 중의 화학 성분을 분리하는데 유용한 고체 조성물 및 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 혼합물 중의 기타 성분의 비특이적 결합을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
도 1은 무기 물질, 표면 잔기 R10, 임의적인 연결기, 결합 잔기 및 분석물을 포함하는 본 발명의 조성물을 개략적으로 도시한다.
도 2는 실시예 1 및 2의 결과를 나타내고, 여기서 2 및 7 레인은 파마시아(Pharmacia) 3.6-9.3 광역(Broad) pI 표준물(Standard)을 나타내며, 3 및 4 레인은 실시예 1을 나타내고, 5 및 6 레인은 실시예 2를 나타낸다. 이 도면은 미처리된 통상적인 무기 산화물의 비특이적 결합을 예시한다.
도 3은 실시예 3 내지 5의 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예 6 내지 8의 결과를 나타내고, 본 발명을 예시한다.
도 5 내지 8은 본 발명의 특정 실시태양(실시예 8)을 특성화하기 위해 수행된 분석의 결과를 포함하고 있고, 여기서 도 5는 실시예 8의 확산 반사 IR 스펙트럼을 나타내며, 도 6은 비교를 위해 실시예 7에서 제조된 조성물에 대한 동 스펙트럼을 나타내고, 도 7은 실시예 8의 MAS Si29NMR 스펙트럼을 나타내고, 도 8은 실시예 8의 X선 광전자 스펙트럼 XPS를 나타낸다.
도 9는 실시예 7의 XPS 스펙트럼을 나타낸다.
도 10은 결합 잔기 부착 후 본 발명을 사용하여 실시예 9에서 제조된 컬럼으의 충전, 세척 및 용출 크로마토그램을 나타낸다.
도 11은 실시예 9에서 수행된 친화성 크로마토그래피의 용출액으로부터 수득된 정제된 토끼 다클론성 IgG의 크기 배제 크로마토그래피로부터의 유출액의 280nm에서의 흡수도를 도시한다.
도 12는 실시예 9에서 세포 액체배지 내에 고정된 출발 토끼 다클론성 IgG의 크기 배제 크로마토그래피로부터의 유출액의 280nm에서의 흡수도를 도시한다.
도 13은 도 14에 예시된 반응으로부터 R10으로서 -CH2OH를 생성하는 피복제의 제조를 도시한다.
도 14는 실리카의 일부가 아닌 규소 원자를 통해 부착된 R10(여기서, R10은 -CH2OH을 나타냄)을 가져 -Si-CH2OH가 실리카에 직접 부착되는 실리카의 제조를 나타낸다(HO-Si---는 실리카 표면상의 실란올기를 나타냄).
도 15는 도 16에 예시된 반응으로부터 R10으로서 -CH(OH)2를 생성하는 피복제의 제조를 도시한다.
도 16은 실리카의 일부가 아닌 규소 원자를 통해 간접적으로 부착된 R10(여기서, R10은 -CH2OH임)을 가져 -Si-R10기가 실리카의 표면에 부착되는 실리카의 제조를 나타낸다(HO-Si---는 실리카 표면상의 실란올기를 나타냄).
도 17은 도 18에 예시된 반응으로부터 R10으로서 하이드록시에틸을 생성하는 피복제의 제조를 도시한다.
도 18은 실리카 및 실리카의 표면에 부착된 -Si-R10(여기서, R10은 1,2-디하이드록시에틸임) 기를 포함하는(즉, R10이 실리카의 일부가 아닌 규소 원자를 통해 실리카 표면에 간접적으로 부착된) 고체의 제조 방법을 나타낸다.
도 19는 실리카 및 실리카의 표면에 부착된 -Si-R10(여기서, R10은 1,2-디하이드록시에틸임) 기를 포함하는(즉, R10이 실리카의 일부가 아닌 규소 원자를 통해 실리카 표면에 간접적으로 부착된) 고체의 제조 방법을 나타낸다.
도 20은 -Si-R10(여기서, R10은 하이드록시메틸임) 기가 실리카의 표면에 부착될 때 가교결합되는 본 발명의 실시태양을 나태낸다(HO-Si---는 실리카 표면상의 실란올기를 나타냄).
도 21은 도 22에 예시된 반응으로부터 생성된, 단일 지점에서 실리카의 표면에 부착되는 -Si-R10(여기서, R10은 하이드록시메틸을 나타냄) 기를 유도할 피복제의 제조를 나타낸다.
도 22는 -Si-R10(여기서, R10은 하이드록시메틸을 나타냄) 기가 단일 지점에서 실리카의 표면에 부착되는 본 발명의 실시태양을 도시한다(HO-Si---는 실리카 표면상의 실란올기를 나타냄).
무기 물질
본 발명을 제조하는데 적합한 무기 물질로는 크로마토그래피 매질로서 시판되는 제품이 포함된다. 이들 물질은 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 무기 물질도 또한 후술하는 결합 잔기용 지지체로서 고려될 수 있고, 때때로 본원에서는 무기 물질을 "지지체"라고 지칭한다. 일반적으로, 본 발명의 무기 물질은 무기 산화물, 보다 적합하게는 무기 금속 산화물, 실리케이트 또는 알루미노실리케이트이다. 무기 금속 산화물이 바람직하다. 본 발명에 적합한 무기 산화물은 기타 화학 작용기와 결합하거나 반응할 수 있는 유리 하이드록실기를 갖는다. 이는 표면 잔기 R10및 결합 잔기 및/또는 연결기가 반응하거나 결합하는 하이드록실기를 통해 이루어진다. 일반적으로, 적합한 무기 산화물로는 고체 무기 산화물 1nm2당 약 1 내지 약 10개의 하이드록실기를 갖는 무기 산화물이 포함된다.
바람직한 무기 금속 산화물의 예로는 크로마토그래피 등급의 실리카 또는 실리카 겔 같은 실리카, 알루미나, 실리카-알루미나, 지르코니아, 지르코네이트, 제어 공극 유리 또는 티타니아가 포함된다. 무기 금속 산화물은 바람직하게는 실리카, 더욱 바람직하게는 크로마토그래피 등급의 실리카 또는 실리카 겔이다. 또한,자기적으로 반응성인 무기 금속 산화물, 예컨대 국제 특허 공개 제 WO 98/31461 호(이의 개시내용이 본원에 참조로서 인용됨)에 개시된 실리카 산화물-피복된 자기 입자도 적합하다. 또한, 혼합된 무기 금속 산화물, 예컨대 실리카와 알루미나의 공동겔(cogel), 또는 공침전물도 사용될 수 있다. 나트륨 실리케이트로 제조된 고체가 적합한 실리케이트의 예이고, 제올라이트가 적합한 알루미노실리케이트의 예이다. 본 발명의 고체는 미립자, 섬유 및 판의 물리적 형태일 수 있다.
표면 잔기(R 10 )
전술한 바와 같이, R10기는 -CH2OH, -CH(OH)2, -CH(OH)CH3, -CH2CH2OH, -C(OH)2CH3, -CH2CH(OH)2및 -CH(OH)CH2(OH)로 구성된 군에서 선택된다. 바람직하게는, R10은 -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2OH 및 -CH(OH)CH2(OH)로 구성된 군에서 선택된 것이다. 더욱 바람직하게는, R10은 -CH2OH, -CH(OH)CH3및 -CH2CH2OH로 구성된 군에서 선택된 것이다. 가장 바람직하게는, R10은 -CH2OH이다.
잔기 R10은 적어도 무기 물질의 표면에 위치한다. "위치한다"는 R10이 출발 무기 물질의 표면의 작용기에 직접 부착될 수 있음을 의미한다. R10은 무기 물질의 주변(periphery)에 존재하는 표면 영역에 위치하거나, 또는 무기 물질의 내부로 침투하고 물질의 주변에 공극 개구부를 갖는 공극에 존재하는 표면 영역에 위치할 수 있다.
또한, R10은 무기 물질의 표면에, 2가 잔기 또는 원자(-X-)를 통해 무기 물질 표면에 부착되어 식 -X-R10의 기를 형성함으로써 "위치할 수 있다". 이 실시태양에서 2가 잔기 또는 R10결합 원자는 무기 물질의 반응물과의 반응전에 출발 무기 물질의 조성물에는 존재하지 않는다. 이 잔기 또는 원자는 R10을 발생시키기 위하여 사용되는 반응물, 예컨대 실란 반응물에서 기원한 잔류 금속 원자(예: 규소 원자)로부터 유래할 수 있다. 잔류 잔기 또는 원자는 무기 물질에 직접, 바람직하게는 무기 물질의 표면의 하이드록실 기를 통하여 부착될 수 있다. 이러한 반응물에서 -X- 기는 반응물마다 다양하지만, 금속 원자 또는 다른 화학적 잔기일 수 있다. 예컨대, X는 규소, 알루미늄, 지르코늄 등 같은 금속 원자에서 유래할 수 있다. 또한, 선택된 무기 물질에 따라 -X- 및 관련 반응물을 선택할 수 있다. 일반적으로, -X-를 함유하는 임의의 반응물은 무기 물질의 반응성 작용기와 반응할 수 있을 것이다. 무기 산화물의 경우, 전형적으로 적합한 반응물은 하이드록실 기와 반응할 수 있는 것이다.
무기 물질과 화합물, 예컨대 R10을 발생시킬 수 있는 화합물의 반응의 화학은 당해 기술분야에, 예컨대 문헌[Smith, Organic Synthesis, John Wiley & Sons, 1994]; [March, Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, Fourth Edition, 1992]; [Larock, Comprehensive Organic Transformations, John Wiley & Sons, Second Edition, 1999]; [Greene et al, Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley & Sons, Third Edition, 1999]; [Brook, Silicon in Organic, Organometallic, and Polymer Chemistry, John Wiley & Sons, 2000]; [Hermanson et al, Immobilized Affinity Lizand Techniques, 1992]; [Weetall, "Covalent Coupling Methods for Inorganic Support Materials", in Methods in Enzymology, vol. XLIV, edited by K. Mosbach, pp. 134-148, 1976]; 애보트(Abbott)의 미국 특허 제 4,298,500 호; 및 아클레스(Arkles)의 미국 특허 제 5,371,262 호에 공지되어 있으며, 이들 문헌의 개시내용이 본원에 참조로서 인용된다. 예컨대, 무기 물질의 표면에 위치하는 R10기를 포함하는 고체는 R10의 전구체 기를 함유하는 알콕시실란, 디알콕시실란 또는 트리알콕시실란 같은 반응물 또는 피복제로부터 제조될 수 있다. 예컨대, 아세톡시메틸은 하이드록시메틸의 전구체 기일 수 있다. 여기서, 피복제는 무기 물질의 표면과 반응하고, 이어서 전구체의 가수분해에 의해 부착된 R10기를 갖는 무기 물질을 생성할 수 있다.
실리카 표면에 위치하는 R10으로서 -CH2OH를 갖는 실리카를 제조하는 방법을 도 13 및 14에 나타낸다. 도 13은 실리카의 표면의 실란올 기, 즉 HO-Si-에 Si-R10(여기서 R10은 하이드록시메틸임) 기를 도입하기 위한 피복제, 아세톡시메틸트리에톡시실란(화합물(2) 참조)의 제조를 도시하고 있다(화합물(5)이 표면에 직접 부착된 Si-R10(여기서 R10은 하이드록시메틸임)을 갖는 실리카인 도 14에 나타낸 반응식 참조). 바꾸어 말하면, 도 14에는 반응물로부터 잔류하는 전술한 잔류 잔기 또는 원자 X의 일례로서 출발 무기 물질의 일부가 아닌 Si 원자를 통해 실리카의 표면에 R10기를 도입하는 방법이 도시된다.
-CH(OH)2인 R10을 포함하는 실리카를 제조하는 방법을 도 15 및 16에 나타낸다. 도 15는 실리카의 표면에 R10기로서 -CH(OH)2기를 도입하기 위한 피복제, 디아세톡시메틸트리에톡시실란(화합물(7) 참조)의 제조를 도시한다(도 16에 나타낸 반응 및 화합물(9) 참조).
도 17은 실리카의 표면에 2-하이드록시에틸을 도입하기 위한 피복제, 아세톡시에틸트리에톡시실란(화합물(11) 참조)의 제조 방법을 나타낸다.
실리카 및 실리카의 표면에 부착된 R10기로서 1,2-디하이드록시에틸을 포함하는 고체의 두 가지 제조 방법을 도 18 및 19에 도시한다.
또한, 각각의 생성된 Si-R10기가 3개의 공유 결합을 통해 무기 물질에 부착되는(3개의 실란올 기를 갖는 피복제의 반응으로부터 생성된, 도 14, 16, 18 및 19의 반응식의 최종 생성물 참조), 실란 반응물로부터의 잔류 금속(예: Si)을 통해 고체의 표면에 부착된 R10기를 갖는 무기 물질을 포함하는 고체도 본 발명의 범위에 속한다.
도 21 및 22에 나타낸 바와 같이, 또한 잔류 원자가 1 또는 2개의 공유 결합을 통해 무기 물질에 부착되거나, 또는 소정의 실시태양이 Si 원자의 가교결합을 포함하도록 하는 방식으로 피복제를 선택할 수 있을 것으로 여겨진다. 이러한 가교결합은 Si-O-Si 결합, 또는 Si-O-C(O)-O-Si, Si-O-알킬렌-O-Si 또는 Si-O-C(O)-알킬렌-O-Si 같은 다른 결합일 수 있다. 도 22의 반응식의 최종 생성물, 즉 화합물(20)은 Si-R10기가 실리카의 표면에 단일의 부착 지점을 갖는 본 발명의 고체의 한 실시태양을 예시한다. 이 실시태양은 고체 무기 물질 및 모노-에톡시실란의 반응으로 제조된다(모노-에톡시실란인 피복제의 제조에 대한 도 21 참조).
결합 잔기
본 발명의 고체는 무기 물질의 표면에, 선택적으로 연결기를 통해 부착되거나, 또는 달리 이 표면에 위치하는 적어도 하나의 결합 잔기를 추가로 포함한다. 이 결합 잔기는 다른 잔기 또는 분자계 분해물에 결합할 수 있는, 예컨데 소수성 상호작용, 공유 결합 또는 쿨롱 상호작용을 통한 결합을 할 수 있는 임의의 분자 또는 분자 분절이다. 이러한 잔기는 분리 산업 분야의 숙련자에게 널리 알려져 있다. 생분리 산업에 전형적으로 사용되는 잔기로는, 예컨대 바이오틴, 아비딘 및 스트렙타비딘, 천연이거나 천연이 아닌 단백질, 펩티드, 항원 및 핵산이 포함된다. 본 발명의 고체의 결합 잔기로서, 바람직하게는 단백질이 수용체 또는 항체이다.
또한, 본 발명의 고체에서 결합 잔기는 핵산용 혼성화 프로브(hybridization probe)를 비롯한, 리간드, 수용체, 항체, 항원, DNA 또는 RNA인 것이 바람직하다. 리간드가 아비딘 또는 스트렙타비딘인 경우, 분해물은 바이오틴이거나 바이오틴화되거나, 또는 그 역으로 될 수 있다.
결합 잔기는 당해 기술분야에 알려진 방법을 이용하여 무기 물질에부착된다(예컨대, 문헌[Hermanson et al,Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, 1992] 및 R10잔기의 부착에 대하여 전술한 다른 문헌 참조). 무기 산화물을 포함하는 고체에서, 결합 잔기는 출발 무기 산화물에 표면 작용기, 예컨대 하이드록실과의 반응을 통해 부착될 수 있다.
또 다르게는, 결합 잔기는 연결기를 통해 무기 물질에 부착될 수 있다. 연결기는 임의로 치환된 2가 화학 기일 수 있다. 이러한 임의로 치환된 2가 화학 기는 n-R- 기를 포함할 수 있으며, 이 때 n은 -R- 기의 개수이고, n은 1 이상의 정수, 바람직하게는 30 이하, 더욱 바람직하게는 15 이하의 정수이다. 더욱 전형적으로는, 2가 화학 기는 결합 잔기에서 무기 물질까지 측정된 길이에서 약 1 내지 약 30개의 원자, 바람직하게는 약 1 내지 약 20개의 원자, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 15개의 원자로 이루어진다. 화학 기 -R-은 -C(R1)H-, -C(R2)=C(R3)- 및 -C=C-로 구성된 군에서 선택될 수 있고, 이 때 R1, R2및 R3은 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알키닐, 치환된 사이클로알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬 또는 치환된 아르알킬이고, 상기 -R- 기는 -O-, -S-, 카보닐, 티오카보닐, -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -C(S)S-, -SC(S)-, -N(R4)-, -N(R4)C(O)-, -C(O)N(R4)-, -C(R5)=N-, -N=C(R5)-, -C(R5)=NO-, -ON=C(R5)-, -P-, -P(OH)O-, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 사이클로알킬렌, 치환된 사이클로알킬렌, 사이클로알케닐렌, 치환된 사이클로알케닐렌, 2가 헤테로사이클릴 또는 2가 치환된 헤테로사이클릴(이 때, R4및 R5는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알키닐, 치환된 사이클로알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬 또는 치환된 아르알킬이다)로 임의로 치환된다. 화학 기의 예로는 n-R- 기를 포함하는 "하이드로카빌"이 있고, 이 때 n은 전술한 바와 같고, 적어도 하나의 -R- 기는 -CH2-이고, (n-1)-R- 기는 전술한 R 기, 예컨대 -O-, -S- 등으로 임의로 치환된다.
본원에 사용되는 "치환된"은 치환된 R 기의 주된 화학적 특징, 예컨대 하이드로카빌의 경우 탄화수소 특징을 변경시키지 않는 측쇄 치환기를 의미한다.
용어 "알킬"은 포화된 분지되거나 분지되지 않은 하이드로카빌 라디킬, 바람직하게는 1 내지 30개, 더욱 바람직하게는 1 내지 20개, 더더욱 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자로 이루어진 하이드로카빌 라디칼을 의미한다. "알킬"의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, s-부틸, 이소부틸, t-부틸, n-펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 1,1-디메틸프로필, n-헥실, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 1,1-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 이소헥실 및 네오헥실이 포함된다. 용어 "사이클로알킬"은 포화된 환상 하이드로카빌 라디칼, 바람직하게는 3 내지 10개, 더욱 바람직하게는 3 내지 6개의 탄소 원자로 이루어진 하이드로카빌 라디칼을 의미한다. "사이클로알킬"의 예로는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 비사이클로헵틸 및 데칼린이 포함된다. "알케닐"은 적어도 하나의 C=C 결합을 갖는 분지되거나 분지되지 않은 하이드로카빌 라디칼이고, 이 때 하이드로카빌 라디칼은 바람직하게는 2 내지 30개, 더욱 바람직하게는 2 내지 20개, 더더욱 바람직하게는 2 내지 6개의 탄소 원자로 이루어진다. "알케닐"의 예로는 비닐, 알릴, 1-프로페닐, 이소프로페닐, 2-부테닐, 1,3-부타디에닐, 3-펜테닐 및 2-헥세닐이 포함된다. "사이클로알케닐"은 적어도 하나의 C=C 결합을 갖는 환상 하이드로카빌 라디칼, 바람직하게는 3 내지 10개, 더욱 바람직하게는 3 내지 6개의 탄소 원자로 이루어진 라디칼을 가리킨다. "알키닐"은 적어도 하나의 -C≡C- 결합을 갖는 분지되거나 분지되지 않은 하이드로카빌 라디칼, 바람직하게는 2 내지 30개, 더욱 바람직하게는 2 내지 20개, 더더욱 바람직하게는 2 내지 6개의 탄소 원자로 이루어진 라디칼을 가리킨다. "알키닐"의 예로는 에티닐, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 2-부티닐, 3-부티닐 및 2-펜텐-4-이닐이 포함된다. "사이클로알키닐"은 적어도 하나의 -C≡C- 결합을 갖는 환상 하이드로카빌 라디칼, 바람직하게는 3 내지 10개, 더욱 바람직하게는 3 내지 6개의 탄소 원자로 이루어진 라디칼을 가리킨다. "사이클로알키닐"의 예로는 펜티닐 및 헥시닐이 포함된다. "아릴"은 방향족 환상 하이드로카빌 라디칼, 바람직하게는 6 내지 14개의 탄소 원자로 이루어진 라디칼이다. "아릴"의 예로는 페닐, 나프틸, 안트르아실 및 펜안트릴이 포함되고, 페닐이 바람직한 아릴이다. "아르알킬"은 하나 이상의 아릴 라디칼로 치환된 알킬 라디칼이다.
"아르알킬"의 예로는 벤질, 펜에틸, 디페닐메틸 및 트리틸이 포함되고, 벤질이 바람직한 아르알킬이다. "2가 헤테로사이클릴"은 O, S 또는 N 원자, 또는 O, S 및/또는 N 원자의 혼합물 중에서 선택된 1 내지 4개의 고리 원자와 함께, 전형적으로 3 내지 10개, 바람직하게는 3 내지 7개, 더욱 바람직하게는 4 내지 6개의 고리 원자를 갖는 2가 환상 라디칼이다. 2가 환상 헤테로사이클릴의 예로는 티이렌, 옥시란, 아지리딘, 1H-아지린, 2H-아지린, 2H-티에트, 티에탄, 2H-옥세트, 옥세탄, 아제트, 아제티딘, 1,2-옥사제티딘, 티오펜, 푸란, 피롤, 이미다졸, 옥사졸, 이속사졸, 티아졸, 이소티아졸, 피라졸, 1,3-디옥솔란, 1,2,3-티아디아졸, 1,3,4-티아디아졸, 1,2,4-티아디아졸, 1,2,3-옥사디아졸, 1,2,4-옥사디아졸, 1,3,4-옥사디아졸, 1,2,5-옥사디아졸, 1,2,3-트리아졸, 1,2,4-트리아졸, 테트라졸, 옥사디아졸, 피리딘, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퀴놀리진, 퀴나졸린, 프테리딘, 카바졸, 벤족사졸, 1,3-옥사진, 2H-1,3-옥사진, 페나진, 페노티아진, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 벤조[b]푸란, 벤조[b]티오펜, 인돌, 이소인돌, 인다졸, 푸린, 이소벤조푸란, 테트라하이드로푸란, 1,4-디옥산, 피롤리딘, 테트라하이드로피란, 1,2-디하이드로피리딘, 1,4-디하이드로피리딘, 피페리딘, 피페라진, 모폴린, 티오모폴린, 크로만, 이소크로만, 크로멘, 1H-아제핀, 3H-아제핀, 1,2-디아제핀, 1,3-디아제핀, 1,4-디아제핀, 트리아제핀 및 아조신의 2가 라디칼이 포함된다. "헤테로아릴"은 방향족 헤테로사이클 라디칼이다. "알킬렌", "알케닐렌", "알키닐렌", "사이클로알킬렌", "사이클로알케닐렌" 및 "아릴렌"은 각각 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 및 아릴 라디칼의 2가 동등물이다.
"치환된 알킬"은 하이드록시, 설프하이드릴, 알콕시, 알킬티오, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, N,N-아릴알킬아미노, 디아릴아미노, 아지도, 아미디노, 우레이도, 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 니트로, 시아노, 아실(바람직하게는 아세틸 및 벤조일), 티오아실, 알킬설피닐, 알킬설포닐, 알킬설폰아미도, 알킬설파모일, 카복실, 알킬카보닐옥시(바람직하게는 아세톡시), 아릴카보닐옥시(바람직하게는 벤조일옥시), 알콕시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 카바모일, 아릴(바람직하게는 페닐), 스티릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 및 헤테로사이클릴(바람직하게는 헤테로아릴)로 구성된 군에서 선택된 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 3개의 치환기로 치환된 알킬이다.
"치환된 알케닐"은 하이드록시, 설프하이드릴, 알콕시, 알킬티오, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, N,N-아릴알킬아미노, 디아릴아미노, 아지도, 아미디노, 우레이도, 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 니트로, 시아노, 아실(바람직하게는 아세틸 및 벤조일), 티오아실, 알킬설피닐, 알킬설포닐, 알킬설폰아미도, 알킬설파모일, 카복실, 알킬카보닐옥시(바람직하게는 아세톡시), 아릴카보닐옥시(바람직하게는 벤조일옥시), 알콕시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 카바모일, 아릴(바람직하게는 페닐), 스티릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 및 헤테로사이클릴(바람직하게는 헤테로아릴)로 구성된 군에서 선택된 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 3개의 치환기로 치환된 알케닐이다.
"치환된 알키닐"은 하이드록시, 설프하이드릴, 알콕시, 알킬티오, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, N,N-아릴알킬아미노, 디아릴아미노, 아지도, 아미디노, 우레이도, 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 니트로, 시아노, 아실(바람직하게는 아세틸 및 벤조일), 티오아실, 알킬설피닐, 알킬설포닐, 알킬설폰아미도, 알킬설파모일, 카복실, 알킬카보닐옥시(바람직하게는 아세톡시), 아릴카보닐옥시(바람직하게는 벤조일옥시), 알콕시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 카바모일, 아릴(바람직하게는 페닐), 스티릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 및 헤테로사이클릴(바람직하게는 헤테로아릴)로 구성된 군에서 선택된 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 3개의 치환기로 치환된 알키닐이다.
"치환된 사이클로알킬"은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 하이드록시, 설프하이드릴, 알콕시, 알킬티오, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, N,N-아릴알킬아미노, 디아릴아미노, 아지도, 아미디노, 우레이도, 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 니트로, 시아노, 아실(바람직하게는 아세틸 및 벤조일), 티오아실, 알킬설피닐, 알킬설포닐, 알킬설폰아미도, 알킬설파모일, 카복실, 알킬카보닐옥시(바람직하게는 아세톡시), 아릴카보닐옥시(바람직하게는 벤조일옥시), 알콕시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 카바모일, 아릴(바람직하게는 페닐), 스티릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 및 헤테로사이클릴(바람직하게는 헤테로아릴)로 구성된 군에서 선택된 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 3개의 치환기로 치환된 사이클로알킬이다.
"치환된 사이클로알케닐"은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 하이드록시, 설프하이드릴, 알콕시, 알킬티오, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, N,N-아릴알킬아미노, 디아릴아미노, 아지도, 아미디노, 우레이도, 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 니트로, 시아노, 아실(바람직하게는 아세틸 및 벤조일), 티오아실, 알킬설피닐, 알킬설포닐, 알킬설폰아미도, 알킬설파모일, 카복실, 알킬카보닐옥시(바람직하게는 아세톡시), 아릴카보닐옥시(바람직하게는 벤조일옥시), 알콕시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 카바모일, 아릴(바람직하게는 페닐), 스티릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 및 헤테로사이클릴(바람직하게는 헤테로아릴)로 구성된 군에서 선택된 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 3개의 치환기로 치환된 사이클로알케닐이다.
"치환된 사이클로알키닐"은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 하이드록시, 설프하이드릴, 알콕시, 알킬티오, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, N,N-아릴알킬아미노, 디아릴아미노, 아지도, 아미디노, 우레이도, 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 니트로, 시아노, 아실(바람직하게는 아세틸 및 벤조일), 티오아실, 알킬설피닐, 알킬설포닐, 알킬설폰아미도, 알킬설파모일, 카복실, 알킬카보닐옥시(바람직하게는 아세톡시), 아릴카보닐옥시(바람직하게는 벤조일옥시), 알콕시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 카바모일, 아릴(바람직하게는 페닐), 스티릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 및 헤테로사이클릴(바람직하게는 헤테로아릴)로 구성된 군에서 선택된 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 3개의 치환기로 치환된 사이클로알키닐이다.
"치환된 아릴"은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 하이드록시, 설프하이드릴, 알콕시, 알킬티오, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, N,N-아릴알킬아미노, 디아릴아미노, 아지도, 아미디노, 우레이도, 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 니트로, 시아노, 아실(바람직하게는 아세틸 및 벤조일), 티오아실, 알킬설피닐, 알킬설포닐, 알킬설폰아미도, 알킬설파모일, 카복실, 알킬카보닐옥시(바람직하게는 아세톡시), 아릴카보닐옥시(바람직하게는 벤조일옥시), 알콕시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 카바모일, 스티릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 아릴(바람직하게는 페닐) 및 헤테로사이클릴(바람직하게는 헤테로아릴)로 구성된 군에서 선택된 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 3개의 치환기로 치환된 아릴이다.
"치환된 헤테로사이클릴"은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 하이드록시, 설프하이드릴, 알콕시, 알킬티오, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, N,N-아릴알킬아미노, 디아릴아미노, 아지도, 아미디노, 우레이도, 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 니트로, 시아노, 아실(바람직하게는 아세틸 및 벤조일), 티오아실, 알킬설피닐, 알킬설포닐, 알킬설폰아미도, 알킬설파모일, 카복실, 알킬카보닐옥시(바람직하게는 아세톡시), 아릴카보닐옥시(바람직하게는 벤조일옥시), 알콕시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 카바모일, 아릴(바람직하게는 페닐), 스티릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 및 헤테로사이클릴(바람직하게는 헤테로아릴)로 구성된 군에서 선택된 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 3개의 치환기로 치환된 헤테로사이클릴 라디칼이다.
"치환된 아릴렌", "치환된 사이클로알킬렌", "치환된 사이클로알케닐렌", "치환된 2가 헤테로사이클릴" 및 "치환된 아르알킬"은 각각 "치환된 아릴", "치환된 사이클로알킬", "치환된 사이클로알케닐" 및 "치환된 헤테로사이클릴"의 2가 동등물이다.
연결기의 기 -R-과 무기 물질을 연결하는 결합은 연결기와 무기 물질을 반응시키는 데 사용된 화학에 따라 다르다. 이 결합은 에테르, 티오에테르, 에스테르, 티오에스테르, 카보네이트, 카바메이트, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포에스테르, 포스포르아미데이트, 아민, 아미드, 이미드, 우레아, 티오우레아, 설폰아미드, 설폭사이드, 설폰, 디설파이드, 옥심, O-아실 옥심, O-카바모일 옥심, O-아실옥시알킬 옥심, O-아실옥시알킬옥시 옥심, O-옥시미노포스페이트, O-옥시미노포스포네이트, O-옥시미노포스포르아미데이트 또는 -C=C- 결합일 수 있다. 또한, 화학 기 -R-과 결합 잔기를 연결하는 결합은 전술한 결합 중의 하나일 수 있다.
연결기를 물질(예: 무기 물질)에 반응시키는 화학은 문헌상 널리 기술되어 있다(문헌[Hermanson et al,Immobilized Affinity Ligand Techniques, 1992 and Weetall,Methods in Enzymology, vol. XLIV, pp. 134-148, 1976] 참조). 연결기를 무기 물질에 반응시키는 구체적인 화학은 사용되는 무기 물질과 연결기에 따라 다르다. 또한, 연결기를 결합 잔기에 반응시키는 화학은 사용되는 연결기와 결합 잔기에 따라 다르다. 적합한 연결기/결합 잔기 커플링 화학의 특정 예를 하기 표 1에 나타낸다. 표 1에 따르면, 결합 잔기는 결합 잔기의 아미노, 설프하이드릴, 카보닐, 하이드록시 기, 또는 활성 수소 원자를 통해 연결기에 커플링될 수 있다.
연결기를 포함하는 고체 지지체를 제조하는데 있어서, 무기 물질에 R10기를 첨가하는 것과 관련한 연결기의 형성 순서를 변경할 수 있다. R10은 연결기를 부착한 후 무기 물질 표면에 형성시키거나, 연결기를 반응시키기 전에 형성시킬 수 있다. 다르게는, R10또는 연결기 중 하나 또는 전부를 형성시키고/형성시키거나, 이후 반응하여 최종 R10및/또는 연결기를 형성시키는 전구체에 부착될 수 있다.
무기 물질 표면의 연결기의 농도는 변경될 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 결합 잔기는 지지체의 표면적의 큰 영역을 "가릴 수 있는" 많은 단백질 분자들을 포함한다. 그 결과, 지지체 표면의 연결기 부위의 농도가 보다 높을 필요가 없다. 농도는 계획된 결합 잔기/분석물 착체의 크기를 기준으로 최적화될 수 있다.
R10및 결합 잔기의 농도를 결정하는 요인으로는 R10기 및 결합 잔기의 종류, 무기 물질 표면의 반응성 부위의 농도, 연결기의 농도 및 분석물의 종류를 들 수 있다.
일반적으로, R10의 농도는 BET에 의해 측정된 표면적을 기준으로 지지체 표면적 nm2당 약 1 내지 약 10개일 수 있다. 특정 실시태양에서, 결합 잔기 농도는 주로 조성물을 사용하는 경우 회수하고자 하는 분석물에 따라 좌우된다. 전술한 바와 같이, 결합 잔기의 농도는 임의적으로 사용되는 연결기의 농도에 따라 좌우될 수도 있다. 그러나, 결합 잔기의 농도는 일반적으로 nm2당 0.04 내지 약 4개일 수 있다. 또한, 결합 잔기가 연결기에 항상 1:1의 화학량론으로 부착되는 것은 아니다. 특정 실시태양에서, 예컨대 결합 잔기가 대형 단백질 분자로부터 제조되는 경우, 결합 잔기는 다수개의 연결기에 의해 부착될 수 있다. 보다 적은 결합 잔기를 사용하는 다른 실시태양에서는, 보다 적은 화학량론적 양의 결합 잔기가 사용되고 반응하지 않는 연결기는 "캡핑"되어 본 발명을 이용하여 분리하려는 경우 방해가 되지 않게 한다.
또한, R10및 결합 잔기의 양은 출발 무기 물질 상에서 반응하거나 R10, 결합 잔기 및/또는 임의의 연결기에 의해 "덮히는(covered)" 작용기의 수에 따라 결정될 수 있다. 예컨대, 상기 무기 물질의 표면 하이드록시 기의 약 50 내지 약 99%가 R10표면 잔기로 덮힐 수 있고, 표면 하이드록시 기의 약 1 내지 약 50%가 연결기를 통해 무기 물질에 임의적으로 부착된 결합 잔기로 덮힐 수 있다.
본 발명의 고체의 특정 실시태양에서는, 상기 무기 물질의 표면 하이드록시 기의 약 75 내지 약 99%가 R10표면 잔기로 덮히고, 표면 하이드록시 기의 약 1 내지 약 25%가 연결기를 통해 무기 물질에 직접 또는 간접적으로 부착된 결합 잔기로 커된다.
전술한 바와 같이, 하나 이상의 결합 잔기 및 R10을 포함하는 본 발명의 고체를 사용하여 결합 잔기에 결합된 공지된 분석물을 단리할 수 있다. 따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 혼합물 중의 하나 이상의 다른 성분과 혼합된 분석물을 단리하는 방법을 포함한다:
1. 본 발명의 고체를, 하나 이상의 결합 잔기가 분석물에 특이적 친화성을 갖는 혼합물과 접촉시키는 단계;
2. 분석물을 하나 이상의 결합 잔기에 결합시키는 단계;
3. 분석물이 결합된 고체로부터 하나 이상의 다른 성분을 제거하는 단계;
4. 고체를 회수하는 단계; 및
5. 고체로부터 분석물을 단리하는 단계.
본 발명의 방법의 실시태양에서, 결합 잔기는 목적하는 분석물로의 특이적 결합을 제공하기에 충분한 양으로 존재한다. 하나 이상의 다른 성분은 단계 (3)에서 고체를 유체로 세척하고 세척물을 페기함으로써 제거되고; 분석물은 단계 (5)에서 용리액을 고체에 배치하고 용리액을 수거함으로써 단리된다.
분석물을 단리하는 방법에서는, 무기 물질 표면의 하이드록시 기의 약 50 내지 약 99%가 표면잔기로 덮히고, 표면의 하이드록시 기의 약 1 내지 50%가 연결기를 통해 무기 물질에 직접 또는 간접적으로 부착된 결합 잔기로 덮히는 것이 바람직하다.
또한, 분석물을 분리하는 방법은 무기 물질 표면의 하이드록시 기의 약 75 내지 약 99%가 표면잔기로 덮히고 표면의 하이드록시 기의 약 1 내지 약 25%가 연결기를 통해 무기 물질에 직접 또는 간접적으로 부착된 결합 잔기로 덮히는 것이 바람직하다.
분석물을 분리하는 방법의 바람직한 실시태양에서, 무기 물질은 실리카 겔 또는 크로마토그래피 등급 실리카 겔이다. 더욱 바람직하게는, 무기 물질은 실리카 겔이다.
또한, 본 발명은 분석물을 함유하는 혼합물 중에서 불순물(불순물은 비분석물 성분, 즉 분석물 이외의 종이다)의 비특이적 결합을 발생시키거나 비특이적 결합을 유도하는 하나 이상의 작용기를 포함하는 무기 물질을 포함하는 고체로의 비특이적 결합을 감소시키는 방법을 포함한다. 무기 물질은 전술한 무기 산화물을 포함하고 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
1. 고체를 제공하는 단계; 및
2. 하나 이상의 작용기를 반응물질과 반응시켜 무기 물질의 하나 이상의 표면에 잔기 R10(여기서, R10은 -CH2OH, -CH(OH)2, -CH(OH)CH3, -CH2CH2OH, -C(OH)2CH3, -CH2CH(OH)2및 -CH(OH)CH2(OH)로 구성된 군에서 선택된다)을 형성하는 단계.
비특이적 결합을 감소시키는 방법에서, R10은 바람직하게는 -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2OH, 및 -CH(OH)CH2(OH)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, R10은 -CH2OH, -CH(OH)CH3및 -CH2CH2OH로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, R10은 -CH2OH이다. R10은 무기 물질이 불순물을 포함하는 혼합물과 접촉하는 경우 불순물의 고체로의 비특이적 결합을 감소시키기에 충분한 양으로 무기 물질의 표면에 존재한다.
이 방법은 표면에 위치한 하이드록실 작용기를 갖는 무기 금속 산화물, 실리케이트 또는 알루미노실리케이트에 대한 비특이적 결합을 감소시키는 데 특히 유용하다. 특히, 실리카(실리카 겔 및 크로마토그래피 등급 실리카) 같은 무기 금속 산화물, 알루미나, 실리카-알루미나, 산화지르코늄, 지르코네이트, 제어 공극 유리, 산화티탄, 공침전물 및 이들의 혼합물에 특히 유용하다. 또한, 이 방법은 자기적으로 반응하는 무기 산화물(예컨대, 실리카 산화물-피복된 자기 입자)에도 유용하다.
고체 지지체로의 비선택적 결합을 최소화하기 위해 고려되어야 하는 지지체 표면으로의 단백질 또는 다른 종의 결합에는 3가지 유형이 있다.
지지체의 표면 전하는 흡착의 수행 pH에서 이상적으로는 0이어야 한다. 이는, 단백질이 단백질 중에 과량의 -COOH 또는 -NH2기로 인한 총 전하를 보유하기 때문이다. pH가 약 7인 단백질의 착체 혼합물에 있어서, 혼합물 중의 단백질이 7 미만의 등전하점을 갖는 경우 음(-)의 총 전하를 가질 것이고, 반대로 혼합물 중의 단백질이 7 초과의 등전하점을 갖는 경우 양(+)의 총 전하를 가질 것이다. 반응하지 않은 실리카 표면은 약 2의 등전하점을 가지므로, pH 7에서 착체 혼합물과 접촉하는 경우 강한 음(-) 전하를 띠게 되어, 양(+) 전하의 단백질은 실리카 표면에 비선택적으로 흡착될 것이다. 이는 단백질의 실리카 표면으로의 강한 비선택적 결합을 설명한다. 따라서, 전술한 바와 같이, 지지체의 표면 전하는 흡착의 수행 pH에서 이상적으로는 0이어야 한다.
최소화되어야 하는 결합 상호작용의 제 2 유형은 소수성 결합이다. 소수성 상호작용은 단일 위치에서의 정전기 또는 쌍극성 상호작용보다 약하지만, 다수의 인접하는 부위 사이의 상호작용이 합쳐지는 경우 그 정도가 상당할 수 있다. 소수성 상호작용은 용매의 염 농도가 비교적 높은 경우 우세해진다. 염의 이온은 하전된 표면과 상호작용하여 단백질로부터 "전하를 스크리닝"할 수 있다. 고염의 존재는 표면과의 정전기적 상호작용을 감소시키지만, 소수성 상호작용은 표면이 소수성 특성인 경우 우세해진다. 따라서, 이러한 상호작용을 최소화시키기 위해서는 소수성 표면 조성물을 지지체에 사용하지 않아야 한다.
단백질의 표면으로의 결합 상호작용의 제 3 유형은 수소 결합, 또는 쌍극성 상호작용이다. 흥미롭게도, 용매가 물인 경우, 이 상호작용은 엔트로피의 측면에서 표면보다 용매를 선호할 것이다. 즉, 단백질이 수소 결합을 통해 표면으로 결합되거나 역시 수소 결합 상호작용으로 수성 시스템의 용액으로서 잔존하는 "선택성"을 갖는 경우, 보다 높은 엔트로피 상태로 인해 용액 형태가 선호된다. 따라서, 수용액으로부터 단백질을 정제하기 위해 쌍극성 조성의 표면은 비선택적 결합을 최소화시키는데 유리하다. 이러한 표면은 전형적으로 낮은 정전기 전하 밀도에서 친수성이다.
본 발명은 이들 3개의 상호작용을 다루고 있으며, 본 발명의 신규한 특징 중 하나는 본 발명이 수성 시스템으로부터 단백질을 정제하기 위해 매우 낮은 표면 전하 밀도를 갖는 친수성 표면이 존재하는 표면 조성물이라는 점이다. 이러한 표면 조성물은 표면을 덮는 무기 산화물 지지체, 예컨대 실리카, 바람직하게는 -CH2OH, -CH(OH)2, -CH(OH)CH3, -CH2CH2OH, -C(OH)2CH3, -CH2CH(OH)2및 -CH(OH)CH2(OH), 바람직하게는 -CH2OH와 같은 R10기를 갖는 실리카 겔을 화학적으로 개질시킴으로써 수득된다. 이러한 R10기는 친수성이나 매우 약한 산으로서, R10기는 본질적으로 약 12미만의 pH에서 해리되지 않아 전하를 띠지 않는다. 단백질의 착체 혼합물이 이러한 표면 조성물과 함께 존재하는 경우, 전하 상호작용이 최소화되지만, 수소 결합 상호작용은 용매화된 단백질이 표면에 결합된 단백질 수소보다 높은 엔트로피 상태를 가지므로 수 용매로부터 수소 결합을 선호하게 된다. 이어서, 이러한 표면 조성물은 원치 않는 단백질의 고 용량 친화성 지지체로의 비선택적 결합을 최소화시켜, 고 용량의 높은 정제 지수를 수득하게 한다.
또한, 본 발명의 범주에는 무기 물질의 표면에 위치한 R10잔기 및 하나 이상의 연결기를 포함하는 고체가 포함된다. 이러한 고체는 고체 사용자에게 "그 자체"로 판매될 수 있는 중간체로서 고려될 수 있다. 목적하는 분석물을 단리하기 전에, 사용자는 결합 잔기를 연결기에 반응시킬 수 있다. 또한, 연결기는 임의적으로 캡핑되거나, 결합 잔기와 반응시키기 전에 추가의 화학성을 요구하는 전구체 형태일 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 일부 실시태양을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 발명은 본원에 개시된 본 발명의 기술사상 또는 본질적 특성에서 벗어나지 않고 하기 실시예에 의해 설명되지 않은 실시태양으로 구현될 수 있다. 예컨대, 본 발명은 당해 분야의 숙련자에 의해 청구의 범위에 기술된 바와 같이 실행될 수 있으며, 청구의 범위에 기재된 구성요소와 동등한 구성요소를 갖는 임의의 실시태양은 본 발명의 청구의 범위의 범주에 포함된다.
실시예 1 및 실시예 2
본 실시예는 종래 기술의 순수 피복되지 않은 하전된 실리카 표면이 주로 등전하점 및 실리카의 표면적을 기본으로 단백질을 강하게 흡착함을 보여준다. 두가지 유형의 실리카를 시험하였다: 실시예 1 및 실시예 2. 실시예 1은 150℃에서 4시간 동안 가열처리후 표면적이 161㎡/g인 낮은 표면적의 실리카 겔이다(미세 공극=73㎡/g, 중간 공극=88㎡/g, 공극 부피=0.373cc/g, 평균 공극 지름=93Å). 실시예 2는 150℃에서 4시간 동안 가열처리후 표면적이 253㎡/g인 높은 표면적/공극 부피 실리카 겔이다(미세 공극=35㎡/g, 중간 공극=218㎡/g, 공극 부피=2.445cc/g, 평균 공극 지름=387Å). 순수 실리카 시료를 수용액의 단백질 착체 혼합물과 접촉시키는 과정을 하기에 기술한다. 수득된 상층액에 대해 등전하 초점화(focussing) 겔 전기영동을 수행하여 단백질 흡착을 분석하였다.
파마시아 3.6-9.3 광역 pI 칼리브레이션 키트(제품번호 17-0471-01)의 바이알(단백질 325㎍/바이알)을 에펜도르프(eppendorf) 관에서 DI H2O 200㎕에 용해시켰다. 상기 실시예 1 0.005g을 첨가하였다. 또다른 에펜도르프 관에서, 파마시아 3.6-9.3 브로드 pI 칼리브레이션 키트(제품번호 17-0471-01)의 바이알(단백질 325㎍/바이알)을 DI H2O 200㎕에 용해시킨 후, 상기 실시예 2 0.005g을 첨가하였다. 두 시료를 모두 1시간 동안 반복 교반하였다. 이들 시료에 대하여 파마시아 파스트겔(Pharmacia PhastGel) 장치에서 3-9 등전하 초점화 겔 전기영동을 수행하였다.이 결과를 도 2에 나타냈고, 이 때 레인별 종류는 하기와 같았다:
레인 종류
2, 7파마시아 3.6-9.3 광역 pI 표준물
3, 4실시예 1
5, 6실시예 2
도 2를 통해 상기 실시예 1 및 실시예 2와 접촉한 시료로부터 띠(band)(단백질)가 제거되었음을 알 수 있고, 이는 이들 단백질이 실리카 표면에 흡착되었음을 의미한다. 높은 표면적 실리카(실시예 2)는 5.9 초과의 등전하점을 갖는 모든 단백질을 흡착하지만, 낮은 표면적 실리카(실시예 1)는 보다 높은 pI의 단백질만을 흡착하였다. 이러한 결과를 통해, 피복되지 않은 실리카는 주로 강한 정전기 상호작용을 통해 단백질과 결합하고, 이 pH(약 5.5로 추정)에서 표면은 음(-)으로 하전됨을 명백히 알 수 있다.
실시예 3, 실시예 4 및 실시예 5
소수성 처리된 지지체 상의 비선택적 결합
본 실시예는 실리카가 소수성 기, 메틸 또는 옥틸 기로 피복되는 경우, 특히 완화된 용매의 이온강도(약 0.1M 염)에서 강한 흡착이 발생함을 보여준다. 실시예 3은 150℃에서 2시간 동안 활성화된 50nm의 공극 중위를 갖는, 더블유. 알. 그레이스 앤드 캄파니(W. R. Grace & Co.)에서 시판중인 순수 피복되지 않은 넓은 공극 실리카, XWP-겔 P 005(SA=72㎡/g)이었다.
실시예 4는 후술하는 바와 같이 메틸 기로 피복시킨 실시예 3의 실리카이었다. 실시예 5는 후술하는 바와 같이 옥틸 기로 피복시킨 실시예 3의 실리카이었다. 실시예 4는 다음과 같이 제조하였다. 250㎖의 둥근 바닥 플라스크에 50㎖의 톨루엔 및 6.16g의 메틸트리에톡시실란을 첨가하였다. 이어서, 10.1g의 실시예 3을 톨루엔/메틸트리에톡시실란 용액에 첨가하였다. N2를 5분동안 공기를 제거시키고 전체 반응중 지속시켰다. 이어서, 시료를 여과하고 50㎖의 톨루엔으로 3회 세척하였다. 시료를 50㎖의 톨루엔 속으로 재슬러리시킨 다음, 여과하고 50㎖의 톨루엔으로 세척하였다. 시료를 110℃에서 건조시킨 다음, 150℃에서 4시간 동안 하소시켰다.
실시예 5는 다음과 같이 제조하였다. 10.1g의 실시예 3을 용매로서 13.25g의 톨루엔 중에 용해된 0.53g의 옥틸트리에톡시실란을 사용하여 초기 습윤도로 함침시켰다. 이어서, 시료를 2시간 동안 후드에서 공기 건조시키고, 110℃에서 1시간 동안 건조시킨 다음 150℃에서 4시간 하소시켰다.
0.1M NaCl에서 단백질 흡수도는 다음과 같이 측정되었다. 실시예 4 및 5는 소수성이므로 단백질 용액과의 양호한 접촉을 담보하기 위해 습윤화 과정이 필요하였다. 에펜도르프 관에 0.014g의 실시예 3을 대조용으로 첨가하였다. 이어서, 1㎖의 에탄올을 첨가하고, 교반하고 원심분리하여 상청액을 제거시켰다. 0.5㎖의 에탄올 및 0.5㎖의 DI H2O를 첨가하고, 교반하고 원심분리하여 상청액을 제거시켰다. 0.25㎖의 에탄올 및 0.75㎖의 DI H2O를 첨가하고, 교반하고, 원심분리하여 상청액을 제거시켰다. 1㎖의 DI H2O를 첨가하고, 교반하고, 원심분리하여 상청액을제거시켰다. DI H2O 세척을 4회 이상 반복하였다. 0.1M NaCl + 0.02M PBS(pH=7.4)를 첨가하고, 교반하고, 원심분리하여 상청액을 제거시켰다. 0.1M NaCl + 0.02M PBS(pH=7.4)를 사용하여 4회 이상 세척하였다. 두 바이알의 시그마(Sigma) IEF 믹스 3.6-9.3 등전 초점화 마커(제품번호 I-3018)를 500㎕의 0.1M NaCl + 0.02M PBS(pH=7.4)에 용해시켰다. 용해된 IEF 믹스를 에펜도르프 관에 첨가하였다.
또 다른 에펜도르프 관에 0.014g의 실시예 4를 첨가하였다. 실시예 3과 동일한 습윤화 과정 및 단백질 첨가를 실시예 4로 수행하였다.
제 3의 에펜도르프 관에 0.014g의 실시예 5를 첨가하였다. 실시예 3과 동일한 습윤화 과정 및 단백질 첨가를 실시예 5로 수행하였다.
한 바이알의 시그마 IEF 믹스 3.6-9.3 등전 초점화 마커(제품번호 I-3018)를 250㎕의 0.1M NaCl + 0.02M PBS(pH=7.4)에 용해시켰다. 이것은 표준 미처리 단백질 혼합물이었다.
모든 시료를 1시간 동안 철저히 교반하였다. 시료를 파마시아 파스트겔(Pharmacia PhastGel) 장치에서 3-9 등전 초점화 겔 전기영동에 적용시켰다. 그 결과를 도 3에 나타냈고, 이 때 레인별 종류는 하기와 같다:
레인 종류
1, 8 표준 단백질 혼합물
2, 3 실시예 3
4, 5 실시예 4
6, 7 실시예 5
도 3에 나타낸 바와 같이, 실리카의 표면 전하는 용해된 염에 의해 "스크리닝"되었고, 단백질 결합은 일어나지 않았으며, 메틸과 특히 옥틸 기와의 소수성 상호작용은 매우 강력하였으며 다수의 띠가 누락되었다. 이러한 데이터는 상기 조건에서 소수성 표면 조성물이 비선택적 결합을 유도할 수 있음을 명백하게 보여준다.
실시예 6, 7 및 8
발명의 실시예
이들 실시예는 실리카 표면에 결합하는 비선택적 단백질을 감소시키기 위해 본 발명에 따르는 R10기를 사용하는 이점을 나타낸다. 실시예 6은 200℃에서 2시간 활성화시키는 것을 제외하고 실시예 3과 동일하였다.
실시예 7은 실리카 표면이 Si-R 기(여기서, R은 아세톡시메틸이다)를 갖는 중간체 표면 조성물이었다. 실시예 8은 실리카 표면이 부착된 Si-R10(여기서, R10은 메틸하이드록시이다) 기를 갖는 본 발명의 표면 조성물의 예이었다. 높고 낮은 이온 강도 용매를 갖는 실시예 8의 이점도 나타낸다.
실시예 7은 다음과 같이 제조되었다. 250㎖ 들이 둥근 바닥 플라스크에 50㎖의 톨루엔 및 20.42g의 아세톡시메틸트리에톡시실란을 첨가하였다. 15.05g의 실시예 6을 톨루엔/아세톡시메틸트리에톡시실란 용액에 첨가하였다. N2를 5분동안 유동시켜 공기를 제거하고 전체 반응중 지속시켰다. 시료를 환류시키고 110℃에서 16시간 동안 교반시켰다. 이어서, 시료를 여과하고 50㎖의 톨루엔으로 3회 세척하였다. 시료를 50㎖의 톨루엔에 재슬러리화시키고, 여과하고 50㎖의 톨루엔으로 5회 세척하였다. 110℃에서 건조시킨 다음 150℃에서 4시간 하소시켰다.
실시예 8의 제조는 하기와 같이 기술된다. 250㎖ 들이 둥근 바닥 플라스크에 10g의 실시예 7 및 100㎖의 0.01M H2SO4를 첨가하였다. N2를 5분동안 유동시켜 공기를 제거하고 전체 반응중 지속시켰다. 이어서, 시료를 여과하고 100㎖의 80℃ DI H2O로 2회 세척하였다. 시료를 100㎖의 80℃ DI H2O에 재슬러리화시키고, 여과하고 100㎖의 80℃ DI H2O로 2회 세척하고, 110㎖에서 건조시킨 다음, 150℃에서 4시간 하소시켰다.
에펜도르프 관에 0.007g의 실시예 7을 첨가하였다. 한 바이알의 시그마 IEF 믹스 3.6-9.3 등전 초점화 마커(제품번호 I-3018)를 250㎕의 0.14M NaCl + 0.02M PBS(pH=7.2)에 용해시킨 다음, 에펜도르프 관에 첨가하였다. 시료를 실시예 7 고염으로 표지하였다.
두 번째 에펜도르프 관에 0.007g의 실시예 8을 첨가하였다. 한 바이알의 시그마 IEF 믹스 3.6-9.3 등전 초점화 마커(제품번호 I-3018)를 250㎕의 0.14M NaCl + 0.02M PBS(pH=7.2)에 용해시킨 다음, 에펜도르프 관에 첨가하였다. 이 시료를 실시예 8 고염으로 표지하였다.
세 번째 에펜도르프 관에 0.007g의 실시예 7을 첨가하였다. 한 바이알의 시그마 IEF 믹스 3.6-9.3 등전 초점화 마커(제품번호 I-3018)를 250㎕의 0.14M NaCl + 0.02M PBS(pH=7.4)에 용해시킨 다음, 에펜도르프 관에 첨가하였다. 이 시료를실시예 7 저염으로 표지하였다.
네 번째 에펜도르프 관에 0.007g의 실시예 8을 첨가하였다. 한 바이알의 시그마 IEF 믹스 3.6-9.3 등전 초점화 마커(제품번호 I-3018)를 250㎕의 0.14M NaCl + 0.02M PBS(pH=7.4)에 용해시킨 다음, 에펜도르프 관에 첨가하였다. 이 시료를 실시예 8 고염으로 표지하였다.
다섯 번째 에펜도르프 관에 대해서는 한 바이알의 시그마 IEF 믹스 3.6-9.3 등전 초점화 마커(제품번호 I-3018)를 250㎕의 DI H2O에 용해시킨 다음, 상기 에펜도르프 관에 첨가하였다. 이 시료를 단백질 혼합물 표준으로 표지하였다.
모든 시료를 1시간 동안 철저히 교반시켰다. 이어서, 모든 시료를 파마시아 파스트겔 장치에서 3-9 등전 초점화 겔 전기영동에 적용시켰다. 이의 결과를 도 4에 나타냈고, 이 때 레인별 종류는 하기와 같다:
레인 종류
1, 8 표준 단백질 혼합물
실시예 7고염
실시예 8고염
실시예 7저염
실시예 8저염
실험 결과는 모든 단백질 띠가 "고염" 및 "저염" 조건하에서 존재한다는 점(참조: 레인 3 및 7)에서 실리카 표면에 대한 비특이적 흡착을 거부하기 위한 본 발명의 실시태양의 하나인 실시예 8의 이점을 명백히 보여준다.
실시예 8의 특성화
본 발명의 표면 조성물은 하기 분석에 의해 특성화된다.
도 5는 1400-4000cm-1의 -CH2OH 기를 포함하는 표면 조성을 갖는 실시예 8의 확산 반사율 적외선 스펙트럼을 나타낸다. 적외선 데이터는 스펙트라테크(Spectra-Tech) 확산 반사율 부속물을 사용하여 니콜렛 마그나(Nicholet Magna) 550에서 얻었다. 4cm-1분해능에서 수집한 512 스캔으로 KBr 중에서 1:20으로 희석시켰다. 2937 및 2897cm-1에서의 피크는 -CH2기의 존재를 명백하게 나타낸다. -OH 공명에 대한 띠는 3483cm-1에서의 넓은 피크 아래에 가려졌다. 비교하면, 도 6은 표면 조성물이 -CH2OCOCH3기를 포함하는 실시예 7의 스펙트럼을 나타낸다. 아세톡시 기와 관련된 특징적인 공명인 1726, 1421 및 1374cm-1에서 새로운 공명이 발생하였다.
도 7은 실시예 8의 MAS Si29NMR 스펙트럼을 나타낸다. 39.76MHz의 공명 진동수에서 작동하는 케마그네틱스(Chemagnetics) CMX 200에서 단일 펄스29Si 핵자기 공명 실험을 수행하였다. 시료를 14mm 길이의 연필형 회전자에 넣었다. 22 정도의 펄스에 상응하는 4㎲의 펄스 길이를 60s의 이완 지연시간(relaxation delay)과함께 이용하였다. -62ppm에서 명백한 공명이 O3Si-CHx-로서 확인되었다(문헌[Vicic, D., and Maciel, J. Am. Chem. Soc. 10591983), pg. 3767-3776] 참조).
도 8은 실시예 8의 X선 광전자 스펙트럼을 나타낸다. 시료를 양면테이프로 시료 스텁(sample stub)에 장착하고, 탄소, 산소 및 규소 스캔을 2시간 동안 수행하였다. 스펙트럼은 오염물 C, 284.7eV 및 알콜 C 원자, 286.7eV로서 확인된 2개의 피크에 부합하였다(문헌["Handbook of X-ray Photoelectron Spectroscopy", Moulder, J. F., Sticke, W. F., Sobol, P. E., and Bomben, K. D., Perkin-Elmer Corp, Eden Prairie, MN, 1992] 참조). 비교를 위해 실시예 7의 XPS 스펙트럼을 도 9에 나타낸다. 이 경우에 있어서, 카복실 탄소와 관련된 289eV에서의 피크가 또한 관측되었다. 이러한 연구는 본 발명의 실시태양 중 하나인 실시예 8의 표면 조성물이 메틸하이드록시 기, -CH2OH, 예컨대 본원에서 정의된 바와 같은 R10을 포함함을 의미한다.
실시예 8의 생성물에서의 R10기(-CH2OH)의 농도는 2.01개의 기/nm2이고, 이것은 최종 생성물의 실리카 지지체의 표면적(72m2/g) 및 탄소함량(1.907%)로부터 계산되었다. 표면적은 통상적인 BET 표면적 측정법을 이용하여 측정하였으며 탄소함량(중량%)은 모델 C-144 레코(LECO) 탄소분석기를 이용하여 측정하였다.
실시예 9
(본 발명을 이용하는 경우의 결합 잔기의 부착 및 감소된 비특이적 결합의 설명)
842g의 톨루엔 및 3.11g의 3-아미노프로필트리에톡시실란을 2000㎖ 들이 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 이어서, 200℃에서 2시간 동안 하소시킨 200g의 그레이스 다비슨(Grace Davison) XWP 500Å 실리카를 상기 둥근 바닥 플라스크에 첨가한 다음, 비등 칩 15개를 넣었다. 둥근 바닥 플르스크를 가열 맨틀 및 부착된 응축기에 집어 넣었다. 가열 맨틀을 오비탈 진탕기의 상부에 부착시키고, 이를 115rpm의 속도로 작동시켰다. N2를 둥근 바닥 플라스크 및 응축기에 통과시켜 전체 반응도중 공기를 제거하였다. 시료를 가열시켜 4시간 동안 비등(약 110℃)시켰다. 시료를 여과하고 2×200㎖의 톨루엔으로 세척하고, 115℃에서 건조시킨 다음, 150℃에서 2시간 동안 하소시켰다. 이러한 시료를 중간물 A로 표지하였다. 생성된 -CH3H6NH2기의 농도는 0.54인 것으로 계산되었고, 지지체의 표면적(BET)(88m2/g), 중간물의 탄소 함량(LECO)(0.321%) 및 질소 함량(0.11%)을 기준으로 하였다. 질소 함량(중량%)은 카를로 에르바(Carlo Erba) NA 1500 분석기 상에서 산소 함유 분위기 및 열전도 탐지를 이용하는 변형된 두마스(Dumas) 방법에 기초한 방법을 사용하여 측정되었다(ASTM D5373(석탄용) 및 ASTM 5291 참조).
800㎖의 1M NaCl을 비이커에서 중간물 A와 혼합하고 자기 교반기로 교반하였다. 초기 pH는 4.79이었으며 pH가 2로 될 때까지 1M HCl을 적가하였다. pH를 15분동안 2.0으로 유지시켰다. 시료를 여과하고 5×200㎖ DI H2O로 세척하고, 115℃에서 건조시킨 다음, 200℃에서 2시간 동안 하소시켰다. 이 시료를 중간물 B로 표지하였다.
680g의 톨루엔 및 177.25g의 아세톡시메틸트리에톡시실란을 둥근 바닥 플라스크에서 중간물 B와 혼합하였다. 비등 칩 15개을 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 이를 가열 맨틀 및 부착된 응축기에 배치시켰다. 가열 맨틀을 115rpm의 속도로 작동하는 오비탈 진탕기의 상부에 부착시켰다. N2를 둥근 바닥 플라스크 및 응축기에 통과시켜 전체 반응도중 공기를 제거하였다. 시료를 가열하여 24시간 동안 비등(약 110℃)시키고, 여과하고, 3×200㎖의 톨루엔으로 세척하고, 115℃에서 건조시킨 다음 150℃에서 2시간 동안 하소시켰다. 이 시료를 중간물 C로 표지하였다.
900㎖의 디옥산 및 100㎖의 0.1M H2SO4를 둥근 바닥 플라스크에서 중간물 C와 혼합하였다. 비등 칩 15개을 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 이를 가열 맨틀 및 부착된 응축기에 위치시켰다. 가열 맨틀을 115rpm의 속도로 작동하는 오비탈 진탕기의 상부에 부착시켰다. N2를 둥근 바닥 플라스크 및 응축기에 통과시켜 전체 반응도중 공기를 제거하였다. 시료를 가열하여 4시간 동안 비등(약 100℃)시키고, 여과하고, 2×200㎖의 톨루엔으로 세척하고, 115℃에서 건조시킨 다음 150℃에서 2시간 동안 하소시켰다. 이 시료를 중간물 D로 표지하였다. 이 생성물의 R10기(-CH2OH)의 농도는 5.65이었고 중간물 D의 탄소 함량을 계산하고 C3H6NH2기에 기여할 수 있는 탄소의 양을 뺀 다음, 실시예 8에서의 계산치를 표시함으로써 측정하였다. 이와 같이 하는 동안 C3H6NH2기의 농도는 0.39인 것으로 계산되었고 이 값은 R10기를 부착하는 화학을 수행하기 이전의 중간물 A에 대한 데이터로부터 계산된 값보다 작았다. 특정 이론에 제한됨이 없이, 질소 함량에서의 미소한 변동(0.11 대 0.08)은 표준 편차에 기인하거나, 가능하게는 R10기를 생성하는 경우의 C3H6NH2의 미소한 침출에 기인한다.
20.75g의 중간물 D 및 400㎖의 커플링 완충액(0.1M Na2PO4+ 0.15M NaCl; pH=7.0)을 1000㎖ 들이 비이커에서 혼합하고 5분동안 교반시켰다. 시료를 여과하여 축축한 덩어리를 형성하고, 이것을 1000㎖ 들이 비이커에 넣은 다음 587.66g의 50중량% 글루타르알데하이드 및 5.91g의 NaClNBH3를 비이커에 첨가하였다. 시료를 4시간 동안 교반하고, 여과하고, 400㎖의 커플링 완충액으로 세척하고 400㎖ 커플링 완충액에 재슬러리화하여 새로운 시료를 수득하였으며, 이를 여과하고, 400㎖의 커플링 완충액으로 세척하고 400㎖의 커플링 완충액에 2회 이상 재슬러리화하였다. 재세척 및 재슬러리화된 시료를 여과한 다음, 400㎖의 커플링 완충액으로 세척하였다. 이 시료를 중간물 E로 표지하였다.
75.44g의 커플링 완충액 및 레플리겐(Repligen)으로부터의 50g(단백질 A)/ℓ의 농도의 24.56g의 단백질 A를 250㎖ 들이 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 2.52g NaCNBH3및 중간물 E를 플라스크에 첨가하고 진탕기 상에서 4시간 동안 혼합하였다. 시료를 여과하고 100㎖의 커플링 완충액으로 4회 세척하였다. 이어서, 75.44g의 커플링 완충액, 2.52g의 NaCNBH3및 0.44g의 에탄올아민을 250㎖의 둥근바닥 플라스크에 첨가한 다음, 진탕기에서 4시간 동안 혼합하였다. 시료를 여과하고 100㎖의 커플링 완충액으로 4회 세척하였다. 시료를 20% 에탄올에 넣어 4℃에서 보관하였다. 이 시료를 실시예 9라 표지하였다. 레코 탄소로부터 실시예 9가 34.67mg(단백질 A)/g(실리카)임이 측정되었다.
직접 부착된 -Si-CH2OH를 갖는 실리카로 충전된 0.66×2cm I.D. 친화성 칼럼을 먼저 20mM 포스페이트 완충액(pH 7.4)로 평형시켰다. 테레디노박터 투르니래(Teredinobacter turnirae) 액체배지의 상청액 중의 0.5mg/㎖의 토끼 폴리클로날 IgG의 5㎖의 공급물 시료를 상기 칼럼에 적재하였다. 이어서, 친화성 칼럼을, 280nm에서 UV 흡수가 기준선으로 복원될 때까지 포스페이트 완충액으로 세척하였다. IgG를 1㎖/분의 유속의 0.1M 아세트산(pH 3.0)을 사용하여 친화성 칼럼으로부터 용출시켰다(참조: 도 9에서의 좁은 피크). 도 10은 280nm에서의 흡수도를 기록함으로써 친화성 칼럼으로부터 얻은 적재량, 세척성 및 용출능의 크로마토그램을 나타낸다.
도 10에 나타낸 친화성 정제의 용출물로부터의 100㎕의 정제된 IgG를 크기 배제 크로마토그래피 칼럼에 주입시키고, 이를 1㎖/분 유속의 0.1M Na2SO4및 0.05M NaH2PO4(pH 5)의 용출 완충액으로 용출시켰다. 크기 배제 크로마토그래피 칼럼으로부터의 용출물의 A280프로파일이 도 11에 도시되었으며, 이것은 세포 액체배지로부터의 매우 미량의 불순물을 갖는 IgG의 단일 피크를 나타낸다.
비교하면, 도 12는 동일한 조건을 사용하는 세포 액체배지로 소량 첨가된 출발 토끼 폴리클로날 IgG의 크기 배제 크로마토그램을 나타낸다. 도 11 및 12의 비교에 의하면 실시예 9(도 11)를 사용하는 세포 액체비재로부터 정제된 IgG는 출발 IgG(도 12)보다 순수한 것임이 명백하였다. 따라서, 도 11 및 12는 실리카 매질에 대해 비선택적 결합이 본 발명의 고체로 최소화되는 것임을 보여준다.
관련 서적 목록
Abercrombie, D. M. et al.Affinity Chromatography(eds. Rickwood, D. & Hames, B. D.)(IRL Press, Washington, D.C., 1983);
Argos, P. et al.Methods in Enzymology(ed. Deutscher, M. P.)(Academic Press, San Deigo, Calif., 1990);
Gagnon, P.Purification Tools for Monoclonal Antibodies(Validated Biosystems, Tuscon, 1996);
Hermanson, G. T., Mallia, A. K. & Smith, P. K.Immobilized Affinity Ligand Techniques(Academic Press, Inc., San Diego, 1992);
Mohan, S. B. et al.Affinity Separations A Practical Approach(eds. Rickwood, D. & Hames, B. D.)(IRL Press, Oxford, 1997);
Scopes, R. K.Protein Purification-Principles and Practice(ed. Cantor, C. R.)(Springer, New York, 1994);
Wheelwright, S. M.Protein Purification Design and Scale up of Downstream Processing(John Wiley & Sons, Inc., New York, 1991);
Wilson, R. C. et al.Protein Purification from Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes(ed. Comstock, M. J.)(The American Chemical Society, Washington, D.C., 1990); 및
Weetall, "Covalent Coupling Methods for Inorganic Support Materials", inMethods in Enzymology, vol. XLIV, edited by K. Mosbach, pp. 134-148, 1976.

Claims (54)

  1. 무기 산화물인 무기 물질, 및 이 무기 물질의 하나 이상의 표면에 위치하는, -CH2OH, -CH(OH)2, -CH(OH)CH3, -CH2CH2OH, -C(OH)2CH3, -CH2CH(OH)2및 -CH(OH)CH2(OH)로 구성된 군에서 선택된 잔기 R10을 포함하는 고체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    R10이 2가 잔기 또는 원자를 통해 무기 물질의 하나 이상의 표면에 부착되는 고체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    R10이 -CH2OH, -CH(OH)CH3및 -CH2CH2OH로 구성된 군에서 선택되는 고체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    R10이 -CH2OH인 고체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    무기 물질이 무기 금속 산화물, 실리케이트 또는 알루미노실리케이트인 고체.
  6. 제 1 항에 있어서,
    무기 물질이 자기 반응성인 고체.
  7. 제 5 항에 있어서,
    무기 금속 산화물이 실리카, 알루미나, 실리카-알루미나, 지르코니아, 지르코네이트, 티타니아, 제어 공극 유리 또는 이의 혼합물인 고체.
  8. 제 5 항에 있어서,
    무기 금속 산화물이 크로마토그래피 등급 실리카인 고체.
  9. 제 5 항에 있어서,
    무기 금속 산화물이 실리카 겔인 고체.
  10. (i) 무기 물질, (ii) 이 무기 물질의 하나 이상의 표면에 위치하는, -CH2OH, -CH(OH)2, -CH(OH)CH3, -CH2CH2OH, -C(OH)2CH3, -CH2CH(OH)2및 -CH(OH)CH2(OH)로 구성된 군에서 선택되는 잔기 R10, 및 (iii) 분석물과 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 잔기를 포함하는 고체.
  11. 제 10 항에 있어서,
    하나 이상의 결합 잔기가 리간드, 단백질, 펩티드, 항체 및 핵산으로 구성된 군에서 선택되는 고체.
  12. 제 10 항에 있어서,
    하나 이상의 결합 잔기가 하나 이상의 연결기를 통해 무기 물질에 부착되는 고체.
  13. 제 10 항에 있어서,
    수용체, 항체, 항원, DNA 및 RNA로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 결합 잔기가 하나 이상의 연결기를 통해 무기 물질에 부착되는 고체.
  14. 제 10 항에 있어서,
    하나 이상의 연결기가 치환되거나 치환되지 않는 2가 화학 기인 고체.
  15. 제 10 항에 있어서,
    고체 nm2당 약 1 내지 약 10개의 R10잔기를 포함하는 고체.
  16. 제 15 항에 있어서,
    고체 nm2당 약 0.04 내지 약 4개의 결합 잔기를 포함하는 고체.
  17. 제 16 항에 있어서,
    무기 물질이 실리카이고, R10이 -CH2OH인 고체.
  18. 제 17 항에 있어서,
    무기 물질이 실리카 겔인 고체.
  19. 제 17 항에 있어서,
    무기 물질이 크로마토그래피 등급 실리카인 고체.
  20. 제 14 항에 있어서,
    치환되거나 치환되지 않은 화학 기가 n-R- 기를 포함하는 하이드로카빌이고, 여기서 n은 -R- 기의 개수로서 2 이상의 정수이고, n-1개의 -R- 기가 -O-, -S-, 카보닐, 티오카보닐, -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -C(S)S-, -SC(S)-, -N(R4)-, -N(R4)C(O)-, -C(O)N(R4)-, -C(R5)=N-, -N=C(R5)-, -C(R5)=NO-, -ON=C(R5)-, -P-, -P(OH)O-, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 사이클로알킬렌, 치환된 사이클로알킬렌, 사이클로알케닐렌, 치환된 사이클로알케닐렌, 2가 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴로 치환될 수 있고, 이 때 R4및 R5는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알키닐,치환된 사이클로알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬 및 치환된 아르알킬로 구성된 군에서 선택되는 고체.
  21. 제 12 항에 있어서,
    하나 이상의 연결기가 결합 잔기에서 무기 물질까지 측정된 길이에서 약 1 내지 약 30개의 원자의 2가의 치환되거나 치환되지 않은 화학 기이고, 이 때 이 화학 기가 -CH2-, -C(R1)H-, -C(R2)=C(R3)- 및 -C≡C-로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 -R- 기를 포함하고, 여기서 R1, R2및 R3은 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알키닐, 치환된 사이클로알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬 또는 치환된 아르알킬이고, 상기 -R- 기가 -O-, -S-, 카보닐, 티오카보닐, -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -C(S)S-, -SC(S)-, -N(R4)-, -N(R4)C(O)-, -C(O)N(R4)-, -C(R5)=N-, -N=C(R5)-, -C(R5)=NO-, -ON=C(R5)-, -P-, -P(OH)O-, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 사이클로알킬렌, 치환된 사이클로알킬렌, 사이클로알케닐렌, 치환된 사이클로알케닐렌, 2가 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴로 치환될 수 있고, 이 때 R4및 R5는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알키닐, 치환된 사이클로알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬 및 치환된 아르알킬로 구성된 군에서 선택되는 고체.
  22. 제 12 항에 있어서,
    하나 이상의 연결기가 에테르, 티오에테르, 에스테르, 티오에스테르, 카보네이트, 카바메이트, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포에스테르, 포스포르아미데이트, 아민, 아미드, 이미드, 우레아, 티오우레아, 설폰아미드, 설폭사이드, 설폰, 디설파이드, 옥심, O-아실 옥심, O-카바모일 옥심, O-아실옥시알킬 옥심, O-아실옥시알킬옥시 옥심, O-옥시미노포스페이트, O-옥시미노포스포네이트, O-옥시미노포스포르아미데이트 또는 C=C 결합을 통해 하나 이상의 결합 잔기 및 무기 물질에 독립적으로 부착되는 고체.
  23. 제 12 항에 있어서,
    하나 이상의 연결기가 시아노겐 브로마이드, N-하이드록시 석신이미드 에스테르, 카보닐 디이미다졸, 환원성 아미노화, 2-플루오로-1-메틸-피리디늄 톨루엔-4-설포네이트 활성화, 1-에틸-3-(3-디메틸프로필)카보디이미드 매개된 아미드 결합 형성, 토실 클로라이드, 트레실 클로라이드, 디비닐설폰, 아즐락톤, 시아누릭 클로라이드, 요오도아세틸 또는 브로모아세틸 활성화, 말레이미드, 피리딜 디설파이드, 에폭시 화합물, 2-이미노티올란 5,5-디티오-비스-(2-니트로벤조산), 하이드라지드, 디아조늄 또는 마니치(Mannich) 축합으로부터 형성되는 고체.
  24. (1) 하나 이상의 결합 잔기가 분석물에 특이적 친화성을 갖는 제 10 항에 따른 고체를 혼합물과 접촉시키는 단계;
    (2) 분석물을 하나 이상의 결합 잔기에 결합시키는 단계;
    (3) 분석물이 결합된 고체로부터 하나 이상의 다른 성분을 제거하는 단계;
    (4) 고체를 회수하는 단계; 및
    (5) 고체로부터 분석물을 단리시키는 단계
    를 포함하는, 혼합물에서 하나 이상의 다른 성분과 혼합된 분석물을 단리시키는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    단계 (3)에서 고체를 유체로 세척하여 세척액을 수득하고, 이 세척액을 폐기시킴으로써 하나 이상의 다른 성분을 제거하고, 단계 (5)에서 용출액을 고체에 배치시키고 용출물을 수거함으로써 분석물을 단리시키는 방법.
  26. 제 24 항에 있어서,
    고체가 nm2당 약 1 내지 약 10개의 R10잔기를 포함하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서,
    고체가 nm2당 약 0.04 내지 약 4개의 결합 잔기를 포함하는 방법.
  28. 제 24 항에 있어서,
    무기 물질이 무기 금속 산화물, 금속 실리케이트 또는 알루미노실리케이트인 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    무기 물질이 자기 반응성인 방법.
  30. 제 28 항에 있어서,
    무기 금속 산화물이 실리카, 알루미나, 실리카-알루미나, 지르코니아, 지르코네이트, 티타니아, 제어 공극 유리 또는 이의 혼합물인 방법.
  31. 제 28 항에 있어서,
    무기 금속 산화물이 크로마토그래피 등급 실리카인 방법.
  32. 제 28 항에 있어서,
    무기 금속 산화물이 실리카 겔인 방법.
  33. 제 24 항에 있어서,
    무기 금속 물질이 실리카이고, R10이 -CH2OH인 방법.
  34. 제 33 항에 있어서,
    실리카가 실리카 겔인 방법.
  35. 제 33 항에 있어서,
    실리카가 크로마토그래피 등급 실리카인 방법.
  36. 제 24 항에 있어서,
    결합 잔기가 바이오틴이고, 분석물이 아비딘, 스트렙타딘, 아비딘에 결합된 물질 또는 스트렙타딘에 결합된 물질인 방법.
  37. 제 24 항에 있어서,
    결합 잔기가 아비딘 또는 스트렙타딘이고, 분석물이 바이오틴이거나, 또는 바이오틴화되는 방법.
  38. 무기 물질을 포함하는 고체에 대한 불순물의 비특이적 결합을 감소시키는 방법으로서,
    무기 물질이 비특이적 결합이 일어나거나 비특이적 결합이 일어나게 하는 하나 이상의 작용기를 포함하는 무기 산화물이고,
    (1) 고체를 제공하는 단계; 및
    (2) 무기 물질의 하나 이상의 작용기를 반응물과 반응시켜 무기 물질의 하나 이상의 표면에 -CH2OH, -CH(OH)2, -CH(OH)CH3, -CH2CH2OH, -C(OH)2CH3, -CH2CH(OH)2및 -CH(OH)CH2(OH)로 구성된 군에서 선택된 잔기 R10을 형성시켜, 무기 물질이 불순물을 포함하는 혼합물과 접촉할 때 고체에 대한 불순물의 비특이적 결합을 감소시키는 데 충분한 양으로 잔기 R10이 무기 물질의 표면에 존재하도록 하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  39. 제 38 항에 있어서,
    단계 (2) 이전에는 무기 물질의 조성물에 존재하지 않는 잔기 또는 원자를 통해 R10을 무기 물질에 부착시키는 방법.
  40. 제 38 항에 있어서,
    R10이 -CH2OH, -CH(OH)CH3및 -CH2CH2OH로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서,
    R10이 -CH2OH인 방법.
  42. 제 38 항에 있어서,
    무기 물질이 무기 금속 산화물인 방법.
  43. 제 42 항에 있어서,
    무기 금속 산화물이 자기 반응성인 방법.
  44. 제 42 항에 있어서,
    무기 금속 산화물이 실리카, 알루미나, 실리카-알루미나, 지르코니아, 지르코네이트, 티타니아 또는 제어 공극 유리이고, 이의 작용기가 하이드록실을 포함하는 방법.
  45. 제 42 항에 있어서,
    무기 금속 산화물이 크로마토그래피 등급 실리카인 방법.
  46. 제 42 항에 있어서,
    무기 금속 산화물이 실리카 겔인 방법.
  47. (i) 무기 물질;
    (ii) 무기 물질의 하나 이상의 표면에 위치하는 잔기 R10; 및
    (iii) 하나 이상의 연결기
    를 포함하고, 무기 물질이 무기 산화물이고, R10이 -CH2OH, -CH(OH)2, -CH(OH)CH3, -CH2CH2OH, -C(OH)2CH3, -CH2CH(OH)2및 -CH(OH)CH2(OH)로 구성된 군에서 선택되는, 고체.
  48. 제 47 항에 있어서,
    하나 이상의 연결기가 치환되거나 치환되지 않은 2가 화학 기인 고체.
  49. 제 48 항에 있어서,
    치환되거나 치환되지 않은 화학 기가 n-R- 기를 포함하는 하이드로카빌이고, 여기서 n은 -R- 기의 개수로서 2 이상의 정수이고, n-1개의 -R- 기가 -O-, -S-, 카보닐, 티오카보닐, -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -C(S)S-, -SC(S)-, -N(R4)-, -N(R4)C(O)-, -C(O)N(R4)-, -C(R5)=N-, -N=C(R5)-, -C(R5)=NO-, -ON=C(R5)-, -P-, -P(OH)O-, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 사이클로알킬렌, 치환된 사이클로알킬렌, 사이클로알케닐렌, 치환된 사이클로알케닐렌, 2가 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴로 치환될 수 있고, 이 때 R4및 R5는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알키닐, 치환된 사이클로알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬 및 치환된 아르알킬로 구성된 군에서 선택되는 고체.
  50. 제 47 항에 있어서,
    하나 이상의 연결기가 화학 기의 말단에서 무기 물질까지 측정된 길이에서 약 1 내지 약 30개의 원자의 2가의 치환되거나 치환되지 않은 화학 기이고, 이 화학 기가 -CH2-, -C(R1)H-, -C(R2)=C(R3)- 및 -C≡C-로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 -R- 기를 포함하고, 여기서 R1, R2및 R3은 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알키닐, 치환된 사이클로알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬 또는 치환된 아르알킬이고, 상기 -R- 기가 -O-, -S-, 카보닐, 티오카보닐, -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -C(S)S-, -SC(S)-, -N(R4)-, -N(R4)C(O)-, -C(O)N(R4)-, -C(R5)=N-, -N=C(R5)-, -C(R5)=NO-, -ON=C(R5)-, -P-, -P(OH)O-, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 사이클로알킬렌, 치환된 사이클로알킬렌, 사이클로알케닐렌, 치환된 사이클로알케닐렌, 2가 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴로 치환될 수 있고, 여기서 R4및 R5는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알키닐, 치환된 사이클로알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬 및 치환된 아르알킬로 구성된 군에서 선택되는 고체.
  51. 제 47 항에 있어서,
    하나 이상의 연결기가 에테르, 티오에테르, 에스테르, 티오에스테르, 카보네이트, 카바메이트, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포에스테르, 포스포르아미데이트, 아민, 아미드, 이미드, 우레아, 티오우레아, 설폰아미드, 설폭사이드, 설폰, 디설파이드, 옥심, O-아실 옥심, O-카바모일 옥심, O-아실옥시알킬 옥심, O-아실옥시알킬옥시 옥심, O-옥시미노포스페이트, O-옥시미노포스포네이트, O-옥시미노포스포르아미데이트 또는 C=C 결합을 통해 무기 물질에 부착되는 고체.
  52. 제 47 항에 있어서,
    하나 이상의 연결기가 시아노겐 브로마이드, N-하이드록시 석신이미드 에스테르, 카보닐 디이미다졸, 환원성 아미노화, 2-플루오로-1-메틸-피리디늄 톨루엔-4-설포네이트 활성화, 1-에틸-3-(3-디메틸프로필)카보디이미드 매개된 아미드 결합 형성, 토실 클로라이드, 트레실 클로라이드, 디비닐설폰, 아즐락톤, 시아누릭 클로라이드, 요오도아세틸 또는 브로모아세틸 활성화, 말레이미드, 피리딜 디설파이드, 에폭시 화합물, 2-이미노티올란 5,5-디티오-비스-(2-니트로벤조산), 하이드라지드,디아조늄 또는 마니치 축합으로부터 형성되는 고체.
  53. 제 47 항에 있어서,
    고체 nm2당 약 1 내지 약 10개의 R10잔기를 포함하는 고체.
  54. 제 53 항에 있어서,
    무기 물질이 실리카이고, R10이 -CH2OH인 고체.
KR1020047002162A 2001-08-14 2002-08-12 복합 혼합물에서 선택적 흡착을 위한 고체 조성물 KR100955124B1 (ko)

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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6987079B2 (en) * 2001-08-14 2006-01-17 W.R. Grace & Co.-Conn. Supported catalyst systems
US8137548B2 (en) * 2003-10-17 2012-03-20 Zirchrom Separations, Inc. Chelator-modified inorganic oxide particles
EP1538481A1 (en) * 2003-12-05 2005-06-08 Sony International (Europe) GmbH A method of activating a silicon surface for subsequent patterning of molecules onto said surface
JP2007529309A (ja) * 2004-03-17 2007-10-25 バイオ−ラッド・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド 混合物からタンパク質を分離、特定するための材料、方法、およびシステム
BRPI0513526A (pt) * 2004-07-19 2008-05-06 Grace Gmbh & Co Kg componentes de aparelho e métodos de utilizar componentes de aparelho para detectar a presença de um analisado
EP1938095B1 (en) 2005-09-29 2016-04-13 Alltech Associates Inc. Composite chromatography column
WO2008131063A1 (en) * 2007-04-19 2008-10-30 3M Innovative Properties Company Methods of use of solid support material for binding biomolecules
CN101663581A (zh) * 2007-04-19 2010-03-03 3M创新有限公司 水分散性二氧化硅纳米颗粒在连接生物分子方面的用途
US20090004231A1 (en) 2007-06-30 2009-01-01 Popp Shane M Pharmaceutical dosage forms fabricated with nanomaterials for quality monitoring
ES2319063B1 (es) * 2007-09-28 2010-02-12 Universidad De Granada Compuesto de silica-vinilsulfona, sintesis y usos del mismo.
RU2523484C2 (ru) * 2009-03-12 2014-07-20 Сисейдо Компани, Лтд. Способ получения наполнителя, наполнитель и колонка
RU2015114330A (ru) 2012-09-17 2016-11-10 У.Р. Грейс Энд Ко.-Конн. Хроматографические среды и устройства
SG11201605712SA (en) 2014-01-16 2016-08-30 Grace W R & Co Affinity chromatography media and chromatography devices
ES2929099T3 (es) 2014-05-02 2022-11-24 Grace W R & Co Material de soporte funcionalizado y métodos de fabricación y uso de material de soporte funcionalizado
BR112017026193B1 (pt) 2015-06-05 2021-09-14 W.R. Grace & Co-Conn Adsorventes, método de produção dos adsorventes e uso dos adsorventes
CN110152630B (zh) * 2019-06-04 2022-03-22 南京信息工程大学 一种高效吸附剂及其应用
WO2021153717A1 (ja) * 2020-01-31 2021-08-05 池田　壽文 人工核酸に基づくアフィニティークロマトグラフィー

Family Cites Families (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3669841A (en) 1970-02-11 1972-06-13 Monsanto Co Attachment of enzymes to siliceous materials
US3715278A (en) 1970-02-11 1973-02-06 Monsanto Co Enzyme-polymer product attached to surface of siliceous materials thereof
US3795313A (en) * 1970-05-22 1974-03-05 Du Pont Chromatographic packing with chemically bonded organic stationary phases
US3666530A (en) * 1970-10-22 1972-05-30 Research Corp Novel silicious silicone bonded materials
US3873426A (en) 1973-07-02 1975-03-25 Miles Lab Insoluble enzymes
US3983299A (en) * 1974-03-04 1976-09-28 Purdue Research Foundation Bonded carbohydrate stationary phases for chromatography
FR2267992A1 (ko) 1974-04-19 1975-11-14 Rhone Poulenc Ind
GB1514707A (en) 1974-06-25 1978-06-21 Atomic Energy Authority Uk Immobilization of biologically active substances
US3954678A (en) 1974-07-11 1976-05-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Semipermeable microcapsules containing a silica gel
US4043905A (en) * 1974-08-26 1977-08-23 Indiana University Foundation Chromatographic separation columns with selectively modified active surfaces and methods for their preparations
US4029583A (en) * 1975-02-28 1977-06-14 Purdue Research Foundation Chromatographic supports and methods and apparatus for preparing the same
US3983000A (en) 1976-04-01 1976-09-28 Corning Glass Works Bonding proteins to inorganic supports
DE2621974A1 (de) * 1976-05-18 1977-11-24 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur herstellung eines zur kovalenten bindung mit biologisch aktivem material befaehigten traegermaterials
EP0003923B1 (fr) 1978-02-16 1982-10-20 Rhone-Poulenc Specialites Chimiques Complexes support-enzyme et leur procédé de préparation
US4206259A (en) 1978-10-16 1980-06-03 Uop Inc. Support matrices for immobilized enzymes
US4268423A (en) 1979-11-16 1981-05-19 Uop Inc. Support matrices for immobilized enzymes
US4430496A (en) 1980-01-17 1984-02-07 Varian Associates, Inc. Strong anion exchange composition and methods
US4298500A (en) * 1980-05-05 1981-11-03 Varian Associates, Inc. Mixed phase chromatographic compositions
CA1130228A (en) 1980-05-21 1982-08-24 Chiang-Chang Liao Support matrix for amino-containing biologically active substances
ZA827728B (en) 1981-11-17 1983-08-31 Nestle Sa A process for the production of enzymatically active biocatalysts and the products obtained
US4415663A (en) 1982-08-25 1983-11-15 Uop Inc. Support matrix for immobilized enzymes
US4540586A (en) * 1983-07-01 1985-09-10 Moore William P Method of preserving fodders with a nutritive coating
US4469630A (en) 1983-11-25 1984-09-04 J. T. Baker Chemical Co. Purification of monoclonal antibodies
US4540486A (en) 1983-11-25 1985-09-10 J. T. Baker Chemical Company Polyethylenimine bound chromatographic packing
DE3342870A1 (de) 1983-11-26 1985-06-05 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Digitalis-antikoerper, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur therapie von digitalis-intoxikationen
US4520122A (en) 1983-12-05 1985-05-28 Uop Inc. Immobilization of organic species on refractory inorganic oxides
US5110784A (en) * 1984-04-09 1992-05-05 Dow Corning Corporation Dual surface porous material
US4544485A (en) * 1984-08-31 1985-10-01 Purdue Research Foundation Chromatographic method and means
US5167812A (en) * 1984-11-28 1992-12-01 Trustees Of The Univ. Of Penna. Affinity chromatogry using dried calcium alginate-magnetite separation media in a magnetically stabilized fluidized bed
US4681870A (en) 1985-01-11 1987-07-21 Imre Corporation Protein A-silica immunoadsorbent and process for its production
US4551245A (en) 1985-04-22 1985-11-05 J. T. Baker Chemical Co. Acylated polyethylenimine bound chromatographic packing
US4606825A (en) 1985-04-22 1986-08-19 J. T. Baker Chemical Company Purification of immunoglobulin G
CH663728A5 (fr) 1985-06-10 1988-01-15 Battelle Memorial Institute Procede de purification de substances bioactives par adsorption biospecifique.
US4837348A (en) 1986-04-30 1989-06-06 Varian Associates, Inc. Bonded phase chromatographic supports
US4994429A (en) 1986-12-29 1991-02-19 Aluminum Company Of America Active material useful as adsorbent comprising metal oxide/hydroxide particles reacted with phosphorus-containing organic acid group of organic compound having unreacted acid group
JP2509542B2 (ja) * 1987-02-26 1996-06-19 株式会社ワイエムシィ 溶質分離用担体
US6251278B1 (en) 1987-06-08 2001-06-26 Chromatochem, Inc. Process for separating a substance from a mixture
US5240602A (en) 1987-06-08 1993-08-31 Chromatochem, Inc. Chromatographic material
CA1320718C (en) * 1987-06-08 1993-07-27 Richard Frederick Hammen Chromatographic material
US4778600A (en) 1987-06-17 1988-10-18 Dow Corning Corporation Liquid chromatography dual zone packing materials
EP0303406A3 (en) 1987-08-14 1991-07-03 Hewlett-Packard Company An immunoaffinity substrate
US5118796A (en) 1987-12-09 1992-06-02 Centocor, Incorporated Efficient large-scale purification of immunoglobulins and derivatives
JPH01181790A (ja) 1988-01-18 1989-07-19 Toray Silicone Co Ltd 生理活性物質の固定化方法
US5277813A (en) 1988-06-17 1994-01-11 S.A.C. Corporation Shielded stationary phases
ES2058538T3 (es) 1988-07-22 1994-11-01 Imre Corp Compuestos de proteina a purificados y procedimiento para su preparacion.
US5045190A (en) * 1988-11-08 1991-09-03 Carbonell Ruben G Chromatography apparatus
US5077210A (en) 1989-01-13 1991-12-31 Eigler Frances S Immobilization of active agents on substrates with a silane and heterobifunctional crosslinking agent
US5035803A (en) * 1989-02-14 1991-07-30 The Regents Of The University Of California High yield water-soluble polymer silica separation resins
US5043062A (en) * 1989-02-21 1991-08-27 Eastman Kodak Company High performance affinity chromatography column comprising non-porous, nondisperse polymeric packing material
EP0386926A3 (en) 1989-03-02 1991-12-18 Supelco, Inc. Silica gel supports suitable for chromatographic separations
US5085779A (en) 1989-06-07 1992-02-04 J. T. Baker, Inc. Polyethyleneimine matrixes for affinity chromatography
US5055194A (en) * 1989-07-28 1991-10-08 University Of Pennsylvania Support for high performance liquid chromatography in a magnetically stabilized fluidized bed
JPH03218458A (ja) 1989-10-02 1991-09-26 Shiseido Co Ltd カラム充填剤及びその製造方法
US5457195A (en) 1989-12-21 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Sapphyrin derivatives and conjugates
US5403750A (en) 1991-03-06 1995-04-04 W. R. Grace & Co.-Conn. Biocompatible, low protein adsorption affinity matrix
DE4130475A1 (de) * 1991-09-13 1993-03-18 Merck Patent Gmbh Modifizierte chromatographische traegermaterialien
CA2064683A1 (en) 1992-03-26 1993-09-27 Krishna Mohan Rao Kallury Formation of thermostable enzymes with extra-ordinary heat tolerance by immobilization on phospholipid matrices
US5906734A (en) 1992-06-19 1999-05-25 Biosepra Inc. Passivated porous polymer supports and methods for the preparation and use of same
US5374755A (en) 1992-07-17 1994-12-20 Millipore Corporation Liquid chromatography stationary phases with reduced silanol interactions
US5362859A (en) 1992-07-27 1994-11-08 Sepracor, Inc. High-capacity affinity supports and methods for the preparation and use of same
US5316680A (en) 1992-10-21 1994-05-31 Cornell Research Foundation, Inc. Multimodal chromatographic separation media and process for using same
US5371262A (en) 1993-03-10 1994-12-06 Gelest, Inc. Hydroxymethyltrialkoxysilanes and methods of making and using the same
US5406766A (en) * 1993-07-29 1995-04-18 Monier Roof Tile Inc. Multi-color concrete tiles and method and apparatus for making same
DE4334353A1 (de) * 1993-10-08 1995-04-13 Merck Patent Gmbh Verfahren und Träger für die Gelpermeationschromatographie
US5527711A (en) 1993-12-13 1996-06-18 Hewlett Packard Company Method and reagents for binding chemical analytes to a substrate surface, and related analytical devices and diagnostic techniques
JP3333309B2 (ja) 1994-04-08 2002-10-15 鐘淵化学工業株式会社 ケトアミン含有タンパク質吸着体
US5663051A (en) 1994-08-31 1997-09-02 Activated Cell Therapy, Inc. Separation apparatus and method
US5652348A (en) 1994-09-23 1997-07-29 Massey University Chromatographic resins and methods for using same
US6025129A (en) 1995-04-25 2000-02-15 Irori Remotely programmable matrices with memories and uses thereof
US6048964A (en) 1995-12-12 2000-04-11 Stryker Corporation Compositions and therapeutic methods using morphogenic proteins and stimulatory factors
US5667674A (en) * 1996-01-11 1997-09-16 Minnesota Mining And Manufacturing Company Adsorption medium and method of preparing same
US6013855A (en) 1996-08-06 2000-01-11 United States Surgical Grafting of biocompatible hydrophilic polymers onto inorganic and metal surfaces
CZ297990B6 (cs) 1997-01-21 2007-05-16 W. R. Grace & Co.-Conn. Cásticový adsorbent a zpusob jeho výroby
US5998183A (en) 1997-07-07 1999-12-07 Le Fevre; Gerard N. Enzyme immobilization on a siliceous support with a polyaldehyde cross-linking agent
US5993653C1 (en) 1997-08-11 2001-11-06 Phenomenex Composition and column used in hplc
FR2777355B1 (fr) * 1998-04-10 2000-05-12 Bio Merieux Procede de fixation d'une molecule biologique sur la surface d'un support constitue de silice ou d'oxyde metallique
DE10022529A1 (de) 2000-05-09 2001-11-15 Emtec Magnetics Gmbh Pigmenthaltiges Aufzeichnungsmaterial
US6987079B2 (en) * 2001-08-14 2006-01-17 W.R. Grace & Co.-Conn. Supported catalyst systems
US6375846B1 (en) * 2001-11-01 2002-04-23 Harry Wellington Jarrett Cyanogen bromide-activation of hydroxyls on silica for high pressure affinity chromatography

Also Published As

Publication number Publication date
BR0211927A (pt) 2004-10-26
US20030042203A1 (en) 2003-03-06
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EP1423191B1 (en) 2013-03-20
NO20040652L (no) 2004-05-14
HRP20040148A2 (en) 2004-08-31
EA200400310A1 (ru) 2004-08-26
AU2002355940B2 (en) 2008-10-16
US7166213B2 (en) 2007-01-23
ZA200401183B (en) 2004-08-26
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IL160321A (en) 2007-05-15
EA006059B1 (ru) 2005-08-25
JP2004538479A (ja) 2004-12-24
CN100374197C (zh) 2008-03-12
WO2003015915A1 (en) 2003-02-27
EP1423191A1 (en) 2004-06-02
US20050003428A1 (en) 2005-01-06
IL160321A0 (en) 2004-07-25
US6802966B2 (en) 2004-10-12
US6998042B2 (en) 2006-02-14
MXPA04001366A (es) 2004-05-27
JP4235547B2 (ja) 2009-03-11
CA2457730A1 (en) 2003-02-27
PL367789A1 (en) 2005-03-07

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